（分析化学专业论文）毛细管电泳电化学发光在药物检测方面的应用研究.pdf

摘要 在施加电场的作用下，一些带电物质在通过毛细管的过程中可实现分离，基 于这个原理，毛细管电泳可以用来检测许多物质，包括无机物和生物大分子( 如 d n a 和蛋白质) 。在过去的二十年里，毛细管电泳已成为一个强大和通用的分析 分离技术，它具有很多诱人的特征，譬如分辨能力强和需样品量少。现今，毛细 管电泳作为高效液相色谱的有益补充广泛地应用于日常分析。 电化学发光检测是一种特殊的化学发光，它的特别之处就在于光发射的产生 直接或间接地跟电极表面的氧化反应或还原反应相关，己成为一个灵敏的有价值 的检测工具。电化学发光检测技术由于其所用的仪器便宜、灵敏度高而且操作简 单，被认为是跟毛细管电泳联用的合宜检测手段。r u ( b p y ) 3 2 + 是发光效率最高、 实践最彻底和使用最广泛的电化学发光试剂。在一定电压施加下，它在工作电极 表面能被氧化成r u ( b p y ) 3 3 + ，而后通过和叔胺官能团相互作用以生成激发态的 r u ( b p y ) 3 ”，该激发态通过返回到基态可以释放出光子。 基于以上技术，本文开展了以下几个方面的工作： 1 把毛细管电泳和末端r u ( b p y ) 3 ”e c l 检测器有机地结合起来，用于盐酸 硫利哒嗪的检测。同时优化了影响电化学发光强度和毛细管柱效的因素，如进样 持续时间、进样电压、p h 值等。当盐酸硫利哒嗪浓度从2p m o l l 增加到8 0 0 i _ t m o l l 时，电化学发光强度随之呈线性增加。这个方法可以用于尿样中盐酸硫 利哒嗪的检测以及它的日常质量控制分析。 2 采用毛细管电泳电化学发光技术( c e 。e c l ) 测定了盐酸地芬尼多的含量。 电化学发光信号的强度在1 0 1 0 。6m o l l 到6 0 1 0 4m o l l 的盐酸地芬尼多浓 度范围内呈线性响应，检测限为1 0 1 0 7m o l l ( s 烈= 3 ) 。该方法成功地用于血 红素和盐酸地芬尼多相互作用的研究，测得其结合位点数和结合常数分别是1 1 2 和2 5 1 0 3l t o o l 。 3 构建r u ( b p y ) 3 2 + c n t n a f i o n 修饰电极并通过计时电流法来分析检测盐酸 地芬尼多。该方法简单且重现性好。该修饰电极可用于含有盐酸地芬尼多的药片 活性成分的分析检测。该修饰电极也可以应用于含叔胺官能团的其它化合物的分 析检测。 关键词：毛细管电泳；电化学发光；修饰电极；相互作用；r u ( b p y ) 3 2 + i i 量竺篁皇鎏皇丝耋垄垄壅塑竺竺矍窑里墼罂星2 茎 a b s t r a c t d u r i n gt h e l a s tt w od e c a d e s ，c a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i s ( c e ) ，b a s e do nt h e s e p a r a t i o no fc h a r g e dm o l e c u l e st h r o u g has m a l lc a p i l l a r yu n d e rt h ei n f l u e n c eo fa n e l e c t r i cf i e l d ，h a se m e r g e da sap o w e r f u la n a l y t i c a ls e p a r a t i o nt e c h n i q u ef o rt h e d e t e r m i n a t i o no fn u m e r o u sa n a l y t e sf r o mo r g a n i cm o l e c u l e st om a c r o m o l e c u l e ss u c h a sd n aa n dp r o t e i n sw i t ha t t r a c t i v ef e a t u r e s ，s u c ha sh i g hr e s o l v i n gp o w e ra n ds m a l l s a m p l ev o l u m e n o w a d a y s ，i ti s u t i l i z e df o rt h ed a i l ya s s a y sa sa ne x c e l l e n t c o m p l e m e n tt oh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y e l e c t r o g e n e r a t e d c h e m i l u m i n e s c e n c e ( e c l ) d e t e c t i o n i sb a s e do nt h e c h e m i l u m i n e s c e n c ee m i s s i