（预防兽医学专业论文）同时检测四种病原菌的pcr方法的研究.pdf

山东农业大学硕十论文 中文摘要 食品安全突发事件频率高是近年来食品安全问题的一个显著特点， 在各种食品安全事件中，细菌性食物中毒则是食物中毒的重要因素。常 见的食源性致病菌主要有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核增生李斯特 氏菌、致泻性大肠杆菌等。目f j i ，国内检测食品中致病菌主要采用传统 的培养方法，其操作繁琐，检测时间较长，通常需要一周才能完成，且 灵敏度较低。近年来，针对某一种或一类致病菌的检验方法被建立起来， 但是一旦检测的方向有误就会造成时间和药品的浪费。因此，急需建立 一种快速有效且通量较高的检测方法。 为建立一种同时检测四种常见动物源致病菌的p c r 方法。本研究针 对大肠杆菌的( 1 6 s 2 3 sr r n a ) 基因、金黄色葡萄球菌的( n u e ) 基因、单增 李斯特氏杆菌的( h l y a ) 基因以及沙门氏菌的( i n v a ) 基因分别设计合成 了四对特异性引物，p c r 扩增的目的基因片段分别为6 6 2b p 、4 8 4b p 、 3 7 2b p 、2 8 4b p 。试验过程中对多重反应体系中引物添加量、镁离子浓 度、d n t p 添加量及退火温度、延伸温度等影响要素进行优化，确定了 适宜的多重反应体系和扩增程序，其反应体系为1 0 x p c rb u f i e r5 此， m 9 2 + ( 2 5 m m ) 3g l ，d n t p ( 2 5m m ) 4g l ，t a q 酶( 2 5u ) 1p l ，模板各2 此， 引物按文中所述终浓度各1 5 此，无菌双蒸水补齐至5 0 肛l 。多重p c r 扩增程序为：9 4 起始变性5m i n ，9 4 变性4 5s ，5 7 退火1m i n ， 7 0 延伸1m i n3 0s ，扩增3 2 个循环，最后一个循环于7 0 延伸2 0m i n 。 建立的多重p c r 方法具有敏感、特异、准确、快速的优点，检测 时间为5 h 左右。为研发同时检测人畜共患病食源性主要致病菌即大肠 杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏杆菌及沙门氏菌的试剂盒奠定了 基础。 关键词：多重p c r ：食品检测；大肠杆菌；会黄色葡萄球菌；单增李 斯特氏杆菌；沙门氏菌 a b s t r a c t f o o ds a f e t ye m e r g e n c i e sa r eh i g hf r e q u e n c yi nr e c e n t y e a r s i nt h e s e p r o b l e m s ，t h ef o o dp o i s o n i n gr e s u l to fb a c t e r i a lp a t h o g e n sw a st h em o s t h a r m f u l a c c o r d i n gt od a t ac a m ef r o mh o s p i t a l sa n di n s p e c t i o n q u a r a n t i n e d e p a r t m e n t s ，m em a i nb a c t e r i a lp a t h o g e n sw e r e s t a p h y l o c o c c u s a u r e u s s a l m o n e l l as p p ，l i s t e r i am o n o c y t o g e n e sa n ds oo n s i n c ec o n 胁j n a t i o n l e v e l sa r eg e n e r a l l yl o wi nf o o d s ，d e t e c t i o nm e t h o d sr e q u i r el e n g t h yc u l t u r e e n r i c h m e n ts t e p st oi n c r e a s et a r g e tb a c t e r i a ln u m b e r sb e f o r ei s o l a t i o na n d i d e n t i f i c a t i o nu s i n gs t a n d a r dc u l t u r a lp r o c e d u r e s t h e s ec o n v e n t i o n a lf o o d m i c r o b i o l o g i c a lt e c h n i q u e so f t e nr e q u i r es e v e r a ld a y st od e t e c tb a c t e r i a l p a t h o g e n sp r e s e n ti nf o o d sa tl o wl e v e l s w i t ht h ea d v e n to fp c r ，i n d i v i d u a l p c ra s s a y sh a v eb e e nd e v e l o p e df o rd e t e c t i o na n di d e n t i f i c a t i o n o ft h e b a c t e r i a lp a t h o g e n s b u ta l a r g en u m b e ro fi n d i v i d u a lp c ra s s a y sw o u l db e n e c e s s a r yi fs i n g l ep r i m e rs e t sa r eu s e di ns e p a r a t er e a c t i o n so nal a r g e n u m b e ro f f o o d s a m p l e s ，w h i c h c a nb ear e l a t i v e l y c o s t l y a n d t i m e 。