（环境工程专业论文）黄孢原毛平革菌产锰酶及其对酸性蓝45的脱色研究.pdf

a b s t r a c t b yp r o d u c i n ge n z y m e ss u c ha sp e r o x i d a s e ( l i p ) ，m a n g a n e s ep e r o x i d a s e ( m n p ) a n d l a c c a s e ( l a c ) , p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u mh a sg r e a te f f e c to nd i f f e r e n td y e sw a s t e w a t e r h o w e v e r , t h eu n s t a b i l i t yo ft h ee n z y m es y s t e ma n db a c t e r i a sk e e po f fi t s i n d u s t r i o u sa p p l i c a t i o n i no r d e rt os o l v et h e s ep r o b l e m s ，d o c u m e n t sw e r ec o n s u l t e de x t e n s i v e l y , a n d p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u mi sa p p l i e dt ot r e a tw i t hb l u ea c i d4 5u n d e re x t e r i o r r e g u l a t i o n si nt h et y p ea n dc o n c e n t r a t i o no fn u t r i t i o n t h ep r o d u c t i o nm e d i u mw a s m o d i f i e do nt h eb a s i so ft h et i e na n dk i r km e d i u m ，c o n t a i n i n g2 0m m o l la c e t a t e b u f f e rq h4 4 ) i n s t e a do fd i m e t h y ls u c c i n a t eb u f f e r s e v e r a ls e t so fs h a k i n gf l a s k e x p e r i m e n t su n d e rf r e ea n di m m o b i l i z e dc o n d i t o n sw e r ec o n d u c t e d t h ek n o t t e d c o r o nc a r r i e r su s e di ni m m o b i l i z e dc o n d i t i o nw a si n v e n t e db yd o c t o rz h o uc h e n g f r o mt s i n g h u au n i v e r s i t y c u t u r ec o n d i t i o n sa n dt h ec o n t e n to fc a r r i e r si n f l u e n c e dt h ec h a n g eo fm n p a c t i v i t ya n ds t a b i l i t y , a n dt h es y s t e mw i t h3 7 0 9 lc a r r i e r sr a n k e df i r s tw i t h14 6 9 u l m n p s oh e r ew ec a l lc o n c l u d es a f e l yf l a s k sw i t hc a r r i e r sp r o d u c em o r ee n z y m e sa n d 3 7 0 9 lw a st h eo p t i m u mc a r r i e rc o n t e n t i no r d e rt od i r e c tt h ed e s i g no ff e r m e n t m i o n p r o c e s s ，a k i n e t i c sm o d e lw a sb u i l tf o rt h eb a t c hc u l t u r eo fp h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m t h ep a r a m e t e r s i n t h em o d e l w e r ec a l i b r a t e db a s e do l lt h e e x p e r i m e n t a ld a t af r o mf r e ea n di m m o b i l i z e dc u l t u r es e p a r a t e l y t h ed i f