o nr e l a t e dd i r e c t l yo ri n d i r e c t l yw i t ho x i d a t i o n o r r e d u c t i o na ta ne l e c t r o d es u r f a c e i ti st r e a t e da sa ni d e a ld e t e c t i o nt e c h n i q u ew h i c h c a r lb ei n t e r f a c e dw i t hc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sb e c a u s eo fi t sh i g hs e n s i t i v i t y , s i m p l eo p e r a t i o na n dt h el o wc o s to fa p p a r a t u su s e d r u ( b p y ) 3 。+ i sc o n s i d e r e da st h e m o s t e f f i c i e n t ，t h o r o u g h l ye x a m i n e d ，a n dw i d e l yu s e d e c lr e a g e n t i tc a nb e o x i d i z e dt o r u ( b p y ) 3 ”o n t h e w o r k i n g e l e c t r o d eu n d e rc e r t a i n p o t e n t i a l s u b s e q u e n t l y ，r u ( b p y ) 3 3 + r e a c t sw i t ht h et e r t i a r ya m i n eg r o u pa n dt h e nc h a n g e st o t h ee x c i t e ds t a t er u ( b p y ) 3 2 “，w h i c hc a nr e l e a s el i g h tb yr e t u r n i n gt ot h eg r o u n d s t a t e t h em a i nw o r ko ft h i st h e s i si ss u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 as e n s i t i v em e t h o dc o m b i n i n gt h e c a p i l l a r ye t e c t r o p h o r e s i s a n dt h e e n d - c o l u m nr u ( b p y ) 3 2 + e c ld e t e c t i o nt od e t e r m i n et h i o r i d a z i n eh y d r o c h l o r i d ei s p r e s e n t e d f a c t o r st h a ti n f l u e n c eo nt h ee c li n t e n s i t ya n dt h ec o l u m ne f f i c i e n c y w e r eo p t i m i z e d ，s u c ha si n j e c t i o nt i m e ，i n j e c t i o nv o l t a g e ，a n dt h eb u f f e rp hv a l u e a n ds oo n w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no ft h i o r i d a z i n eh y d r o c h l o r i d ei n c r e a s e df r o m2 u mt o8 0 0p m ，t h ee c li n t e n s i t yi n c r e a s e dl i n e a r l y t h i sm e t h o dc a nb eu t i l i z e df o r t h ed e t e c t i o no ft h i o r i d a z i n eh y d r o c h l o r i d ei nu r i n ea n di t sr o u t i n eq u a l i t yc o n t r o l a n a l y s i s 2 c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i se l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e ( c e e c l ) s e p a r a t i o n s y s t e mw a se m p l o y e dt od e t e c td i f e n i d o lh y d r o c h l o r i d e al i n e a re c lr e s p o n s ef o r d i f e n i d o lh y d r o c h l o r i d eo v e rt h er a n g ef r o m1 0 1 0 6t o6 。