（林木遗传育种专业论文）白腐菌漆酶基因的克隆及序列分析.pdf

摘要 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，普遍存在于白腐菌中，具有降解木质素和使苯氧基类除 草剂等有毒酚类物质无毒化的作用，还可去除石油工业废水的毒性。在造纸、饮料加工、和 环保等方面具有广泛的应用自h 景。大多数白瘸菌在水中的生长速度较馒，结球结块，仅能生 活在水体表面，这些都限制了其在处理废水等方面的直接应用。克隆自腐菌漆酶的结构基因， 对今后培育白腐菌漆酶基因大量表达的工程菌株和用工程菌处理酚类污染的废水等具有十 分重要的意义。本研究以2 5 种自腐真菌为材料，测定了不同菌株漆酶的活性，并对6 种自 腐菌漆酶基因进行了克隆和序列分析，结果如下； ( i ) 对2 5 种白腐真菌进行了漆酶活性铡定，结果有11 个菌种具漆酶活性，它们分别是裂蹄 木层孔菌( p h e i n u s i n t e u s ) 、朱红密孔菌( p y c n o p o r u sc i n n a b a r i n u s ) 、环带干酪 菌( t v r o 墨y c e sz o n a t u l u s ) 、栎迷孔菌( o a e d a l e aq u e r c i n a ) 、三色革裥菌( l e n z i t e s t r i c d o r ) 、北方梭囊孔菌( 口i m a c o c y s t i s b o r e a l i s ) 、桦革裥菌( l e n z i p s 5 e t u i n a ) 、 血红密孔菌( p v c n o p o r u s s a n g u i n e u s ) 、自粑齿菌( i r p e x l a c t e a ) 、单色下皮黑( 国r 阳月a u n i c o i o r ) 、梭孔菌( f a v o i u sa j v e o 龇拈) 。 ( 2 ) 建立了快速提取高纯度完整丝状真菌r n a 、d n a 的方法。 ( 3 ) 通过r t p c r 实验证明了扁芝菌的m r n a 不具有p o l y ( a ) 序列。 ( 4 ) 设计并合成了用于克隆漆酶基因的一对简并引物，在6 个菌种中扩增和克隆了与漆酶基 因及其类似基因有同源性的特异片段，它们分别是朱红密孔菌( 1 2 2 7b p ) 、血红密孔菌 ( 1 2 2 7b d ，a y 3 3 1 1 8 9 ) 、单色下皮黑( 1 2 0 7b p ，a y 4 5 4 3 0 5 ) 、环带干酪菌( 1 2 2 3b p t a y 4 5 4 3 0 6 ) 、北方梭囊孔菌( 1 2 0 1b p ，a y 3 3 3 1 2 4 ) 、枥迷孔菌 、r y r o m y c e s2 0 n a l t d u s ti 2 2 3 b p a y 4 5 4 3 0 6 ) 、c i m a c o c y s t i sb o r e a l i s ( 1 2 0 1b p ，a y 3 3 3 2 4 ) 、d a e d a e aq u e r c i n a ( 1 2 3 2b p ， a y 3 3 3 1 2 5 ) ( 5 ) t h ef u l l 1 e t i g 小e d n ao fp y c n o p o r u ss a n g u i n e u si n c e n s eg e n ew a sc l o n e d a c c o r d i n g t ot h e i n c e n s e g e n ef r a g m e n to fp y c n o p o r u ss a n g u i n e u s ( a y 3 3 it8 9 ) ，t h ef u l l l e n g t he d n ao f p y c n o p o r u ss a n g u i n e u 3l a c c a s eg e n ew a si s o l a t e db yu s i n gr a c e ( r a p i da m p l i f i c a t i o n o f e d n a e n d s ) t e c h n i q u e ，1 h e 魁l ll e n g c l lo fs e q u e n c ew a s 19 0 2b p ，c o m a i n i n ga l lo p e nr e a d i n g f r a m e ( 1 5 5 4b p ) e n c o d i n gap e p d d e o f 5 1 8a l l l i l l oa c i d s 5 a n w a n s l a t e dr e 9 4 0 nw a s5 j 印，3 。 