（林木遗传育种专业论文）外源基因在转基因杨树世代传递间遗传及表达规律研究.pdf

摘要 本试验选用具有不同抗虫性的转双抗虫基因( 研和爿脚7 4 1 杨株系为母本，用具有 优良特性的白杨无性系8 4 k 杨为父本，进行有性杂交，获得杂种后代家系。以不同 杂种家系为材料，对外源基因( 标已基因m 和b t c 叫脚c 基因) 的遗传和表达及 外源基因问的相互关系进行研究。探索外源基因遗传和表达的规律性与稳定性，外源 基因问在遗传和表达上的相互关系，为转基因杨树的利用和杂交育种提供理论依据和 原始材料。取得的进展如下： 1 通过对7 4 1 杨和毛白杨成龄大树进行5 a 结实性研究结果表明：7 4 l 杨果穗长度、 果穗粗度、果穗数量、每个果穗蒴果数均显著低于毛白杨的。毛白杨果穗在成熟开裂 前5 1 0 脱落，而7 4 1 杨7 0 一9 0 脱落，因此7 4 l 杨不会造成明显的飞絮现象，且减 少了外源基因飘移的可能性。 转基因7 4 1 杨较难获得种子，其原因主要是杂种胚发育到3 周以后停止发育并消 失，导致果穗结实率低，且大部分果穗成熟前脱落。因此采用胚挽救是克服杂交不育 的一种有效的方法。通过试验确定较适杂种苗幼胚培养的培养基为 m s + 6 - b a o 1 m l 。 2 试验研究发现杨树抗性芽在含5 0 r n l k a l l 生根培养基中生根是很好的筛选过 程，一般通过嫩茎小植株在5 0m l k a i l 生根状况，即可初步断定杂交后代中是否含 有新霉素磷酸转移酶基因帅fi i 。5 个杂交组合产生的后代中选取4 1 个生长势较好的 杂种单株进行了k a n 生根筛选，试验结果表明：所选4 1 个单株不符合一对等位基因的 孟德尔分离规律；同理在杂交组合p b l 8 4 k 中产生的后代中，符合一对等位基因的 孟德尔分离规律；在p b 6 8 4 k 中产生的后代中，不符合一对等位基因的孟德尔分离 规律，由于其余3 个杂交组合群体较小没有进一步验证。由于本试验总的群体较小， 试验的准确性有待进一步验证。 3 本试验以转双抗虫基因7 4 l 杨的5 个株系为母本，未转基因的8 4 k 为父本， 杂交f i 代获得的7 3 个单株为研究对象，利用p c r 技术检测分析了b t c 砂j r 4 c 和 研1 i 基因的表达及遗传。结果表明：检测的杂交f i 代单株中，外源基因b t c 砂，一c 分离 比例为1 7 0 ：l ，经f 测验不符合一对等位基因的孟德尔分离规律；在转基因株系 p b l 杂交f i 代中分离比例为1 ：1 ，经f 测验符合一对等位基因的孟德尔分离规律； 在转基因株系p b 6 杂交f l 代中分离比例为2 4 3 ：l ，经测验不符合一对等位基因 的孟德尔分离规律。 同理，研究 协i i 基因的分离，杂交f i 代7 3 个单株中外源基因 印1 1 分离比例 为1 9 2 ：l ，经f 测验不符合一对等位基因的孟德尔分离规律；在转基因株系p b l 杂交f l 代中分离比例为1 ：1 ，经岩测验符合一对等位基因的孟德尔分离规律；在转 基因株系p b 6 杂交f l 代中分离比例为3 - 8 ：l ，经r 测验不符合一对等位基因的孟德 尔分离规律。两个外源基因在p b 6 8 4 k 杂交f l 代不符合l ：l 的分离规律，接近3 ：1 的分离，经r 测验符合3 ：1 的分离。 转m 基因杨树中t _ d n a 上嵌合了新霉素磷酸转移酶基因( 坳f i i ) ，但是在杂交后 代中发生分离，交换率为2 7 。 本研究为转基因杨树的遗传改良方面的应用提供一定的参考依据，也为转基因 7 4 l 杨的应用和推广提供一定的理论依据。 关键词：有性杂交；转基因杨树；外源基因；遗传；表达 s t u d i e so nt h ei n h e r j t a n c ea n de x p r e s s i o no ff b r e i g ng e n e s i n i r a n s m i s s i o no fg e n e r a t i o ni n1 1 r a n s g e n i cp o p l a r a u t h o r ：d uj u a “ m a j o r ：f o r e 8 th e r e d j 母a n db r 。e d i n g s u p e r v i s o r ：p r o fy a n gm i n s h c n g a b s t r a c t s e x u a lh y b 瑚i z a t i o nw a ss t u d i e di nt l l i sa 币c l e ，c h o o s i n gt h ew h i 把p o p l a rc 1 0 n e s t r a n s f o r n l e dt w oi n s e c t r e s i s t a n tg e i l e s ra n da p dw h i c hh a dd i f f 打e i l tr e s i s t a l l t 嬲f b m a l e p a r e n ta n d8 4 kp o p l a rw h i c