（分析化学专业论文）过硫酸钾鲁米诺体系后化学发光现象的研究.pdf

过硫酸钾一鲁米诺体系后化学发光现象的研究 高申霞 摘要：化学发光( c h 锄i l u m i n e s c c n c c ，c l ) 是化学反应的反应物、中问体或产 物吸收了反应释放的化学能后跃迁至激发态，当其返回到基态时所产生的光辐射。 根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或发光总量来确定反应中相应组分含量 的分析方法叫化学发光分析法。 化学发光分析法因其灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单、分析速度快、 容易实现自动化和连续分析等优点吸引着广大分析工作者的注意，其已被成功地 应用于生命科学、地质分析、药物分析、临床检验、环境检测和分子生物学等各 个分析领域。 近年来，吕等发现在一些化学发光反应结束后，向其反应混合液中加入某种 新的物质时，又能引起一个新的化学发光反应，并检测到强的化学发光信号。这 种新的化学发光现象被称为后化学发光现象，相应的化学发光反应被称为后化学 发光反应。 本论文分为两部分，第一部分综述，第二部分研究报告。 第一部分简要阐述了近年来化学发光分析法的新技术及其应用进展；介绍了 过硫酸钾作为氧化剂的化学发光反应体系，着重介绍了几种主要的化学发光反应 类型及其分析应用。同时，对本实验室近几年在后化学发光方面的研究和应用作 了小结。 第二部分为具体的研究工作，发现了盐酸地尔硫卓、富马酸喹硫平和金属离 子在过硫酸钾鲁米诺体系产生的后化学发光行为，探讨了此后化学发光的反应机 理，评价了将这一现象用于这些物质测定的可行性，给出了相关的分析参数，建 立了测定盐酸地尔硫卓、富马酸喹硫平和金属离子的流动注射后化学发光分析法。 研究报告主要由三部分组成： 一、流动注射后化学发光法测定盐酸地尔硫卓 研究发现，当将盐酸地尔硫卓溶液注入到过硫酸钾和鲁米诺反应后的溶液中 时，一个更强的化学发光反应后化学发光反应发生了。在对这一后化学发光 反应的动力学性质、化学发光光谱、荧光光谱以及一些相关问题研究的基础上， 讨论了其可能的反应机理；利用所发现的后化学发光反应，结合流动注射技术， 建立了一种测定盐酸地尔硫卓的化学发光法。方法的检出限为3 x 1 7 9 m l 盐酸地 尔硫卓，线性范围为3 0 x l n l 0 x 1 0 4 9 m l ( r - - 0 9 9 6 6 ) ，对6 0 x 1 0 s g m l 的盐酸地 尔硫卓标准溶液进行1 1 次平行测定的相对标准偏差为1 6 。此法已用于盐酸地尔 硫卓片剂中盐酸地尔硫卓的含量的测定。 二、流动注射后化学发光法检测富马酸喹硫平 研究发现，当将富马酸喹硫平溶液注入到过硫酸钾和鲁米诺反应后的溶液中 时，可以引发一个更强的化学发光反应一后化学发光反应。在对这一后化学发光 反应的动力学性质、化学发光光谱、荧光光谱以及一些相关问题研究的基础上， 讨论了其可能的反应机理；利用所发现的后化学发光反应，结合流动注射技术， 建立了一种测定富马酸喹硫平的化学发光法。检测的线性范围为1 0 1 0 - 7 _ 1 0 x 1 0 - s g m l ( r = o 9 9 5 7 ) ，对8 0 x 1 0 6 9 m l 的富马酸喹硫平标准溶液进行n 次平行测定的 相对标准偏差为2 2 ，方法的检出限为3 x 1 0 。8 咖l 。此法已用于富马酸喹硫平片 剂中富马酸喹硫平含量的测定。 三、过硫酸钾鲁米诺体系中金属离子后化学发光反应的研究 发现了金属离子m 9 2 + 、b a 2 + 、c d 2 + 、p b 2 + 、n i 2 + 5 种金属离子在过硫酸钾鲁米 诺体系中的后化学发光现象。在优化的分析条件下，建立了m 9 2 + 、b a 2 + 、c d 2 + 、 p b 2 + 、n p 这5 种金属离子的后化学发光分析方法。m g x , 、b a s + 、c a 2 、p b 2 + 、n i 2 + 的检出限依次为2 x 1 0 - s g m l ，2 x 1 0 - s g m l ，3 x 1 0 7 9 m e ，6 x 1 0 7 9 m l ，8 x 1 0 9 9 m l ： 对此后化学发光反应的动力学性质、化学发光光谱及其它相关性质的进行了研究， 从而，初步构建了过硫酸钾鲁米诺后化学发光分析体系。 关键词：后化学发光过硫酸钾鲁米诺 n i n v e s t i g a t i o no f t h ep o s t - c h e m i l u m i n e s c e n c e p h e n o m e n o n i n p o t a s s i u mp e r s u l f a t e - l u m i n o ls y s t e m g a os h e a x i a a b s t r a c t ：c h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) w a sd e f i n e da se l e c t r o m a g n e t i c ( u l t r a v i o l e t ， v i s