（水生生物学专业论文）微囊藻毒素对哺乳动物和鱼类线粒体毒效应的研究.pdf

微囊藻毒素对哺乳动物和鱼类线粒体毒效应的研究 摘要 线粒体是维持细胞正常结构和功能的重要细胞器，因此很容易遭受各种毒素的 侵害。目前，微囊藻毒素( m c s ) 对动物机体影响的研究较多集中在组织、细胞和 分子水平，对亚细胞器的研究较少。本文系统的研究并比较了m c s 对哺乳动物( 家 兔) 和鱼类( 鲫) 两种不同类群动物线粒体的影响，分别从线粒体超微结构的病理 变化、生理生化重要酶系和线粒体的氧化应激等方面探讨了m c s 对线粒体的毒作用 机制。目前，机体的氧化损伤和细胞凋亡被认为是m c s 的主要毒作用途径，而线粒 体在机体的氧化损伤和细胞凋亡或死亡的过程中有着关键性的作用。因此，本文从 组织的氧化损伤研究开始，通过比较m c s 对两种不同类群动物线粒体的毒效应及同 一动物不同组织的线粒体对m c s 生化响应的差异，探讨并归纳了线粒体损伤在m c s 诱导细胞毒性中的可能作用机制，为探讨m c s 的致毒机理提供进一步的参考依据。 主要结果如下： 1 ) 试验表明，m c s 能够引起两种动物肝组织的急性氧化损伤，即s o d 、c a t 、g p x 和g r 抗氧化酶活性都有明显的变化并伴随着脂质过氧化水平( l p o ) 的显著升 高，然而两种动物肝脏的主要抗氧化酶系对m c s 的生化响应明显不同：家兔各抗 氧化酶指标与对照组相比明显降低而鲫则明显升高，说明不同动物类群对m c s 的毒效应有其自身的响应和抵御机制；在m c s 对家兔的亚急性试验中，我们对家 兔腹腔注射2p g k gb wm c s 2 4h ，分别在7d 和1 4d 发现，超低浓度m c s 持续染 毒也能引起家兔肝、肾和脑不程度的氧化损伤，只是s o d 、c a t 、g p x 和g r 在不 同组织中的响应不同，说明即使是超低浓度的m c s 也会对动物产生一定的损伤且 不同组织对m c s 的毒效应有其不同的适应和补偿性机制。 2 ) 在家兔的体内试验中，我们对家兔腹腔注射1 2 5 和5 0l 上g k g b w 剂量的m c s 粗提液 后，分别在1 、3 、1 2 、2 4 、4 8h 检测了肝脏和心肌线粒体的毒效应情况。试验表 明，m c s 诱导了线粒体超微结构的改变和明显的脂质过氧化损伤，且高浓度组 m c s 毒效应表现出不可恢复性特征。同时m c s 改变了线粒体呼吸链酶复合物 n a d h 脱氢酶和琥珀酸脱氢酶( s d h ) 活性以及影响了n a 十k + a t p 和 c a 2 + _ m 9 2 + a t p 酶的活性，随之可能导致线粒体离子平衡的破坏而引起线粒体膜 电位( m m p ) 的丧失。因此，本试验表明m c s 对肝脏和心肌线粒体均有明显的 损伤作用。不同的是，m c s 对肝脏线粒体的影响明显比心肌的严重，且低浓度 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 m c s 对肝脏线粒体的损伤作用随着染毒时间的延长有一定的恢复现象。 3 ) 在m c s 对鲫肝线粒体的毒效应试验中，腹腔注射5 0 和2 0 0g g k gb w 剂量的m c s 粗 提液后，分别在1 、3 、1 2 、2 4 、4 8h 检测了m c s 对肝脏线粒体的毒效应情况，发 现，鲫肝线粒体超微结构、线粒体呼吸链酶复合物及a t p 酶等重要生理生化酶系 也发生了明显的变化。与家兔肝线粒体损伤情况相比，发现：两种动物线粒体超 微结构的变化规律一致；然而两种动物重要酶类对m c s 的响应具有明显差异，鱼 类线粒体各种指标在m c s 作用下均明显低于对照组水平，具有一定的同一性和规 律性，而n s l 动物线粒体对m c s 的响应情况则更为复杂多变；而且，随着m c s 染毒时间的延长，鲫肝线粒体损伤从整体上表现出了更好的恢复性特征。 综上所述，m c s 对不同种类动物线粒体和同种动物不同组织线粒体有着不同的 毒效应机制。然而，不管是何种情况，m c s 诱导的线粒体损伤是其对细胞毒性作用 的机制之一。我们认为，m c s 毒作用的线粒体途径，一方面通过线粒体损伤，产生 大量的r o s 引起组织抗氧化系统的破坏，而对机体产生危害；另一方面，m c 可能通 过影响线粒体的呼吸链和磷酸化系统，使细胞能量和相关代谢发生紊乱，并通过氧 化损伤作用破坏线粒体的离子平衡等功能而最终诱发细胞凋亡程序的发生，对细胞 产生毒作用。 