hh a dc h o i c e n e s sc h 盯t c ra sm a l ep a r e i l t ：i nt h ee n d ，w eh a d g o tc m s s b r e e ds m p t h ei n h e r e t a n c ea n de x p r c s s i o no ff b r e i 髓g e i l e s ( m a r k e rg em ) f i i a n db t o y ，一c ) a n dt h er e l a t i o n s h i po ft w of o r c i g ng e n e sw e f es t i l d i e dw i mm a t e r i a l so f d i f f 醯e l l tc m s s b r e e ds m p t h e o r yb 嬲i s 锄d 谢垂n a lm a t 耐a lt om el n i l i z a t i o no f 仃a i l s g e l l i c p o l a r 蛆dh i b d i z a t i o nw e r ep r o v i d c da c c o r d i n gt oe x p l o r i n gt l l er e g i l l a r i t y ，s t a b i l i t ya n d m er e l a t i o n s h i po f f o r c i g ng e n e s t h ep m g r e s sw a sa sf o l l o w 。d ： 1 w i t l lf i v ey e ；螽r so b 8 e i 、，a t i o nt ot h en a t u r ew h i t ep o l a rh y b r i d7 4 1 ( p o l a r7 4 1 ) ，t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tp o l a r7 4 1w a sl o w e rm 锄c l l i n e s ew h i t ep o l a ri nm n g el e n 垂h 、衔n g e t h i c k 、衔n g en u m b e ra n dc a p s u l en u m b c rp c rm e t 1 1 1 eo b s e n ，a t i o ni n d i c a t c dm a tt h e 衔n g co f c h i n e s ew h i f cp o l a rf e l lo f f5 1o b e 岛r em e yc r a z c dw i l 饥t h e yw e r er i p e a n d p 0 1 a r7 4 lf c l lo f r 7 0 一9 0 s ot h ep o l a r7 4 ld i dn o tn yg a r m l o u sb a s i c a l l y a n dr e d u c e dt l l e f e a s i b i l i t yo f g e n e t i c 幽f to f f b r e i 印g e n e s 乒e a t ly 1 1 1 et w oi n s e c t - r e s i s t a l l c eg c n e st r a n s f o 哪e dp o l a r7 4 19 0 ts e e dh 捌l y t h em a i n r e a s o nw a st h a tt l l e 锄b r ) 时o fc r o s s b r e e ds t o p p e d 粤- o w m i n ga n dd i s 印p e a r e da r e rt h r e e w e e k s 罂d w t l l nl e a dt o1 0 w e rs e e dr a t e ，a tt l l es a m et i m em o s to fm e 劬g ef d lo f r b e f o r e t h e yc r a z e dw h e nt l l e yw e r er i p e s ot l l ec m b r y or e s c u et e c h i l i q u e sw a s a i le 饪t i v em 武h o d t oc o n q u e rm es t 鲥io fo u t b r c dc m s s t h eo p t i m a lm e d i u mf o rc u l m r ci m m a t i l r ee n l b r y o w a sm s + 6 一b a 0 1 m l 2 t 1 l ee x p 嘶m e i l tp m v e dt 1 a tt l l e 岛l s t n e s sb u dm o t e di i l l ec u l t u r em e m u mw i m 5 0 m gl 1 k a nw a sab