e r e n c e b e t w e e ne a c hv a r i a b l e sv a l u e sc a l c u l a t e db a s e do l lk i n e t i c sm o d e la n de x p e r i m e n t a l d a t aw a sw i t h i n1 5 t h ei n f l u e n c eo fd y ec o n c e n t r a t i o n so nd e c o l o r i z a t i o na n dd e g r a d a t i o nw a s s t u d i e du n d e ro p t i m u mc o n d i t i o nw i l3 7 0 9 lc a r r i e r t h ee x p e r i m e n t ss h o w e dw h e n t h ec o n c e n t r a t i o n sw a sl o w e rt h a n6 0 0 m g ：l ，t h es y s t e mh a db e t t e rd u p l i c i t y , a n dt h e d e c o l o r i z a t i o na n dd e g r a d a t i o no fa c i db l u e4 5w a se x c e l l e n t ，s i n c eb o t ho ft h e m e x c e e d e d9 0 o nc o n s i d e r a t i o no ft h eh i g hc o s ti nt h es t e r i l et r e a t m e n to fr e a c t o r , c u l t u r e m e d i u ma n dw a s t e w a t e r , i n f l u e n c eo fd i f f e r e n ti n j e c t i n gt i m eo fd y e so nd e c o l o r i z i n g a c i db l u e4 5w i 也w h i t er o tf u n g iu n d e rn o n - s t e r i l ec o n d i t i o n sw e r ei n v e s t i g a t e d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed e c o l o r i z a t i o nu n d e rn o n s t e r i l ec o n d i t i o nw a ss i m i l a rw i t h s t e r i l e c o n d i t i o n , a f t e ri t w a si n c u b a t e df o r1 t o4 d a y s u n d e rs t e r i l e c o n d i t i o n ；h o w e v e r , t h ee f f i c i e n c yw a s5 5 a t2d a y si fw h i t er o tf u n g u sh a db e e n i n c u b a t e df o r0 5 d a yu n d e rs t e r i l ec o n d i t i o n t h er e a s o no ft h a td e c r e a s ew a sb e c a u s e t h eg r o w t ho fw h i t er o tf u n g u sw a ss u p p r e s s e db ya c i db l u e4 5a n dt h er e a c t i o n s y s t e mw a sc o n t a m i n a t e db yy e a s tf u n g u s s o ，i nd e c o l o r i z i n ga c i db l u e4 5 ，i fo n l y w h i t er o tf u n g u si sp r e d o m i n a t e ds t r a i ni nr e a c t i o ns y s t e m ，t h ei n c u b a t i n gt i m eu n d e r s t e r i l ec o n d i t i o nc o u l db es h o r t e n e dt old a yo rm o r e t h es t u d yr e s u l t sw o u l dp r o v i d eg u i d a n c et ot h es c a l e dp r o d u c t i o no fm i l pa n d l o w e rt h ec o s to fw a s t ew a t e rt r e a t m e n t a n dt h eo u t c o m e sa l s oh a v et h e o r i c a lv a l u e a n dp r a c t i c a lf u n c t i o ni nt h es t u d yo fd e c o l o r a t i o nm e c h a n i s mb yw h i t er o tf u n g i k e yw o r d s ：p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m ，m n pa c i db l u e4 5 ，d e c o l o r i z a t i o n ， c 锄e r 论文独创性声明 本人声明：本人所呈交的学位论文是在导师的指导下，独立进行 研究工作所取得的成果。