（环境工程专业论文）高效脱氮菌种保藏技术的研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 用于硝化细菌保藏。在缺氧条件下，采用自然温度、4 、2 0 、2 0 c ) j n 1 5 体积甘油四种方法保藏，硝化活性衰减速率分别为0 0 1 2d 一、0 0 2 1d 一、 0 0 1 9d - 1 、0 0 1 3d ，半衰期分别为1 7 l 、1 0 9 、1 2 2 、1 6 2 个月，饥饿保藏 5 个月后四种保藏方法的硝化活性保留率分别为1 6 0 、1 3 9 、2 0 8 、 2 0 4 。以自然温度保藏硝化细菌，活性保留率居中，但保藏成本较低。 2 、研究了厌氧氨氧化菌混培物保藏特性的变化规律，填补了厌氧氨氧化菌混 培物保藏技术的空白。 考察了厌氧氨氧化菌混培物保藏过程中血红素c 含量、硫化物含量、外源 硫酸盐含量及颜色的变化规律，研究证明血红素c 含量可定性表征厌氧氨氧 化活性，但受硫化物影响，缺氧保藏过程中混培物颜色变黑，可干扰颜色与 活性间的关系。 试验了间歇性饥饿对厌氧氨氧化菌混培物保藏性能的影响，研究表明在厌 氧氨氧化菌混培物保藏过程中，问歇性饥饿较长期性饥饿损害更大。缺氧条 件下，采用4 c j n 州h 4 ) 2 s 0 4 、4 c n 每1 0d 换一次n 0 2 - - n n h 4 + - n 浓度比 为1 3 2 的基质、4 加每1 0d 换一次n 0 2 - n n h 4 + - n 浓度比为1 6 3 的基质 三种方法保藏，保藏5 个月后，厌氧氨氧化活性保留率分别为7 4 7 、6 8 o 、 6 0 3 。 试验了温度对厌氧氨氧化菌混培物保藏性能的影响，研究表明4 加 0 n l n 4 ) 2 s 0 4 的缺氧保藏法最为有效，但自然温度加( n h 4 ) 2 8 0 4 的缺氧保藏法最 为经济。在缺氧条件下，采用4 c ) 3 1 ：1 ( n h 4 ) 2 s 0 4 、4 加n h 4 c l 、自然温度加 ( n h 4 ) 2 8 0 4 三种方法保藏，饥饿保藏5 个月后，厌氧氨氧化活性保留率分别 为7 4 7 、4 5 o 、6 4 2 。 关键词：硝化细菌混培物；厌氧氨氧化菌混培物：保藏特性；保藏方法 浙江火学硕士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t m i c r o o r g a n i s m sa r eak i n do fi m p o r t a n tn a t i o n a lr e s o u r c e ，a n dt h e i rp r e s e r v a t i o n i sam e a n so fs t o r i n gg o o ds t r a i na n dm e e t i n ga p p l i c a t i o nr e q u i r e m e n t s i nt h ef i e l do f w a s t e w a t e rt r e a t m e n t ，al o to fn o v e lb i o t e c h n o l o g i e ss u c ha ss h o r t c u tn i t r i f i c a t i o na n d a n a m m o x a ( 塑a e r o b i c a m m o n i u mo _ _ _ x x i d a t i o n ) p r o c e s s f o rn i t r o g e nr e m o v a lw e r e d e v e l o p e do v e rt h ep a s td e c a d e s ，s oal a r g ea m o u n to fq u a l i t ym i c r o o r g a n i s m sf o r n i t r o g e nr e m o v a la r en e e d e dt op r o m o t et h ea p p l i c a t i o no fn o v e lb i o t e c h n o l o g i e s c o m p a r e dw i t ho t h e rm i c r o o r g a n i s m s i ti sd i f f i c u l tt oo b t a i na n ds t o r eq u a l i t y n i t r i f y i n gb a c t e r i aa n da n a m m o xb a c t e r i ab e c a u s eo ft h e i rs l o wg r o w t ha n dh i g h s e n s i t i v i t yt oe n v i r o n m e n t t h e r e f o r e ，t h ep r e s e r v a t i o nm e t h o d so fn i t r i f y i n gb a c t e r i a a n da n a m m o xb a c