e t t e rc o u r s et of i l 仃a t e w ec o u l dd r a wac o n c l u s i o nt h a tm ec r o s s o 行p r i n gw h e m e ro rn o tt o c o n t a i nn c o m y c i np h o s p h o 岫s f 打a s ea c c o r d i n gt ot h e m d i c a t i o nc o n d i t i o no ft e n d e rs t e mi nc u l t u r em e d i 啪w i m5 0 l n gl 一1 k a n w es e l e c t e d4 1 o 行s p r i n gc l o n yo f5c r o s sc o m b i n a t i o nw h i c hg r o w mb e t t e r 柚du s e di tk a nr a d i c a t i o n f i l t r a t e t h er e s u l ts h o w e dm a td i dn o tf i tn l em e n d d sl a w ( 1 ：1 ) ；a n di nt l l eo 凰p f i n go f c r o s sc o m b i n a l i o np b l 8 4 kt h a tf i tm em c n d e l sl a w ( 1 ：1 ) ；a n di nm eo 凰砸n go f c r o s s c o m b i n a t i o np b 6 8 4 kt h a td i dn o tf i tm em e n d d sl a w ( 1 ：1 ) t h ev e r a c i 锣o f e x p e r i m e l l t ss h o u l db ev a l i d a t eb e c a u s eo f l i t ed o n y 3 1 1 1t l l i se x p 耐m e n t ，s e x u a lh y b r i d i z a t i o nw 勰s t u d i e d ，c h o o s i n g7 4 lp o p l a rw i 也t w o l n s e c t 。r e s l s t a n tg e n e sw h l c hh a dd i 行b r e n tr e s i s t a n ta st b m a l ep a r 肌ta n d8 4 k p o p l a rw h l c h h a dc h o i c e n e s sc h a r a c t e ra sm a l ep a r e n t ，a n di tg o t7 3c l o ny p 0 1 y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) t e c h n i q u ew a su s e dt oi n v e s t i g a t et h ei n h e r i t a n c ea i l de x p r e s s i o no ft h ef o r e i g i l g e sb t c j 4 c 锄d 仲f i io ft l l e7 3c l o n y n l er c s u l t ss h o w c dt h a tt l l es e g r e g a t i o nr a t i o o fp o s i t i v et on e g a t i v ep l a n ti nf lc o l o n yw a s1 7 0 ：lo ft l l ef o r c i 弘g e i l eb t c 砂埘c ， w h i c hd i dn o tf i tt h em e n d e l sl a w ( 1 ：1 ) b y t e s t m e a m 柚i l et h es e 孕e g a t i o nr a t i oo f p o s i t i v et on e g a t i v ep l a l l ti nt h ef lo f p b l ( w h oc r o s s e dw i l h8 4 kp o p l a r ) c o l o n yw a s l ：l o f t 1 1 e 南r e i g i lg e n eb t c 秒爿c ，w h i c hf i tt l l em e n d e l sl a w ( 1 ：1 ) b y t e s t ，a n dt h e s e 孕e g a t i o nr a t i oo fp o s i t i v et on e g a t i v ep l a l l ti nf lo fp b 6c o l o n yw a s2 4 3 ：lo ft l l e f o r e i 肛g e n eb t ( 砂j 爿c ，w h i c hd i dn o tf