c o n s u m i n gp r o c e s s t or e d u c et h en u m b e ro ft e s t sn e e d e df o rd i a g n o s i s o fi n d i v i d u a lp c ra s s a y s ，t h es i m u l t a n e o u sd e t e c t i o no fs e v e r a lp a t h o g e n s w i t ham u l t i p l e xp c r ( m p c r ) a p p r o a c hw o u l db e r e l a t i v e l yr a p i da n d c o s t e f f e c t i v e f o re s t a b l i s h i n gam e t h o do f d i a g n o s i n gf o u rs p e c i e sc o m m o na n i m a l b o r n e p a t h o g e n i cb a c t e r i a s i m u l t a n e o u s l yb ym u l t i p l e xp c r f o u rp a i r so f s p e c i f i cp r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h eg e n e16 s 2 3 sr r n ao f e s c h e r i c h i ac o l i ，t h eg e n eh u eo fs t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，t h eg e n eh l y ao f l i s t e r i am o n o c y t o g e n e sa n dt h eg e n ei n v ao fs a l m o n e l l as p p t h et a r g e t g e n ef r a g m e n ta m p l i f i e db yp c rr e s p e c t i v e l yw a s6 6 2b p ，4 8 4b p ，37 2b p ， 2 8 4b p ，i nt h ep c rp r o c e s s ，d n ac o n c e n t r a t i o n ，m 9 2 + c o n c e n t r a t i o n ， t e m p l a t ev o l u m e ，a n n e a l i n gt e m p e r a t u r ea n dp c rc i r c l e sa r eo p t i m i z e dt o d e t e r m i n et h eo p t i m a lp c r t h er e a c t i o nm i x t u r ec o n s i s t e do f5 0p l ， io x p c rb u f f e r5p l ，m g z 十( 2 5 m m ) 3 肛l ，4 “lm i x t u r eo fd n t p s ，t a q 2 山东农业人学硕上论文 e n z y m e ( 2 5u ) 1p l ，t e m p l a t e2p l ，d d h 2 0t o5 0p l t h er e a c t i o nw a sr u n u n d e rt h ef o l l o w i n gc o n d i t i o n s ：c o o ls t a r t ；d n ap r e d e n a t u r a t i o na t9 4 。c f o r5m i n ，d n ad e n a t u r a t i o na t9 4 f o r4 5s ，p r i m e ra n n e a l i n ga t5 7 cf o r 1m i n ，a n dd n ae x t e n t i o na t7 0 f o r1m i n 3 0 s ，r u n3 2c y c l e s ；t h ef i n a l e x t e n t i o nw a sp e r f o r m e da t7 0 cf o r2 0m i n t h ee s t a b l i s h e dm u l t i p l e xp c rm e t h o dw h o s ei n s p e c t i o nt i m ew a s a b o u t5 hh a dt h ea d v a n t a g e so fs e n s i t i v e ，s p e c i f i c ，a c c u r a t ea n dr a p i d i t l a y st h ef o u n d a t i o nf o rr e s e a r c h i n ga n dd e v e l o p i n ga k i tt h a td e t e c t st h em a i n f o o d h o m ep a t h o g e n i cb a c t e r i u mo