i b l eo rn e a r - i n f r a r e d ) r a d i a t i o no ft h er e a c t a n t ，t h ep r o d u c t i o no rt h ei n t e r m e d i a t ea sa r e s u l to fac h e m i c a lr e a c t i o n t h ec la n a l y t i c a lm e t h o dw a se s t a b l i s h e db a s e do nt h e m o m e n tr a d i a t i n ni n t e n s i t yo rt h eg r o s sr a d i a t i o nq u a n t i t i e s c li sn o wc o n s i d e r e da sa v e r ys e n s i t i v ea n a l y t i c a lm e t h o da n da p p l i e dt od i f f e r e n tf i e l d ss u c ha sl i f es c i e n c e s , g e o l o g i c a la n a l y s i s ，p h a r m a c o l o g y , c l i n i c a lm e d i c i n e ，e n v i r o n m e n t a ld e t e c t i o na n d m o l e c u l a rb i o l o g ye t c b e c a u s eo fi t sh i g hs e n s i t i v i t y , l o wd e t e c t i o nl i m i t s ，w i d el i n e a r r a n g e s ，s i m p l em e a s u r ed e v i c ea n da p tt or e a l i z ea u t o m a t i o na d v a n t a g e i nr e c e n ty e a r s ， l ve t c r e p o r t e dt h a tan e wc h e m i l u m i n e s c e n c er e a c t i o nc o u l db ei n i t i a t e dw h e n i n i e c t i n gs o m es u b s t a n c e si n t or e a c t i o nm i x t u r ea f t e rt h ef i n i s ho fs e v e r a lc lr e a c t i o n s t h ep h e n o m e n o nw a sn a m e da sp o s t c h e m i l u m i n e s c e n c e ( p c l ) p h e n o m e n o na n dt h e c o r r e s p o n d i n gc h e m i l u m i n e s c e n c er e a c t i o na sp o s tc h e m i l u m i n e s c e n c er e a c t i o n t 1 l i st h e s i sc o n s i s t so far e v i e wa n dar e s e a r c hs e c t i o n t h er e v i e wi n c l u d e st h ec h e m i l u m i n e s c e n c es y s t e mi nw h i c hp o t a s s i u mp e r s u l f a t e w a su s e da st h eo x i d a n ta n dt h ea p p l i c a t i o no fc h e m i l u m i n e s c e n c es y s t e m si nt h er e c e n t y e a r i tw a sf o c u so nt h em e c h a n i s ma n da n a l y t i c a la p p l i c a t i o ni nl u m i n o l - p o t a s s i n m p e r s u l f a t es y s t e m t h er e s e a r c hg a v ea p r e s e n t a t i o no ft h ep c l b e h a v i o r so fd i l t i a z e mh y d r o c h l o r i d e , q u e t i a p i n e f a m a r a t e a n dm e t a li o n si n p o t a s s i u mp e r s u l f a t e - l u m i n o ls y s t e