关键词：微囊藻毒素；哺乳动物；鱼类；线粒体；抗氧化酶；超微结构；呼吸链酶 复合物；a t p 酶 微囊藻毒素对哺乳动物和鱼类线粒体毒效应的研究 a b s t r a c t m i t o c h o n d r i aa r ek n o w nt ob ev u l n e r a b l et a r g e t so fv a r i o u st o x i n sb e c a u s eo ft h e i r i m p o r t a n tr o l ei nm a i n t a i n i n gc e l l u l a rs t r u c t u r e sa n df u n c t i o n s s of a r , t h es t u d i e so ft h e e f f e c to fm c st od i f f e r e n tk i n d so fa n i m a l sw e r ef o c u s e do nt h el e v e l so ft i s s u e ，c e l la n d m o l e c u l eb u tl i t t l eo nt h es u b - c e l l u l a rf i a c t i o n s i nt h ep r e s e n ts t u d y , w es y s t e m i c a l l y l e a r n ta n dc o m p a r e dt h ed i f f e r e n te f f e c t so fm c so nm i t o c h o n d r i ai nt w ok i n d so fa n i m a l s ， r a b b i ta n dc r u c i a nc a r p ，r e p r e s e n t e dm a m m a l sa n df i s hr e s p e c t i v e l y t h ec h a n g e so f m i t o c h o n d r i a lu l t r a s t r u c t u r e ，t h ee s s e n t i a lp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a le n z y m e sa n dt h e o x i d a t i v es t r e s si nm i t o c h o n d r i aw e r es t u d i e dt ol e a r nt h ep o s s i b l em e c h a n i s mo f m i t o c h o n d r i a ld a m a g ei n d u c e db ym c s r e c e n t l y ，i ti sc o n s i d e r e dt h a tm c sd a m a g ew a s r e l e v a n tw i t ho x i d a t i v es t r e s sa n dp r o g r a m m e dc e l ld e a t hc a l l e d a p o p t o s i s a n d m i t o c h o n d r i aw e r es u g g e s t e dp l a y i n gac r i t i c a lr o l ei no x i d a t i v es t r e s sa n da p o p t o s i s t h e r e f o r e ，b a s e do nt h er e s e a r c h e so fo x i d a t i v es t r e s si nt i s s u e s ，w es t u d i e da n d c o n c l u d e dt h er o l eo fm i t o c h o n d r i a ld y s f u n c t i o ni nm c - i n d u c e dc y t o t o x i ce f f e c t st h r o u g h c o m p a r i n gt h ed a m a g eo fm i t o c h o n d r i ai nd i f f e r e n to r g a n sa n di n t h es a m eo r g a no f d i f f e r e n ta n i m a l st oc o n t r i b u t et h ef u r t h e rd i s c u s s i o nt ot h ep o s s i b l em e c h a n i s mo ft h e m c st o x i ce f f e c t s 1 ) t h ea c u t er e s e a r c h e si n d i c a t e dt h a tm c sc o u l di n d u c et h eo x i d a t i v es t r e s si nl i v e ro f t w ok i n d so fa n i m a l s t h es t u d ys h o w e dt h a tt h ea c t i v i t i e so fs o d ，c a t , g p xa n dg r w e r ec h a n g e da sw e l la sl p ol e v e lo b v i o u s l yi n c r e a s e da f t e rm c s e x p o s u r e h o w e v e r , w ef o u n dt h a tt h e r ew a sad i f f e r e n t