t e r i aw e r es t u d i e d ，a n dm a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h ep r e s e r v a t i o nc h a r a c t e r i s t i c sw e r es t u d i e da n ds o m ee f f i c i e n tp r e s e r v a t i o n m e t h o d sw e r es u g g e s t e df o rm i x e d n i t r i f y i n gc u l t u r e a sp r e s e r v a t i o ne v a l u a t i o ni n d e x ，n i t r i f y i n ga c t i v i t yi sb e t t e rt h a nt o t a l b i o m a s s a f t e rp r e s e r v a t i o nf o r5m o n t h s t h es u r v i v a lb i o m a s sp e r c e n t a g ew a s2 5t o 3 9t i m e sl a r g e rt h a nt h es u r v i v a la c t i v i t y p e r c e n t a g ew i t h d i f f e r e n tp r e s e r v a t i o n m e t h o d s ，s oi ti se a s yt om i s l e a dt h ee v a l u a t i o nr e s u l t sb yu s i n gt o t a lb i o m a s sa s e v a l u a t i o ni n d e x t h ec o n t e n to fh e m eca n da t pc o u l dq u a l i t a t i v e l yd e s c r i b en i t r i f y i n ga c t i v i t y , b u tt h ec o l o rh a dn oc o r r e l a t i o nw i t hn i t r i f y i n ga c t i v i t y u n d e ra n a e r o b i cc o n d i t i o n s ， t h ec o l o ro fp r e s e r v e dm i x e dn i t r i f y i n gc u l t u r ew a sc h a n g e df r o mo r a n g ey e l l o wt o b l a c kd u et os u l f a t er e d u c t i o n ，b u tl o wt e m p e r a t u r ea n dn i t r i t e n i t r a t ec o u l dd e c r e a s e t h es u l f i d ef o r m a t i o na n dt h ec o l o i c h a n g e a n a e r o b i cp r e s e r v a t i o nw a sb e t t e rt h a n a e r o b i cp r e s e r v a t i o nf o rm i x e d n i t r i f y i n gc u l t u r e u n d e ra n a e r o b i ca n da e r o b i cc o n d i t i o n s ，t h eh a l fd e c a yt i m e so f s u r v i v a la c t i v i t yw e r e1 71m o n t h sa n d1 6 0m o n t h s ，a n dt h es u r v i v a la c t i v i t y p e r c e n t a g e sw e r e15 9 a n d5 6 r e s p e c t i v e l ya f t e rp r e s e r v a t i o nf o rf i v em o n t h s n i t r i t ec o u l di m p r o v et h ep r e s e r v a t i o no fm i x e dn i t r i f y i n gc u l t u r e ，a n dc o u l d d e c r e a s et h ed e c a yr a t eo fn i t r i f y i n ga c t i v i t y u n d e ra n a e r o b i cc o n d i t i o n s ，t h ed e c a y r a t e so f n i t r i f y i n ga c t i v i t yw e r e0 0 1 0d 一，0 