除论文中已经注明引用的内容外，对论文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本论 文中不包含任何未加明确注明的其他个人或集体已经公开发表的成 果。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 逸心、奚训7 年箩月哆日 论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归 属学校。学校享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的 学术论文或成果时，署名单位仍然为长安大学。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：蛰小醍 导师签名平移巷 川7 年, - j 寻 7 e t 矽7 年5 其即日 长安大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 研究背景 染料是一种大分子芳香烃化合物，结构复杂，在水环境、光照和氧化剂存在 等条件下性质稳定。大量的染料进入水域后造成水体的色度升高，影响入射光线 的量，导致水体的透光率降低，抑制水中光合作用，进而影响到各级消费者的生 长，导致水生生态系统的多样性下降，破坏水体的自净作用。目前，已在偶氮类、 蒽醌类、三苯甲烷类染料中发现具有致癌、致畸、致突变作用的品种【1 1 。因此， 染料废水在排入水体前必须经过处理。 1 1 1 染料废水污染现状及其危害性 染料被广泛用于各种工业活动、医学、生物学领域及各种人类活动中，由于 生产和使用要求，人工合成的染料普遍具有高度的稳定性，耐光、耐热、耐物理 化学作用，同时能够抵御生物降解，因此成为重要的环境污染物。染料废水污染 现状如下： 首先是污染量大。目前世界上每年生产的染料约1 0 0 ，0 0 0 种，染料产量约 为8 x 1 0 5 9 x 1 0 5t 2 l ，我国染料年产量达1 5 x 1 0 5t ，位居世界前列，在染料的生产 和使用中约有1 0 * - - , 1 5 的染料随废水排入环境【3 1 ；因我国染料工业、纺织印染 业发达，染料废水对环境的污染更为严重。 第二是作为环境污染物的染料种类多、结构复杂。全世界使用的合成染料达 3 万多种，8 0 以上的染料为含偶氮键、多聚芳香环的复杂有机化合物【4 】。 第三是染料产品标准本身要求其产品具较高光稳定性及水洗稳定性。故多数 染料具有耐光、耐热、耐化学氧化等特点，在多数氧化剂的存在条件下都能保持 其稳定性，因而难以去除。 第四是大量的染料进入水域后造成水的色度升高，影响入射光线的量，从而 影响水底植物的光合作用和水生动物的生长，使水质变差，破环水体生态系统。 第五是部分染料为有毒物质，具有致癌、致畸、致突变的“三致”作用。染料 的降解产物多为联苯胺等一些致癌的芳香类化合物，医学科学已经证明：8 0 9 0 的癌症与环境因子有关，而已发现的致癌物中绝大多数是有毒有机化合物。 1 1 2 染料废水处理方法简介 第一章绪论 含染料废水的处理难点：( 1 ) c o d 高，而b o d c o d 值较小，可生化性差； ( 2 ) 色度高、成分复杂、脱色难度大【5 1 。国内外常用的处理方法包括物理化学法和 生物法。物理化学法主要有絮凝沉降法、吸附法、化学氧化法、辐照、湿式空气 氧化法、离子交换法和超滤膜过滤法、光催化高压脉冲和电解技术等【6 , 7 】。 絮凝沉淀( 气浮) 法是指在染料废水中投加铝盐、铁盐等絮凝剂，使其水解 形成带高电荷的羟基化合物从而达到对染料分子的混凝去除。它们对水中憎水性 染料分子的混凝效果较好，而对酸性染料、活性染料、特别是小分子量、单偶氮 键、含数个磺酸基的水溶性染料的混凝脱色效果较差。 电化学法采用石墨、钛板等作极板，以n a c l 、n a e s 0 4 或水中原有盐类作导 电介质，对染料废水通电电解，阳极产生0 2 或c 1 2 ，阴极产生h 2 。新生态氧或 n a c l 0 的氧化作用及h 2 的还原作用能够破坏染料分子的结构从而使染料脱色， 此法属于电解法。以f e 、a 1 作阳极，由电极反应产生f e 2 + 及灿3 + ，其水解产物 形成絮凝，通过对染料分子的氧化还原及黏附作用而脱色，絮体由阴极产生的 h 2 浮上，此法属于电气浮法。这两种方法对含有一s o 广基团及n = n 的可溶性 染料，活性染料均有良好的脱色作用，但该法消耗的电能较大。 