m c h e m i l u m i n e s c e n c em e c h a n i s m sw e f ci n v e s t i g a t e dd e t a i l e d l y f e a s i b i l i t yt on s et h e p h e n o m e n o nt o t h ea n a l y s i so ft h e s em e d i c i n e sw a se v a l u a t e da n dt h ec o r r e l a t i v e a n a l y t i c a lp a r a m e t e r sw e r ea l s og i v e n t h ef l o w i n j e c t i o np c la n a l y t i c a lm e t h o do f d i l t i a z e mh y d r o c h l o r i d e ，q u e t i a p i n ef a m a r a t ea n dm e t a li o n sw a se s t a b l i s h e d t h er e s e a r c hs e c t i o ni n c l u d e st h r e ep a r t s i np a r to i l e an e wp c lr e a c t i o nw a so b s e r v e dw h e nd i l t i a z e mh y d r o c h l o r i d ew a s 蛳e e t e di n t ot h er e a c t i o nm i x t u r ea f t e rt h ef i n i s ho f c h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) r e a c t i o no f p o t a s s i u mp e r s u l f a t ea n dl u m i n 0 1 t h ep o s s i b l em e c h a n i s mf o rt h ep c lr e a c t i o nw a s d i s c u s s e dv i at h es t u d i e so ft h ec lk m e d cc h a r a c t e r i s t i c s ，t h ec ls p e c t r a ，t h eu v a b s o r p t i o ns p e c t t aa n dt h ef l u o r e s c e n c e e c t r ao fs o m er e l a t e ds u b s t a n c e so rr e a c t i o n s t h ef l o wi n i e c t i o np c lm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fd i l t i a z e mh y d r o c h l o r i d ew a s e s t a b l i s h e d t h er e l a t i v es t a n d 盯dd e v i a t i o n ( r s d ) f o rt h ed e t e r m i n a t i o no fd i l t i a z e m h y d t o c h l o r i d cw a s1 6 ( n = 1 1 ，c = 6 0 x 1 0 - 5g m l ) t h ep c li n t e n s i t y r e s p o n d e d l i n e a r l yf r o m3 0 x 1 0 ot o1 0 x 1 0 4g m lw i t hac o r r e l a t i o nc o e 伍c i e n lo f0 9 9 6 6 n l e d e t e c t i o nl i m i tw a s3 x 1 0 - g m l t h em e t h o dh a db e e na p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no f d i l t i a z e mh y d r o c h l o r i d ei nt h et a b l e t s i np a r tt w o ，an e wp c lr e a c t i o nw a so b s e r v e dw h e no u e t i a p i n ef a m a r a t ew a s i n i e c t e di n t ot h er e a c t i o nm i x t u r ea f t e rt h ef i n i s ho fc lr e a c t i o no fp o t a s s i u mp e r s u l f a t e a n dl u m i n 0 1 t h ep o s s