r e s p o n s ei na n t i o x i d a t i v ef u n c t i o ni nt w oa n i m a l s ： t h ea c t i v i t i e so fa n t i o x i d a n te n z y m e si nl i v e ro fr a b b i ts h o w e do b v i o u s l yd e c r e a s e d w h i l et h e yw e r ei n c r e a s e di nc r u c i a nc a r p t h i sm a yd u et ot h e i rd i f f e r e n tm e c h a n i s m o fr e s i s t a n c ei nd i f f e r e n ta n i m a l s o nt h eo t h e rh a n d ，i nt h es u b - c h r o n i cr e s e a r c h e so f m c s ，r a b b i t sw e r ei n j e c t e di p w i t he x t r a c t e dm c s ( m a i n l ym c r ra n d l r ) a t2 m c l r e q 肛g k gb wd o s e ，a n da f t e r7da n d14de x p o s u r e ，l i v e r , k i d n e ya n db r a i n w e r ea l ls h o w e do x i d a t i v ed a m a g ew i t hd i f f e r e n tr e s p o n s ei ns o d ，c a t , g p xa n dg r a c t i v i t i e si n d i c a t e dt h a te v e nal o w e rd o s a g eo fm c sc o u l di n d u c et h ed a m a g et o a n i m a l sa n dd i f f e r e n to r g a n sh a v et h e i ro w na d a p t i v ea n dc o m p e n s a t o r yr e s p o n s et o i i i 华中农业大学2 0 0 9 届硕：t 学位论文 t h et h r e a t s 2 ) w ee x a m i n e dt h et o x i ce f f e c t so fm c so nm i t o c h o n d r i ao fl i v e ra n dh e a r to fr a b b i ti n v i v o r a b b i t sw e r ei n j e c t e di p w i t he x t r a c t e dm c s ( m a i n l ym c - r ra n d - l r ) a tt w o d o s e s ，12 5a n d5 0m c - l r e q i t g k gb w ，a n dt h ec h a n g e si nm i t o c h o n d r i ao fl i v e ra n d h e a r tw e r es t u d i e da t1 ，3 ，12 ，2 4a n d4 8ha f t e ri n j e c t i o n m c si n d u c e dd a m a g eo f m i t o c h o n d r i a lm o r p h o l o g ya n dl i p i dp e r o x i d a t i o ni nb o t hl i v e ra n dh e a r t ，a n dt h e i n f l u e n c eo fh i g hd o s eo fm c si si r r e t r i e v a b l e m c si n f l u e n c e dr e s p i r a t o r ya c t i v i t y t h r o u g hi n h i b i t i n gn a d hd e h y d r o g e n a s ea n de n h a n c i n gs u c c i n a t ed e h y d r o g e n a s e ( s d h ) m c s a l t e r e dn a + 1 0 a t p a s ea n dc a 2 + _ m 9 2 + a t p a s ea c t i v i t i e s o f m i t o c h o n d r i aa n dc o n s e q u e n t l yd e m o l i s h e di o n i ch o m e o s t a s i s ，w h i c hm i g h tb ep a r t l y r e s p o n s i b l