u n t r a n s l a t e dr e g i o nw a s2 9 7b p b l a s t a n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h el a c c a s ec d n aa n d 锄曲o a c i d ss e q u e n c ef r o m p y c n o p o r u ss a n g u i n e u ss h a r e dh i g hi d e n t i t yw i t hl a c c a s eg e n ef r o mo t h e r o r g a n i s m si nn u c l e o t i d e sa n da n l m oa c i d sr e s p e c t i v e l y , t h el a c c a s ep r o t e i nh a sf o u rc a t a l y t i c c u p r i c1 0 1 1 5d o m a i na n ds e v e ng t y c o s y l a t i o ns i t e s ，t h er e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h tw a s5 6 3i32 ，a n d t h e o r e t i c a lp jw 酷5 , 5 9 【6 ) t h ec o m p l e t ed n a s e q u e n c eo f l a c c a s ef r o m p y c n o p o r u ss a n g u i n e u sw a so b t a i n e d b a s e do n t h ep y c n o p o r u ss a n g u i n e u sl a c c a s ec d n a s e q u e n c e ，ap a i ro f s p e c i f i cp d m e r h a db e e n d e s i g n e d ； t h ec o m p l e t ed n a s e q u e n c eo f 2 1 5 4b p ( a y 5 1 0 6 0 4 ) w a s i s o l a t e db yp c r b e s i d e st h ec o d i n g a r e ao fc d n a ，t h es e q u e n c ec o n t a i n i n g1 0i n t r o n sr e g i o n s ，w i t hl e n g t hb e t w e e n5 2 7 0b p ， w h i c hs h o w e dt y p i c a le u k a r y o t e si n t r o nc h a r a c t e r i s t i c ，i n c l u d i n g5 7 d o n o rs p l i c i n gs i t e 、3 r e c e p t o rs p l i c i n gs i t ea n d b i f i a r c a t es e q u e n c e k e yw o r d s ：l a c c a s e ，w h i t e r o tf u n g i ，p y c n o p o r u ss a n g u i n e u ，g e n ec l o n i n g ，r a c e 白腐菌漆酶基因的克隆及序列分析 1 前言 i 1 漆酶的研究概况 漆酶是一种多酚氧化酶( d - d i p h e n 0 1 _ o x i d a s ee c l 1 0 3 2 ) ，它最早是r 本学者吉f = f = | 从漆树的分泌物中发现( y o s h i d a ，1 8 8 3 ) ，随后人们发现一些高等真菌也能分泌这种酶 ( b e r t r a n d ，1 9 8 7 ：l a b o r e d ，1 8 9 6 ) 。现在人们知道，漆酶广泛存在于担子菌、半知菌和子囊 菌中，但其中最主要的生产者是担子菌中的白腐菌。也发现几种昆虫( t h o m a sp fa ，1 9 8 9 ) 、 细菌( a l e x a n d r e z h u li n ，2 0 0 0 ：s a n c h e z a m a teea 7 ，2 0 0 1 ：m a r t i n se ta ，2 0 0 2 ) 及最近发现黄蜂的毒液( p a r k i n s o ne ta j ，2 0 0 1 ) 均能分泌漆酶。1 0 0 多年来，漆酶一直是 生物学、化学和环境科学等领域十分活跃的研究热点，其中最受重视的是溱酶在本质素降解 中的重要效用。近年来随着研究的深入，漆酶对与木质素自口体物质分子结构相似的许多环境 污染物的降解作用受到人们的关注( , 8 u m p u se t “，1 9 8 5 ) ，尤其在纸浆生物漂白、废水处 理、坏境污染物质去毒与降解方面，显示出具有较大研究价值和应用潜力，并己耿得些突 破性成果和显著成就。随着2 0 世纪7 0 年代前后聚丙烯酰胺凝胶电泳和分子克隆等生物学技 术的问世，漆酶分子生物学的研究也揭开了新的一页。在国外很多菌种的漆酶基因得到了克 隆并且进行了分析和鉴定，一些漆酶基因也实现了其异源表达。漆酶首先从木质索降解研究 中发现，并在木质素降解中超重要作用。