吸附法是利用吸附剂如活性炭、硅聚物、高岭土、工业炉渣等吸附废水中染 料的方法。不同的吸附剂对染料吸附有选择性。其中活性炭的吸附效果较好，但 是费用高，限制了其工业应用。 物理化学法对废水色度去除率较高，但对c o d 去除率较低，且存在处理费 用高、可能引起二次污染的问题。相比之下，生物法是一种经济而有效的处理方 法【6 】。目前发现能降解染料的微生物种类很多，主要有真菌、细菌和藻类三种。 细菌脱色大多是在厌氧条件下对染料的不完全降解，生成的中间产物往往毒 性很大，使其应用受到限制。例如利用细菌对偶氮染料进行降解，在厌氧条件下， 偶氮键被还原成芳胺，虽然达到脱色目的，但却有毒致癌；尽管目前已能获得好 氧细菌品系降解偶氮染料，但是其对染料的严格专一性在很大程度上限制了细菌 对多种染料成分共存的实际废水的有效处理。而白腐真菌可在有氧条件下合成木 质素过氧化物酶( l i p ) 、锰过氧化物酶( m n p ) 和漆酶( l a c ) 等一系列酶系， 能够降解农药废水农药废水、含油废水、造纸废水等难降解工业废水以及多种人 工合成染料，并将它们最终矿化成c 0 2 和h 2 0 。由于白腐真菌对多种结构各异 2 长安大学硕士学位论文 的有机污染物具有独特的降解能力【6 ，8 】，降解效率高，降解程度较为彻底，因此 近年来越来越受到重视，在环境保护领域具有较强的应用潜力。 1 2 白腐真菌的研究现状 目前，对白腐真菌的生物学背景、生物降解酶系、降解机理及其代谢过程 影响因子的认识及研究现状主要如下： 1 2 1 白腐真菌的生物学背景 白腐真菌是指一类具有相同功能，能引起木质白色腐烂的丝状真菌的集合。 白腐真菌能选择性降解木素纤维素，其菌丝能够穿入木质细胞腔内，释放出降解 木质素和其他木质组分的酶，导致木质腐烂成淡色的海绵状团块( 白腐) ，团块 内白色的囊穴和条层相间。它可引起树木的白腐病，使带褐色的木质素腐烂，从 而使木材上留下白色海绵状的纤维素团块、白色孔穴或斑纹。它是整个碳素循环 的中心，是已知的唯一能在纯系培养中将木质素降解为c 0 2 和h 2 0 的一类微生 物。白腐真菌既不专指某一种真菌也不泛指某一些真菌，而是一类腐生在木质上， 对木质有相同的进攻能力并造成木质发生相同的结构及外观变化的丝状真菌的 总称【9 1 。 白腐真菌在生物分类学上属于担子菌门和半知菌门，其中以担子菌门居多。 担子菌门中的白腐真菌主要分属于层菌纲多孔菌目的多孔菌科( p o l y p o r u s ) ，半 知菌门中的白腐真菌主要分属于半知菌门丝孢菌纲丝孢菌目的瘤痤孢科 ( t u b e r c u l a r i a c e a e ) 、丛梗孢科( m o n i l i z c e a e ) 、束梗孢科( s t i l b a c e a e ) 和暗色菌 科( d e m a t i a c e a e ) 【1 0 1 。它的菌丝体为多核，少有隔膜，无锁状联合，多核的分 生孢子为异核，担孢子却是同核体，存在同宗配合和异宗配合两类交配系统【4 1 1 1 。 黄孢原毛平革菌是白腐真菌研究的模式菌种，具有发达的菌丝体。其生长分 为营养期( 初生生长) 和繁殖期( 次生生长) 两个阶段。在营养期阶段，其生长 是线性的，生物量明显增多；在繁殖期阶段，生长基本处于停滞状态，生物量甚 至可能下降，此时因为碳、氮营养的限制触发了次生代谢，黄孢原毛平革菌进入 了木质素降解阶段f 1 2 】，处于木质素降解阶段的菌能够高效合成木质素过氧化物酶 ( “p ) 、锰过氧化物酶( m n p ) 和漆酶( l a c ) 等多种酶系，达到对难降解污染 物的降解及矿化。黄孢原毛平革菌的过氧化物酶系能降解木质素和多种结构复杂 3 第一章绪论 的有机物( 尤其对人工合成的难以自然降解的有机污染物有很强的降解能力) ， 如多环芳族有机物、氯化芳族有机物、农药和染料等，显示出在环境保护领域的 广泛应用前景。 1 2 2 白腐真菌的生物降解酶系及机制 白腐真菌对难降解有机污染物的降解转化发生在生长的次级代谢阶段。一些 研究报导，在次生代谢阶段，作为营养限制( 主要是氮源限制和碳源限制) 的应答， 黄孢原毛平革菌合成并逐渐形成一套特殊的降解酶系统，并完成难降解有机污染 物的催化转化1 0 1 。 这套酶系统主要包括产生h 2 0 2 的氧化酶、需h 2 0 2 的过氧化酶以及漆酶 ( l a c c a s e ) 、还原酶、甲基化酶和蛋白酶等。产生h 2 0 2 的氧化酶主要有细胞内葡 萄糖氧化酶和细胞外乙二醛氧化酶，它们在分子氧参与下氧化底物而形成h 2 0 2 ， 从而激活过氧化物酶，启动酶的催化循环。需h 2 0 2 的过氧化物酶主要有木质素 降解酶。木质素降解酶包括木质素过氧化物酶( l i g n i np e r o x i d a s e ，l i p ) 和锰过氧化 物酶( m a n g a n e s e p e r o x i d a s e ，m n p ) ，分别代表一系列的同功酶【1 3 1 4 1 5 1 ，这些酶均 在细胞内合成，分泌到细胞外，以h 2 0 2 为最初氧化底物。木质素降解酶和漆酶 是黄孢原毛平革菌降解酶系统的重要组成与功能核心。 自腐真菌对木质素的降解是一个胞外的非专一的、非水解的次生代谢过程。 