ef o rt h el o s so fm i t o c h o n d r i am e m b r a n ep o t e n t i a l ( m m p ) t h e r e f o r e ，i t w a so b v i o u st h a tm c sw e r eh i g h l yt o x i ct om i t o c h o n d r i aa n dw i t hm o r es e r i o u s d a m a g ei nl i v e rt h a ni nh e a r t a n dd a m a g eo fm i t o c h o n d r i ai nl i v e ri n d u c e db ym c s s h o w e dr e d u c t i o na st h ee x p o s u r et i m ep r o l o n g e di nt h el o wd o s eg r o u p 3 ) c r u c i a nc a r pw e r ei n j e c t e di p w i t he x t r a c t e dm c s ( m a i n l ym c - r ra n d l r ) a tt w o d o s e s ，5 0a n d 2 0 0m c l r e q g g k gb w ，a n dt h ec h a n g e si nm i t o c h o n d r i ao fl i v e r w e r es t u d i e di nv i v oa t1 ，3 ，1 2 ，2 4a n d4 8ha f t e ri n j e c t i o n i tw a ss h o w e dt h a tm c s o b v i o u s l yi n f l u e n c e d t h em i t o c h o n d r i a lu l t r o s t r u c t u r ea n da l t e r e dt h ee s s e n t i a l p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a le n z y m e ss u c ha sr e s p i r a t o r y c h a i ne n z y m e sa n d a t p a s ei nt h em i t o c h o n d r i ao fl i v e ri nc r u c i a nc a r p c o m p a r e dw i t hm i t o c h o n d r i a l d a m a g ec a u s e db ym c s i nl i v e ro fr a b b i t ，t h ec h a n g e so fm i t o c h o n d r i a lu l t r o s t r u c t u r e i nt w ok i n d so fa n i m a l ss h o w e dt h es a m e h o w e v e r ，t h er e s p o n s eo fi m p o r t a n t e n z y m e so fm i t o c h o n d r i ai nl i v e rs h o w e dv a r i o u si nt w oa n i m a l s t h ea c t i v i t i e so f t h e s ee n z y m e si nm i t o c h o n d r i ao fc r u c i a nc a r pw e r ea 1 1d e c r e a s e do b v i o u s l y c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lo n e s a n dt h ec h a n g e si nm i t o c h o n d r i ao fc r u c i a nc a r p s e e m e dm o r ei d e n t i c a la n dr e g u l a rw h i l em o r ec o m p l e xi nr a b b i t m o r e o v e r , t h e r e d u c t i o no fm i t o c h o n d r i a ld a m a g ei nl i v e ro fc r u c i a nc a r ps h o w e db e t t e rt h a nt h e s i t u a t i o ni nr a b b i ta st h ee x p o s u r et i m eo fm cp r o l o n g e d i nc o n c l u s i o n , m c sh a v es p e c i a lt o x i ce f f e c t st om i t o c h o n d r i ao fd