0 2 0d 1a n d0 0 2 1d 一，t h eh a l f d e c a yt i m e s o fs u r v i v a la c t i v i t yw e r e2 41 ，1 13a n d1 0 9m o n t h s ，a n dt h es u r v i v a la c t i v i t y i v - 浙江人学硕士学位论文 a b s t r a c t p e r c e n t a g e sw e r e13 1 14 4 a n d13 9 a f t e rp r e s e r v a t i o nf o r5m o n t h sb ym e a n s o f 4 w i t h5m m o l l n i t r i t e ，4 cw i t h5m m o l l n i t r a t ea n d4 c ，r e s p e c t i v e l y n a t u r a lt e m p e r a t u r ew a ss u i t a b l ef o rs t o r i n gm i x e dn i t r i f y i n gc u l t u r e u n d e r a n a e r o b i cc o n d i t i o n s ，t h ea c t i v i t yd e c a yr a t e sw e r e0 0 1 2d 1 ，0 0 2 1d - 1 ，0 0 1 9d 1 ， 0 0 1 3d 1 ，t h eh a l f d e c a yt i m e so f s u r v i v a la c t i v i t yw e r e1 7 1 ，1 0 9 ，1 2 2 ，1 6 2m o n t h s ， a n dt h es u r v i v a la c t i v i t yp e r c e n t a g e sw e r e16 o ，13 9 ，2 0 8 ，2 0 4 a f t e r p r e s e r v a t i o nf o r5m o n t h sb ym e a n so fn a t u r a lt e m p e r a t u r e ，4 ，一2 0 a n d - 2 0 w i t h 15 g l y c e r o l r e s p e c t i v e l y t h e s u r v i v a l a c t i v i t yp e r c e n t a g e a tn a t u r a l t e m p e r a t u r ew a sn o tt h eh i g h e s t ，b u tt h ec o s tw a st h el o w e s to fa l lp r e s e r v a t i o n m e t h o d s 2 t h ep r e s e r v a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so fa n a e r o b i ca m m o n i u mo x i d a t i o nw e r e s t u d i e d ，a n ds o m ee f f i c i e n tp r e s e r v a t i o nm e t h o d sw e r es u g g e s t e df o rm i x e da n a m m o x c u l t u r e t h ec o n t e n to fh e m ecc o u l dq u a l i t a t i v e l yd e s c r i b ea n a m m o xa c t i v i t y , b u tt h e c o l o rh a dn oc o r r e l a t i o nw i t ha n a m m o xa c t i v i t yb e c a u s eo fs u l f i d ep r o d u c t i o nw h i c h l e dt ot h ec h a n g eo fc o l o rf r o mr e dt ob l a c kd u r i n gt h ep r e s e r v a t i o no fm i x e d a n a m m o xc u l t u r e i n t e r m i t t e n ts t a r v a t i o nw a sw o r s et h a np e r s i s t e n ts t a r v a t i o nd u r i n gt h e p r e s e r v a t i o n o fm i x e da n a m m o xc u l t u r e u n d e ra n a e r o b i c c o n d i t i o n s ，t h r e e p r e s e r v a t i o nm e t h o d s ，4 w i t hs u b s t r a t eo f ( - n h 4 ) 2 s 0 4 ，4 w i t ha d d i t i o n o f s u b s t r a t e ( n 0 2 - n n h 4 + - nr a t i oo f1 3 2 ) e v e r yt e nd a y sa n d4 w i t ha d d i t i o no f s u b s t r a t e 州0 2 。