fz o o n o s i s s i m u l t a n e o u s l y ，t h a t i s e s c h e r i c h i ac o l i ，s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，l i s t e r i am o n o c y t o g e n e sa n d s a l m o n e l l as p p k e y w o r d s ：m u l t i p l e xp c r ； f o o d i n s p e c t i o n ； e s c h e r i c h i a c o l i ； s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ；l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s ；s a l m o n e l l as p p 3 山东农业大学硕十论文 符号说明 4 3 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进 行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指 导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确 说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论 文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机 构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：蚴 签耋：肇印 日 期：一。一 f 同时检测叫种病原菌的p c r 方法的研究 引言 l 立题背景及意义 1 1 食品安全问题的紧迫性 食品安全是公共卫生问题中最应重视的环节，据世界卫生组织报道 全球每年发生食源性疾病的病例高达一亿例，全球每年约有17 0 万儿章 死于由食源性微生物污染引起的腹泻病，成年人的感染病例达到数十 亿；在发达国家，至少有1 3 的人患食源性疾病，其中，由食源性致病 菌引起的病例占大多数。 我国是一个食品生产和消费大国，随着市场经济的快速发展和生活 水平的提高，特别是加入w t o 后，消费者对食品安全更加关注，食品 安全与食品贸易的关系更为密切，提高我国食品安全水平的要求越来越 迫切，由于近几年频繁爆发食品安全重大事件，国务院发展研究中心组 建了中国食品安全战略研究课题组，开展了关于中国食品安全战略的研 究工作。为了完成本项研究任务，国务院发展研究中心组织力量开展了 跨部门、跨学科的协作，先后有国内5 0 余家机构、1 5 0 多位研究人员参 与了课题研究。 研究发现，目前我国食品安全领域存在如下问题：( 1 ) 微生物污染 是影响我国食品安全的最主要因素。( 2 ) 在投入品供给，农业产地环境， 防疫体系，农产品生产、加工以及销售等环节仍然存在安全隐患。( 3 ) 食品安全科技成果和技术储备不足。( 4 ) 食品安全标准体系、检验检测 体系、认证认可体系等方面还存在明显的不适应性，食品安全管理体制 和法律法规体系有待完善。( 5 ) 食物中毒和食源性疾病仍然对中国的食 品安全构成了明显的威胁，重大食品安全事故屡有发生。 食源性疾病是我国人口的重要疾病来源，也是食品安全问题最直接 的表现之一。解决食品安全问题不但可以预防与控制食源性疾病的发生 和传播，还可以避免全球贸易扩大食源性疾病的流行，同时也是为了更 好的解决世界贸易中存在的技术壁垒。我国今年更是修订了新食品安 全法，将食品安全列入了国家重点关注项目。 4 山东农业大学硕十论文 1 2 食品安全检测的重要性 检测技术是一个国家食品安全科学发展的核心标志，是一个国家食 品安全监管能力的重要体现。近年来欧美等发达国家投入大量资金对食 品安全检测关键技术进行攻关，检测技术水平快速提高，并以此为基础 对残留限量标准提出越来越高的要求，限制残留超标的国外产品进入。 因此，突破检测技术的制约，成为了保障我国食品安全、应对贸易非关 税技术壁垒的关键。 欧美等发达国家自2 0 世纪6 0 年代开始对食品中药物残留进行了研 究，7 0 年代就开展了食品药物残留的检测工作，现已形成了非常完善的 检测体系，包括法律法规体系、监督管理体系、检测机构体系、技术 队伍体系和技术标准体系。我国动物性食品药物残留的研究和监控工作 起步较晚，检测技术及手段落后，限量标准和检测方法标准很不完善甚 至缺乏，严重制约了对动物性食品安全的有效监控。 为确保我国食品安全与食品贸易，必须大力加强食品检验的力度， 在我国建立、健全食品安全法规，加强食品安全监控，提高检测技术， 使我国相应的法规、标准与国际接轨，特别是食品快速检测技术达到国 际先进水平。 2 病原菌简介 世界卫生组织将食源性疾病定义为，通过摄食进入人体的，使人体 患感染性或中毒性的疾病。人类有6 0 的疾病都与动物疾病有关，近些 年出现的新型疾病中，这一比例更是高达7 5 ，在养殖业高度发达、人 与动物多层面接触的今后，这一比例恐怕还会升高。常见的食源性致病 菌包括沙门氏菌属、致病性大肠杆菌、葡萄球菌及毒素、变形杆菌属、 副溶血性弧菌、李斯特菌、肉毒梭菌毒素、蜡样芽抱杆菌、韦氏梭菌、 弯曲杆菌、酵米面椰毒假单胞杆菌、结肠炎耶尔森氏菌、链球菌及志贺 氏菌属等。 在各种食物中毒中，细菌性食物中毒是食物中毒的主要因素。本研 究针对在我国食物中毒中最常见的致病菌，旨在寻求一种食物中毒诊断 及食品检测的有效方法。