i b l em e c h a n i s mf o rt h ep c lr e a c t i o nw a sd i s c u s s e dv i at h e s t u d i e so ft h ec lk i n e t i cc h a r a c t e r i s t i c s ，t h ec l s p e c t r a , t h eu va b s o r p t i o ns p e c t r aa n d t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r ao fs o m er e l a t e as u b s t a n c e so rr e a c t i o n s an e wf l o wi n j e c t i o n c lm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fq u e t i a p i n ef a m a r a t ew a se s t a b l i s h e d n er e l a t i v e s t a n d a r dd e v i a t i o n 皿s d ) f o rt h ed e t e r m i n a t i o no fq u e t i a p i n ef a m a r a t ew a s2 2 ( n = 1 1 ， c = 8 o x l o r 6g m e ) 皿el i n e a r l yr e s p o n d e dr a n g ew a sf r o m1 0 x 1 0 7t o1 0 x l 旷g m l w i t hac o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n to f0 9 9 5 7 t h ed e t e c t i o nl i m i tw a s3 x l 旷g m l t h e m e t h o dh a db e e na p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fo u e t i a p i n ef a m a l a t ei nt a b l e t s i np a r tt h r e e ，an e wp c lr e a c t i o nw e r eo b s e r v e dw h e nm ：产，b a 2 + ，c a 2 + ，p b 2 + o rn i 2 + w a si n i e c t e di n t ot h er e a c t i o nm i x t u r ea f t e rt h e f i n i s ho fc lr e a c t i o no fp o t a s s i u m p e r s u l f a t ea n da l k a l i n el u m i n 0 1 t h cd e t e c t i o nl i m i tw c r e2 x 1 0 - 5g m 乙2 x 1 0 3g m l ， 3 x 1 0 - 7g m 1 6 x 1 0 - 7g m l , 8 x 1 0 4g m lf o rm 9 2 + ，b a 2 + , c a “，p b 2 + o rn i 2 + t h cp c l r e a c t i o nw a sd i s c u s s e dv i at h es t u d i e so fl l l ec lk i n e t i cc h a r a c t e r i s t i c s t h ec l s p e c t r a a n do t h e re x p e x l m e n t s t h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n so ft h ec lr e a c t i o n sw e r eo p t i m i z e d a n dt h ef e a s i b i l i t yu s i n gt h er e a c t i o nt oa n a l y z et h e s em e t a li o n sw a se v a l u a t c d k e y w o r d s ：p o s t c h e m i l u m i n e s c e n c e ；p o t a s s i u mp e r s u f a t e ；l u m i n o l 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中 作了明确说明并表示谢意。 