本文就漆酶、漆酶分子生物学以及基因克隆研究进 展方面进行了评述。 1 1 1 漆酶的理化性质 1 1 1 1 产漆酶的微生物 漆酶最初是在漆树漆液中发现的，随后人们发现某些高等真菌也能分泌这种酶。多年柬 的研究发现，漆酶在植物中具有广泛的存在，而在微生物世界的分布范围则是有限的。漆酶 主要存在于担子菌中的一个特殊类群一白腐菌中，在部分半知菌中有少量的分御，在原核生 物中则极为罕见。严东辉，杨宝军( 1 9 9 7 ) 还发现松材线虫b u r s a p h e t e n c h u sx y l o p h i l u s 也能向体外分泌漆酶和过氧化物酶。 1 1 1 2 漆酶的活性测定方法 测定漆酶活性的方法有h p l c 法、测压法、分光光度法、级谱法等。目前常以3 - 乙基苯 东北林业大学硕士学位论文 并噻唑一6 磺酸( a b t s ) 为底物，测定漆酶对其氧化速度。具体方法为：反应在2 5 下进行， 总反应体积3m l 中，含有2 【1 3 l 溶有0 ，5 m o l a b t g 的0 。1m m o l l 醋酸缓冲液( p h = 50 ) ， 添加酶液启动反应，在4 2 0n m 下测定其吸收值的变化。酶活力单位定义为上述条件下( 2 5 ， p hj o ) lf f l l 酶液每m i n 氧化底物( a b t s ) 引起吸光值的增加量( a o d 。( m l m i n ) ) ( 缪 静，姜竹茂，2 0 0 1 ) 。 c f e m m a rjd ( 1 9 9 7 j 等以二戊铁( f c - h ) 作为底物，在二乙二醇单丁醚( d g b e ) 磷酸 缓冲液中，用分光光度计在6 1 7n m 处测定漆酶的活性。该法无副产物干扰，重复性好a 望 天志等( i 9 9 7 ) 采用微量热法测定漆酶的活性，对l e b 一2 1 0 7 b a t c h 型微量热系统，在温度为 2 9 8 i jk ，p h 为7 4 的条件下，测定了漆酶的催化活性。该法的特点是用样品重少，并且对 酶的悬浮液体也能测定，宜用于研究酶促反应。 1 i 。1 3 漆酶的种类和特性 漆酶是含锕多酚氧化酶，分戈漆树漆酶和真菌漆酶两大类，而人静) 对动物漆酶则知之甚 少a 漆酶是耱蛋白一般以单蛋白体的形式存在，这些蛋白的表观分子量有很大的差异，从 5 9 3 9 0k d a 不等不同来源的漆酶具有不同程度的糖基化，糖基化程度在1 0 一4 5 之间一 般情况下真菌滚酶的碳水化合物含量要低于植物漆酶碳水化合物含量。一部分菌株产生的漆 酶由数种同工酶组成，都是单体酶。酶分子中一般部含有4 个铜原子，适宜反应温度较低， 酸性p h 催化效率较高，具有广泛的底物专一性，不同漆酶之间的作用范围也不尽相同，底 物具有较大的广谱性，主要包括酚类、芳脓类、羧酸类、激素与色素、金属有机化合物及其 它化合物( 季立翻，胡培植，1 9 9 7 ) 。d u c r o sv a l e l l e 等人首先将c o p r o n u sc d e z _ u , 5 产生的 漆酶利用酶法去除了糖基，然后以聚乙二醇为沉淀剂，利用悬滴法把它制作成小片晶体。经 过x 一射线霄j 射分析发现它们属于空间群p 2 、2 2 。，单位晶胞参数为a = 4 5 4n m ，b - 8 5 7n m c = 1 4 3 in m ( c h r i s t o p h e r ，1 9 9 4 ：o u c r o sp fa 7 ，1 9 9 7 ；a n l 2 0 r i n ep fa ，2 0 0 2 ) 。 1 1 1 ，4 漆酶分子健化活性中心结构与功能 漆酶是一种最简单的多铜过氧化酶，一般含有4 个铜原子。根据其光谱特征，可划分为 3 种类型的铜；l 号锕具有典型的蓝锕谱带：紫外可见光谱上6 0 0 m ：5 0 0 0 ( m o l c m ) 1 处出现峰值，在e p r ( 电子顺磁共振) 谱上有个小的平行超精细耦合结构；：( 4 0 7 0 ) x 1 0 1 c m ，它参与分子内的的电子传递，把电子从底物传递到其它铜原子上；2 号铜只具一 般的e p r 谱带( a 。 1 4 0 i 0 弋m 。) ：3 号锕区由2 个3 号锕原子通近一个一o h 桥配位连接起来， 组成双核铜区，具有抗磁性，因而在e p r 上无谱带，紫外可见光谱上3 3 0n m 处的尖峰是3 号c u 。的特征峰。i 号铜与2 个组氨酸( h i s ) 和1 个半胱氨酸( c y s ) 配位：2 号铜与2 个 h i s 和1 个水分子e 位，形成t 型几何结构( m e s s e r s c h m f d te t 甜，】9 9 2 ) ，这对结构对一 价铜比二价铜更有利；3 号铜与3 个h i s 和一个氢氧桥配位，形成四面扭曲的四方立体结构 一2 一 白腐苗潍酶基因的克隆及序列分析 ( t a k e s h ie ta 7 ，1 9 9 5 ) ：2 号铜和2 个3 号铜原子组成的三核铜簇中所有的铜原子彼此之 间的距离都是o 3 8 a m 。