- n n h 4 + - nr a t i oo f1 6 3 ) e v e r yt e nd a y s ，w e r ec a r d e do u t a f t e r p r e s e r v a t i o nf o r5m o n t h s ，t h e i rs u r v i v a la c t i v i t yp e r c e n t a g e sw e r e7 4 7 ，6 8 o a n d 6 0 3 r e s p e c t i v e l y t h ep r e s e r v a t i o na t4 w i t h ( n h 4 ) 2 s 0 4w a st h eb e s t ，b u tt h a ta tn a t u r a l t e m p e r a t u r e 州m ( n h 4 ) 2 s 0 4w a st h ec h e a p e s t u n d e ra n a e r o b i cc o n d i t i o n s ，t h e s u r v i v a la c t i v i t y4 w i t h ( n h 4 ) 2 5 0 4 ，4 w i t hn h 4 c la n dn a t u r a lt e m p e r a t u r ew i t h ( n h 4 ) 2 s 0 4w e r e7 4 7 ，4 5 o a n d6 4 2 r e s p e c t i v e l ya f t e rp r e s e r v a t i o nf o r 5 m o n t h s k e yw o r d s ：m i x e dn i t r i f y i n gc u l t u r e ；m i x e da n a m m o xc u l t u r e ；p r e s e r v a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s ；p r e s e r v a t i o nm e t h o d s v 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝望盘堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位敝储躲泣彩宇签字嗍渺年矽月z 尹日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿盘堂 有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制于段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者躲泣彩争 签字日期：澎纱年汐f 月名 导师虢劾刁 签字口飙幽p 年df 月形日o b l o ol 矿p 浙江大学硕士学位论文致谢 致谢 两年半的研究生生涯即将结束于美丽的华家池畔，在这两年多时间内我收获 了很多很多，需要感谢的人也很多很多。 感谢我的恩师郑平教授，没有您的悉心指导，没有您在论文选题、试验和撰 写各个环节中倾注的大量心血，我不可能能顺利完成论文。而且您科学严谨的治 学态度，实事求是的工作作风，乐观平和的人生理念一直是我学习的榜样，也将 是我今后工作学习过程中永远的指南针。在此，向恩师表示我最衷心的感谢! 感谢胡宝兰、吴东雷、曾江宁、金仁村、孙建平、张蕾、胡安辉、蔡靖、唐 崇俭、陈建伟、陈小光、余一、陈婷婷、季军远、娄菊青、丁爽、沈李东、张吉 强、吉启星、陆慧峰、张萌、梁露怡等老师和同学在学习和生活上给予的大力支 持和帮助! 感谢实验室x d j m 的家人艾如、陈芳、郦卓熙在生活上给予的帮助! 感谢姜晨竞、沈忱思、田志娟等好友在我无助时一直陪在我身边! 感谢姑姑、姑父及表哥姚槐应老师一家，是您们让我对从小就对浙大产生了 向往! 最后，感谢我的父母，没有您们多年如一日的付出就没有我和哥哥的今天； 感谢我的哥哥，没有你的榜样和父母般的付出就不会有我今天的成绩! 祝所有我爱的人和爱我的人永远幸福、快乐! 汪彩华 2 0 1 0 年1 月于浙大华家池畔 浙江大学硕士学位论文引言 1 1 常规菌种的保藏 第1 部分引言 菌种是一个国家的重要资源，其遗传和功能多样性是人类开发利用菌种资源 的重要基础。适宜的菌种保藏方法可以确保分离选育的优良菌种在一个相当长的 时间内不死、不衰、不变异、不被污染，保持较高的存活率和稳定的遗传性，以 满足科研和生产之需( 吕红线，2 0 0 7 ；王奕峰，2 0 0 7 ) 。 