0 1 0 。mw a s e s t a b l i s h e dw i t had e t e c t i o nl i m i to f1 0 10 m t h i sm e t h o dw a ss u c c e s s f u l l y u t i l i z e dt oi n v e s t i g a t et h ei n t e r a c t i o no fh e m o g l o b i nw i t hd i f e n i d o lh y d r o c h l o r i d e 1 l i 硕士学位论文 t h en u m b e ro fb i n d i n gs i t e sa n dt h eb i n d i n gc o n s t a n tw e r ec a l c u l a t e da s1i 2a n d2 5 l0 3m r e s p e c t i v e l y - ，3 t h er u ( b p y ) 3 2 + c n t n a f i o n m o d i f i e de l e c t r o d ew a sp r e p a r e da n da p p l i e dt o t h ea m p e r o m e t r i cd e t e c t i o no fd i f e n i d o lh y d r o c h l o r i d e t h i sm e t h o di ss i m p l ea n d r e p r o d u c i b l e t h e s e n s o rw a se m p l o y e df o rt h ed e t e r m i n a t i o n o ft h ea c t i v e i n g r e d i e n t si nt h et a b l e t sc o n t a i n i n gd i f e n i d o lh y d r o c h l o r i d e i t se v i d e n tt h a ts u c h k i n do fs e n s o rc a na l s ob eu s e df o rt h ed e t e c t i o no fo t h e rt e r t i a r ya m i n e - c o n t a i n i n g a n a l y t e s k e y w o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ；e l e e t r o c h e m i l u m i n e s e e n e e ；m o d i f i e d e l e c t r o d e ；i n t e r a c t i o n ；r u ( b p y ) 3 2 + i v 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立迸行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名：日期：秒力年柚2 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇 编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“、”) 作者签名： 【 聊签铹b 山厶乒2 年年 删押 期期 硬士学位论文 第1 章绪论 1 1 高效毛细管电泳及其特点 高效毛细管电泳【1 】( h i g h p e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，h p c e ) 是带 电粒子以电场为驱动力，在毛细管中按其淌度不同进行高效、快速分离的一种电 泳新技术。在广泛应用的毛细管区带电泳中，毛细管和电极槽内充有相同组分和 相同浓度的背景电解质溶液。样品从毛细管的一端( 称为迸样端) 导入。当毛细 管两端加上一定电压后，带电粒子便朝与其电荷极性相反的电极方向移动，由于 样品组分间的淌度不同，它们的迁移速度不同，因而经过一定时间后，各组分将 按其速度( 或淌度) 大小顺序，依次到达检测器被检出，得到按时间分布的电泳 谱图。用谱峰的迁移时间或类似于色谱学的术语保留时间作定性分析，按其谱峰 的高度或峰面积作定量分析。 由于毛细管具有良好的散热效能，允许在毛细管两端加上高至3 0k v 的高电 压，分离毛细管的纵向电场强度可达到4 0 0v c m 以上，因而分离操作可以在很 短的时间内完成，达到非常高的分离效率。