l 号蓝铜离三核铜簇距离大约为为1 2 5 r i m ，中间通过一c y s h i s 一联系 起来，形成c u ( i ) 一c y s - h i s - c u ( i i i ) 电子传递通道。l e i f j ( 1 9 9 5 ) 等人对觚f 阳v e r s i c o l o r 活性中心研究发现其含2 个二硫桥：c y s 一8 5 与c y s 一4 8 7 形成一个二硫桥，把l 号铜区与3 号 铜区联系起来：c y s 1 1 7 与c y s 一2 0 5 形成另一个二硫桥，把2 号铜区和l 号铜区联系起来。 漆酶催化活性中心与4 个铜原子配位的1 0 个h i s 以及与1 号铜配位的c y s 相对而言是 比较保守的。在c y s 的下侧，相应于l 号铜的第4 个配体的位置对1 号铜的还原电势有决定 作用。此位置的疏水基团越大，则其还原电势越强。依据该位置的基团的不同，可将漆酶序 列分为3 类：l a c1 ( 甲硫氨酸：m e t ) 还原电势最低；l a c 】1 ( 亮氨酸：l e u ) 还原电势次之： l a c k ( 苯丙氨酸：p h e ) 还原电势最高( 胡平平，付时雨，2 0 0 1 ) 。 i 1 1 5 催化反应机理 漆酶在木质素降解过程中的作用，至今人们还很不清楚。根据对漆酶光谱学、动力学和 晶体衍射的研究，漆酶作为一种多酚氧化酶，可催化氧化酚类和芳胺类多种底物，漆酶催化 底物的方式可能如下：底物结合于酶活性中心的i 型铜原子位点，i 型铜原子作为初级电子 的接受者，它参与分子内的电子传递，把电子从底物传递到其他镉原子上。然后电子结合于 三核位点，该位点进一步把电子传递给结合到活性中心的第二底物氧分子，使之还原为水。 整个反应过程需要连续的单电子氧化作用来满足漆酶的充分还原，还原态的酶分子再通过四 电子转移传递给分子氧，因此漆酶又被称为分子电池。在此过程中，氧还原很可能分两步进 行，两个电子转移产生过氧化氢中间体，该中问体在另两电子作用下被还原为水( 钞亚鹏， 钱世钧，2 0 0 1 ) 。 1 1 2 漆酶分子生物学研究进展 l1 2 1 漆酶基因氨基酸序列分析 漆酶蛋白质部分一般含有】段大约4 5 0 - 6 5 0 氨基酸残基的多肽序列。p y c n o p o r u s c i n n a b a r i n u s 漆酶基因l a c l 编码1 个5 1 8 氮基酸残基的蛋白质，其中包含1 个2 1 个氮基酸 残基的信号肽( o t t e r b e i ne ta 上2 0 0 0 ) 。c o r i o l u sv e r s c o o r 漆酶基因c v l g l 编码1 个 5 2 6 氨基酸残基的蛋白质，包含1 个2 3 氨基酸残基的信号肚( m i k u n i m o r o h o s h i ，1 9 9 7 ) 。 b a s i d i o m y c e t ep m i ( c e c t2 9 7 1 ) 漆酶基因c d n ao r f 编码5 1 7 氨基酸残基的蛋白质，其信 号肽为2 1 个氨基酸残基( c o l l 日fa ，1 9 9 3 ) 。g a e u m a n n o m y o e sg r a m i n i sv a r t r i t i c i 的 3 个漆酶基因l a c l 、l a c 2 、l a c 3 分别编码6 0 9 个、5 7 7 个、和5 8 1 个氨基酸的多肽，他们的 信号肽为1 8 2 0 个氮基酸残基( a n a s t a s i ap a 五2 0 0 2 ) 。m a r a s m i u sq u e r c o p h i u s 漆酶 一3 一 东北林业大学硕士学位论文 l a c l 基因编码1 个5 1 7 氨基酸残基的蛋白质( d e d e y a ne ta ，2 0 0 0 ) 。一种担子菌l e 月t i n u l a e d o d e s 漆酶g l a l 基因编码1 个5 7 l 氨基酸残基的肽( z h a oe t 丑j ，2 0 0 0 ) 。 漆酶来源很多，其氨基酸序列差异很大。目前研究最多的是其n 末端氨基酸序列。同源 性担子菌漆酶的n 端氨基酸序列具有很大的相似性，而已知的子囊菌n 端氨基酸序列都不具 褶似性，与担子菌的漆酶的序列也相差很大( 胡平平，付时雨，2 0 0 1 ) 。对担子蕾b e s d i o 研y c e t e 印漆酶l a c ln 木端与报道的其它种漆酶相b e 较，它与c e r i p o r i o p s i ss u b v e r m z s p o r e 同源 性为1 0 0 ，与p y c n o p o r u sc i n n a b a r i n u s 和d i c h o m i t u ss q u a e n sl c l & l c 2 同源性为8 7 5 ， 与c o r h u sm r s u t u s 和t r a m e t e sv e r s i c o l o ri 同源性为7 5 。而与r i g i d o p o r u sj i g o s u s ( d ) 完全没有同源性( 刘淑珍，钱世钧，2 0 0 3 ) 。