表1 - 1 细菌不同保藏方法的比较 t a b l e1 - 1c o m p a r i s o no fd i f f e r e n tp r e s e r v a t i o nm e t h o d s 常规菌种保藏方法可分为6 大类：传代法、液体石蜡覆盖法、载体法、寄主 法、干燥法和冷冻法，各类方法的比较见表1 1 。这些方法都以微生物的生理、 浙江大学硕上学位论文引言 生化特点为基础，人为创造低温、干燥、缺氧等条件，来降低微生物的代谢活性， 并避免菌种死亡和遭受污染( 王奕峰，2 0 0 7 ) 。其中，冷冻法和冷冻干燥法是长期 保存菌种的主要方法( 常金梅，2 0 0 8 ) 。 1 2 硝化菌种的保藏 近年来，随着氮素污染问题的凸现和水体富营养化事件的频发，控制氮素污 染并维持氮素循环平衡成了社会各界关注的热点( 李旭丰，2 0 0 6 ) 。在氮素污染防 治中，生物法凭借其特有的经济性和高效性而成为主流技术，而硝化作用是废水 生物脱氮中的第一步同时也是最关键的一步反应( k o w a l c h u ka n ds t e p h e n ，2 0 0 1 ； w a n ga n dy a n g ，2 0 0 4 ；p a r ka n dn o g u e r a , 2 0 0 7 ) 。作为硝化作用的承载者( 郑平， 2 0 0 4 ；p a r ka n dn o g u e r a ，2 0 0 7 ；s c h r a m ne ta 1 ，1 9 9 6 ) ，硝化细菌的活性和数量从根 本上决定了硝化作用的强度( 任杰，2 0 0 7 ；v o g e l s a n ge ta 1 ，1 9 9 9 ；m a n s e re ta 1 ， 2 0 0 6 ；s a l e me ta 1 ，2 0 0 6 ) 。但由于硝化细菌倍增时间长，对氧气、p h 、温度、生 长基质、代谢产物等因素反应敏感( g e e t se ta 1 ，2 0 0 6 ；郑平，2 0 0 4 ；s t e i na n da r p ， 1 9 9 8 ) ，致使硝化工艺小易启动( o k a b e ，1 9 9 9 ) 、容易失稳、失稳后难以恢复。而 所有这些问题的解决都有赖于优质硝化菌种的选育、保藏和应用。其中，优质硝 化菌种的保藏是一个不可缺少的重要环节。 1 2 1 硝化细菌的种群特征 表1 2 各属氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌的形态特征 t a b l e1 - 2m o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h eg e n e r ao fa m m o n i a - o x i d i z i n gb a c t e r i a a n dn i t r i t e o x i d i z i n gb a c t e r i a 浙江火学硕士学位论文 引言 硝化作用是一个序列反应，需要氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌的协同作 用。根据菌体形态和细胞内膜排列方式，伯杰氏系统细菌学手册第二版 ( b r e n n e re ta 1 ，2 0 0 5 ) 将氨氧化细菌分为3 个属，亚硝酸盐氧化细菌分为4 个属， 各属的主要形态特征见表1 2 。 1 2 2 硝化细菌的生理生化特性 1 2 2 1 硝化细菌的营养物质 ( 1 ) 能源 硝化细菌属于化能营养型微生物，氨和亚硝酸盐依次是氨氧化细菌和亚硝酸 盐氧化细菌自养生长的唯一能源，两者的化学反应为( m a d i g a na n dm a r t i n k o ， 2 0 0 7 ) ： n h ；+ 1 5 0 , 寸n o ；+ 2 h + + h 2 0 a g 日= _ 2 8 8 k j t o o l 。1 ( 删：) 1 一一 一 ( 1 ) n o ；+ 0 5 。 jn o ： a g o = - 7 4 1 k j m o l 。1 ( 何) 一 ， 一 ( 1 - 2 ) 化学反应释放的自由能只有转化成a t p 等形式才能被生物细胞所利用。 由于氨和皿硝酸盐的标准电势电位较高，分别为e e ( n o ；n h ：) = + 3 4 0 m v ， e o ( ( 丐in o f ) = + 4 3 0 m v ，它们通过氧化磷酸化合成a t p 的效率较低( 郑 平等，1 9 9 9 ) 。 根据a t p 水解反应： a t p + h 、0 专a d p + p i a g ；= - 3 1 0 朋。厂1 ( 么冲) 1 - 3 即使氨和亚硝酸盐生物氧化所释放的全部自由能都转化为a t p ，每摩尔 氨氮和业硝氮也仅能各自产生9 1m o la t p 和2 3m o la t p 。 另外，对于氨氧化细菌来说，氨只是形式上的能源，代谢中间产物 羟胺才是真正的能源( 式1 4 ) ，以羟胺和氨一起作为基质可成倍提高氨氧化 细菌的细胞产率，但若单独以羟胺作基质，氨氧化细菌会停止生长( d eb r u i j n p ，a 1 ，1 9 9 5 ；郑平，2 0 0 4 ) 。 n l 凡学l 学伸论z引言 删2 讲，+ 05 q _ + h q + 2 何+ 2 8 f 1 4 1 a g 。