i tt h em e n d e l sl a w ( 1 ：1 ) b y t e s t p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) t e c h n i q u ew a su s e dc oi n v e s t i 鲥et h ei n h e f i t 锄c e a n de x p r e s s i o no f l ef o l 试驴g e n e 尬fi io ft l l e7 3d o n y 1 1 1 er e s u l t ss h o w c dt l l a tt l l e s e g r e g a t i o nr a t i oo f p o s i t i v e t on e g a t i v ep l a n t i nf 1c o l o n y w a s1 9 2 ：lo f t h e 确g n g e n e 研i i ，w h i c hd i dn o tf i tt h em e n d e l sl a w ( 1 ：1 ) b yr t e s t _ m e 锄w h i l em es c g g a t i o n r a t i oo fp o s i t i v et on e g a t i v ep 1 孤ti nt h ef lo fp b l ( w h oc r o s s e dw i t h8 4 kp o p l a r ) c o l o n y w a s l ：1o f t l l ef o r e i 印g e n e 研i i ，w h i c h 五t t h em c n d d sl a w ( 1 ：1 ) b y t e s t ，a n dm e s e g r e g a t i o nr a t i oo fp o s i t i v et on c g a t i v cp l 孤ti nf lo fp b 6c o l o n yw a s3 8 ：lo ft h e f o r e i 弘g e n e 印i i ，w h i c hd i dn o tf i tt h em e n d e l sl a w ( 1 ：1 ) b y t e s t t h et w o - o r e i 印 g e n 鼯b t 铆埘ca n d 仲f i i sn l es e g r e g a t i o n 枷oo f p o s i “v e t on e g a t 主v ep l a l l t i nn l e f i o f p b 6 ( w h oc r o s s e dw i t h8 4 k ) c o l o n yw a sn o t l ：1 柚da p p r o a c h e d3 ：1 ，w l l i c hf i tt h e m e n d d sl a w ( 3 ：1 ) b y 卫t e s t t - d n at a b l e dg c n eo fn e o m y c i np h o s p h o 仃a n s 妇船e 帅枷) i nb tt r a i l s g c n i cp o l 虬 b u tt l l ec r o s ss 印a r a t e i n gw a so c 饥盯c di no f 卸血ga n dm e c h 锄g er a t ew a s2 7 t h es 砌yp r o v i d e ds o m eb a s i sf o rt h ea p p l i c a t i o no ft r a n s g e n i ct c c l m i q u ei ng e n e t i c m e l i o r a t i o na n ds o m et l l c o r c t i c a lb a s i sf o rt l l e 印p l i c a t i o na n dp 叩u l 撕z a t i o no f 仃趾s g c n i c p o d l a r k e yw b r d s ：s e x l l a lh y b r i d i z a t i o n ；订a n s g e n j cp o p l a r ；f 0 1 d g ng e ；i n h c r i t a n c e ；e x p r e s s i o n 英文缩写词英文全名 6 b a b p b t c t a b d n a d n t p e b e d t a i a a i b a k a n m s n p t i i p c r p v p t r i s 缩略词表 a b b r e v i a t i o n 中文全名 6 - b e n z y l 锄i n o p u d n e 6 一氨苄基嘌呤 b a s ep a i r b a c i l l u st h u n 垂e i l s i s 氨基对 苏云金芽孢杆菌 c e t y l 啊m e 廿l y 砌m o n i 啪b r o m i d e溴代十六烷基三甲胺 