因为毛细管内径很小( 一般小于1 0 0 l a m ) ，对内径5 0p m ，长度为5 0c m 的毛细管，其容积不足1 “l ，进样体积在 n l 级，样品浓度可低于1 0 一m o l l 。因此，h p c e 达到了仪器分析技术所要求的 高效、快速和样品用量少等最基本特点。此外，h p c e 还有容易自动化、操作简 便、溶剂消耗少和环境污染小等优点。正因为h p c e 技术具有如此诱人的优点， 使它在短短的几十年中，特别是在最近几年，受到分离分析科学家的极大关注， 成为生物化学和分析化学中备受瞩目的一个分离分析技术。 1 1 1 毛细管电泳的改革 毛细管电泳方法虽新，但历史久远1 2 】。以毛细管等速电泳的出现为起点可以 上溯到1 9 6 0 年代甚至更远【3 j ，但多数学者认为应该以毛细管区带电泳的出现为 起点，即便如此，其历史亦可上溯到1 9 6 0 年代中期【4 ，5 】。c z e 是瑞典科学家h j e r t e n 首先提出的 6 1 ，他用壁涂甲基纤维素的3m mi d 的石英管进行电泳分离，令管 子绕轴旋转以锐化区带。此法构思奇妙，可惜操作麻烦，难以实用。m i k k e r s 7 】 等于1 9 7 9 年，一方面从理论上研究了影响c z e 效率的电场聚焦现象，一方面在 实验上用2 0 0u mi d 的聚四氟乙烯管为分离通道，以区带电泳模式分离了1 6 种 有机酸。在外加电压作用下，样品从毛细管一端迁移到另一端，用u v 和电导检 测器在线检测，记录到类似色谱图的电泳谱图，获得了高的分离效率，这是c z e 发展史中的第一个重大突破。1 9 8 1 年，j o r g e n s o n 和l u k a c s 使用7 5u mi d 的熔 毛细管电泳电化学发光在药物检测方面的应用研究 融石英毛细管，用电迁移法窄带迸样，用灵敏的荧光检测，得到的理论塔板数超 过4 0 0 0 0 0 0 m 【3 】，这么高的分离效率是以前其它分离分析方法从未达到的，而且， 简单的计算表明，区带增宽仅仅来自样品的分子扩散。他们还进一步推论，如果 维持分子扩散是c z e 中区带增宽的唯一缘由。那么，生物大分子如蛋白质的分 离将会在短时间内获锝惊人的效率。他们十分成功的试验和异常出色的理论工作 轰动了分析化学界，引起了人们的巨大反响，成为毛细管电泳发展史上的一个里 程碑。1 9 8 3 年后，h j e r t e n 先后提出了毛细管凝胶电泳【9 】和毛细管等电聚焦【1 0 1 法， 它们不仅可以大幅度提高分离效率，而且可以实现自动化操作，便于定性、定量 工作。1 9 8 4 年t e r a b e 运用含s d s 胶束的缓冲液“电泳”分离中性组分【l “，从而建 成m e c c ( 胶束电动毛细管色谱) 。1 9 8 6 年，l a u e r 报道其在蛋白质c z e 中获得 了1 0 6 ，m 的极高分离效率 1 2 1 。这些激动人心的研究结果，掀起了关于毛细管电 泳研究的热潮，分析仪器厂商也同时卷入，随着商品仪器在1 9 8 8 年的迅速推出， 毛细管电泳开始了突飞猛进地发展。 1 1 2 毛细管电泳的分离模式 1 1 2 1 毛细管区带电泳 毛细管区带电泳1 1 3 , 1 4 】( c a p i l l a r y z o n e e l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 是指在毛细管 内进行的自由溶液区带电泳。它采用均一的、组成不因电场作用而发生变化的电 解质体系，通常是缓冲溶液作为背景电解质，其作用是为电流的产生提供介质， 建立恒定电场，并影响样品组分的有效淌度。c z e 可以实现阴阳离子的同时分 离，但是对中性组分无分离效果。它可用于多种蛋白质、肽以及氨基酸等带电离 子的分析。 1 1 2 2 毛细管等电聚焦电泳 众所周知，在电场作用下带电粒子将在电解质中作定向迁移，这种迁移和粒 子的荷电状况有关，对于与蛋白质类似的两性电解质分子而言，其荷电状况视介 质的p h 而异，在某一个p h 时，蛋白质分子的表观电荷数为零，通常将这一p h 值称为蛋白质的等电点，不同蛋白质的等电点不同。显然，如果此类分子处于 p h 和等电点一致的介质中而介质又不受电渗的推动，则迁移就停止进行。如果 介质内的p h 是位置的函数，或者说有一个p h 的位置梯度，那么有可能使不同 等电点的分子分别聚集在不同的位置上，不作迁移而彼此分离，这就是所谓的等 电聚焦过程。毛细管等电聚焦过程是在毛细管内实现的，具有极高的分辨率，可 以分离等电点差异小于0 0 lp h 的两种蛋自质【协17 1 。 一种两性电解质的混合物用来作为载体注入毛细管中以产生p h 梯度，施加 电压后，带正电的流向阴极，带负电的流向阳极，使阴极端的p h 升高，阳极端 硕士学位论文 的p h 降低。这样两性电解质载体中各组分就分别停留在与自身等电点相对应的 位置上，并在两者之间形成一个梯度，梯度的大小视组成两性电解质载体的组分 及其个数而异。