= 一1 1 4 k jt o o l 。 ( 2 ) 碳源 硝化细菌属丁_ - 自养型微生物碳源是c 0 2 但也有衅l i l 化细苗能进行混 合营养牛k ，它们不但同化c 0 2 也同化有机物。 白养犁微生物田定c o ：土要有叫种途径，旷膏尔文循环( | 生| 1 1 ) 、反向 二羧酸循环、3 一羟基丙酸途 = 和己酰- c o a 途往( 李季伦，1 9 9 1 ；郭霭光，2 0 0 4 ； s c h o u t e ne ta l ，2 0 0 4 ) ，硝化细茼丰要利j ； j 卡尔文循环。由于通过卡尔文循环 还原c 如需要消耗人量a t p 和n a d p h ，冈此硝化细菌生长较慢。在长期进 化巾，有些硝化细菌就具备了蚓化有机物的能力( m a d i g a na n d m a m n k o ，2 0 0 7 鄞f 2 0 0 4 ) 。 o ：；2 j 篡苫k 尹、一墨 、月 ”“ o o o 苫“：1 口o o o o 6 揣7 紧怠 m m “d 6 0 书，7 茹m 啦 “” o o 口$ 警。：般器 1 4 ? ；乒1 圈l 一1 自养型徽生物的卡尔文循环 f i g 1 - 1t h e c a m nc y c l eo f a u t o t r o p h l e m i c r o o r g a n i s m s ( 3 ) 其他营养需求 除了能源和碳源，硝化细茼还需要其他营养物质。例如，础化细菌需要 钠钾维持细胞渗透压半衡，需茧制组成氨单加钮酶( a m o ) 的双制催化中心 ( 图i - 2 ，s h e a r sa n dw o o d ，1 9 8 5 ) ，需要铁组成羟胺氧还脯的m l 红索( 吲l 一3 a r e i e r oa n d h o p p e 1 9 9 3 ) 需要铜纽成硝酸盐氧迁嘣的制喋呤，需要铁和 浙江大学硕士学位论文引言 硫元素组成f e s 簇( m a d i g a na n dm a r t i n k o ，2 0 0 7 ) ，需要磷来组成c 0 2 固定 过程中的两个关键酶二磷酸核酮糖梭化酶和磷酸核酮糖激酶以及a t p 、 n a d p h 等细胞物质。 凰s h ll c o o l - ! c o o l 重 图1 - 2 血红素分子结构 f i g ! - 2t h e s t r u c t u r eo fh e m e 1 2 2 2 硝化细菌生长的环境条件 ( 1 ) 氧气 c u 2 + _ c u 2 + 图1 - 3 a m o 双铜催化中心( 氧) 模型 f i g 1 - 3t w oc o p p e rc a t a l y t i cc y c l ef o ra m o 硝化细菌属于好氧菌，生长代谢过程中需要氧气参与( 图1 4 和图1 5 ) ， 但供氧不足或过量都会抑制其代谢。 在氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌同化c 0 2 的过程中需要能量和还原 力，这两种物质各自从基质氧化过程中获得。氨氧化细菌获得能量的主要途 径是将羟胺氧化释放的电子通过呼吸链传递给末端氧化酶，最终交给氧，并 在电子传递过程中实现氧化磷酸化，合成a t p 。然而，氨单加氧酶也需要电 子，用于启动氨氧化反应。在氨单加氧酶和末端氧化酶之间存在电子流分配 问题。供氧充分，可强化末端氧化酶功能，使电子流偏向末端氧化酶，导致 氨单加氧酶电子供应不足，不能正常启动氨氧化反应；供氧不足，则会造成 氨单加氧酶和末端氧化酶均处于电子饥饿状态，代谢活动一样不能正常进 行。 亚硝酸盐氧化细菌同化c 0 2 所需的a t p 同样来自于亚硝酸盐氧化过程 中的氧化磷酸化，但亚硝酸盐氧化所释放的电子除了传给末端氧化酶外，还 需要沿呼吸链逆向传递用于合成n a d p h ，在亚硝酸盐氧化细菌细胞内也存 在电子流分配问题。氧分压过高，电子流偏向末端氧化酶，导致a t p 产生量 新大学硕士学位论空 引i 增加，n a d p h 产生量下降；而氧分压过低又会同时引起两者合成量不足 。 图l o n i t r o s o m o n a s 菌株的氮氧化与电子 流( 郑平，2 0 0 4 ) f i g 1 一a m m o n i a - o x i d i z i n ga n d d 代t m n c n to f n h t a s o m a n a s ”墼 ”圈虻 7 - 圈1 5 n i t r o b a c t e r 菌株的亚硝酸盐氧化与 电子流( 郑平，2 0 0 4 ) f i g , i - 5n i t r i t e - o x i d i z i n ga n de 1 种“n c u r r e n to f n i t r a b a c t e r ( 2 ) 温度 硝化细莳属于嗜温细菌，大多数菌株的生长温度范围为5 3 5 c ，最适生 长温度为2 5 3 0 ，也有少数分离自深海的苗株可耐受5 c i 三【下的低温，少 数分离自沙漠和热泉中的苗株可耐受6 0 c | 三 上的高温。