根据g b4 7 8 9 1 食品卫生微生物学检验总则和 g b4 7 8 9 1 7 肉与肉制品检验中的相关要求以及结合我国目前食源性致 5 同时检测四种病原菌的p c r 方法的研究 病菌的发生发展情况，选取以下四种细菌作为检测对象：沙门氏菌、大 肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏杆菌。 2 1 大肠杆菌 2 1 1 生物学特性大肠杆菌为革兰氏阴性两端钝圆的短杆菌，其宽在 1 1 1 5 9 m 长在2 0 6 0 1 , t m 。大小为o 4 0 7 l , t m x 2 3 岬。大多数菌株周生 有鞭毛，能运动；部分菌株具有荚膜或微荚膜；不形成芽孢。大肠杆菌 为需氧或兼性厌氧，最适生长温度为3 7 ，在4 2 4 4 条件下仍能生长， 生长温度范围为1 5 4 6 。在普通营养琼脂培养基上生长良好。大肠杆 菌能发酵葡萄糖、麦芽糖等多种糖类并产酸产气，大部分菌株可发酵乳 糖。大肠杆菌对热抵抗力较其它肠道菌要强，经5 5 加热6 0m i n 或 6 0 1 5m i n 仍可有部分菌存活。盐、亚硝酸盐和煌绿染料等对大肠杆菌 有选择性抑制作用。大肠杆菌的抗原主要有o 、k 、h 三种。o 抗原是 耐热的菌体抗原，即菌体的内毒素，1 2 1 高温均不被破坏，目前大约 有1 7 3 种，是血清学分型的基础。k 抗原是菌体的表面抗原，存在于荚 膜、被膜体表部分的抗原，大约有1 0 3 种。h 抗原为鞭毛抗原，约有5 6 种。 2 1 2 流行病学大肠杆菌是寄居在温血动物肠道后段的条件性致病 菌。可随粪便排出体外而污染土壤、饮水、饲料等，当机体抵抗力下降 或其侵入肠外组织或器官时，可作为条件致病菌而引起肠道外感染致 病，给畜牧养殖业带来严重的威胁。因此在生产实践中一定要高度注意 奶牛的环境卫生，并采用综合性疾病防治措施。在奶牛粪便中分离到的 4 0 株疑似大肠杆菌中有6 株，为致病性菌株，并证明这些菌株毒力较强， 占分离总菌数的1 5 0 。 2 1 3 致病性根据毒力因子与发病机制的不同，与动物疾病有关的病 原性大肠杆菌有产肠毒素大肠杆菌、产类志贺毒素大肠杆菌、败血性大 肠杆菌、尿道性致病性大肠杆菌等。 某些血清型大肠杆菌能引起人类腹泻。其中肠产毒性大肠杆菌会引 起婴幼儿和旅游者腹泻，出现轻度水泻，也可呈严重的霍乱样症状。腹 泻常为自限性，一般2 - - 3 天即愈，营养不良者可达数周，也可反复发 作。肠致病性大肠杆菌是婴儿腹泻的主要病原菌，有高度传染性，严重 6 坐垄奎兰兰叁兰堡! ：笙文 者可致死。细菌侵入肠道后，主要在十二指肠、空肠和回肠上段大量繁 殖。此外，肠出血性大肠杆菌会引起散发性或暴发性出血性结肠炎，可 产生志贺氏毒素样细胞毒素。大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 是其中危害较大的菌 型，常见于温血动物的肠内。其释放的强烈的毒素，能导致肠管出现严 重症状，如严重的水泻、带血腹泻、发烧、腹绞痛及呕吐。情况严重时， 更可能并发急性肾病。5 岁以下的儿章出现该等并发症的风险较高。若 治疗不当，可能会致命。 2 2 金黄色葡萄球菌 2 2 1 生物学特性典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径o 8p m 左右， 显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚 膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上 生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度3 7 ，最适生长p h7 4 。平 板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1 2n l l l l 。血平板菌落周围形成 透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在1 0 1 5 n a c i 肉 汤中生长。 2 2 2 流行病学金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰 尘及人和动物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的机会很多。 近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二 位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，在 美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒 的3 3 ，加拿大则更多，占到4 5 ，我国每年发生的此类中毒事件也非 常多。 金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点：季节分布，多见于春 夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油 煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻 腔带菌率8 3 ，所以人畜化脓性感染部位，常成为污染源。 一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品：食品加工人员、 炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在 加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装 不密封，运输过程中受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时， 7 同时检测p q 种病原菌的p c r 方法的研究 对肉体其他部位的污染。 