组分越多，梯度越小。带净电荷的溶质( 比如蛋白质) 顺着p h 值递减的方向朝阳极迁移，在p h 值与等电点相同的位置时电荷为零，迁移停止。 阳极缓冲液的p h 值必须低于大多数酸性的两性电解质的p h 值，以防止它进入 阳极电解液，同时阴极缓冲液的p i - i 值也必须比大多数碱性的两性电解质高。 1 1 2 3 毛细管等速电泳 早在现代毛细管电泳技术诞生之前，等速电泳【1 8 】，就已作为一种基于毛细 管的电泳技术流行于世，只是按照现在的标准来说，它所采用的毛细管内径过大 ( 2 0 0 2 5 0 儿m ) 。毛细管等速电泳是一种“移动边界”电泳技术，它采用两种不同 的缓冲液系统，一种是前导电介质，充满整个毛细管柱，另一种称尾随电介质， 置于一端的电泳槽中，前者的淌度高于任何样品组分，后者则低于任何样品组分， 被分离的组分按其不同的淌度夹在中间，以同一速度移动，实现分离。例如，在 作阴离子分离时，所选的前导电介质必须含有阴离子，其有效淌度高于被测组分， 尾随阴离子也是这样，只是其有效淌度要低于所有被测组分的相应值，施加电场 后，阴离子按淌度大小向阳极泳动，前导电介质中的离子淌度大，速度快，集中 在最前面，紧接着是被分离组分中淌度最大的那一个，以此类推，排在最后的是 尾随电介质，于是所有的阴离子形成各自独立的区带，达到分离。一旦分离完毕， 达到平衡，各区带都以和前导电介质相同的速度向前移动，此时若有任何两个区 带脱节，其间阻抗趋于无穷大，电场强度就会迅速增加，迫使后一区带迅速赶上， 保持恒定。除速度恒定外，等速电泳还有两个特点，一是区带锐化，在平衡状态 下，如果有离子扩散进入相邻区带，由于它豹速度和这一区带上的主体组分离子 速度不同，迫使它立即返回到自己的区带，因此，界面清晰，能显示很高的分离 能力。二是区带浓缩，即组分区带的浓度由前导电介质决定，一旦前导电介质浓 度确定，各区带内离子的浓度亦即为定值。如果在这时某一组分的离子浓度较小， 就将被“浓缩”，当然，反之亦然。这种浓缩效应已被用于其它毛细管电泳操作模 式中的预浓缩。 1 1 2 4 胶束电动毛细管色谱 胶束电动色谱【1 9 ，2 0 】( m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i ce h r o m a r o g r a p h y ，m e k c ) 是以胶 束为假固定相的一种电动色谱，是电泳技术和色谱技术的巧妙结合，多数m e k c 在毛细管中完成，故又被称为胶束电动毛细管色谱( m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i c c a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y ，m e c c ) 。m e c c 是在电泳缓冲液中加入表面活性剂， 当溶液中表面活性剂浓度超过l 临界胶束浓度时，表面活性剂分子之间的疏水基团 聚集在一起形成胶束( 假固定相) ，溶质基于在水相和胶束相之间的分配系数不 毛细管电泳电化学发光在药物检测方面的应用研究 同而得到分离。它是1 9 8 4 年由t e r a b e 首先报道的一种毛细管电泳技术【l 。c z e 基于溶质的淌度差异进行分离，而m e c c 则是基于溶质在胶束和水两相中的不 阿分配系数进行分离。因此，m e c c 的突出优点是除了能分离离子化合物外，还 能分离不带电荷的中性化合物，而c z e 仅能分离离子化合物。将电泳技术与色 谱技术结合，把电泳分离的对象从离子化合物扩展到中性化合物，是m e c c 的 一大创举。对含有离子和中性化合物的混合样品，以及电泳淌度相同的溶质的分 离，m e c c 要明显地优于c z e ，此外，m e c c 还可以很快且很容易地通过改变 流动相和胶束相组成来增加分离选择性，非常适合于手性化合物的分离。 m e c c 要求有两相，一相是带电的离子胶柬，是不固定在柱上的载体( 假固 定相) ，它具有与周围介质不同的电泳淌度，并且可以与溶质互相作用，另一相 是导电的水溶液相，是分离载体的溶剂。在电场作用下，溶液由e o f 驱动流向 阴极( 对内壁未处理的熔硅毛细管) 。离子胶束依其电荷极性不同，移向阳极或 阴极，在多数情况下，e o f 速度大于胶束电泳速度，所以胶束的实际移动方向 和电o f 相同，都向阴极运动。中性溶质基于色谱原理，在以电渗流驱动的水溶 液流动相和运动较慢的胶束相之间进行分配，疏水较强的溶质与胶束的作用较 强，结合到胶束中的溶质较多也较稳定，相对于疏水性较弱的溶质迁移较慢，未 结合的溶质随e o f 流出。因此，中性溶质按其疏水性不同以及由此引起的在两 相间的分配不同而得到分离，溶质的迁移速度决定于它在两相间的分配系数。目 前常用的胶束有阴离子型的s d s 、s t s 及阳离子型的d t a b 、c t a b 等，而以s d s 的使用最多。 