由于木质素结构的复杂性，相应降解木质素的酶系也很复杂，牵涉到胞外大分子 降解和胞内小分子分解代谢反应。废水中的木质素浓度、p h 值、碳源、氮源、 硫源、f e 2 + 浓度及搅拌的速度等限制触发。l i p 以h 2 0 2 为电子受体氧化非酚型化 合物，漆酶以0 2 为电子受体氧化酚型化合物，m n p 以h 2 0 2 为电子受体既可氧 化木素中的酚型结构也可氧化非酚型结构。漆酶的活性受c u 2 + 的调控，而l v i l l 2 + 控制m n p 的活性，l i p 的活性与藜芦醇( v a ) 有关f 1 5 】。l i p 和m n p 含有血红素辅 基，l i p 的血红素是埋在蛋白质内，可连接至少一个v a ，木素大分子不能接近 该活性中心，但在接近活性中心通道表面裂缝中，有一段有序的残糖基，可能是 木素结合点【1 6 1 。在m n p 的血红素中仅有一个m n 2 + 结合点。m n p 消耗一份h 2 0 2 ， 产生两份m n 3 + ，从m n p 脱离后需要螯合常数较低的螫合剂以保证扩散中的稳定 性【1 4 1 。 l i p 是最早从白腐真菌中分离得到的木质素降解酶，它在木质素的降解中起 4 长安大学硕士学位论文 着非常重要的作用。l i p 是一种带有糖基的胞外血红蛋白，分子质量3 8 - 4 6 k u ， 血红素埋在蛋白质内构成活性中心，可连接至少一个v a ( v a 是l i p 的自然底物) 。 木质素大分子不能接近该酶的活性中心，其结合位点是一段有序的糖残基，位于 接近活性中心通道表面的裂缝中【1 6 】。 l i p 以h 2 0 2 为电子受体，可以氧化富含电子的酚型或非酚型芳香化合物， 在通过电子传递体攻击木质素时，它可以从苯酚或非苯酚的苯环上夺取一个电 子，将其氧化成自由基，继而以链式反应产生许多不同的自由基，导致木质素分 子中主要键断裂，此过程需要h 2 0 2 的驱动，其机理如下： l a p 珊 r h 脚l 图1l i p 降解木素的机理 其反应式如下： l i p + h 2 0 2 - ij pi + h 2 0 l i pi + i m r - r h + + l i pi i l i pi i + r h z - r h + + l i p l i p 中的f e 离子是f e 3 + ，通常呈“静止”状态。h 2 0 2 使血红素发生2 个电子 的氧化，导致其变为l i pi 。l i pi 对各种还原性化学物质具有很高的反应性， 在将它们单电子氧化成自由基的同时自身被还原为l i p i i ( 同样是l i p 的中间 体) 。l i pi i 再与另一些化学物质反应，被还原为含f e 3 + 的静止态酶。 从静止态酶到l i pi ，再从l i pi 到l i p i i ，又恢复到静止态，这样就形成了 l i p 的循环，同时伴随着对底物r h 2 的氧化性催化。这就是l i p 的催化循环。l i pi 和l i pi i 具有比其他过氧化物酶高得多的还原电位，这就大大扩大了l i p 所能氧 化的化学物质的种类及数目。 锰过氧化物酶是一种糖基化的血红素蛋白，有多种同工酶形式，分子质量通 5 第一章绪论 常为4 0 - - - 5 0 k u 。1 9 9 1 年w a r r i s h i 等证明，m n p 能解聚合成的木质烈1 7 】；1 9 9 4 年 b a n 等证明，m n p 通过脂类过氧化作用可以降解难降解的芳香族化合物【l 引。m n p 和l i p 一样，同属于过氧化物酶，两者之间存在不少共性，但是在结构和功能等 方面，还存在着特殊性。如其催化反应也需要有h 2 0 2 的触发。所不同的是，m n p 活性必须依赖于m n 2 + 的存在，m n p 利用普遍存在于木质纤维素和土壤中的m n 2 + 作为其偏好的底物，即电子供体。在m n p 的催化循环中，作为主要还原性底物 的m n 2 + ，在有效地还原m n pi 和m n pi i 的同时，自身被氧化为m n 3 + ；这种氧化 态的m n 离子再去氧化有机底物。m n p 的催化循环机理如下： 奠h 鬟墨h 图2 m n p 降解木素的机理 其反应式如下： m n p + i 2 0 2 - - * m n pi - h 2 0 m n pi + m n ( i i ) 一m 1 1 pi i + m n ( ) m l l p i i + m n ( i i ) - - , m n p + m n ( i i i ) + h 2 0 过氧化氢触发m n p 将m n ( i i ) 氧化为m n ( i i i ) ；在m n ( i i i ) 螯合剂的直 接作用下，酚类物质( 以及某些非酚类芳香族物质) 被氧化成对应的自由基；在 m n ( ) 的间接作用下，先将共氧化剂氧化成相应的自由基，由它们去进攻大 部分的非酚类芳香族物质，形成对应的自由基；接着发生一系列的自由基的链反 应，实现对酚类及非酚类芳香族化合物的降解。 漆酶是一类含铜的多酚氧化酶，可以催化酚型化合物形成苯氧游离基。漆酶 对多种酚型化合物的作用结果显示确有氧化降解反应发生。漆酶催化单电子氧化 反应，对于木素模型化合物，反应的主要部位有：c a 一氧化、脱除甲氧基和芳香 环开裂【1 9 】。