但很重要的一点是漆酶在和铜原子连接的半胱氨 酸及l o 个组氨酸之中或周围都有严格的保守氨基酸残基，任何情况下这些氨基酸都分布在 含有两对组氨酸残基的n 一末段区域，或是分布于c 一末端的半胱氨酸和其余组氨酸残萋之间 ( 钞亚鹏，钱世钧，2 0 0 1 ) 。i i m u r a ( 1 9 9 2 ) 曾测定了三种漆酶的n 端氨基酸序列，发现l a c c a s e l 和l a c c a s e2 的n 端3 0 个氨基酸序列中有l o 个不同，但他们是同工酶，h a c c a s e2 和l a c c a s e 3 的n 端氨基酸序列很相似( 只有两个位置不同) 但他们在对底物的氧化反应上却存在很大 的不同。 漆酶的氨基酸顺序等同性较低，g a e u m a n n o m y c e sg r a m i n i sv a l t r i t i c i 的三个漆酶基 因l a c l 、l a c 2 、l a c 3 的氮基酸序列与n e u r o s f l o r ac r a s s a 漆酶( e m b lp 0 6 8 1 1 ) 分别有3 58 、 3 5 4 和4 8 5 的相似性，它们之间的氨基酸序列相似| 生分别为4 2 ，6 ( l a c i ，l a c 2 ) ，3 8 、1 ( l a c i ，l a c 3 ) ，军口3 9 9 ( l a c 2 ，l a c 3 ) ( a n a s t a s i ae ta 上2 0 0 2 ) 。 1 1 2 2 漆酶基因的克隆 随着分子生物学技术的发展，漆酶基因已经从术素降解菌和非木素降解菌中得到克隆并 进行了序列分析。漆酶是一个结构近似的基因家族所编码，其克隆无论在数量上还是菌种 来 源上均是比较多的。目前将近3 0 种不同来源的漆酶基因已被克隆和测序。包括c o r i o l u s h i r s u t u s ( e o j i l ae ta 1 9 9 0 ) ，t r a f h e c e sv e r s i c o l o r ( h u n o l s t e i ne t 盆t1 9 8 6 ；j jn n s o n e t a l ，1 9 9 5 ；】jn n s o ne t a 7 ，1 9 9 7 1 鼢i e 6 i a r a d i a t e ( 。s a l o h e i m oe ta j ，1 9 9 1 ) ，强a 册e t e s v i l j o s a ( y a v e r g o l i g h t l y ，1 9 9 6 ：y a v e re a - ，1 9 9 6 ) ，助s i d i o m y c e t ep m l ( c o i l 日t a l ，1 9 9 3 ) ，t r a m e t e s i 一6 2( c e c t2 0 1 9 7 ) (m a n s u re ta i ，t 9 9 8 ) ，p y c n o p o r u s c i n n a b a r i n u s ( e g g e r t e t a j 1 9 9 7 、，n e u r o s p o r ac r a s s a ( g e r m a n n e t a i ，1 9 9 8 1 a s p e r g i j j u sn i d u l a n s ( a r a m a y o t i m b e r l a k e ，1 9 9 0 ) 和r h i z o c t o n i as o e n i ( w a h e i t h n e r e ta ，1 9 9 6 ) 等等。研究漆酶的编码基因及漆酶基因的表达调控机制，有助于阐明不同漆酶 在发育过程中所起的作用。 1 9 8 8 年f r o l m n 等首次利用快速扩增c d n a 技术从白腐菌p e u r o t u so s t r e a t u s 中克隆 一4 一 到漆酶p o x i 基因。后来的学者多用r t f c r 技术来获得漆酶基因 a ( 6 ) 。p y c n o p o r u sc i n n a b a r i n u s 漆 酶有着密码子偏向性如l e u ( 8 豫c u u g e ，1 3 c u u ) ，, v a l ( 8 蹦g u g c ，2 嘴g u a u ) ，和p b e ( 9 0 u u c ，l0 9 6u u u ) 。它包含6 个潜在的n 端糖基化位点。p y c n o p o r u sc i n n a b a r i n u s 漆酶基因上 东北林业大学硕士学位论文 游序列2 4 0b p 包括启动子元件c a a t 和t a t a ，t a t a 框位于转录起始位点上游6 8b p 处，其 它的真菌漆酶也包含启动子元件t a t a 和c m t ，然而，尽管这些序列保守，但它们的位置是 不同的( e g g e r t e ta r ，1 9 9 8 ) 。 