1 i 2 5 毛细管电色谱 毛细管电色谱 2 1 - 2 3 1 ( c a p i l l a r y e l e c t r o c h r o m a t o r a p h y , c e c ) 是一种高效分离 技术。它是在毛细管电泳技术的不断发展和液相色谱理论日益完善的基础上兴起 的。所谓的毛细管电色谱是指用电场驱动的微柱液相色谱。它克服了毛细管电泳 选择性差和分离中性物质难的缺点，同时大大地提高了液相色谱的分离效率，形 成了自己独特的高效、微量和快捷的特点。c e c 采用熔融的石英毛细管柱，柱 内填充高效液相色谱所使用的固定相，用高压直流电源代替高压泵，即用电渗流 代替压力推动流动相。溶质根据它们在流动相与固定相中的分配系数不同和自身 电泳淌度的差异得以分离。因而该技术既能分离中性物质又能分离带电物质。 c e c 既不同于毛细管区带电泳又有别于高效液相色谱，而是把毛细管电泳技术 的高效性( 理论塔板数通常高于5 0 0 0 0 0 m ) 和高效液相色谱的选择性( 有大量 可供选择的固定相) 有机地结合起来，开辟了高效的微分析技术新途径。 1 1 2 6 毛细管筛分电泳 从自由溶液区带屯泳中派生出来的用凝胶物质做支持物来进行电泳的方式， 碗士学位论文 被称为凝胶电泳。普通的凝胶电泳是在板上进行，移到毛细管中进行的凝胶电泳 称为毛细管凝胶电泳。无论是普通凝胶电泳还是毛细管凝胶电泳，都是以凝胶物 质作为介质，这种介质在结构上类似于分子筛，流经凝胶的物质原则上按照分子 的大小分离，亦即大体上服从筛分机理。严格地讲，具有筛分功能的物质并不一 定都是凝胶，特别是在毛细管电泳中，由于管内空间有限，很多人将兴趣集中于 同样具有筛分功能的非凝胶材料，因此产生了一种所谓的毛细管无筛分电泳。在 这里我们把毛细管凝胶电泳和毛细管无筛分电泳统称为毛细管筛分电泳【2 4 1 。 筛分介质是一类具有筛分功能的物质的统称。在电泳中使用的筛分剂可分为 凝胶材料和非凝胶材料两类。区分凝胶材料和非凝胶材料的直观物理指标是粘 度。在某种意义上讲，凝胶材料可以看作是无胶材料粘度无限增加时的一个极限。 这种粘度上的不同往往和筛分材料的形成过程有关，其形成过程有化学和物理之 分。凝胶材料通常是指以化学共价或交联方式形成的胶状多孔物质，一旦成型， 即很难改变，如聚丙烯酰胺。非凝胶材料实际上是指一类由缠绕的聚合物以物理 方式组成的物质，它们可以比较容易地视容器的不同而改变自身的形状，甲基纤 维素和未交联的聚丙烯酰胺都属于这一类。 凝胶作为一种固态胶体分散体系，是由颗粒网状结构和共聚在其中的溶剂所 组成的。凝胶物质具有多孔性，因此它有类似于分子筛的作用，通过它的物质可 按照分子的大小一一分离。 1 1 2 7 非水毛细管电泳 毛细管电泳通常是在以水为溶剂的缓冲溶液中进行的，这限制了分析物的使 用范围。而如果用纯有机溶剂代替水介质来完成特殊样品的电泳分离，则可以解 决这个问题，且具有很多优点，此即非水毛细管电泳法【2 5 ，2 6 】( n o n a q u e o u sc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s ，n a c e ) 。n a c e 由w a b r o h e l 2 7 1 等于1 9 8 4 年首次提出，目的是解 决疏水性样品在毛细管电泳中的分析分离问题。他们以乙腈为非水溶剂分离了几 何异构体喹啉和异喹啉，取得了不错的效果。n a c e 法可适用于：( 1 ) 分析不易 溶于水，易溶于有机溶剂的物质，如一些药物及其代谢物、肽类化合物和阴离子 表面活性剂等2 8 。3 0 i ；( 2 ) 在以水为溶剂的缓冲溶液中淌度十分相似的物质的分 离，如弱酸、弱碱、胺类药物和无机阴离子等【2 7 ，3 卜3 4 1 ；( 3 ) 在水中难以进行反 应的物质的研究，如多聚醚与阳离子的聚合反应【35 1 。目前，n a c e 应用的研究 热点集中在有机溶剂、电解质和监测器的选择以及方法的优化等方面。 有机溶剂的选择要根据待测物的性质和分析的要求，需要考虑挥发性、介电 常数、粘度和质子离解等多种因素的综合影响。甲酰胺及其衍生物是少有的几种 介电常数较高、粘度较小的有机溶剂，但在使用时要注意其对人体的毒害作用以 及在紫外区的背景吸收问题。 毛细管电泳电化学发光在药物检测方面的应用研冤 1 1 3 毛细管电泳检测方式 1 1 3 1u v 可见吸收检测 u v 可见吸收检测法d 6 1 是毛细管电泳分离的一种常用检测法。由于吸收检测 器通用性较好、结构简单，加上商品吸收检测器已达到较高性能，因此，u v 可 见吸收检测器是目前应用最广泛的一种c e 检测器。它由光源、光路系统、信号 接收和处理系统构成。 u v - 可见吸收在柱检测方法简单。多数有机和生物分予( 特别是多肽、蛋白 质等) 在2 1 0 砌左右有很强的吸收，因此，这种检测器已接近通用性检测器。 但是，毛细管的短光程严重地限制了它的灵敏度，很难满足越来越多的对低浓度 和极微量样品分析的要求。为了进一步降低吸收检测限，人们提出了不少有关扩 展吸收光程和提高吸收检测的新方法、新技术。其中包括用矩形的扁毛细管代替 圆柱毛细管作毛细管电泳分离，具有光程长、光学畸变小和散热效率高的优点。 