但硝化细菌不能形成 具有抗热性和耐寒性的芽于( ! ! ，u 现在为止，还未发现嗜冷或嗜热的硝化细菌 ( t o k u y a m ae t a l 1 9 9 7 ；郑平，2 0 0 4 ) 。 ( 3 ) 其他环境条件 除了氧气和温度以外，硝化细荫的生长繁殖过程还受酸碱度、光照、毒 物等环境因素的影响。 出于氢氧化过程是一个产酸过程，日亚硝酸细菌的真正基质是n h 3 t 提 高p h 不1 ： = i 町以增大n h ，比例还可中和氧氧化反应产生的酸性物质，有利 于氨氧化反应的高效进行，硝化细菌的生长p h 范围为58 矗5 ，最适生长p h 范围为7 5 80 属于嗜碱细菌。 硝化细菌对光照，特别是近紫外线的光照很敏感。紫外线可激发硝化细 菌的感光氧化型细胞色素c ( j o h n s t o n ea n dj o n e s ，1 9 8 8 ) 或激发氨单加氧酶 ( a m o ) 的取铜催化中心( 图i 一3 ) 产生强氧化剂( y o s h i o k aa n dy a t s u k a ， 1 9 8 4 ) ，不可逆地抑制硝化细菌活性。j o h n s t o n e 等人( 1 9 8 8 ) 发现，光照可 阻 臣圈 浙江人学硕士学位论文引言 使饥饿4 周的n i t r o s o m o n a sc r y o t o l e r a n s 氨氧化活性降低9 7 4 ，使未被饥 饿的n i t r o s o m o n a sc r y o t o l e r a n s 氨氧化活性降低7 5 。 亚硝酸盐是氨氧化细菌的代谢产物，同时又是亚硝酸盐氧化细菌的生长 基质，高浓度的亚硝酸盐对氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌都会产生抑制作 用，但不同菌株对业硝酸盐的响应值差别较大。当亚硝酸盐浓度达到1 0 0 m m o l l 1 时，n i t r o s o m o n a s 菌株的氨氧化活性降低3 6 ，n i t r o b a c t e r 菌株的 亚硝酸盐氧化活性降低4 0 ( s h a r m aa n da h l e r , 1 9 7 7 ) ；当亚硝酸盐浓度达到 6 0 0m m o l l o 时，n i t r o s o m o n a se u r o p a e a 和n i t r o s o c o c c u sm o b i l i s 混合体系的 氨氧化活性降低5 0 ( t a n ，2 0 0 8 ) ；而当亚硝酸盐浓度为5m m o l l 以时， n i t r o b a c t e rw i n o g r a d s k y f 的亚硝酸盐氧化活性就会受到抑制( l a a n b r o e ka n d s c h o t m a n ，1 9 9 1 ) 。 1 2 3 硝化菌种的保藏技术 1 2 3 1 纯种的保藏 ( 1 ) 避光法 光照可通过影响硝化细菌的感光氧化型细胞色素c ，或激发氨单加氧酶的双 铜催化中心产生强氧化剂，导致硝化细菌活性的不可逆抑制。在一度程度上，采 用避光法可以延长硝化细菌的保存时间。 保藏前将硝化细菌接种于适宜的培养基中，于最适条件下培养，待生长充分 后，离心收集菌体，并转接到适宜的培养基中，再置于黑暗环境中保存。根据已 有研究，在缺乏能源物质的条件下，n i t r o s o m o n a se u r o p a e a 可以保存2 个月以上 ( w i l h e l me ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 此法操作简单，不需要复杂的设备，保存过程中对氨单加氧酶( a m o ) 和 羟胺氧还酶( h a o ) 活性影响很小，但对细胞形态有较大影响，适于菌种短期 保藏。 ( 2 ) 空气阻隔法 氨氧化细菌属于化能自养型好氧菌，需要以氧气作为氨氧化的电子受体，以 c 0 2 作为碳源。隔绝空气可阻止氧气和c 0 2 进入保藏系统，从而抑制氨氧化细菌 的代谢活动，隔绝空气还可防止杂菌污染。 浙江大学硕上学位论文引言 据j o h n s t o n e 等报道，将对数生长期的n i t r o s o m o n a sc r y o t o l e r a n s 离心收集并 转接至适宜的培养基中，用氯丁橡胶塞塞紧瓶口后，可在自然环境中保存1 0 周 以上。 此法操作简便，所需设备简单，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异或 污染，但保存时间较短，仅适于作为传代法的辅助方法。 ( 3 ) 载体法 在生物反应器中，菌体形成团聚体有利于泥水分离和菌体持留。在保藏过程 中，菌体以生物膜形式存在，有利于延长菌体保藏时间。载体法保藏菌种的原理 是硝化细菌在载体表面形成生物膜，生物膜含有大量胞外多聚物( e p s ) ，在营 养丰富的情况下，这些胞外多聚物可吸附大量营养物质，以维持营养匮乏情况下 的生命活动( p o w e l la n dp r o s s e r , 1 9 9 1 ；b a t c h e l o re ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 在用作载体前，需先对载体物质进行灭菌，烘干处理。