2 2 3 致病性金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可 引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血 症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产 生的毒素和侵袭性酶：a 溶血毒素：外毒素，分0 【、p 、小6 四种，能损 伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；b 杀白细胞素：可 破坏人的白细胞和巨噬细胞；c 血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人 体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞 噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；d 脱氧 核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用 来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；e 肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数 种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为a 、b 、c 1 、c 2 、c 3 、d 、 e 及f 八种血清型。肠毒素可耐受1 0 0 煮沸3 0 分钟而不被破坏。它引 起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮 素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。 2 3 单核增生李斯特氏杆菌 2 3 1 生物学特性该菌为革兰氏阳性短杆菌，长约1 0 2 0l x m ，直或稍 弯，两端钝圆，常呈v 字型排列，偶有球状、双球状、兼性厌氧、无芽 胞，一般不形成荚膜，但在营养丰富的坏境中可形成英膜，在陈旧培养 中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性，该菌有4 根周毛和1 根端毛，但周毛 易脱落。 该菌营养要求不高，在2 0 2 5 * c 培养有动力，穿刺培养可见倒立伞状 生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。该菌的生长范围为 2 4 0 c ，也有报道在0 c 能缓慢生长，最适培养温度为3 5 3 7 ，在中 性至弱碱性( p h9 6 ) 、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生 长良好，在肉汤中生长良好。在固体培养基上，菌落初始很小，透明， 边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。在5 7 的血 平板上，菌落通常也不大，呈灰白色。 2 3 2 流行病学单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融， 能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、 8 山东农业人学硕士论文 烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔、粪便的 途径进行传播。据报道，健康人粪便中单增李氏菌的携带率为0 6 - - - 1 6 有的人可短期带菌，轧8 的水产品、5 1 0 的奶及其产品、3 0 以上的 肉制品及1 5 以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入软奶酪、未充 分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生 牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染， 约占的病例是由被污染的食品引起的。该菌可通过眼及破损皮肤、粘膜 进入体内而造成感染，孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿， 栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接触也是本病传播的可能途 径，且有上升趋势。 2 3 3 致病性单增李氏菌进入人体后是否发病，与菌的毒力和宿主的 年龄、免疫状态有关，因为该菌是一种细胞内寄生菌，宿主对它的清除 主要靠细胞免疫功能。因此，易感者为新生儿、孕妇及4 0 岁以上的成 人。此外，酗酒者、免疫系统损伤或缺陷者、接受免疫抑制剂和皮质激 素治疗的患者及器官移植者也易被该菌感染。该病的临床表现，健康成 人个体出现轻微类似流感症状，新生儿、孕妇、免疫缺陷患者表现为呼 吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、昏迷、自然 流产、脑膜炎、败血症直至死亡。 