d e o x ”u c l e o s i d ea c i d脱氧核糖核苷酸 d e o x y n u c l e o s i d et p h o s p h o s p h a t e脱氧核糖核苷三磷酸 e t h i d i u mb r o m i d e溴化已锭 e t h y l e n ed i 珊i n ct e t r a a c e t i ca c i d已二胺四乙酸 i n d o l e - 3 a c e t i ca c i d吲哚乙酸 i n d o i e b u t y r i ca c i d吲哚丁酸 卡那霉素 m u r a s h i g c s k o o gm e d i 啪m s 培养基 n e o m y c i l lp h o s p h o 锄s 胁s e新霉素磷酸转移酶 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 p o l y v i n g lp y r r o l i d o n e聚乙烯基吡咯烷酮 埘h y d m x y m e f l l l a m i n o m e l l l a i l o三羟甲基氨基乙烷 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑i 垦盘些盘堂或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：市乏焉 签字日期：1 如石年6 月 g 同 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解扭韭盔些盘鲎有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑些盔些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 啦绢 签字日期：1 如年月jg 日 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 导师躲和欲之 签字日期：五一彳年月汐日 电话 邮编 外源基闻在转基冈杨树 廿代传递问遗传及表达规律研究 1 1 转基因植物的安全性评价 1 引言 廿= 界主要发达国家和部分发展中国家都已制定了各白对转基因生物( 包括植物) 的管理法规， 负责对其安全性进行评价雨i 监控。如美国是在原有联邦法律的基础上增加转基因生物的内容，分 别由农业部动植物检疫局( a p h i s ) 、环保署( e p a ) 及联邦食品和药物局( f d a ) 负责环境和食品两个 方面的安全性评价和审批。由丁备国在法规和管理方面存在很大差异。特别是许多发展中国家尚 米建立相廊的法律法规，一些国际组织如经合组织( o e c d ) 、联合国工业发展组织( u n i d o ) 、粮农 组织( f a o ) 和世界卫生组织( w h o ) 等在近年来都组织和召开了多次专家会议，积极组织国际间的 坍调，试图建立多数国家( 尤其是发展中国家) 能够接受的生物技术产业统一管理标准和程序。但 由丁存在许多争议，目前尚未形成统一的条文。总体来说，英国和加拿大对转基因植物的管理较 为宽松。欧洲的消费者很难接受转基冈食品，欧共体国家对转基因植株的管理最严格，欧洲作为 商黼种植的转基因作物还很少。 1 1 1 国内外转基因植物的安全性研究 目前，人们就转基因植物人田释放的安全性及转基因食品的安全性问题己经展开了广泛的研 究，经过科学的实验设计和试验程序，并积累了足够的数据，根据这些数据来判断转基因植物的 田间释放昶吠规模商品化生产是否安全。但是受人们掌握知识的限制，对转基因产品进行全面准 确的安全性评估不是一什容易的事。可以说，生物安全和风险评估本身是一个进化过程，随着科 学的发展，生物安全的概念、风险评估的内容、风险的人小以及人们所能接受的能力都将发生变 化。与此同时，植物转化技术将不断在转化效率和精确度方面得到改进。因此，定期地利用新的 科学知识对安全性和潜在风险进行评价是非常必要的。 1 1 2 转基因植物的环境安全性研究 环境安全性是转基因植物安全性评价的一个重要方面。其核心问题是转基因植物释放到田 间，外源基因的散失及漂移。当前，有关转基因植物安全性的争论主要针对生态安全性和食品安 全性。环境安全性评价的主要内容有：转基因植物的生存竞争性；转基因植物成为杂草的可能性： 由丁花粉传播造成基因漂移到与之相同物种或近缘野生种的可能性；转基因植物对非靶生物的影 响，如对近缘野生种植物的影响、对土壤微生物区系的影响、转基因抗虫植物对有益昆虫的影响、 抗病毒转基因植物中发生病毒异源包装或异源重组的可能性、转基因植株的残渣对下一季作物的 影响以及转基因植物对生物多样性等生态环境的影响。 河北农业人学顽十学何( 毕业) 论文 1 1 t 3 转基因植物存在的潜在危险性 理论上说，转基因技术利常规杂交育种都是通过优良基冈重组获得新w - 种的，但常规育种的 安全性并未受到人们的质疑。其主要理由为常规育种是模拟自然现象进行的，基因重组和交流的 范围很有限，仅限r 种内或近缘种间。