漆酶最早是从漆树的分泌物中发现，随后发现很多植物和微生物都 可产生这种酶。反应的最适p h 值为3 5 一0 其对木素的催化过程如图3 所示。 6 长安大学硕士学位论文 图3 中，漆酶还原分子氧为水，在电子转移介体a b t s 的作用下，实现木素的氧 化降解，被漆酶氧化的a b t s 以a b t s 自由基的形式在漆酶分子与纤维细胞壁木 素分子之间传递电子，构成完整氧化还原周期。近期的研究结果认为，在0 2 存 在时，漆酶催化酚型化合物脱去羟基上的电子或质子形成自由基，从而导致酚型 木素侧链脱羧、脱氧，造成c c 键断裂。与前两种酶的最大区别是不需要h 2 0 2 存在即可完成催化氧化反应。 举熊森术曩 图3 漆酶i 绎解木素机理 除了上述种重要的酶外，其它如细胞内的葡萄糖氧化酶和细胞外的乙二醛氧 化酶，它们在分子氧的参与下氧化污染物并形成h 2 0 2 ，激活过氧化物酶而启动 酶的催化循环。此外，还有芳醇氧化酶、酚氧化酶、过氧化氢酶及还原酶、甲基 化酶、蛋白酶等，这些酶也是白腐真菌降解系统的重要组成【2 0 1 。 木素的降解过程是以自由基的链反应为基础的过程，自由基是木素受单电子 传递攻击而形成的。这种自由基反应是高度非特异性和无立体选择性的，使得白 腐菌与降解对象之间并非是象酶与底物那样的一一对应关系，故对污染物的降解 显现广谱特征。因木素降解中消耗大量0 2 但并不生成a t p , 所以白腐菌在对木素 进行降解作用时还需其他碳源的存在作为还原物或用于a t p 合成。 1 2 3 环境因子对白腐真菌代谢活动的影响 白腐真菌的生理活动，木质素降解酶的合成、活性等，受培养基条件或环境 因子的影响非常大。从某种程度上讲，对菌的代谢或降解潜能开发利用的关键， 实质上是一个对各种培养参数的操作、调控和优化过程。 ( 1 ) 培养基成分对代谢活动的影响 白腐真菌一般需要在限氮或限碳培养基中才能合成木质素降解系统。除了 碳、氮源比例不同外，这两种培养基的其它组成成分基本相同。常用的培养基包 括以下几个部分：碳氮源、缓冲液、宏量元素、微量元素、维生素。有的为了提 高木素酶的酶活还会加入藜芦醇和吐温等。 k i r k 2 1 1 等以葡萄糖、甘油、纤维素、琥珀酸钠、葡萄糖酸内酯和香草酸钠等 7 第一章绪论 为碳源物质的研究表明：甘油和琥珀酸既可充当碳源亦可为能源，都支持木质素 降解；葡萄糖酸钠和葡萄糖内酯虽然也支持菌的生长，但木质素矿化成c 0 2 的 量不如甘油和琥珀酸钠；香草酸钠不能支持生长及木质素分解；木质素分解最好 的碳源是葡萄糖和木浆纤维素。但是出于获得碳源的方便和其他原因的考虑，在 基础研究及应用研究的试验室探索阶段，碳源的选择最多的还是葡萄糖。 k i r k t 2 1 】等用硫酸铵、硝酸铵、l 广天冬酰胺、酒石酸铵、尿素、硝酸钠、酪蛋 白氨基酸或硝酸铵加l - 天冬酰胺混合物等不同氮源物质进行试验，发现氮源的 种类对木质素降解的影响不大，氮源的浓度影响较大。高氮不利于木质素代谢， 因为高氮促进了木质素降解所必需的生长底物的消耗，氮代谢与木质素代谢之间 通过需要相同的辅助因子而发生竞争，氮调控着木质素降解系统中某种或多种组 分的合成。 在培养基中，不仅要保证碳源和氮源的限制，还要保证c ：n 。z a e e h i l 6 0 1 等 报道：低c ：n 营养时，菌丝不合成细胞外多糖。这将有利于木素酶的产生。 k i r k t 2 1 】等的研究表明：只有硫胺素( 维生素b 1 ) 对于菌的生长和木质素代 谢是必要的；培养基中添加硫胺素和补充多种维生素混合物，对木质素的降解效 果一样，但维生素混合物对生长的作用稍好。 r e n g a n a t h a n 2 2 】等研究了乙酸钠、琥珀酸钠、酒石酸钠、柠檬酸钠和2 ，2 二甲基琥珀酸钠( d m s ) 等缓冲液在2 0 m m o l l 时对黄孢原毛平革菌l i p 产生的 影响，发现最好的是乙酸钠，其次为琥珀酸钠，d m s 排第三。k i r k 2 1 】等发现对 木质素生物降解的最佳p h 为4 5 。 金属元素的种类及浓度对菌的木质素降解酶的合成和活性有显著的影响。它 们的主要功能，是作为一般的营养元素，或者作为酶的结构组分和活性因子。 h a a p a l a 2 3 1 等曾系统地研究c u 2 + 、m n 2 + 、z i l 2 + 、f e 2 + 等对l i p 产生的影响，发现： c u 2 + 和z n 2 + 浓度升高，l i p 活性提高；m n 2 + 浓度高虽然抑制l i p 合成，但是实现 l i p 生产的最大化必需有一定的m n 2 + ；f e 2 + 对l i p 稍有抑制作用。m n 2 + 对黄孢原 毛平革菌的l i p 和m n p 具有调剂作用，一般讲l i p 活性与m n 2 + 浓度成反比，m n p 活性则与 v i a 2 + 浓度成正比。c u 2 + 是l a g 的组分之一，所以培养基中含有一定的 c u 2 + 是l a e 合成和活性所必需的。m m o l 浓度级的c a 2 + 能有效地防止m n p 发 生热失活。 长安大学硕士学位论文 ( 2 ) 活性添加成分对菌代谢活动的影响 随着人们研究的深入，越来越多的化学物质被发现有利于保护和提高黄孢原 毛平革菌的木素酶系统。