单增李氏菌的抗原结构与毒力无关，它的致病性与毒力机理如下： 寄生物介导的细胞内增生，使它附着及进入肠细胞与巨噬细胞；抗活化 的巨噬细胞，单增李氏菌有细菌性过氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬 细胞内的过氧物分解；溶血素，即李氏杆菌素o ，可以从培养物上清液 中获得，活化的细胞溶素，有仅和p 两种，为毒力因子；内化素，l m 通过吞噬作用进入宿主细胞体内，有些细胞如巨噬细胞是专职吞噬细 胞，通常吞噬细菌并将其杀灭，而其它的上皮细胞和内皮细胞则为非专 职吞噬细胞，但可经过诱导产生吞噬细胞的能力。 2 4 沙门氏菌 2 4 1 生物学特性沙门氏菌为革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌，较大 肠杆菌细，直径o 7 1 5 岬，散在或成对，无荚膜和芽胞，大多数血清 型周身具有鞭毛，可运动，其具有的菌毛可使其吸附于宿主细胞表面或 9 同时检测四种病原菌的p c r 方法的研究 凝集豚鼠红细胞。 沙门氏菌为需氧及兼性厌氧菌，在普通琼脂培养基上生长良好，培 养2 4 小时后，形成中等大小、圆形、表面光滑、无色半透明、边缘整 齐的菌落，其菌落特征亦与大肠杆菌相似，无粪臭味。在麦康凯、s s 、 伊红美兰等鉴别培养基上培养，一般为无色菌落，三糖铁琼脂斜面斜面 为红色，底部变黑并产气。 2 4 2 流行病学沙门氏菌病全年皆可发生，多见于夏、秋两季，5 l o 月发病起数和发病人数可达全年发病总起数和总人数的8 0 。由于沙门 氏菌属广泛分布于自然界，在人及动物，如家畜中猪、牛、马、羊、猫、 犬、家禽中鸡、鸭、鹅等均有广泛的宿主。因此，沙门氏菌污染肉类食 物的几率很高，特别是畜肉类及其制品，其次为禽肉、蛋类、乳类及其 制品，由植物性食品引起者很少。 沙门氏菌污染途径主要有：家畜、家禽的生前感染和宰后污染；患 沙门氏菌病的奶牛其乳受污染；禽类原发和继发感染使卵巢、卵黄、全 身带菌外，禽蛋在经泄殖腔排出时，粪便中的沙门氏菌污染肛门腔内的 禽蛋蛋壳，并可通过蛋亮气孔侵入蛋内亦容易受到污染蛋类；烹调后的 熟制品可再次受到带菌容器，烹调工具等污染或食品从业人员带菌者的 污染等。 2 4 3 致病性沙门氏菌食物中毒发病率较高，占总食物中毒的 4 0 6 0 ，最高可达9 0 。沙门氏菌致病力强弱与菌型有关，致病力越 强的菌型越易致病，猪霍乱沙门氏菌致病力最强，其次为鼠伤寒沙门氏 菌，鸭沙门氏菌致病力较弱，对于幼儿、体弱老人及其他疾病患者等易 感性较高的人群，即便是较少菌量或较弱致病力的菌型仍可引起食物中 毒，甚至出现较重的临床症状。 引起食源性疾病的沙门氏菌属的血清型很多，有2 3 0 0 多个血清型， 我国有2 0 0 多种。沙门氏菌属食物中毒一般多由鼠伤寒沙门氏菌、肠炎 沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌所引起，进入肠道后大量繁殖，除使肠道粘 膜发炎外，大量活菌释放的内毒素可同时引起机体中毒。沙门氏菌随同 食物进入消化道后，摄入量在1 0 万个以上的才出现临床症状，但对于 儿童、老人和体弱者较少量的细菌也可出现临床症状。此外，与不同沙 1 0 山东农业大学硕士论文 门氏菌致病力强弱有一定的关系。常引起肠热症、胃肠炎、败血症等症 状。 沙门氏菌的主要致病物质：1 侵袭力：沙门氏菌属有毒株能侵袭小 肠粘膜，先粘附至m 细胞表面，引发细胞肌动蛋白重排、内在化，菌存 在于吞噬泡，吞噬泡转送未经降解的菌并释放至上皮下区，菌被固有层 中的巨噬细胞吞噬。沙门菌的粘附和穿入宿主细胞，是由染色体上的侵 袭基因i n v 介导。2 内毒素：沙门菌死亡后释放的内毒素，可引起宿主 体温升高、白细胞数下降，大剂量时导致中毒症状和休克。2 肠毒素： 个别沙门菌可产生肠毒素。 3 食品安全检测的研究进展 食源性疾病病原的检测技术是食源性疾病的预防与控制的关健技 术环节。随着时代的进步，以及人们对危害健康的致病微生物的逐步重 视，食品安全检测方法的先进性、灵敏度、特异性要求都在不断提高， 致病微生物快速检测技术也随着科学技术水平的日新月异而不断发展， 目前在国际上，已将很多先进的技术应用于食源性微生物检测领域。 3 1 传统检测方法 传统的培养方法一般包括前增菌、选择性增菌、选择性平板分离、 生物化学筛选和血清学鉴定五个步骤。原理是根据不同病原体的化学组 成或所产生的代谢产物各异，利用微生物的不同生化和生理等特性，对 细菌进行鉴定。缺点是无法对人工难以培养的致病微生物进行检测。 3 2 免疫学方法 免疫检测的基本原理是抗原抗体反应，抗原抗体反应是指抗原与相 应抗体之间所发生的特异性结合反应。不同的微生物有其特异的抗原并 能激发机体产生相应的特异性抗体。免疫检测技术包括免疫荧光技术、 酶联免疫吸附技术、蛋白芯片检测技术、荧光细菌噬菌体分析等。此外 还有一些基于免疫学原理的快速检测设备。 3 3 分子生物学方法 分子生物学检测技术的发展，为微生物食物中毒快速检测提供了良 好的技术平台。随着微生物学、生物化学和分子生物化学的飞速发展， 对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等 同时检测四种病原菌的p c r 方法的研究 一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结 构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，核酸探针、聚合 酶链反应等技术以其敏感、特异、简便、快速的特点成为世人瞩目的生 物技术革命的新产物，已逐步应用于食源性病原菌的检测。 4 多重聚合酶链式反应 4 1 聚合酶链式反应原理 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o np c r ) ，是由k l e p p e 等人在1 9 7 1 年首先提出，1 9 8 5 年有美国p e c e t u s 公司人类遗传研究室 的m u l l i s 等发明的具有划时代意义的技术，它是一种在体外快速扩增 特定基因或序列的方法，故又称为基因的体外扩增法，也称为无细胞克 隆系统。