漆酶基因中含有相当多的内含子，例如p m o b i ar a d i a t a 漆酶基因有9 个内含子， c o m o l u sh i r s u t u si 0 个， b a s i d i o m y c e t ep m l ( c e c t2 9 7 1 ) i o 个，a g a r i c u sb i s p o r u s1 4 个，p j e u t o t u so s t r e a t u s1 9 个其中一些离度保守。而且不同来源的漆酶基因内含子的位 置也大多是保守的。这两方面可以做为分析酶的同源性和菌株间亲缘关系的依据之一( y a v e r g o l i g h t t y ，1 9 9 6 ) 。 1 1 2 4 漆酶基因家族 许多真菌能产生由多基因编码的几种漆酶基因的同系物家族，立f l r h y z o c t o n i as o l a m 有 4 种漆酶同系物( w a h l e i t h n e r o ta l ，1 9 9 6 ) ，t r a m e t e sv e r s i c o l o r 有5 种( y a v e r g o l i g h t l y 1 9 9 6 ) ，b a s i d i o m y c e t ei 一6 2 有3 种( m a n s u re ta 7 ，1 9 9 8 ) ，a g a r i c u sb i s p o r u s 有2 种( s m i t he ta l 。1 9 9 8 ) ，p e u r o t u ss a j o r - c a j u 有4 种( s o d e n e ta j ，2 0 0 2 ) ，p e u r o c u s o s t r e a t u s 至少有3 种( g i a r d i n ae fa ，1 9 9 9 ) ，g a e u m a n n o m y c e s g r a m i n i s v a r t r i g i c i 至少有3 种( c o i l e ta 7 1 9 9 3 ) ，p o d o s p o r aa n s e r n a 至少有4 种( f e r n a d e z l a r r e a s t a h l ，1 9 9 6 ) 。一般来说这些基因在不同的环境条件( m a n s u re t 丑上1 9 9 8 ；z h a o k w a n ，1 9 9 9 ： s m i t he ta 1 9 9 8 ：f e r n a d e z l a r r e a s t a h l ，1 9 9 6 ；s c h e e l e ta l ，1 9 9 9 ) 或真菌生长不同 阶段的生话周期( m a n s u re ta ，1 9 9 8 ：f e r n a d e z l a r r e a s t a h l ，1 9 9 6 ：t s a i e ta 7 ，i 9 9 9 ) 中表达。研究p e u r o t u s 船d r 且臁酶的四种同系物发现它们的产生发生在基因转录的不 同水平，l a c 3 基因为组成性表达基因，而l a c l ，l a c 2 和l a c 4 则在不同的诱导条件下表达( s o d e n e ta i 、2 0 0 2 ) 。对g a e u m a n n o m y c e sg r a m i n sv a rt r i t i c 艨酶基因的同系物l a c l ，l a c 2 t 和 l a c 3 的研究发现，l a c l 为组成性表达基因，l a c 2 在铜诱导条件下表达，而l a c 3 的转录表达则 只发生在植物体中或在有植物寄主存在条件下( c o l i e ta j ，t 9 9 3 ) 。同一物种漆酶同系物基 因在氮基酸水平上的同源性并不是很高，例如爿p 啪s 可撕c a 且膝酶l a c l 和l a c 4 具有较 高的同源性( 8 5 ) ，而l a c 3 与其它的p e u r o t u ss a j o r - c a j c l g 鍪酶同系物的同源性则较低， 仅为5 2 9 6 5 7 。白e 蚴a 加侧c e sg r a m i n s v g l 7 之间的同源性则更低，为3 8 ，1 4 2 6 ( c o l 1 有不同的作用，但目前尚未有文献报道。 1 1 ，2 5 漆酶的表达调节 t r i t i c 壤酶基因同系物l a c i ，l a c 2 ，和l a c 3 e ta ，1 9 9 3 ) 。不同表达的漆酶基因说明它具 真菌漆酶的表达受不同条件的影响，如培养基中的c n 和c u 、m n ”离子浓度，结构与木 质素有关或与木质素单元相似的低分子芳香族化合物或木质索碎片化合物，如香草酸、藜芦 醇、阿魏酸和吐温等均可影响漆酶的产生并提高真菌的产酶盈。并且漆酶的表达调节在种间 6 一 白腐菌漆酶基因的克隆及序列分析 有显著的不同。肋l 曲妇r a 以a 抬漆酶的转录物在氮限制和木质素水解条件下稳定检出。 