虽然传统的育种可能造成近亲繁殖以致抵抗力f 降的满在 危险，但千百年的经验证明这已被变成能接受的事实，并米带给人类灾难性的影响。而转基因技 术j i ! i j 不同，它可以把任何生物甚至人l 合成的基冈转入植物。j a c k s o n 【2 】等人研究表明，合成基冈 并不能表现累加效应而可能产生意想不到的后果，为了研制老鼠的避孕疫曲，提高老鼠的抗体水 平，科学家将一种化学物质i n t 甜e n k i n 4 导入老鼠体内，不仅没有提高其抗性，却使所有老鼠都死 亡。新基因的表达具有潜在的风险，白然界是一个复杂的系统，靶标昆虫取食转基因植物后义会 被高一级的消费者取食或利用，如果有不良作刚，此作川将被系统的非线性机制放大，其产生生 态后果是无法估量的。基于转基因植物的这一特殊性，使人们不得不而且也必须对转基因植物存 在的潜在危险性作出尽可能全面的估计。目前对其所具有的危害主要有以下几方面： ( 1 ) 破坏自然生态环境，打破原有生物种群的动态平衡 转基因植物释放到田问和野生物种或常规物种长期生存并形成一定的竞争关系，这一过程可 能导致以下结果：转基因植物有可能演变成农田杂草，植物获得新基冈后有可能增加其生存竞争 性，在生妖势、种子产量和生活力等方面比非转基冈植株强。若转基冈植物可以在自然生态条件 r 生存，势必会改变自然的生物种群，打破生态平衡：基阕可能漂流到近缘野生种，在自然生态 条件下，有些栽培植物会和周围生长的近缘野生种发生天然杂交，从而将栽培植物中的基因转入 野生种中”j 。 ( 2 ) 可导致过敏性和毒素的产生 有科学家认为，转基因植物由于不是由自然选择而来，所以“可能使一些产生毒素的物质返 回”有关人士认为应当避免从通常的致敏食品或已知能诱导敏感个体发生谷朊敏感性肠道疾病 的食品中进行基因转移，除1 f 有材料证实被转移的基因不编码致敏源与谷航敏感性肠道疾病有关 的蛋白。 ( 3 ) 使植物本身产生变异 美国自从1 9 9 4 年第一次批准延迟成熟的转基因西红柿上市以米，到1 9 9 7 年底，转基因植物 或产物已经出现了各种各样的问题。例如，孟山都公司培育的抗虫转基因棉花于1 9 9 6 年进行了 大规模的种植，但其中部分遭到失败，出现了大量存活的棉铃虫。该公司开发的另一种抗除草剂 草甘膦转基因棉花于1 9 9 7 年人规模种植，到秋季时，在棉花产区d e l t a 地区这种棉花在收获前人 量出现落铃或畸形棉桃。 ( 4 ) 对非目标生物造成伤害 转基因抗虫植物在种植前期有效的抑制了害虫的繁殖，但与此同时，也不同程度影响到专 性天敌的生存数量。有研究表明：草蛉、瓢虫捕食以转基因抗虫作物为食的害虫后，发育减慢、 存活率和发育率下降。美国的一种马利筋蛱蝶大量减少，经研究发现是这种蛱蝶在取食马利筋植 物时也误食了抗虫转基因玉米的花粉所致。因为玉米是风媒植物，一部分花粉也随风落到了玉米 地附近的马利筋植物上p j 。 ( 5 ) 对人体健康造成危害 2 外源基冈在转基因杨树世代传递问遗传及表达规律研究 转抗除草剂基冈牺物的出现增加了除草剂的人量使州，从而增加对环境的污染以及对人身体 健康的危害”j 。 ( 6 ) 产生新靛突变体 在鑫蘸条# ：f ，烈a 瘸毒毒籀当熟戆突嶷效率，突变俸戆不甄遽纯会导黧撬性靛丧失，在 p 琶b v 中戬褥证实。( t 郴c h 等1 9 9 5 ) ，繁转l l 等均发现转基躅水稻与米转基因东稻相隗，在株离、 穗长、花期、百粒熬和育性等方面都显莆降低m 。m o n s a n i o 公司开发了一种商品名为r 州n d u p r e a d y d 的抗除草剂革甘膦转基冈棉花，1 9 9 7 年第一年犬规模种植。划秋季时，在棉花产隧d e l t a 地这种转基调棉花谯收获前大量出现落铃溅畸形棉桃，面积达l + 2 而h m 2 。造成严重损失_ j 。 7 ) 生麴多# 性静丧必 获1 9 辨年截至1 9 鳃年6 茸，蓬癸惑准薅蝗扼瘴瓣熬蠢类转蒸闲穗耪己透粥秘，大短嚣l 盖 米是最主要的转基冈作物，1 9 9 9 年分剐占全球转基蹶作物种植面积的5 4 和2 8 ，棉花和油菜 籽各占9 ，1 9 9 5 年转基因作物的全球销倦颧为7 5 0 0 万荚元，1 9 9 6 年t e 前一年增长了2 储( 达 到2 3 5 亿美元) ，1 9 9 7 年又增长了2 倍( 达6 7 0 亿美元) ，1 9 9 8 年增长到1 6 4 亿美元。由嗡转基 闪植物所带来的巨大的经济剥蕊，是一些地隈溅国家盲日大量生产转基因植物，从而使物种趋予 擎一，生魏多嚣性蜓在受剿藏胁豫。 1 2 外源基因在转基因植物中的遗传与表达的研究进展 8 0 年代以来由于蕾组d n a 技术莆l 原生艘体融合技术的发展，实现了植物领域的遗传照组。 在禾谷类作物中，原擞质体和质粒的直接相甄佧删，以及原生质体掰生技术的改进为生产转蒸因 獯魏奠定了基撼。照饕转基溺技术戆窭现晕 溪爹发褒，农业生物技零避入了分子承平的发袋瓣期， 鞴时也标志着农洼靛戴有了新的育种手段。 植物转基因技术的发展异常迅猛。随箫锌种遗传转化技术的训立和改进，近几十年米，在许 多作物上都获得了转揍闲植株。