它可以在试管中建立反应，数小时后能将极其微量的目的基因 或某一特定的片段扩增数十万倍，乃至千百万倍，并且无须通过烦琐费 时的基因克隆程序，便可以获得足够数量的精确的d n a 拷贝。 其原理是：在存在模板d n a 、特异性引物、d n t p 、适当缓冲液的反 应混合物中，在热稳定聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的 片段进行扩增。整个反应过程由变性一退火延伸三个基本反应步骤构 成：模板d n a 的变性：模板d n a 经加热至9 4 左右一定时问后，使模 板d n a 双链结璇成为单链；模板d n a 与引物的退火复性：温度降至5 5 左右，引物与模板d n a 单链的互补序列配对结合；引物的延伸：模板 d n a 一引物结合物在t a qd n a 聚合酶的作用下，以d n t p 为反应原料，按 碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板链互补的半保留复制 链，循环进行，而且每一循环产生的片段均能成为下一次循环的模板， 故扩增的目标是呈指数增加，通常单一拷贝的基因经2 5 3 0 个循环可扩 增1 0 0 万- - 2 0 0 万倍。 目标序列最终扩增的拷贝数可由以下等式得出：( 2 “- - 2 n ) x ，其中n 代表扩增反应的循环数，x 是最初模板的拷贝数，2 n 是整个反应过程中 产生的长度不均一的片段。 4 2 多重p c r 特点 多重p c r 是通过在同一个p c r 反应体系中，引用多对引物，同时完 成多个特异性目的基因片段的扩增方法，实现了对多种菌的同步检测， 1 2 山东农业大学顾上论文 更加节省时间和成本，是快速检测致病菌的重要研究方向。其优点如下： ( 1 ) 高效性：在同一p c r 反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个 型别的目的基因进行分型，且所需模板或样品量极少。( 2 ) 系统性：多重 p c r 很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒、肠道致病性细菌、性病、 无芽胞厌氧菌等的同时检测。( 3 ) 经济简便：多种病原体在同一反应管内 同时检出，将大大节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更 多更准确的诊断信息。多重p c r 要求不同的引物能在同一反应体系中进 行各自的特异性扩增，但它的体系建立和条件优化过程需要较长的时 间，这也限制了该方法的推广应用。 4 3 多重p c r 在对病原检测中的应用 4 3 1 多种病原微生物的同时检测或鉴定多重p c r 是在同一p c r 反应 管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行p c r 扩增。可用于同 时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染，常见可系统组合的 有：( 1 ) 肝炎病毒的感染：在同一病人或同一供血者体内，有时存在多种 肝炎病毒重叠感染，有时是甲乙丙型肝炎病毒重叠，有时可能是甲乙型 肝炎病毒重叠，有时是乙丙型肝炎病毒重叠。( 2 ) 肠道致病性细菌的检 测：如伤寒，痢疾和霍乱，有时具有较相同的肠道症状，有时痢疾霍乱 同存一病人并同时发病。( 3 ) 性病的检测：如梅毒，淋病及艾滋病的诊断。 ( 4 ) 生物战剂细菌的检测：如破伤风杆菌，产气荚膜杆菌，炭疽杆菌，鼠 疫杆菌等侦检。( 5 ) 需特殊培养的无芽胞厌氧菌，如脆弱类杆菌、艰难 杆菌的鉴定等。 4 3 2 病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定某些病原微生物、 遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个好发部位，多重p c r 可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等。可系统应用的有：乙型肝 炎病毒亚型的分型；乳头瘤病毒的分型；单纯疮疹病毒的分型；杜氏肌 营养不良症的分型及癌基因的检测等。 5 本研究的任务及目的 本研究以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏杆菌、沙门氏 菌四种食源性致病菌为检测对象，旨在研究建立一种快速、有效、简便 的多重p c r 检测方法。 同时检测四种病原菌的p c r 方法的研究 研究内容 试验一：同时检测四种病原菌的p c r 方法的建立 l 材料与方法 1 1 试验材料 1 1 1 菌株 本试验所用标准菌株为：大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l ia t c c3 5 2 1 8 ) ， 金黄色葡萄球菌( s t a a u r e u s a t c c2 5 9 2 3 ) ，单增李斯特氏杆菌( l i s t e r i a m o n o c y t o g e n e sc v c c1 5 9 7 ) ，沙门氏菌( s a l m o n e l l as p pc v c c5 4 2 ) ，无 乳链球菌( s t r a g a l a c t i a ec v c c1 8 8 6 ) ，均为本实验室收藏的保存菌株， 保存于山东农业大学动物科技学院传染病研究室。 