作者签名：缝 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西师 范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校 l 蛩书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索； 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名：日期：垫! l 上 第一部分综述 一、化学发光分析法的应用新进展 1 1 概述 化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ) 是化学反应的反应物、中间体或产物吸收了反 应释放的化学能后跃迁至激发态，当其返回到基态时所产生的光辐射。根据化学 发光反应在某一时刻辐射光的发光强度或发光总量来确定反应中的相应物质含量 的分析方法叫化学发光分析法化学发光分析法因其灵敏度高、测量装置简单、 线性范围宽、分析速度快和容易实现自动化等优点而成为分析化学中一个十分活 跃的研究热点，已被成功地应用于生命科学、地质分析、药物分析、临床检验、 环境检测和分子生物学等领域【l - 9 1 。 最早发现的化学发光现象发生在生物体内，如萤火虫，现称之为生物发光 ( b i o l u m i n c s c c n c c ) ，到了十九世纪，人们发现简单的非生物有机化合物也能产生 化学发光。1 9 2 8 年，a l b r e c h t 发现了鲁米诺( 1 u m i n 0 1 ) 的发光现象，成为化学发 光史上的一个重要的里程碑，对于化学发光发展成一种分析化学重要手段起到重 要的作用。1 9 3 5 年k g l e u 等人发现了光泽精( l u c i g e n i n ，n ，n - - - 甲基二吖啶硝 酸盐) 与过氧化氢反应产生化学发光现象，在以葡萄糖测定为典型例子的许多还 原性物质测定中获得应用。 由于大多数化学发光非常微弱，且稍纵即逝，而且由于检测器的限制，使得 化学发光反应的应用受到了限制。2 0 世纪6 0 年代以前，化学发光的研究处于单纯 的发光现象和机理的研究探讨阶段到了6 0 年代以后，现代电子技术工业和高灵 敏度的光电传感器的发展，为研究和测试化学发光提供了许多新技术和新手段， 用于化学发光分析的手段也有很大的迸步，从照相法发展为光电检测、c c d 检铡， 操作方式从手动发展为自动、原位及在线检铡。同时，生命科学、环境科学、材 料科学的兴起，对化学发光测试起到了推动作用，化学发光分析法与众多学科相 交叉，研究和应用领域越来越广泛，从早期的简单的过渡金属离子的测定，到现 在的快速多组分的检测。 目前，化学发光分析法的发展呈现以下三个主要特点：一是化学发光新体系研 究活跃：二是化学发光与其他分析技术联用多样，把纳米，免疫、流动注射、高 效液相色谱、毛细管电泳、光纤等各种最新技术与化学发光相结合，提出了多种 实用性强的分离分析方法；三是化学发光分析应用范围广泛，特别是在医药领域， 化学发光免疫分析、细胞发光、自由基研究、流动注射化学发光、增强发光自显 影技术、药物与中草药化学发光、n o 化学发光和酶学测定等研究成果得到广泛 的应用。 本节就近几年化学发光分析法在无机分析、有机分析、生物活性氧研究、免 疫分析、核酸探针分析和微全分析中的最新技术及应用进行了评述。 1 2 化学发光分析法的应用新进展 1 2 1 化学发光检测联用技术在无机物分析中的应用 化学发光分析法目前可测定的金属离子和其他无机组分已达4 0 多种，涉及的 分析试样极为广泛，以测定环境o o - u l 及生物样品中的无机组分为主 利用金属离子对化学发光反应的催化作用测定无机物的研究报道最多；利用 被测无机组分的氧化作用或对化学发光反应的抑制作用或利用偶合反应测定无机 物的研究也有报道。采用的分析手段以流动注射为主，并与其他技术联用，其中 以毛细管电泳化学发光( c e c l ) 联用技术最引人注目近年来，已有关于毛细 管电泳分离与化学发光检测联用用于金属离子分析的评述【1 4 - l s 。 程介克等1 1 9 】基于过渡金属在碱性条件下催化i , u m i n o l - h 2 0 2 发光体系，利用 c e - c l 法分离测定了c o ( 1 i ) 、c u ( 1 i ) 、n 近i i ) 、f i i ) 和m n ( i i ) 5 种金属离子， 对c o ( n 1 的检出限达5 0 x 1 0 1 3 m o l l ，比此前报道的最灵敏的结果低2 个数量级； 最近他们【硎又报道对v ( ) 的检出限可达1 个分子，表明化学发光与毛细管电泳联 用，有可能成为单分子检测的一种新手段 芯片毛细管电泳的出现，为化学发光检测提供了一个重要的用武之地。 t s u k a g s h i 等研究了c o ( h ) 、c u ( 1 i ) 、n i ( i i ) 、f e ( i i ) 的芯片毛细管电泳分离和化学 发光监测方法。林金明等人根据c o o t ) 、c u ( n ) 、s i ( i i ) 过渡金属离子等催化鲁米 诺过氧化氢化学发光反应机理，建立电泳微芯片实验系统1 2 l 】，该体系测定金属离 子的常用的流动注射化学发光实验装置也适用于大多数的化学发光反应体系。 t c r a b e 等人阎利用聚二甲基硅氧烷( p m d s ) 材料作为芯片，比较了鲁米诺过氧 化氢和过氧化草酸酯过氧化氢化学发光体系的检测效果，成功地分离和检测了 c o ( 1 ，c u ( 1 i ) 、c r0 n ) 。 