i f f e r e n to r g a n so r t h es a m eo r g a ni nd i f f e r e n ta n i m a l s h o w e v e r ，n om a t t e rw h a tk i n do fo r g a n so ra n i m a l s i v 微囊藻毒素对哺乳动物和鱼类线粒体毒效应的研究 s t u d i e d ，t h ed a m a g eo fm i t o c h o n d r i ai sa p p a r e n t l yo n eo ft h ep o s s i b l em e c h a n i s m so f c y t o t o x i c i t yi n d u c e db ym c s o u ri nv i v os t u d i e si n d i c a t e st h a tm c sm a yd a m a g e m i t o c h o n d r i aa n di n d u c e da b u n d a n tr o sf o r m a t i o nw h i c hc o u l db r e a kt h ea n t i o x i d a n t s y s t e m ，c o n s e q u e n t l yc a u s e dd a m a g et oa n i m a l s o nt h eo t h e rh a n d ，t h et o x i ce f f e c to f m c sm i g h tb e t h r o u g hi n f l u e n c i n g t h em i t o c h o n d r i a l r e s p i r a t o r y c h a i na n d p h o s p h o r y l a t i v es y s t e m ，u l t i m a t e l yl e a d i n gt od i s r u p t i o no fc e l l u l a rb i o e n e r g e f i c sa n d m e t a b o l i s m ，a n dt h a tm c sp r o m o t e dr o sf o r m a t i o n ，w h i c hm i g h ta l s ob er e s p o n s i b l ef o r t h ec h a n g eo fi o nr e g u l a t i o ni nm i t o c h o n d r i a , c o n s e q u e n t l yl e a d i n gt om i t o c h o n d r i a l d y s f u n c t i o na n da p o p t o s i s k e yw o r d s ：m i r o c y s t i n s ；m a m m a l s ；f i s h ；m i t o c h o n d r i a ；o x i d a t i v es t r e s s ；m i t o c h o n d r i a l u l t r o s t r u c t u r e ；r e s p i r a t o r yc h a i ne n z y m e s ；a t p a s e v 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 a t p b c l 一2 d t t e d t a g s h h e p e s 缩略语表 a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e 三磷酸腺苷 b c e l lc l l l y m p h o m a2b 细胞淋巴瘤一2 d l d i t h i o t h r e i t o l二硫苏糖醇 e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 g 1 u t a t h i o n e还原型谷胱甘肽 n - - 2 - h y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e - - n - - e t h a n e - - s u l p h o n i c a c i d n ( 2 一羟乙基) 哌嗪n - 2 乙烷磺酸 m c l r m i c r o c y s t i n - - l r m c - - r r m i c r o c y s i t n - r r m d a m m p m p t n a d h p m s f r o s s d h t a c 微囊藻毒素l r 微囊藻毒素一r r m a l o n d i a l d e h y d e 丙二醛 m i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a l 线粒体膜电位 m i t o c h o n d r