p e u r o t u ss a j o f c a j u 漆酶同系物l a c 2 和l a c 4 在高n 条件下表达量明显提高( s o d e n p f a l ，2 0 0 2 ，8 a s i d l a f l y c e t e i 一6 2 ( c e t2 0 1 9 7 ) 也有同样的现象( m a n s u re ta i ，1 9 9 8 ) ，而e g g e r t 等弋1 9 9 8 ) 的研究表明眄c n o l m r u sc f n 瑚6 盯功漆酶活性与生长条件下的c n 有关。在对 c o n o u s v e r s i c o l o z 笋 研究中发现c 限制时可显著提高漆酶产量( 吴坤等，2 0 0 1 ) 。铜离 子对于漆酶的产生和活性有重要的作用，研究发现c u 能提高n e u r o s p o nc f a s s a 漆酶活性 ( h u b e r & l e r c h ，1 9 8 7 ) ，提高t r a m e t e sv e r s i c o l o r ( c o i l i n s d o b s o n ，1 9 9 7 ) 和用e u f o u s o s t r e 暑t u s ( p a l m i e r ie ta t ，2 0 ) 漆酶的骜医转录。而s u b v e r m s p o r a 和a e d i c u c a m p e s t n s 在c u ”存在的前提下还受m n 2 + 影响。帆能明显提高h e u r o t u ss a j o r c a 且榛酶的活 性和表达，在臼腐真菌c 1 i t o c y b u ad u s e n i i 和n e m a t o j o m af r o w a r d i i 中m 矿能提高漆酶m r n a 的表达量( s c h e e le 8 ，2 0 0 0 ) 。在t r a m e t e sv i l l o s a 中，l a c i 受2 ，5 - 二甲基苯胺强烈诱导， i a c 2 的转录水平不变，而l a d ，l a c 4 和l a c 5 的转录扬却检测不到。但在肋i m c t o n ms o b s 中l a c l 、l a c 2 和l a d 成簇而与l a c 4 分离( w a h l e i t h n e re ta l ，1 9 9 6 ) ，这可自t 说踢在基鼠结构 和转录调节之间具有联系。芳香族化合物如二甲代苯胺、阿魏酸、掣芦醇均能提高漆酶的产 量( y a v e re t 盘五1 9 9 6 ；c o l l i n s d o b s o n ，1 9 9 7 ；m u s c z e ta z 】9 9 7 ) 。 1 1 2 6 漳酶基因的异源表达 对漆酶基因的克隆和序列分析实现其高表达并得以应用是一个重要的目的。但多种漆 酶自身的表达重很低，在异源宿主上表达重组漆酶蛋白是解决这一闻题的一个有效途径，因 此一直有人研究漆酶的异源表达。1 9 9 0 年k o ji m a 首次将c o r i o i u s 坩u c “s 的木素降解酚 氧化酶进行了克隆和在酵母系统s a c c h a r o m y c e $ c e r e v i s i a e 中表达，表达量为4 m g l l ( k o j 【i m ao ta l ，1 9 9 0 ) 。1 9 9 1 年m a r k k us a l o h e i m o 等将编码白腐菌p h l e b i ar a d i a 幻漆 酶基因克隆于软腐菌力0 c h o d e r m ar e e s e i 表达系统中，用纤维素酶启动子来启动该酶的表 达，表达量达到2 0m c l 。随后入霄 研究不f 冠的表达系统来实现漆酶高效表达。甲基营养酵 母p i c h i ap a s t o r i s 系统成功表达了若干种不同来源的漆酶，如f r a m e t e sv e r s i c o t o r ( j 5 n n s o n s a l o h e i m o ，1 9 9 7 ；g e l o p u b li c e t a l , 1 9 9 9 ：b r o w n e ta 上2 0 0 2 ) ，t r a m e t e s s a n g u i n e a ( h o s h i d ae ta l ，2 0 0 1 ) 和p y c n o p o r u sc i n n a b a r i n u s ( o t t e r b e i ne ta l ，2 0 0 0 ) 。 除此之外s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ( k c t j i m a e t8 ，1 9 9 0 ：c a s s l a n d j o p , s s o i ，t 9 9 9 ) 、 t r i c h o d e r m at e a s e ( s a l o h e i m oe ta l , 1 9 9 1 ) 、a 5 p e r g i i i u so r y z a e ( y a v e re ta j 1 9 9 6 ； b e r k ae ta l1 9 9 7 ) 、a s p e r g i l l u sn i g e r ( r e c o r de ta t2 0 0 2 ；l a r r o n d o e ta t , 2 0 0 3 ) 和 a s p e r g i l l u s n i d u h n s ( b a r r o n d oe ta l 。