1 2 2 化学发光色谱柱后检测在有机物分析的应用 有机化合物种类繁多，相对于无机物的化学发光分析而言，有机物的分析难 度更大。有机化合物的化学发光分析有以下三种途径：一是有机物作为发光试剂参 与化学发光反应直接被测定；二是作为反应物( 不是发光剂) 、敏化剂、猝灭剂、 能量接受体等被间接测定；三是通过酶促反应的产物与发光反应偶合间接被测定 有机化合物的化学发光分析一般都要结合分离技术，近年来研究最多的是高效液 相色谱与化学发光联用，即h p l c c l 法，这方面已有综述报道i 咎冽作为色谱柱 后检测最常用的化学发光体系有鲁米诺【2 5 伽和过氧化草酸酯【2 7 】。其中过氧化草酸 2 盐体系一般需先将被测物衍生成荧光物质后，经化学发光柱后检测【雄3 0 l ；鲁米诺 体系一般将鲁米诺的衍生物，如异鲁米诺a b e l 标记到羧酸和胺类化合物上，经过 高效液相色谱分离后，再在碱性条件下与过氧化氢铁氰化钾或者其他催化试剂反 应进行化学发光检测，可以应用于氨基酸、蛋白质、脂肪酸以及胺等化合物的测 定。目前报道的大部分化学发光体系都具有很高的灵敏度，但是与色谱联用时， 往往出现色谱流动相干扰化学发光测定的现象，所以化学发光体系与色谱分离条 件的匹配是限制这一方法发展的主要原因。化学发光色谱柱后检测比较典型的分 析例子是以去离子水为流动相，对化学发光测定的影响可以降到最低，能够很好 地结合于鲁米诺过氧化氢碱性发光体系，实现了乙酸、丁酸等五种有机酸在1 0 r a i n 内得到分离与检测的目的1 3 “。 除了鲁米诺和过氧化草酸酯两种典型的化学发光体系外，近年来出现了一系 列化学发光新体系，如利用高锰酸钾和硫酸铈的强氧化能力，在酸性条件下与一 些有机物发生氧化还原反应而产生发光现象，这样的体系更适合与色谱流动相溶 液相匹配，减少流动相溶液对化学发光反应的影响。林金明等人 3 2 1 提出了 k h s o d c o ( i i ) 测定荧光性有机化合物的化学发光反应体系。利用该体系较好地分 离与检测了多种丹酰化氨基酸，并用于实际样品的测定i 叫。 1 2 3 化学发光在活性氧中的研究应用 近年来，活性氧( 。o h ， 0 2 。，1 0 2 ，h 2 0 2 和r o o h ) 在生物学和生学医学等领 域中的研究倍受关注，自由基参与的各种发病机理研究越来越受到重视l 驯。活性 氧在生物体内通过电子转移、加成以及脱氢等方式与多种分子作用，使细胞坏死 或突变，造成机体损伤和病变。因此，研究简单、灵敏、快速的方法测定活性氧 具有重要意义。电子自旋共振法( e s r ) 和高效液相色谱法( h i l c ) 法是最常用 的两种方法，但均需要昂贵的仪器，且操作较复杂。与以上方法相比，化学发光 分析法用于活性氧的分析研究，更具有优越性。近年来，活性氧的化学发光研究 也是活性氧测定法研究领域中比较活跃的分支之一，特别是针对过氧化氢的测定， 有许多灵敏度高、选择性好的化学发光体系 3 5 - 4 5 1 。目前比较成功的活性氧化学发 光测定法主要有鲁米诺法、光泽精法和甲壳动物荧光素法。 化学发光法虽然有它的简便和高灵敏度等特点，但是到目前为止化学发光法 的分析选择性还难以令人满意。而医学、环境等许多领域里，迫切需要开发高灵 敏度、高选择性的活性氧以及其他一些活性自由基的测定方法。特别是活性氧的 活体测定，对于解释生命机体的各种生理、病状等有着重要的意义，建立简便可 靠的活性氧以及其他自由基的测定方法成为分析化学今后发展的方向之一 1 2 4 化学发光免疫分析 3 化学发光免疫分析( i a ) 是借助于化学发光反应的高灵敏性和免疫反应的 高特异性而建立的一种测定方法，是继放射免疫分析法、荧光免疫分析法和酶免 疫分析法之后，在近年来迅速发展起来的一种新型免疫分析技术 4 6 4 7 1 它包括标 记化学发光物质的化学发光免疫分析、标记酶的化学发光酶免疫分柝和标记荧光 物质的荧光化学发光免疫分析。1 9 7 7 年，h a l m a n 第一次把化学发光与免疫分析结 合，1 9 8 0 年化学发光免疫分析( c l - i a ) 一词开始出现，9 0 年代以来，c l - i a 发 展更为成熟，应用领域更为广泛。 由于化学发光免疫分析是以发光剂标记或酶标记进行测定的，其灵敏度可以 赶上甚至超过放射免疫分析。章竹君等l 删在国内最早建立了偶合反应化学发光酶 联免疫分析法，成功地应用于流动出血热病人的k m 和乙型肝炎病人表面抗原抗 体、甲胎蛋白、铁蛋白等的测定。他们还以h r p 标记粪样中的轮状病毒，将双孵 式免疫技术改进成单孵式多层免疫技术，以鲁米诺增强化学发光测定了轮状病毒， 方法的灵敏度是常规化学发光酶联免疫分析的4 倍，特异性、阳性检出率均有提 高。b r o w n 等1 4 9 j 用苯氧取代的吖啶酯作为葡萄糖氧化酶活性的长寿命发光指示剂， 测定促甲状腺激素( t s n ) 的检出限可达o 1 8f m o l ，线性范围为0 2 - 1 6 5p m o l 孔。 最近，由瑞士罗氏公司( i g e n ) 和b o e h f i n g e r m a n n h e i m 公司研制的e l e c s y s 免 疫分析采用钌联吡啶t p a 电化学发光体系( 砸c l ) 是一种更先进的发光免疫分 析技术。