1 1 2 主要溶液 1 0 s d s 裂解液：将1 0g 高纯度的s d s 置于烧杯中，加入约8 0m l 的 d d h 2 0 ，6 8 c 力h 热溶解，滴加浓盐酸调节p h 值至7 2 ，定容至1 0 0m l 后，室温保存。 t e ( p h 8 0 ) - 1 0m m o l lt r i s - c i ( p h 8 o ) ，lm m o l le d t a ( p h 8 0 ) 5 x t b e 5 4gt r i s 、2 7 5g 硼酸、2 0m l0 5m o l le d t a ( p h 8 0 ) ，加双 蒸水定容至1 0 0 0 m l ，工作液为o 5 5 0 x t a e ：2 4 2g i r i s ，5 7 1m l 冰醋酸、1 0 0m l0 5m o l le d t a ( p h 8 o ) ， 加三蒸水定容至1 0 0 0m l ，工作液为1 e b 溶液( 1 0 m g m l ) 在1 0 0m l 双蒸水中加入1g 溴化乙锭，磁力搅拌 至其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，室温保存。 1 1 3 其他主要试剂 d l 2 0 0 0d n a m a r k e r 、琼脂糖( 电泳纯) 、t a qd n a 聚合酶、d n t p 、m g c l 2 、 1 0 x p c rb u f f e r 、细菌基因组d n a 纯化试剂盒均购自大连宝生物工程公 司，无水乙醇、苯酚、氯仿等均为国产分析纯产品。 1 2 试验方法 1 2 1 细菌的培养 取灭菌l b 培养基分别接种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核增生 1 4 山东农业大学硕上论文 李斯特氏杆菌、沙门氏菌、置于2 0 0r m i n 摇床震荡，3 7 * ( 2 过夜培养。 1 2 2 模板d n a 的制备 将待测菌株接种于液体l b 培养基中，于3 7 ，2 0 0r m i n 摇床过夜培 养。取菌液2 0 0 此于1 5m l 离心管，1 2 0 0 0r m i n 离心2m i n ，弃上清液， t e 缓冲液( p h = 8 o ) 洗涤，于沉淀中加入c h e l e x 提取液( 2 5 c h e l e x 1 0 0 ， 0 5 n p4 0 ，t e 缓冲液配制，p h = 9 0 ) ，重悬菌体，加入1g lr n a s e a ， 于5 6 孵育3 0m i n ，取出震荡1 0 1 5s ，1 0 0 水浴1 0m i n ，取出震荡1 0 1 5 s ，1 2 0 0 0r m i n 离心2m i n ，取上清液即为模板d n a ，储存备用。 1 2 3 引物设计 靶基因的选择应具有种或属特异性，即种或属内共有，而种或属间 特异。本研究经过d n a m a n 软件进行同源性比较选取保守序列，金黄 色葡萄球菌根据n u c 基因，沙门氏菌根据i n v a 基因，单增李斯特氏杆菌 根据h l y a 基因，大肠杆菌根据1 6 s 2 3 sr r n a 基因，采用引物设计软件 p r i m e r5 0 进行分析，引物合成由上海生工生物技术公司完成。见表1 。 表1 多重p c r ：j i 物设计 t a b l e1d e s i g n e dp r i m e r so fm u t i p l e xp c r 同时检测四种病原菌的p c r 方法的研究 1 2 4 多重p c r 反应条件的优化 通过预试验及资料显示，我们发现有许多因素影响多重p c r 反应 成败，主要为：各引物组分浓度以及退火温度，m 9 2 + 浓度及延伸时间 等。在其他影响因素数值固定的情况下，微调任一影响因素数据，使其 在最适值左右进行摆动，以获得所有影响因素数据的最适值。 1 2 4 1 各引物组分浓度分别将各引物组分浓度按1 0n m m l 为梯度增 大，寻找最适引物浓度配比。 1 - 2 4 2 退火温度结合预试验，设定1 为梯度，5 4 5 8 的退火温度 测定。 1 2 4 3 镁离子添加量的优化反应体系中m 9 2 + 的添加量以l 此为梯 度，3 此为起始值，在所有梯度中寻找适宜添加量。 1 2 4 4t a q 酶与d n t p 添加量的优化5 0 肛l 反应体系中，t a q 酶添加量 以0 5p l 为起始值，0 1 皿为梯度，d n t p 以l l 为梯度，依次递增， 寻求最适宜添加量。 1 2 4 5 延伸温度及时间延伸时间自1m i n 起始，依次递增15s ，至2 m i n 。根据文献及预试验，考虑到长时间高温反应有可能影响到t a q 酶 的活力，比较7 0 与7 2 延伸温度。 1 2 5 多重p c r 反应特异性 分别取实验室保存的大肠杆菌( e s c h e r 纪h i ac o l ia t c c3 5 2 1 8 ) ，金 黄色葡萄球菌( s t a a u r e u sa t c c2 5 9 2 3 ) ，单增李斯特氏杆菌( l i s t e r ia m o n o c yt o g e n e s c v c c15 9 7 ) ，沙门氏菌( s a l m o n e l l as p pc v c c 5 4 2 ) 各 标准株作为阳性对照，无乳链球菌( s t r a g a l a c t i a ec v c c 18 8 6 ) 作为阴性 对照。使用表1 中四对引物混合物，分别对阳性对照和阴性对照进行扩 增试验，测试引物特异性。再以四种菌随机组合人工污染样品提取模板， 检测多重p c r 反应在实际检测中的特异性。 1 2 6 多重p c r 反应敏感性 分别培养四种标准菌，分光光度计测得o d 6 0 0 约为o 5 时，按1 0 u 1 0 叫 梯度进行1 0 倍稀释，