（环境科学与工程专业论文）可利用城市污水培养的高脂肪藻种的筛选及培养条件优化.pdf

国内图书分类号：x703.1 学校代码：10213 国际图书分类号：502 密级：公开 工学硕士学位论文 可利用城市污水培养的高脂肪藻种的筛选 及培养条件优化 硕 士 研 究 生 ： 卢舒萍 导 师 ： 金文标教授 申 请 学 位 ： 工学硕士 学科 ： 环境科学与工程 所 在 单 位 ： 深圳研究生院 答 辩 日 期 ： 2010 年 12 月 授予学位单位 ： 哈尔滨工业大学 classified index: x703.1 u.d.c: 502 dissertation for the master degree of engineering screen of high-lipid microalgae strains with culturing by municipal wastewater and optimize culture condition candidate: lu shuping supervisor: prof. jin wenbiao academic degree applied for: master of engineering specialty: environmental science and engineering affiliation: shenzhen graduate school date of defence: decemeber, 2010 degree-conferring-institution: harbin institute of technology 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 -i- 摘 要 目前水环境污染与能源危机是人类面临的两大难题， 一方面大量的污水未得到 有效处理直接排入河流引起污染， 另一方面代替化石燃料的清洁能源生物柴油由于 原料问题而不能持续生产， 而利用污水含有的氮磷等营养物质培养高脂肪藻类制备 生物柴油，不仅可去除污水中的污染物，并可实现污水的资源化，从而缓解当前的 能源紧缺问题。 本论文研究可用城市污水培养的高脂肪藻种的筛选及培养条件优化， 具有很好的应用前景和实际意义。 本论文对已有文献报道的 5 种高脂肪藻种进行筛选，通过实验比较藻生物量、 脂肪产量及脂肪酸组成优选出蛋白核小球藻，进一步通过单因素实验、均匀设计等 试验方法优化藻种培养条件， 主要考察了氨氮、尿素、硝氮、磷酸盐、fe3+、mg2+、 光照周期、光照强度、ph、co2浓度等影响因子对藻种生物量和脂肪量的影响。 本论文主要研究成果如下： 1）筛选出的蛋白核小球藻能在污水中快速生长同时脂肪产量在 5 种高脂肪藻 中最高，脂肪酸组成以 c16 和 c18 为主，满足生产生物柴油的要求。 2）高浓度氨氮和尿素对藻生长有一定的抑制作用，氨氮作为氮源有利用于藻 细胞的脂肪合成。在实验设定的范围内，不同浓度磷对藻生长有影响，对脂肪量无 明显影响。co2浓度为 2%的曝气最适合藻生长和脂肪合成。 3）光强为 1000lx-12000lx 范围内，光照强度越高藻细胞的生物产量越高，脂 肪含量越低，分别在 12000lx 和 4000lx 取的最大藻生物量和脂肪量，为 0.84g/l 和 0.16g/l。 光照时间对藻生物量和脂肪的影响则随着光照时间的增加呈现先增加后减 少， 在 19h 取得最大藻生物量， 为 0.93g/l， 在 9h 和 14h 取得最大脂肪量为 0.25g/l。 4）高铁环境有利于藻细胞脂肪合成，镁离子能促进蛋白核小球藻生长，其中 镁离子浓度为 0.5mm 时总脂量最大，为 0.25g/l。 5）藻种生长的 ph 范围在 4-9 之间，在生长过程中可调节 ph，不同初始 ph 值下的脂肪量较低。 6）多因子条件下蛋白核小球藻富集油脂的最佳条件为：光照时间 23h，氨氮 浓度为 125mg/l，fe3+浓度为 0mm，光照强度为 9000lx，磷浓度为 14mg/l，mg2+ 浓度为 0.18mm，co2为 1.3%，脂肪产量为 0.28g/l。 关键词：蛋白核小球藻；污水处理；合成污水；脂肪；资源化 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 -ii- abstract water shortage and energy crisis are two major problems which the humanity are facing. on the one hand the massive sewage has not been effectively processed and dispersed into the rivers directly which cause the pollution, on the other hand, as a substitute for fossil fuel, the clean energy biology diesel oil cannot be produced continually because of the lack of material. but high-fat microalgae can grow in the wastewater containing nitrogen , phosphorus and other nutrients, which can not only remove the pollutant in sewage, but also can change the sewage into resources, which will relieve the problem of energy shortage .the thesis researches the choosing of the high-fat microalgae growing in the city sewage and the optimization of culture conditions, which will be a good application and has practical significance. in this paper, chlorella pyrenoidosa is optimized by screening experiment in five high-fat species microalgaes. using some experiment methods to investigate various environmental factors influence on the biomass of algae and the amount of fat in synthetic sewages, including of ammonia, urea, nirate, phosphorus, fe3+, mg2+, illumination intensity, photopdriodicity, ph and co2. also using actual wastewater as medium to culture the microalgae to verify the previous results and analysis the growth of microalgae and the removal of pollutants. the concultion of the thesis are shown as following: 1) the filtered chlorella pyrenoidosa can grow fast and contains the highest fat in five kinds of algae in synthetic sewages and actual wastewater, which can meet the requirements of the producing of biodiesel. 