从1 9 8 3 年荫例转基因( 烟草、马铃薯) 问世至今短短的1 8 年的时 间里，科学家们已在2 0 0 多种植物中实现了撼闲转移，其中包括水稻、小麦、玉米、棉花、大豆、 油菜、向日葵、甜菜、马铃薯、两红柿、烟苹和杨树等农作物和林本。转入基因的性状包括抗病 毒、撬缨蕴、抗奏蘩、撬蛊、撬豫摹裁、抗逆境、政受瑟覆f 蛋鑫矮、i 垂撵、磺瘩纯台豹 、攘整 不育、改变花琶花形、延熬傈鲜等。荠髓在 9 8 6 年透行了酋孰转鏊鞠俸物墨阉试验。1 9 辫年， 美国c a l g e i l e 公司研制的延熟保鲜转基因两缀柿在美国批准上市，成为发达国家批准商业化的第 一个转基因作物。随后，转基阕作物商品化种植面积和经济效益迅速扩大，其中以美国的发展最 为迅猛。 1 2 。 终嚣基因在转基闲攮物审戆蘧簧裘遮豹舔究 随着分子生物学的不断发展，转基因技术在植物中的应用己越来趟广泛。由于转基因技术比 传统的常规杂交育种技术有着十分明显的优势：通过转基因技术可以定向地改良作物，避免不理 想和不良性状的引入，使精确性得到了很大的提高；可以无限范尉地摇宽植物育种的种质疑源， 扶菜穆程裹上讲，转蒸闲接术可醢克驻远缘物静骞牲杂交不育的簿褥，孰 i 实现广泛豹逸缘杂交 3 河北农业人学硕十学位( 毕业) 论文 育种还可使育种室内外同时进行，缩短育种周： | | j ，提高育种效率，从而竹约人力、物力干财力， 减少农药使州，降低环境污染j 。 一般认为抗虫和抗除草剂植物是第代转基因植物。迄令为j r ，许多有应_ l j 前景的基闳已导 入植物中，并有转基冈植物已释放到人田应_ l l j ( c l l r i s t o u ，1 9 9 5 ；s o n g s t a de ta i ，1 9 9 5 ) 。在林木遗 传育种上，自1 9 8 7 年6 l l a t t i 利_ l _ j 基因一程技术首次成功地培育山杨树抗除草剂植株，至目前为 i r ，进行遗传转化的的树木有：杨树( 脚“船) 、按树( 眈c a 6 p 凇) 、核桃 础m 懈妇) 、刺槐( ，0 6 折缸 芦c “如口c 缸0 、麻栎( q “p m w 口c “船拥口) 、恺木口如口c h m f n a 船) 、苹果( 如，卿“m 妇) 、李( p m m u 肋比如) 、称猴桃以c 砌f f 口c f h m s 括) 、鹅掌揪犯洲。如，曲c l n e m p ) 、胶皮枫香树犯由“胁砌口r s 妒c 驰埘) 、火炬松( 尸伽心地c 幽) 、花旗松( 觑“出打昭口c 月= 蛔f f ) 、辐射松m d 胁船) 、落叶松犯d r 扭) 、 欧洲赤松v 口、自云杉( n c g 缸“c 口) 、威云杉僻口6 胁) 、木麻黄( c a 5 “一n d ) 等2 0 余种。 但真正获得转基因植株有杨树、落叶松、核桃、李和苹果等”。 因此，在植物的遗传改良方面，转基因技术正发挥着越来越重要的作用。但是这一新的技术 能否成为一种行之有效的遗传改良手段，在很大程度上取决于引入的外源基因能否稳定地表达和 遗传。本文就有关外源基因在转基因杨树杂交后代中的表达与遗传及其影响因素的研究作一简 述。 1 2 2 外源基因在转基因植株中的表达与遗传 外源基因在转基因植株中的表达与遗传规律一般从表型传递，标记基因的表达及分子杂交分 析等方面进行研究。关于基因的遗传规律早在1 9 5 6 年b m u n 就已证明，n o p a l j n e 型t i 质粒农杆菌 侵染植物组织后产生的冠瘿瘤细胞中带有t - d n a ，它能形成畸形瘤或称异常芽，因此具有形态发 生的潜力，这此异常芽在所嫁接的烟草植株上可以正常的开花结果。其自交f 。后代仍带有胭脂碱 n 叩a l i n e 基因，所以t - d n a 是可以遗传的。1 9 8 4 年h o r s c h 首次利垌农杆菌t i 质粒将外源基因 导入烟草获得成功。随后在短短的数年时间内，转基因工程的研究取得了突破性的进展，已经在 l o o 多个物种上获得了转基因植株( 博荣昭等，1 9 9 4 ) 。但是，随着各种植物遗传转化体系的建立， 人们逐渐认识到外源基因整合的多样性其相应的表现为表达和遗传的复杂性。外源基因通常以 质粒为载体，通过d n a 重组，随机地整合到受体染色体d n a 上，所以质粒d n a 在受体染色体 上的存在方式会直接影响到外源基因在受体染色体中存在的完整性及拷贝数，进而影响到其表达 和遗传的稳定性【13 _ “】。 1 2 2 1 外源基因在转基因植物中的遗传多样性 外源基因在后代中的遗传多样性通常采用转基因植株与非转基因植株杂交或转基因植株自 交结合s o u m e n lb l o i i i n g 来分析外源基因在后代中的遗传。一般来说，外源基因大多表现单显性 基因遗传，遵循孟德尔分离规律。( p e n g 甜耐1 9 9 2r i c e ) 、( p o 时k u s 甜n ，1 9 8 5 t o b a c 0 0 ) 、( f r o m m “口j 1 9 9 0c o m ) 、( s h i a m o t o “口9 8 9r i c e ) 、( 李燕娥等1 9 9 8 ，黎垣庆等1 9 9 9 ，吴明国1 9 9 9 ，王忠华 等2 0 0 0 ，s a c h s e s e t 甜口，1 9 9 8 1 。 