2 0 0 3 ) 也成功地应用于真菌漆酶的异源表达宿主。 最近细菌b a c i l l u ss u b d l i s 漆酶基因c o t a 在e s c h e r i c h i ac o i l 中成功的进行了表达 ( 1 i t a r t i n se ta , 2 9 0 2 ) 。不同表达系统漆黪的表达产量不同。漆酶在酵母中衷达量非常低， 东北林业大学硕士学位论文 约为5 m g l ，丝状真菌宿主重组漆酶的产量为l o m g l 2 0 m g l 。c o p r i n u $ c j n e r e u s 漆酶基 因在a ；p e r g i l l u so r y z a e 中实现了漆酶的最好表达，表达产量达8f f l g 几1 3 5m g l 。 p y c n o p o r u $ c i n n a b a r i n u s 漆酶l a cl 基因在真菌宿主a s p e r g i l l u sn i g e r 中实现了大量表 达，表达量为7 0m g l 。c o p r i n u sc i n e r e u s 漆酶基因和p y c n o p o r u sc i n n a b a r i n u s 漆酶基 因的异源离效表达，使漆酶的大规模工业生产和应用成为了可能。 1 1 3 漆酶的应用 由于漆酶在木质素及其前体类似物降解中的重要作用，近年来，漆酶一直是生物学、化 学和环境科学领域十分活跃的研究热点( c h r i s t o p h e r ，1 9 9 4 ：r e i n h 删，1 9 8 4 ) ，其中最受 重视的是漆酶在木质素降解中的重要作用。近年来，随着研究的深入，漆酶对与木质素前体 物质分子结构相似的许多环境污染物的降解作用受到人们的关注，尤其在纸浆生物漂白、废 水处理、环境污染物质去毒与降解、食品加工、化学分析等方面( 缪静，姜竹茂，2 0 0 1 ；李 光f 等，2 0 0 0 ) ，具有较大的研究价值和应用潜力，并已经取得了突破性成果和进展。 i 1 4 国内外漆酶及其技术的研究进展 国外真菌漆酶分子生物学研究进行的比较深入系统，很多菌种的漆酶基因得) u - y 克隆并 进行了分析和鉴定：一些菌种漆酶也实现了异源表达。漆酶基因的克隆、异源表达和表达调 控对于漆酶的应用和研究漆酶在真菌个体发育过程中的功能具有很重要的作用。相对于国外 的情况而言，国内对于漆酶分子生物学的研究则尤显不足。如今国内对漆酶的分子生物学研 究工作已有所加强，有一些研究项目获得了国家自然科学基金和9 7 3 项目等重大科研项目的 资助，相信我国的漆酶分子生物学的研究会在短酹尚内达到国际先进水平。 1 2 简并引物p c r 技术及其在基因克隆中的应用( 王洪振等，2 0 0 3 ) i 21 简并引物p c r 技术 简并引物p c r 技术是p c r 技术的发展。p c r 技术最初是为扩增已知序列设计的，简并引 物p c r 技术却自g 扩增未知序列t 当待研究的基因序列不明，仅知其一部分蛋白质的氨基酸序 列，可根据氨基酸序列合成一组简并引物，进行p c r 扩增，对基因家族中未知成员( 基因) 进：i 亍分离a 简并引物p c r 与常规p c r 之间的一个重大差别，是用简并引物代替具有特定序列 一8 一 自腐菌漆酶基因的克隆及序列分析 的特异的p c r 引物。简并引物的出现是由于遗传密码具有简并性，这样可以根据氨基酸的保 守序列反推d n a 水平设计引物。由于大多数氨基酸的遗传密码不止一种，所以引物的部分碱 基不能确定。可以撮据各种不同的遗传密码规律设定d n a 和氨基酸之问的相互转换，这样设 计出来的引物是将可能编码一个给定氨基酸序列的核管酸设计为一组，实际上是多种序列的 混合物，序列大部分是相同的，但在某些位点有变化，称之为简并引物。 应用简并引扬p c r 方法藏功与否关键在于简并引物的设计，应遵循静总原剁为：尽量降 低引物的简并度。尤其在3 末端或近3 末端。 1 2 2 应用简并引物p c r 获锝全长基因的方法 主要有两种途径。一种是采用简并引物p c r 扩增的c d n a 小片段作为探针筛选c d n a 文库， 从而获得相应的目的基因；另种方法是可以以此小片段为基础设计特异引物进行3 和5 c d b a 末端快速扩增( r a p i da m p l i f i c a t i o nc d n ae n d s ，r a c e ) ，扩增此c d n a 的其余部分， 从而获得全长基因。 1 2 3 简并弓j 物p c r 技术的应用范围 简并引物p c r 技术的应用范围主要在两个方面： ( 1 ) 当分离出一种新蛋白并测定了其中的一段氨基酸序列，要进一步寻找相应的基因时， 可以使用简并引物f c r 技术。 ( 2 ) 用简并引物p c r 易于找到具有进化上保守结构域的蛋白质家族新成员的基因。出于 几乎所有蛋白质都具有与其它蛋白质的