它具有电化学和化学发光免疫分析的特点：标记物稳定，灵敏度高，可 实现多元检测，可实现均相免疫分析，可实现全自动化，已用于多种抗体、抗原 和标记物的分析l s o - 5 1 1 。o b e n a u e r - k u t n r e 等i 删用夹心i e c l 方法测定了未稀释血清 样品中的重组干扰素( m n a 2 6 ) ，该方法的准确度优于酶联免疫分析法( e l i s a ) 。 目前，c l - i a 技术的发展趋势在于合成新的发光标记物、优化抗体制备、标 记技术以及建立新的免疫分析方法等。c l - i a 分析方法多样，适用面广，在医学、 食品分析、环境等方面具有广阔的应用前景。 1 2 s 化学发光在核酸检测分析中的应用 核酸探针分析技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之 一，是定性及定量检测特异性d n a 或r n a 序列片段的有效手段。传统的核酸分 子探针采用的是放射性标记的检测方法，但由于放射性同位素本身固有的缺点以 及所用仪器的限制，该方法的发展受到一定的影响。 近年来，化学发光分析技术以其分析快速、操作简单以及无放射性污染等显 著优点，新型化学发光试剂的研究取得了进展，利用化学发光进行标记和检测核 酸及其它生物分子的应用愈来愈多，使核酸探针分析技术受到极大地关注弘2 删。 加上高灵敏度的生物发光、电致化学发光标记技术的迅速发展，使得许多非放射 4 性标记检测的灵敏度达到甚至超过了同位素标记测定。 在核酸检测分析中，制备特异、灵敏的标记探针是这一技术成功的关键。化 学发光标记物中最有发展前途的发光标记物是吖啶酯衍生物和以稳定的1 ，2 二氧 环乙烷衍生物作为底物的酶。吖啶酯衍生物可以直接标记在核酸探针上，以它作 标记物不需催化剂，标记反应不影响其发光的量子产率，并可选择性地分解标记 物，产生化学发光，而吖啶酯衍生物的发光可因其中的苯酚水解而完全猝灭。因 此，在一定条件下，可以用化学的方法将未杂交的吖啶酯水解而破坏，而探针中 的吖啶则因插入到碱基对中受到保护。在以化学发光标记代替同位素标记的核酸 探针技术中所遇到主要问题是延长化学发光的寿命。以1 ，二二氧环乙烷衍生物为 底物的碱性磷酸酯酶化学发光体系的引入解决了这一问题【5 5 】。该衍生物能够有效 地被酶促反应激活并以较高的量子产率发出光辐射，其发光寿命可持续几个小时 甚至几天。 近年来r o ) p y ) 3 2 + 配合物作为标记探针在核酸分析中的应用特别引人注目印j 。 x u 等i + - 5 7 1 研制了一种用于d n a 分析的电化学发光传感器，其原理是以单晶金为 基底，把一条以r u ( b p y ) 3 2 为嵌入剂的d n a 寡链固定在电极表面上，进而与另 一条含有互补碱基序列的d n a 寡链识别，然后通过e c l 进行定量分析。这种方 法不但可以测定靶d n a 浓度，同时还能确定其部分碱基序列顺序。 j 目前，这些新的发光标记手段正逐步普及，商品化的试剂和仪器也在增多， 未来的发展趋势将是化学发光、生物发光技术在核酸探针标记中占主导地位。 1 2 6 化学发光在微全分析系统( t - t a s ) 中的应用 微全分析系统1 5 s - 6 ”，( m i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m ，即- w a s ) 是2 1 世纪分析 化学发展的方向之一，它是将所有化学分析过程中的各种功能及各种步骤微型化， 或叫芯片上的实验室( l a b - o n - a - c h i p ) ，把试样的采集、预处理、分离、反应、检 测等部分集成在几平方厘米的面积内，从而实现了分析检测的微型化、集成化、 一体化和自动化。由于芯片体积小，要求进样量少( 仅为纳升甚至皮升级) ，分析 时间短( 检测在秒级时间内完成) ，因此对检测手段和装置的要求有其特殊性。 z - t a s 的检测方法目前使用较多是激光诱导荧光( 1 a s e ri n d u c e d f l u o r e s c e n c e ，l i f ) 和电化学检测。l i f 检出限低，但要求检测对象必须能产生荧光或经衍生能产生荧 光，且对透光性不好的基体，l i f 很难应用。另外l i f 检测器价格昂贵，也限制 了它的应用。电化学检测器比较l i f 检测器也有一些不足，如对无电活性的物质 不能检测等。化学发光与芯片毛细管电泳的结合，兼备了毛细管电泳分离的高效 率、芯片的集成化和化学发光高灵敏度的优点，直接用于复杂样品中微量组分的 分离与测定。 5 m a n g r u 等 6 2 1 采用鲁米诺化学发光体系在玻璃芯片上进行毛细管分离后的化学 发光检测，进样体积仅为8n l 。a r o r a 等【6 3 】采用s u ( b p y 铲+ 电致化学发光体系， 在n l 级电解池中检测三丙胺的检出限为0 5p m o l l 。t s u k a g o s h i 等1 6 4 1 应用过氧草 酸盐( t c p 0 ) 化学发光体系在石英芯片上毛细管分离后的化学发光检测丹酰氨基 酸，进样体积仅为1 0 p l 。