对截面积5 0 1 0 0 0u m 2 扁形毛细管，在相同样品塞长度下，进样体积比i d 5 0 i t m 的圆柱毛细管可增加2 5 倍。该方法对吡哆素的检测下限可达到8 1 0 0 m o l l ，灵敏度提高了2 0 倍【3 7 1 。 1 1 3 2 激光诱导荧光检测器 激光诱导荧光【3 8 1 ( l a s e r - i n d u c e df l u o r e s c e n c e ，l i f ) 检测是所有检测方法中 灵敏度最高的一种方法。多数情况下，l i f 的检测限为1 0 - 1 0 1 0 4 2m o l l ，比常规 的u v 吸收检测低5 - 6 个数量级。高灵敏度检测对毛细管电泳有着重要意义，这 意味着可以使用更小孔径的毛细管，施加更高强度的电场，获得更高的分离效率。 同时，也意味着可以处理更小量的样品，使高效、快速的毛细管电泳分离技术成 为极低浓度及极微量样品( 如单个细胞中的核苷酸) 分离检测的有力工具。c e 在线荧光检测系统主要是由激发光源、激发和收集光学系统、信号检测以及显示 或记录系统组成。高性能的荧光检测器需要对各组成部分综合考虑，认真设计， 使荧光的激发和收集效率最高和背景噪音最小。但大多数化合物本身不发荧光， 需要衍生，所以衍生技术在荧光检测中的使用很有必要。恰当地选择激发波长和 荧光试剂，对提高检测灵敏度和增加选择性有着重要意义。l i n l 3 9 】等综述了 c e l i f 联用技术的优点，并指出其在分离d n a 、蛋白质、单个细胞以及它们的 衍生物等方面的应用。 1 1 3 3 质谱检测器 质谱法【4 0 】( m a s ss p e c t r o m e t r y , m s ) 灵敏度高、专属性强，能提供分子结构 信息，是跟毛细管电泳联用的非常理想的一种检测器。毛细管电泳的高效分离和 m s 的高鉴定能力相结合，使得仅用n l 级样品就可以进行分子结构分析和分子 坝士学位论文 量的准确测定。该联用技术已成为微量生物样品分离分析的强有力工具，近年来， 越来越受人们的关注，特别是在多肽和蛋白质的分离分析方面受到人们格外的青 睐。m s 用作毛细管电泳的检测器，有离线检测和在线检测两种方式。离线检测 是将毛细管电泳分离组分收集后，送到m s 离子源进行m s 分析。在线检测是分 离毛细管直接耦合到m s 中进行m s 检测。多种离子化系统方法可应用于c e m s 系统，常用的有电喷雾离子化、粒子喷射和基质辅助激光解析离子化等。d e n g l 4 l 】 等人基于c e m s 技术定量检测了人血浆中的小分子药物，比如丙咪嗪等，结果 表明这种手段可用于临床上小药物的分析。 1 1 3 4 折射指数检测法 一般情况下，溶液的折射指数( r e f r a c t i v ei n d e x ，r i ) 与溶液组成、浓度及温 度有关。在这里，我们讨论基于溶液组成或浓度变化的r l 检测法【4 2 1 。一般的 r i 检测器由于灵敏度低、易漂移的原因而很少被采用。但是，与其它类型的检 测器相比，r i 检测器具有非破坏性、通用性强、结构简单、造价低廉和适于微 体积和微柱检测的优点。它可以不需要衍生直接检测所有毛细管电泳分离组分。 u v 吸收检测器算得上是较通用的检测器，但对于i d 伯胺。因此，要对 伯胺和仲胺进行e c l 分析，首先必须在分析之前对它进行衍生。举个例子，伯 胺在衍生之后形成叔胺官能团然后才可用r u ( b p y ) 3 2 + e c l 进行检测。 e c l 也可用于监测酶反应，在这种体系中，酶反应经常要涉及到e c l 共反 应物的产生或消耗。辅酶n a d h 就是其中的一个例子，n a d h 的氮原子上含有 孤对电子，所以可作为r u ( b p y ) 3 2 + e c l 反应的共反应物，然而n a d + 即n a d h 的氧化态上的氮原子上没有孤对电子，所以不能作为r u ( b p y ) 3 ”e c l 反应的共 反应物 9 3 】。利用以上事实，人们设计出分析检测基于n a d h 酶的底物的方法 9 4 ， ”】。该方法以葡萄糖为例子阐述如下，葡萄糖与己糖激酶相互作用生成的产物还 原n a d + 生成n a d h ，然后通过检测n a d h 与r u ( b p y ) 3 2 + 相互作用产生的光信号 来反映葡萄糖的含量。 1 2 2 2 有关发光体的某一物质浓度分析研究 e c l 在临床绝大部分的应用是以这样的一个模式：检测作为标记物的发光 体的浓度。首先，把r u ( b p y ) 3 2 4 的衍生物以共价键的方式联结在参与亲和反应的 某一物质上i s 9 1 ，然后在过量且恒量的共反应物存在的情况下进行e c l 信号的采 集( 共反应物一般是用t p r a ) 。由于共反应物过量，因此e c l 信号的大小取决 于e c l 发光体的浓度，而该发光体是联接在某一物质上的，故e c l 信号的大小 可以反映该物质浓度的大小。 