它们实际上经常是作为活性添加成分，添加到培养基中 以提高体系的反应性。这些活性成分主要包括藜芦醇( v a ) 、有机酸、芳族化合 物、表面活性剂。 v a 最初是在黄孢原毛平革菌木质素降解培养中发现的一种次生代谢物，积 累在细胞外介质中。v a 是l i p 的底物，被l i p 氧化；也是l i p 的辅助因子。外 源加入一定浓度的v a 可以显著提高l i p 的合成和活性。 h a a p a l a 2 3 】等认为：有机酸尤其是草酸作为一种低分子量的生物化学调节剂 可以充当l i p 的抑制剂，还原木质素降解生成的醌类物质，稳定m n 2 + 的螯合剂 等。有机酸作为螯合剂，螯合由m n p 氧化生成的m n 3 + ，产生m n 3 + 复合体，扩 散离开m 【l p 的活性部位，从而充当一种可扩散的氧化剂。 h e n r i k s s o n 2 4 】等提出氧化还原调节剂的概念，来解释木质素降解中一些由菌 在次生代谢阶段生成的低分子量有机物的生理功能及代谢作用。木素酶是细胞外 工作的，在木质素降解过程中，它们无法进入木细胞壁与底物接触，而是通过间 接地激活低分子量的可扩散进木细胞壁中的氧化还原调节剂来完成对木质素的 氧化。这些氧化还原调节剂是：l i p 中的v a ，m n p 中螯合的m x l 3 + 和l a c 的3 羟基邻氨基苯甲酸盐。 在黄孢原毛平革菌的液体搅动培养体系中，加入表面活性剂t w e e n 2 0 、 t w e e n 4 0 、t w e e n 6 0 、t w e e n 8 0 等，可以有效地保护木质素降解酶免受因机械剪 切力所造成的结构破坏或活性丧失。尤其是t w e e n 8 0 ，是研究和使用最多的表面 活性剂。t w e e n 8 0 的可能作用还包括：与l i p 相互作用引起活性的提高；促进 l i p 从菌体中释放并使其存在于液相之中；其本身和或其水解产物可以作为一种 细胞外的能源被用于次生代谢；其本身和或其水解产物还可能参与l i p 合成的 激活或诱导，导致酶产量的提高。 ( 3 ) 氧浓度对菌代谢活动的影响 黄孢原毛平革菌是好养微生物，氧的浓度对其生理代谢和降解活动有很大的 影响。k i r k t 2 5 】等在菌的浅层静置培养体系中，在5 、2 1 及1 0 0 的氧分压下， 研究菌的生长、葡萄糖的消耗和木质素的矿化之间的相关性。他们发现：不同氧 9 第一章绪论 分压下，前3 天的生长情况相似，利用了约2 5 ( 质量浓度) 的葡萄糖；生长期 以后，在1 0 0 和2 1 氧分压条件下，木质素开始分解为c 0 2 ，而5 氧分压下 木质素不发生降解反应；1 0 0 氧中木质素的最终矿化量是2 1 的2 3 倍。但是 l e i s o l a l 2 6 】等提出：纯氧的作用并非像前述报道那样明显；氧相反应体系，尤其是 向菌体内的传递或扩散是一个至关重要的限速因子。在静置反应体系中，浅层静 置培养能保证氧的有效利用；在搅动培养体系中，搅动对供氧与对胞外酶的破坏 又构成了需要与效果破坏之间的矛盾，因此必须限制搅动的速度，对菌体进行固 定，在培养体系中加入表面活性剂。 ( 4 ) 其他因素对菌代谢活动的影响 研究表明当培养基的p h 低于3 5 或高于5 0 ，都会强烈抑制木质素的降解和 降解酶系统的工作。 黄孢原毛平革菌是喜热微生物，菌的生长扩增所需的温度范围是2 8 3 9 0 c ， 要求并不十分严格，菌降解和产酶的最佳温度为3 7 。c 左右【3 引。 一般认为，白腐真菌在悬浮状态下培养时，剧烈振动会抑制木质素降解酶系 的产生，但适当的搅拌和振动又利于传质过程，从而促进其脱色和降解效果。 1 2 4 白腐真菌降解染料的优势 白腐菌对污染物的独特降解机理决定了它具有其他生物修复技术所无法拟 比的优点： ( 1 ) 不需要经过特定污染物的预条件化 用细菌降解污染物时，细菌必须先置于一定有效浓度的污染物中才能诱导合 成所需的降解酶。这将导致细菌只能将污染物降到有效水平。而白腐菌的降解酶 合成与降解底物的多少无关，它是靠营养限制( 主要是来启动整个降解过程的， 因此它对污染物浓度没有要求，并且可以将污染物降解至检测限以下。 ( 2 ) 降解底物的非专一性 细菌对降解底物专一性较强，只有在多菌种的共同作用下，才能达到相似的 降解效果。白腐真菌的降解体系反应是一系列的自由基链反应，这种反应是高度 非特异性和无立体选择性的，使得木质素降解酶与降解底物之间并非一一对应关 系，故对污染物的降解呈现广谱特性，能使染料废水的处理效率更高。 ( 3 ) 细胞外降解特征 1 0 长安大学硕士学位论文 白腐真菌降解系统的核心组成部分位于细胞外，这使得白腐真菌的降解系统 可以产生高效氧化性物质，同时避免了对菌体细胞的毒害，白腐真菌对毒性较大 的污染物有很强的耐受力，可以忍受较高浓度的染料废水【1 6 】。 ( 4 ) 对其他微生物的拮抗 白腐真菌的最佳生长p h 较低，生长温度较高，产生降解酶系往往需要限氮 或限碳培养基，不利于其他微生物的生长。并且白腐菌能产生象o h 这样的氧自 由基，氧化其他微生物的蛋白质、d n a ，导致它们死亡，因此白腐菌能在竞争 上保持一定的优势。 ( 5 ) 对营养物要求不高 白腐真菌对营养物的要求不高，可以利用废弃物中的木质纤维等廉价的物质 作为营养源来培养，因此成本低。而且，白腐菌在固体、液体培养中均能生长， 因此可以在多种培养体系中降解染料。 1 3 白腐真菌处理染料废水的研究现状 染料的种类多样，结构复杂，主要包括偶氮染料、酞菁染料、葸醌染料、靛 类染料、三苯甲烷染料、硫化染料和杂环染料等。白腐真菌对染料具有广谱的降 解性能，几乎能降解所有类型、近百种涉及各种颜色的染料【2 7 1 。 1 9 9 0 年c r i p p s 等首次报道黄孢原毛平革菌能降解偶氮染料橙i i 、金莲 橙o 、刚果红【2 8 】：1 9 9 1 年p a s z c z y n s k i 等在偶氮染料分子中导入可代谢的取代基 后，发现可以显著提高黄孢原毛平革菌的降解性f 2 9 】；1 9 9 4 年g o s z c y n s l d 等利用 黄孢原毛平革菌研究其过氧化物酶对磺酸化偶氮染料降解的反应途径，研究支持 过氧化物酶催化芳烃化合物降解的阳离子自由基途径【3 0 】；1 9 9 5 年k n a p p 等利用 黄孢原毛平革菌，对偶氮染料酸性媒介黄1 0 、活性黄2 、直接桔黄、酸性红1 0 6 、 橙i l 、艳黄进行降解，表明染料的吸附与降解同时存在【3 l 】；1 9 9 5 年k n a p p 等利 用黄孢原毛平革菌对葸醌染料中性红、酸性绿2 7 等进行试验，表明该菌种通过 吸附和降解能够实现对葸醌染料的脱色【3 1 】；1 9 9 5 年k n a p p 等试验了黄孢原毛平 革菌对酞菁染料四磺酸四钠盐的降解【3 l 】；1 9 9 7 年c o n n e e l y 等报道了黄孢原毛平 革菌对铜酞菁染料活性翠蓝的降解，7 d 内实现了对浓度为2 0 0 m g l 的染料的完 全脱色【3 2 】。 第一章绪论 国内对黄孢原毛平革菌处理染料废水的研究还处于起步阶段。李慧蓉等利用 黄孢原毛平革菌对5 种代表性三苯甲烷染料进行处理，菌对1 0 m g l 、5 0m g l 和1 0 0m g l 不同浓度的碱性紫5 b n 、碱性副品红、甲酚红、溴酚蓝和孔雀绿等 5 种染料具有不同程度的脱色降解能力【3 3 1 。唐婉莹【3 4 】等用黄孢原毛平革菌处理分 散染料废水，发现该菌对染料废水的水质变化适应能力强，脱色效果好，但对它 的去除率不高，所以还需与絮凝等物化方法相结合。何德文【3 5 】等发现黄孢原毛平 革菌在处理分散染料废水时呈波浪式下降，推测是因为废水中含多种芳香族化合 物，不能被完全氧化而显示出较低的c o d 值，随着生化降解逐步进行，大分子 重新开环、断链生成易被氧化的链状物质，测得的值升高，接着链状物质逐渐被 氧化，测得的c o d 值也随之下降。张朝晖【3 6 】用含有木质素过氧化物酶的酶液进 行酶降解酸性卡布龙红的动力学研究，推导出酶降解卡布龙红的反应速率方程式 为有底物抑制的双底物乒乓动力学方程，同时证明菌丝体也有一定的脱色能力。 李慧蓉【3 7 3 8 】等，研究了黄抱原毛平革菌对多种染料的降解，考察了各种培养参 数对染料的脱色和降解的影响，包括菌种、培养方式、染料类型、缓冲液种类和 黎芦醇浓度等。并且观察到染料降解过程中培养液的最大吸收波长向短波方向显 著移动，说明有新的有色中间产物形成。 1 4 本文的研究内容、目的及意义 白腐真菌分泌的胞外木质素降解酶系具有非特异性和无需底物诱导的独特 性能，使得它对许多结构不同、高毒性、高分子难降解有机物具有广谱的降解能 力，能降解包括多环芳香烃化合物、氯代芳烃化合物、农药、染料以及炸药废水 等在内的多种环境化合物，在造纸工业的生物制浆和纸浆生物漂白，水污染控制 和土壤修复等方面具有重要的应用潜力。 在现阶段的研究中，白腐真菌的应用方式主要为： ( 1 ) 将白腐真菌接种到待处理废水中，利用菌体在生长过程中产生的木质 素降解酶系降解其中的难降解有机物【3 0 】。 ( 2 ) 将白腐真菌产生的木质素降解酶系和酶促反应所需的其它反应物投入 到待处理废水中，直接利用酶促反应降解其中的难降解有机物【2 9 1 。 无论采用哪种应用方式，白腐真菌产生的木质素降解酶都是应用过程中的关 1 2 长安大学硕士学位论文 键，其中木质素降解酶的存在才使难降解有机物的降解得以实现。因此，如上所 述，提高木质素降解酶的合成水平及其酶活表达是强化白腐真菌对难降解有机物 降解作用的关键所在。 关于白腐真菌合成的条件及l i p 在染料降解中的作用前人已经做了大量的 研究【3 叫2 1 ，而m n p 的相关报道较少。 m n p 的p 值( = 7 5 5 e v ) 和m n ( i i ) + 乙酸系统的d 值相似，能对p 值5 7 5 5 e v 的多环芳烃进行单电子氧化降解，不能氧化p 值之7 8 0 e v 的芳香化合物，但由m i l p 引发的脂肪过氧化反应产生的口值芝7 8 0 e v ，因而能氧化降解p 值2 7 8 0 e v 的芳 香化合物川。p a s t i l 4 3 1 等的试验证明m n p 单独作用同样可以降解多种不同类型的 污染物。 因此，本论文以较少为人所研究的m n p 为研究对象，采用打结棉线载体固 定化培养黄孢原毛平革菌。该载体不仅具有良好的传质性能，较高的强度，且对 黄孢原毛平革菌无毒害，其丝状特性与黄孢原毛平革菌菌体状态相符，有