火菌后，载体先用无 基质培养基润湿，再注入茵悬液并搅匀，搅匀后，将菌体置于适宜条件下培养， 待菌体在载体表面形成生物膜后移至自然环境条件下保存。据已有研究，此法能 将n i t r o s o m o n a se u r o p a e a 保存6 周以上( b a t c h e l o re ta 1 ，1 9 9 7 ) ，若在保存过程 中加入亚硝酸盐，则可进一步延长保藏时间( l a a n b r o e ke ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 以载体法保藏的菌种易受污染、易发生变异，保藏时间较短，操作方法也相 对繁琐。 1 2 3 2 混培物的保藏 ( 1 ) 缺氧法 硝化细菌属好氧菌，在缺氧环境下，其代谢作用受到抑制，老化进程得到延 缓，防氧封口还可防止杂菌污染。 从硝化装置中取硝化污泥，自然沉降滗水，再转接到适宜的合成培养基中， 用丁基橡胶塞塞紧瓶口后置于自然环境中保存。此法的保藏时间依硝化菌群的不 同而不同。据报道，氨氧化细菌的保藏效果好于亚硝酸盐氧化细菌，亚硝酸盐氧 化细菌的保藏效果好于异养型细菌，其中缺氧条件下硝化细菌可保藏4 周以上， 厌氧条件下可保藏6 周以上( m a n s e re ta 1 ，2 0 0 6 ；m o r g e n r o t he ta 1 ，2 0 0 0 ；s a l e me l a 1 2 0 0 6 ) 。 浙江大学硕上学位论文引言 以缺氧法保藏菌种，操作简单，不需复杂设备，适于短程硝化污泥保藏，但 保藏时间较短。 ( 2 ) 冷冻法 硝化细菌属中温菌，低温可抑制硝化细菌的代谢活动，而在冷冻过程中，加 入保护剂可减少细胞损伤( 蒲丽丽，2 0 0 7 ；秦华明，2 0 0 1 ；刘占杰，2 0 0 0 ；c r o w ee t a 1 ，1 9 8 8 ) 。据报道( l a u r i ne la 1 ，2 0 0 6 ；v l a e m i n c ke ta l ，2 0 0 7 ) ，冷冻法保存硝化 细菌可达1 年以上。 冷冻法操作简便，所需设备简单，保存时间长，菌种不易被污染，但成本高， 不能随时检查菌种是否污染、死亡、变异等。 ( 3 ) 干燥法 水是一切生物生存的基本条件，当生物的生存环境缺水时，生物的代谢活动 就会减缓，繁殖速度也会相应降低，因此可以采用干燥条件来保藏菌种。 从硝化装置中取硝化污泥，自然沉降滗水，再转接到适宜的合成培养基中， 加入适宜的保护剂，用丁基橡胶塞塞紧瓶口后于真空干燥器中抽干，或快速冻融 后再于真空干燥器中干燥，干燥后将菌种置于适宜的环境温度下保藏。据 v o g e l s a n g 等人报道( 1 9 9 9 ) ，在- 2 0 环境中硝化细菌可以保藏3 个月以上。 以干燥法保藏菌种，保存时间较长，不易受到污染，但操作复杂，对设备要 求较高，而且不能随时检查菌种是否污染、死亡、变异等。 1 3 厌氧氨氧化茵的保藏 在厌氧条件下，以业硝酸盐为电子受体将氨氧化成氮气的反应称为厌氧氨氧 化，能够进行厌氧氨氧化的生物称为厌氧氨氧化菌。 目前，基于厌氧氨氧化的新型生物脱氮工艺有短程硝化厌氧氨氧化工艺 ( s h a r o n a n a m m o x ) 、基于亚硝酸盐的全自养型氮去除( c a n o n ) 工艺、硫酸 盐型厌氧氨氧化工艺等( v a nd o n g e ne t 以，2 0 0 1 ；s t r o u s ，2 0 0 0 ；f d z - p o l a n c oe ta 1 ， 2 0 0 1 ) ，s h a r o n m n a m m o x 工艺已成功应用于废水生物脱氮领域。荷兰鹿特丹污 水处理厂以s h a r o n a n a m m o x 工艺进行污泥压滤液脱氮，反应器总氮去除率高达 9 5k g 。m 3 - d 一( v a nd e rs t a r , 2 0 0 7 ) 。 但是，厌氧氨氧化菌生长缓慢，对氧气、p h 、温度、生长基质等环境条件 9 浙江大学硕上学位论文 异常敏感( v a nn i f l r i ke la 1 ，2 0 0 4 ；v a nd o n g e ne la 1 ，2 0 0 1 ；e g l ie la 1 ，2 0 0 1 ；w a k ie t a 1 ，2 0 0 7 ) ，导致厌氧氨氧化工艺不易启动、容易失稳、失稳后难以恢复。因此， 选育、保藏和应用优质的厌氧氨氧化茵是突破上述瓶颈的关键，其中优质厌氧氨 氧化菌的保藏是不可缺少的重要环节。 1 3 1 厌氧氨氧化菌的种群特征 厌氧氨氧化菌属于分支较深的浮霉状菌目厌氧氨氧化菌科，该科包含5 个 属，1 0 个种( 各种的形态特征见表1 3 ) ，均为化能自养型厌氧菌并具有厌氧氨 氧化功能( j e r e ne ta 1 ，i np r e s s ；张蕾，2 0 0 9 ) 。厌氧氨氧化茵是一类难培养微生物， 迄今为此，密度梯度离心法是成功分离厌氧氨氧化菌的唯一方法( s t r o u s ，2 0 0 2 ) ， 对厌氧氨氧化菌的鉴定也只能借助于分子生物学于段。 选用自然环境样品作为接种物，按目标菌群所