1 3 毛细管电泳电化学发光的应用 电化学发光用于毛细管电泳是近十来年才发展起来的一项检测技术，该法不 仅具有毛细管电泳的快速高效分离、样品用量少等特点，还发挥了e c l 电化学 发光高选择性、高灵敏的优点。e w i n g 小组【9 6 j 最早报道了这方面的工作。他们利 用l u m i n o le c l 反应用毛细管电泳分离检测，被测物为辛胺、丙胺以及三肽 v a l t y r v a l 。1 9 9 7 年s w e e d l e r 等瞰】最早把毛细管电泳与r u ( b p y ) 3 ”e c l 结合检 测了b 受体阻断剂。此后陆续有几个小组开展了这方面研究，而且均采用 r u ( b p y ) 3 2 + e c l 检测。毛细管电泳电化学发光技术在胺类药物、多胺、环境污染 物等的检测中有较广泛的应用 9 8 - 1 0 3 。使用毛细管电泳电化学发光技术要注意避 免电泳高压对电化学信号的影响。在检测端之前，预先留有高压接地，使电泳电 硕士学位论文 流大部分经过接地端流走。由于接地的制作一般较麻烦，在后期的文献中，一般 是采用末端检测模式，采用小孔径毛细管，同时毛细管出口端与电极保持一定距 离1 1 0 4 】。使用细内径毛细管( 仲胺 伯胺。同时联接在叔胺官能团上的 其它基团也可能对叔胺官能团的发光效率产生影响，给电子基对叔胺官能团的发 光效应有促进作用，而吸电子基的作用恰恰相反 1 2 7 。 电化学发光是一种特殊的化学发光。它的特殊之处就在于：光信号的产生是 源于电极表面的氧化或还原反应。一定电位施加下，发光试剂r u ( b p y ) 3 ”在电极 表面被氧化为r u ( b p y ) 3 ”，然后r u ( b p y ) 3 3 + 与叔胺官能团相互作用生成激发态的 r u ( b p y ) 3 ”+ ，而它可以通过回到基态来释放出光信号。当然，电化学发光方法除 了可以跟毛细管电泳联用以外，还可以与高效液相色谱( h p l c ) 1 2 8 - 1 3 0 】以及流 动注射分析l l ”o ”】联用。 盐酸硫利哒嗪( t h i o r i d a z i n eh y d r o c h l o r i d e ) ，又名为盐酸甲硫达嗪，其化学 式和化学名分别为c 2 l h 2 6 n 2 s 2 h c l 和1 0 - 2 ( 1 甲基2 哌啶) 乙基】2 甲基硫代 吩噻嗪盐酸盐。本品为白色或类白色的结晶性粉末，微臭，在乙醇中溶解。它是 吩噻嗪类抗精神病药，抗精神病作用主要由于阻断脑内多巴胺受体，对锥体外系 统多巴胺受体作用及体温中枢影响较弱，镇静作用也较弱，可增强镇痛药、催眠 毛细管电泳电化学发光在药物检测方面的应用研究 药、抗组胺药、麻醉药及乙醇的中枢抑制作用，不宜与奎尼丁合用，适应急、慢 性精神分裂症。中华人民共和国药典2 0 0 0 版二部采用电位滴定法，用o 1m o l l 的。高氯酸滴定液滴定盐酸硫利哒嗪，每lm l 高氯酸滴定液( 0 1m o l l ) 相当于 4 0 7 0m g 的盐酸硫利哒囔，但这个方法费时且操作繁复。 在这里，我们用毛细管电泳与电化学发光联用技术来分析检测盐酸硫；f 哒嚷 ( 图2 1 ) ，我们发现该方法灵敏度高、操作简单且损耗少，可满足盐酸硫利哒嗪 日常分析的需求。 2 2 实验部分 f i g 2 1m o l e c u l a rs t r u c t u r eo ft h i o r i d a z i n e 2 2 1 化学试剂 盐酸硫利哒嗪购于中国药品生物制品检定所。氯化三联吡啶钉六水和物来自 于j & k 化学药品公司。n a 2 h p 0 4 和k h 2 p 0 4 用来配制一系列不同p h 值的6 7 m m o l l 磷酸缓冲溶液。本实验所用的水都是二次蒸馏的，并且其它化学试剂都 是分析纯级别。所有溶液在使用之前用孔径为o 2 2 “m 的水膜过滤。 2 2 2 仪器 电化学分析仪采购于上海辰华仪器公司( 中国) 。所用的工作电极是直径为1 m m 的铂电极，相应的参比电极采用a g a g c i 电极，而把铂电极作为对电极。 m p i ac e e c l 毛细管电泳电化学发光检测仪购于西安瑞迈电子科技有限公 司( 中国) ，由三个部位组成：数控毛细管电泳高压电源、数控电化学分析恒电 位仪、多通道数控采集分析仪和多功能化学发光检测器。电化学发光检测池( 装 置如图2 2 所示) 置于多功能化学发光检测器中。它是由三电极系统组成：直径 为3 0 0 “m 的铂电极作为工作电极，a g a g c i 电极作为参比电极，铂电极作为对电 极。r u ( b p y ) 3 ”溶液可以添加到电泳缓冲液中，但r u ( b p y ) 3 2 + 会吸附在毛细管壁上， 分析性能差。通常是把r u ( b p y ) 3 2 + 溶液添加到电化学发光检测池中，在一定电位 硕士学位论文 施加下于工作电极表面被氧q 6 ) 5 茈r u ( b p y ) 3 3 + 。插入电化学发光检测池中的毛细管 末端与工作电极表面的距离被设置为1 0 0 “m 。