i a lp e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o n 线粒体膜复合孔 n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d e 苯甲基磺酰氟 r e a c t i v eo s y g e ns p e c i e s 活性氧 s u c c i n a t ed e h y d r o g e n a s e琥珀酸脱氢酶 t r i c a r b o x y l i ca c i dc y c l e 三羧酸循环 v i 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 舀 如需保密，解密时间年 月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研牲娩厶币币 帆2 同年6 月弓日 糊黼张叁昂曜翩签名姆 签名日期：2 砷年月弓日 签名日期：岬月弓日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 微囊藻毒素对哺乳动物和鱼类线粒体毒效应的研究 第一章文献综述 1 我国水体富营养化现状及危害 1 1 我国水体富营养化现状 由于工业化的发展，人类生产活动的不断加剧，大量有机污染物不断排入湖泊 并在其中不断积累，致使湖泊产生了富营养化现象。水体富营养化是指过量的氮磷 等营养性物质输入水体中，使水体中藻类以及其他水生生物异常过度繁殖，水体透 明度和溶氧下降，引起水质恶化，使水域生态和水功能受到阻碍和破坏。我国是一 个多湖泊国家，目前已有许多湖泊爆发水华，其面积、强度均在大幅度增长，造成 的环境和生物安全问题日益引起人们的关注。近2 0 年来，我国湖泊富营养化发展速 度相当快。调查结果表明，富营养化湖泊个数占被调查湖泊的比例由2 0 世纪7 0 年代 末至8 0 年代前期的4 1 发展到8 0 年代后期6 1 ，至2 0 世纪9 0 年代后期又上升到7 7 。 同样，根据对全国3 9 个大、中、小型水库的调查结果显示处于富营养状态的水库个 数和库容分别占所调查水库的3 0 8 和11 2 ，处于中营养状态的水库个数和库容分 别占所调查水库的4 3 6 和8 3 1 ( 金根东，2 0 0 8 ) 。此外，也有报道汉江，珠江， 长江上游的香溪河等部分河流水域发生不同程度的富营养化现象。可见，我国水体 的富营养化的发展趋势十分严峻。 1 2 水体藻毒素污染及流行病学调查 蓝藻由于其在水体富营养情况下的异常增殖能力和特有的种间竞争优势成为富 营养化水体中水华的主要种类，蓝藻水华( w a t e rb l o o m ) 的爆发严重影响了水体的 水质及鱼类和其他水生生物的大量死亡。除此之外，蓝藻水华所产生的藻毒素污染 己成为全球关注的环境问题。藻毒素是藻类次生代谢产物，会随着藻细胞的死亡破 裂而释放到水体中。世界各地发生的水华所造成的藻毒素污染常常是以各种构型的 微囊藻毒素( m i c r o c y s t i n s ，m c s ) 为优势毒素。目前对我国南北几个省市的各种水样 的监测显示，各水体都有不同程度的m c s 污染，其中以沟塘水、河水和水库水最为 严重( 陈刚等，1 9 9 6 ；狄留妹，2 0 0 2 ) 。陈刚等( 1 9 9 6 ) 在原发性肝癌高发地区江 苏海门等地的许多沟塘中检出大量的微囊藻毒素，河水和沟塘水中检出的m c s 最高 华中农业大学2 0 0 9 届硕上学位论文 分别达1 5 5 8p g m l 和3 0 0p g m l 。除在污染水体中检测到m c s 外，研究发现长期暴露 于m c s 的鱼类、虾、蟹体内也出现了微囊藻毒素的生物富积( w i l l a m se ta 1 ，1 9 9 7 ； m a g a l h 五e se ta 1 ，2 0 0 1 ，2 0 0 3 ) ，淡水鱼类、虾、蟹等水产品是人类食物资源的重要组 成部分，提示了藻毒素可以在生物链中富集，并有可能通过食物链威胁人类健康。 流行病学研究表明，m c s 可引起野生动物和家畜中毒，其症状包括虚弱、皮肤 苍白、过冷等，严重的可引起肝大出血及肝坏死，使动物因呼吸阻塞而死亡。m c s 同样也危害人类健康。人们直接接触含有毒素的水华，如在湖泊、河流、水库中进 行游泳等娱乐活动会引起皮肤、眼睛过敏、发烧、疲劳以及急性肠胃炎，如果经常 暴露于含有毒素的水体会引发皮肤癌、肝炎及肝癌。有关m c s 直接导致人类中毒的 首次报道见于1 9 9 6 年在巴西发生的一起医疗事故( p o u r i ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。1 9 9 6 年2 月， 巴西一血液透析中心因误用含藻毒素污染的水给病人做肾透析，结果造成1 2 6 人出现 了急性或亚急性肝中毒症状，其中有6 0 人因肝衰竭而死亡。 研究表明，饮用水源中的m c s 污染与肝癌的发病率具有相关关系。俞顺章等 ( 1 9 9 5 ) 对东南沿海肝癌高发区，肝癌与饮用水中m c s 的关系进行研究，证明沟塘 水中以m c s 为代表的藻类毒素是致肝癌的促癌剂。