外源基因通过花粉的传递力低于通过卵细胞传递力。花粉对外源基因的传递能力很弱甚至于 不传递，原因可能是转基因植株花粉的发芽力、花粉管伸长能力与受精能力比非转基因植株的花 粉要差，也可能是转基因插入到影响花粉活力的基因位点上( w a l t e 1 9 9 2 、z l l a n g1 9 9 6 、u 1 j a n1 9 9 4 、 4 外源基冈“：转基冈杨树i u ：代传递间遗传及表达规律研究 r e g i s t e ri t i1 9 9 4 、c h r i s t o u1 9 8 9 、w a l t e r l 9 9 2 ) 。 植物遗传转化中，一般转基冈植株后代d n a 中整台有外源基网时，s o u t l l e m _ b l o l i i n g 杂交图 谱与转基冈当代植株完全一致( p g “d 9 9 5 ，c a o 甜口f 1 9 9 2 ，c o o l e y 甜口9 9 5 ，s p e n c e r 甜口， 1 9 9 2 ) ，表明外源基冈整合在同一条染色体上。但由于转基冈的基冈丢失、基闻重组和基因扩增等 现象，导致同一转基冈株系的后代中外源基冈杂交剀谱发生变异( s r i v a s t a v a “d 9 9 6 ) 。其中基冈 丢失可能会是影响转基冈技术实_ l | j 化的重要障碍。c h o 在1 9 9 9 年研究转基因人麦时发现加厂基 冈在七个由玉米u k q u i c i n 作为启动子的转基冈品系中表达并稳定传递到t i 代，然而，人多数品 系中n 表达在t ，代和以后世代逐渐丧失。s r i v a s i a v a 在1 9 9 6 研究转基冈小麦晶系时观察到在 入个转基冈小麦品系中，6 口r 基冈在无个晶系中能稳定表达并遵循单显性基冈的孟德尔遗传分离 规律，只有一个小麦转化鼎系2 b 2 在凡代丢失了6 口r 基冈利“姒副基因，可能是在基冈组上的 一定位点不适合外源基因的遗传整合【l ”。 1 2 2 2 外源基因在转基因植物后代中的表达 外源基因在转基冈植物中的遗传与表达直接影响到转基阅植物的麻用，而基冈沉默是转基因 作物中普遍存在的一种现象。基因沉默首先在农杆菌介导的转基因烟草中发现的( p o 仃y k u s 酣口， 1 9 8 5 ) 。随后在多种佧物中都发现了基冈沉默的现象( r e g i s t e r i i i 甜口，1 9 9 4 玉米) 、( w a na n d k a x 1 9 9 4 人麦) 、( s c h u h “d 9 9 3 ：k u m p a t i a “d 9 9 7 水稻) ，这些结果表明：外源基因的沉默将成为 影响植物基闶l ：科麻_ l i 的一个滞在问题。基冈枪羊农杆菌介导是植物遗传转化中晟常用的两种方 法，通过基冈枪转化可产生l - 2 0 个拷贝；通过农杆菌介导转化多为单拷贝或低拷贝，结果是通过 基因枪转化获得转基冈植株沉默的机率大于农杆菌介导的转化的机率。 近儿年来，人们对转基因沉默的研究发现外源基因沉默主要发生在西个阶段：即转录水平上的 失活( t r a n s 嘶p r i n 0 1 1i n a c t i v i a n o n ) 雨l 转录后共抑制( p o s t - h s c r i p t i o n a lc o s u p r e s s i o n ) ( p g 酎口f 1 9 9 0 ；p e n g 甜d 9 9 5 ) 。主要表现在d n a ，d n a 、d n a r n a 、i a r n a 的相互作用上，其中也可 能存在蛋白质的参与( m a i o r i a 甜口，1 9 9 5 ) 。引起基因沉默的原冈包括基因拷贝数、位点效应、外 源基冈的结构、外源基因在染色体上的存在方式、特殊碱基序列、转化质粒、共抑制、基因重排 ( 在外源基因和宿主基因组上或靶位点侧翼上的点突变、微小缺失、复制所引起的k o h l ia 甜口， 1 9 9 8 ，t a l a n o 耐口，9 9 8 ) 、启动子及编码序列的甲基化等。m a q b o o l 认为基因拷贝数对外源基因的 表达只起很小的作用。i i l 耐b m c h t1 9 9 4 年在转基因烟草研究中发现甲基化是基因沉默的机理，并 且是转录后的基因调节。w s e n e g g e 等在1 9 9 4 年同样发现过量转录的r n a 导致的基因组d n a 的甲基化。与此相反，s r i v a s 协v a 在1 9 9 6 发现基因重排仅仅表现为杂交模式的变化，并没有影响 外源基因b a r 基因的表达。总之，甲基化和外源基因在植物细胞内的表达具有一定的相关性。至 于甲基化是原因还是结果，还有待进一步的研究【i 。 迄今为止，研究基因沉默现象往往针对某外源基因而言，研究较多的是遗传转化中的非筛 选基因( u n s e l e c l e dt m n s g e ) ，研究内容多为引起基因沉默直接原因的分析。有研究表明：抗壮观 霉素转基因绿藻细胞有丝分裂后代中，在壮观霉素的连续筛选下，能提高细胞中外源基因的表达 稳定性，如果撤去壮观霉素的筛选作用，则容易发生转基因的镶嵌失活现象( c e m i l