r i c h t e r 等睁l 设计了固定化酶的化学发光检测芯片，用于 黄嘌呤的化学发光研究，这一设计可望被发展成过氧化氢测定的芯片传感器。类 似的传感器还有章竹君等【叫设计的t 型芯片反应器。 这些研究表明，| c t - t a s 芯片与化学发光检测联用有极好的应用前景，尤其是 在基因诊断和生物大分子的分析中。 表1 1 近年发表的部分化学发光综述论文 6 化学发光新体系在无机 分析中的应用 化学发光分析在环境分 析中的应用 电致化学发光在分析中 的最新进展 化学发光和生物传感器 的新进展 化学发光免疫技术 化学发光免疫分析 生物发光及化学发光在 生物医学领域中应用进 展 化学发光及其在生物医 学中应用 2 0 0 0化学发光反应在分析化 学中的应用 2 0 0 0化学发光作为临床诊断 工具 2 0 0 1免疫细胞化学发光机制 与检测 2 0 0 1化学发光分析在环境分 析和药物分析中的应用 化学发光新体系在无机分析中的 应用，主要展现中国学者在该领域 的进展 综述了1 9 9 3 1 9 9 7 年化学发光分析 在环境分析中的应用 1 9 9 9 年以前5 年问文献评述 【7 6 1 原理、特点和应用实例 【7 9 】 技术介绍 原理、方法及以应用介绍 在细胞学检测、分子生物学研究、 卫生学检测、生物传感器、脂质过 氧化物检测以及药物筛选中的应 用情况 介绍某些生物组织和体液在某些 助氧化物和刺激物的作用下化学 发光的机理及其在是生物学中的 应用 反应机理 【8 0 【8 1 1 【8 2 1 i s g 从基本原理到实际应用 【2 6 对免疫细胞化学发光机制与检测 进行综述 评述了化学发光在环境和药物分 析中的应用及化学发光与其它分 析技术的联用 【8 5 】 【8 6 】 2 0 0 1流动注射化学发光分析化学发光分析在药品、环境和食品 【8 7 1 的应用等方面的应用 。 2 0 0 1流动化学发光体系在药按强氧化剂、鲁米诺光泽精等体系 【8 8 】 物分析研究进展进行分类评述 2 0 0 2高效液相色谱及毛细管综述了鲁米诺及其各种衍生化试 【2 5 】 7 哟 哟 唠 咖咖咖 1 l 1 2 2 2 电泳的鲁米诺型化学发 光衍生化试剂 气相色谱分析中硫和氮 化学发光检测法 化学发光分析法应用新 进展 化学发光传感器的研究 进展 用于毛细管电泳分析的 超灵敏化学发光检测 化学发光测定金的进展 活性氧的化学发光测定 法 电化学发光传感器研究 进展 电生试剂的化学发光研 究与应用 生物分子的诱导化作为 毛细管电泳讹学发光检 测 液相色谱及毛细管电泳 分析中试剂诱导方法的 新进展 化学发光色谱柱后检测 技术及其应用 2 0 0 3化学发光在临床分析中 应用 2 0 0 3生物样品中n o 的测定 2 0 0 4发光分析 2 0 0 4化学发光传感器研究进 展 剂在h p l c 和c e 中的应用 硫、氮专用检测器 涉及无机、有机、生物活性氧等多 方面 生物组分固定化 以鲁米诺和过氧化草酸酯体系为 主 对化学发光测定金进行评述 活性氧及自由基 介绍电化学发光传感器近几年取 得的研究成果 介绍电生b r o 、a o 、h 2 0 2 等的 化学发光研究与应用 衍生化反应 u 0 和c e 分析中试剂诱导方法的 【9 8 】 新进展 介绍国内外有关化学发光作为 h p l c 、c e 和芯片等柱后检测的新 技术和新应用 介绍免疫标记、核酸探针技术、活 性检测以及各种分离技术的联用 气相化学发光作为n o 测定手段 评述我国发光分析的发展概况 综述了1 9 9 9 年以后国内外化学发 光传感器研究进展 【9 9 】 【l o o 0 0 l 】 【1 0 2 】 0 0 3 8 p 凹 阻 陧 阴蔓；_ ： 瞰 阿 阶 耄| 耋| 薹| 薹| 耋 啷 啷 瞄 瞄 抛 姗 珊 瑚 瑚嬲 嗍 嬲 嬲 析 研究的新进展 2 0 0 4电化学发光分析研究进 展 2 0 0 4 2 0 0 4 2 0 0 4 化学发光分析法应用进 展 化学发光分析及其在药 理学上的应用 化学发光技术在蛋白质 和d n a 分析中的新进 展 ， 化学发光免疫分析 化学发光试剂研究新进 展 化学发光试剂在有机分 子检测中的应用 吖啶类化合物化学发光 机理的研究和应用 2 0 0 5电化学发光在基因检测 中的应用 2 0 0 5高效液相色谱- 化学发光 法在药物分析中的运用 学领域的最新研究进行评述以及 在分析检测中的应用 简要综述了电化学发光体系和分 析技术以及在临床分析中应用的 研究进展 介绍了化学发光试剂的类型，化学 发光在无机、有机及药物分析中的 应用 介绍几种化学发光体系及其原理， 综述化学发光分析在药理学上的 应用 对化学发光技术在蛋白质和d n a 分析中的较有特色的新进展进行 了评述 综述了化学发光免疫分析的基本 原理及应用 综述了近十年来几种主要化学发 光试剂的研究新进展 介绍了化学发光试剂的发展历程 及主要类型，综述自1 9 9 7 年以来 化学发光试剂在有机分子检测中 的应用 总结了吖啶类化合物作为化学发 光试剂的国内外发展概况，并对其 作用机理及应用进行概括和总结 概述了电化学发光的基本原理、传 统的基因检测技术和当前基因检 测中的应用现状，并对其前景作了 展望 评述了近5 年来