u e n o 等( 1 9 9 6 ) 和陈刚等( 1 9 9 6 ) 对我国肝癌高发区海门和抚绥地区的原发性肝癌病因学研究表明，饮用水源水中藻 毒素尤其是m c s 含量与原发性肝癌的发病率呈正相关。杨坚波等( 2 0 0 4 ) 发现饮用 水m c s 污染与渔民肝脏血清酶的增高可能存在一定的联系。陈艳等( 2 0 0 2 ) 的研究 结果表明，太湖地区饮用水m c s 污染与小学生肝功能损害之间具有相关关系。 2 微囊藻毒素的一般概况 2 1m c 的化学结构及理化性质 目前普遍认为m c s 是一类具有生物活性的单环七肽化合物( c a r m i c h a e l ，1 9 9 4 ) ， 主要由淡水藻类铜绿微囊藻( m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a ) 产生，它的产生受到藻类的遗 传和环境因素共同作用。一般结构为：环( d 丙氨酸l x 赤- 1 3 - d - 甲基天冬氨酸 l z a d d a d 异谷氨酸n 甲基脱氢丙氨酸) ，其中a d d a ( 3 氨基9 一甲氨基2 ，6 ， 8 三甲基1 0 苯基6 一二烯酸) 是特殊的2 0 个碳原子的氨基酸，x 、z 为两种在2 、4 位 上可变的l 氨基酸。由于x 与z 的不同及甲基天冬氨酸( m e a s p ) 和n 甲基脱氢丙氨 酸( m d h a ) 的甲基化去甲基化产生的差异，可以形成多种不同的异构体。目前己从 2 微囊藻毒素对哺乳动物和鱼类线粒体毒效应的研究 不同的微囊藻菌株中分离、鉴定了近8 0 多种微囊藻毒素结构( d a w s o n ，1 9 9 8 ；s i v o n e n a n dj o n e s ，1 9 9 9 ) 。存在最普遍、含量较高、毒性较大的是m c l r 、r r 和y r ，其中 l 、r 和y 分别代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸。m c s 的一般结构如图1 所示。m c s 性质 较为稳定，煮沸后不失活，不挥发，抗p h 变化，可溶于甲醇或丙酮。m c s 极易溶解 于水，在水中的溶解度达l l 以上，不易沉淀或被吸附于沉淀物和悬浮颗粒物中。 2 2m c 的毒性研究 2 2 1 肝毒性 图i 微囊藻毒素的结构 f i g u r e1 s t r u c t u r eo fm i e r o e y s t i n s f a l c o n e r 等( 1 9 9 2 ) 研究发现，肝细胞膜上的胆汁酸转运系统是毒素进入细胞的 中间载体，在体试验结果表明，经同位素1 4 c 标记的m c l r 经腹腔注射小鼠染毒1m i n 后，肝脏检测出的微囊藻毒素占总量的7 0 ，3h 后肝脏中微囊藻毒素的量增加到总 量的9 0 ，表明肝脏是m c l r 分布的首要靶器官( b r o o k se ta 1 ，1 9 8 7 ) 。而用m c s 经腹腔或静脉注射染毒大鼠( r a t t u sn o r v e g i c u s ) 和小鼠( m u sm u s c u l u s ) 实验证明 肝脏也是受损最严重的器官，急性中毒主要症状表现为肝脏肿胀、瘀血、肝体比重 增加及一系列酶学变化，超微结构显示肝细胞骨架破坏，肝脏出血坏死( b e a s e l ye ta 1 ， 2 0 0 0 ) 。血清酶学表现主要是谷丙转氨酶( a l t ) 、谷草转氨酶( a s t ) 和乳酸脱 氢酶( l d h ) 泄漏、谷氨酰转肽酶( g g t ) 和碱性磷酸酶( a l p ) 升高( y o s h i d ae t a 1 ，1 9 9 7 ) 。光镜下可见肝窦状血管破坏、血窦内皮损伤、细胞间隙增大，电镜下肝 细胞超微结构发生改变，粗面内质网发生折叠、线粒体脊膜扩张、胞质空泡样变、 浆膜反折、细胞内器重新分布，肝细胞坏死融合成带，出现桥接样坏死( m i u r ae ta 1 ， 3 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 1 9 9 1 ) 。在m c s 的亚急性和慢性动物实验中，肝组织也可出现类似急性中毒的组织 学和酶学改变，且同样存在时间剂量反应关系。同时在毒素的长期慢性作用下， 肝组织呈现炎性样变化，症状表现为中央小叶区被淋巴细胞、巨噬细胞、嗜中性粒 细胞浸润，纤维化，细胞凋亡及脂肪样变( g u z m a na n ds o l t e r ，1 9 9 9 ) 。研究证明， m c s 是一种强烈的肝脏肿瘤促进剂。胡志坚等( 2 0 0 2 ) 通过建立m c s 促肝癌动物模 型研究表明，m c s 可显著增加大鼠肝癌前指标y 谷氨酰转肽酶( y g t ) 的阳性率 和上调肝癌前病灶的主要凋亡抑制基因b c l 2 的表达，同时可下调促细胞凋亡作用基 因b a x 的表达。 2 2 2 肾毒性 动物体内注入m c 后，除肝脏外，肾脏中m c 含量也较高。进一步的放射性自显 影研究显示，进入肾脏的m c 主要定位于肾皮质区域内的肾细胞核内( 张占英等， 2 0 0 2 ) 。b h a t t a c h a r y a 等( 1 9 9 7 ) 给大鼠腹腔注射m c ，发现血中尿素和肌酸水平升 高，白蛋白含量下降，随后尿中出现血红素、蛋白、胆红素，而肾脏乳酸脱氢酶及 谷草转氨酶下降，提示m c 具有肾毒性。m i l u t i n o v i 6 等( 2 0 0 3 ) 研究表明，m c 能使 肾小球的毛细血管簇遭到破坏，肾小球、近曲小管和远曲小管的管腔扩大，并且管 腔中有大量的红细胞，近曲和远曲小管的上皮细胞脱落到管腔内或消失，许多管状 上皮细胞的细胞质中出现液泡，胞间隙中有淋巴细胞浸润。用离体肾灌注系统研究 表明，m c 改变了肾的灌注压、肾血管阻力、肾小球滤过率等一些功能指标( n o b r ee t a 1 ，1 9 9 9 ) 。 2 2 3 遗传毒性 国内外学者对m c 的遗传毒性在不同水平上进行了测试，短期生物测试女i a m e s 试验大都显示出阴性结果，表明m c 不引起碱基突变。m a n k i e w i e z 等( 2 0 0 2 ) 用 e s c h e r i c h i ac o l ip q 3 7 做紧急呈色测验( s o s ) ，用人淋巴细胞做慧星测试。结果发 现，微囊藻提取物能引起淋巴细胞d n a 的破坏且在染毒1 2h 后达到顶峰。在染色体 水平，m c 可明显提高叙利亚地鼠( c r i c e t i d a e ) 胚胎细胞微核率的形成，并呈一定 的剂量反应关系( 王红兵和朱惠刚，1 9 9 5 ) 。据分析，上述实验结果的差异可能是 由于所用m c 的纯度不同所引起( 施玮和朱惠刚，2 0 0 3 ) 。目前较多学者认为纯毒素 不具有致突变性，对d n a 不会造成直接损害，但由于m c 进入细胞是一个主动转运 4 微囊藻毒素对哺乳动物和鱼类线粒体毒效应的研究 的过程，而目前尚不清楚检测体系中所用大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 是否具有主动 转运m c 的功能，所以尚不能确定纯毒素是否具有致突变性。 2 2 4 其他毒性 有研究显示，m c 是一种潜在的致心脏病的成分。研究人员在m c 中毒的大鼠中 观察到一持续快速的心脏输出量和每搏输出量的减少、血管扩张、周围血管发生低 血压反应、心率下降以及多巴胺和异丙肾上腺素分泌等血液动力学改变及其引起的 激素分泌( l e c l a i r e ，1 9 9 5 ) 。另外，张占英等( 2 0 0 2 ) 给孕鼠妊娠第6 天起连续1 0 天腹腔注射m c l r 。结果发现，不同剂量的毒素( 4 6 2i t g k g ) 均可损伤胎盘屏障， 整个胎盘细胞变性、水肿和间质疏松。毒素通过胎盘屏障进入胎鼠体内，影响胚胎 的形成和发育，导致胎鼠发育畸形或脏器发育不良及损伤，且随着染毒剂量的增高， 畸胎发生率也随之增高。m c 还会对其他器官和系统造成一定的损伤，如对小鼠的免 疫功能产生明显的影响。涉及到免疫系统基因和分子的多层次、多方面( 孙露等， 2 0 0 2 ) 。 3 哺乳动物和鱼类对m c 毒性的不同响应 人们在研究m c 毒性效应时，大多数研究选择了直接栖息生活于水体的鱼类和与 人类进化地位最为接近的哺乳类动物作为研究对象。然而，人们发现m c 对哺乳类动 物和鱼类的致毒效应并不一致。研究结果表明鱼类对m c 的敏感性比哺乳动物差，具 有更强的耐受性，腹腔注射m c l r ，鱼类l d 5 0 远远高于哺乳动物。对小鼠腹腔注射 m c - l r ，其l d 5 0 在2 5 1 5 0l x g k g b w ，一般认为5 0 - 6 0l x g k g b w ( 谢平，2 0 0 6 ) 。而鱼 类同样方式染毒，l d 5 0 远远高于小白鼠：鲤( c y p r i n u dc a r p i ol ) 腹腔注射m c - l r 的l d 5 0 ( 7d 试验) 为3 0 0 5 5 0p , g k g b w ( r a b e r g he ta 1 ，1 9 9 1 ) ；鲫腹腔注射m c - l rl d 5 0 为3 8 0 “e e x gb w ( b a l d i a e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。在巴西透析事件中死亡患者肝脏中m c 含量 平均为0 7 4 3 ( o 1 6 7 1 5 7 3 ) i t g k gb w ( c a r m i c h a e le ta 1 ，2 0 0 1 ) 而在荷= 、i j s s e l m e e r 湖 中胡瓜鱼( o s m e r u sm o r d a x ) 肝脏中的m c 含量高达8 7 4i _ t g & ga f d w 。后者比前者 肝脏m c 含量的最大值高出3 0 0 倍。 鱼类组织病理学研究表明，急性m c l r 中毒致鱼类死亡的机制与哺乳动物明显 不同。k o t a k 等( 1 9 9 6 ) 研究报道，腹腔注射m c l r 的虹鳟( o n c o r h y n c h u sm y k i s s ) 5 华中农业人学2 0 0 9 届硕七学位论文 虽然也出现肝肿大，但出血并不是其显著特征；虹鳟肝脏肿大可能主要起因于肝细 胞肿胀( h e p a t o c e