2) high concentration of ammonia and urea have a certain extent on the inhibition of algae growth, ammonia as a nitrogen source is favorable to algal cells fat synthesis. different concentrations of phosphorus have different influence the algal growth, but has no significant effect on fat mass. co2 concentration of 2% is best for algae growth and fat synthesis. 3) in 1000lux-12000lux range, the higher light intensity makes higher biomass of algal cells, and lower fat content, the maximum amount of algal biomass and fat is 0.84g / l and 0.16g / l in 12000lx and 4000lx.with illumination time increased, the impact of biomass and fat are at first increased and then decreased. time of 19h in the light for maximum algal biomass, is 0.93g / l, at 9h and 14h to achieve maximum fat content is 0.25g / l. 4) the biomass of microalgae in high concentration of iron is better than low iron medium. magnesium ions can promote the growth of chlorella pyrenoidosa, 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 -iii- when the concentration of magnesium ions is 0.5mm total lipid is the largest, 0.25g / l. 5) the growth of algae species between the ph range 4-9, after three days of training with different initial ph values are 6.9-7.4,under different initial ph, amount of fat is lower. 6)optimum condition of chlorella pyrenoidosa with multi-factor for oil accumulation is illumination time is 23h, ammonia concentration is 125mg/l, the concentration of fe3+ is 0mm, light intensity is 9000lx, the concentration of phosphorus is 14mg/l, the concentration of mg2+ is 0.18mm, the concentration of co2 1.3%, the fat yield up to 0.28g/l. keywords: chlorella pyrenoidosa, wastewater treatment, synthetic sewage, lipid, resources 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 -v- 目 录 摘 要. i abstract . ii 第 1 章 绪论 . 1 1.1 课题背景 . 1 1.1.1 水资源污染问题 . 1 1.1.2 能源短缺问题 . 1 1.2 微藻在污水领域的国内外研究现状 . 2 1.2.1 n、p 等营养物的去除 . 2 1.2.2 重金属的富集和吸收 . 3 1.2.3 有机化合物的降解 . 3 1.3 生物柴油原料的国内外研究概况 . 3 1.3.1 动植物油脂 . 4 1.3.2 餐饮废油 . 4 1.3.3 微生物 . 5 1.3.4 高油脂微藻作为生物柴油原料的优点 . 6 1.4 微藻在生物柴油领域的国内外研究概况 . 6 1.4.1 研究历史 . 6 1.4.2 种类 . 7 1.4.3 培养方式 . 8 1.4.4 工程微藻的研究进展 . 10 1.5 课题研究目的及内容 . 11 1.5.1 课题来源及研究目的 . 11 1.5.2 本课题的研究内容 . 12 第 2 章 实验材料和方法 . 13 2.1 实验装置 . 13 2.1.1 单因子实验装置 . 13 2.1.2 均匀实验装置 . 13 2.1.3 小试验证实验装置 . 14 2.2 实验用水及水质 . 14 2.3 实验材料 . 15 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 -vi- 2.3.1 实验藻种 . 15 2.3.2 培养基 . 15 2.4 实验仪器与设备 . 16 2.5 实验方法 . 17 2.5.1 藻种的保存与扩大培养 . 17 2.5.2 实验分析项目及检测方法 . 17 2.6 本章小结 . 19 第 3 章 高脂肪藻种的筛选 . 20 3.1 藻细胞总脂肪测定方法改进 . 20 3.1.1 影响因素 . 20 3.1.2 试验方案 . 21 3.1.3 结果分析 . 21 3.1.4 验证实验 . 22 3.2 藻种的筛选 . 23 3.2.1 5 种藻的生长特性 . 23 3.2.2 5 种藻的脂肪产量 . 25 3.2.3 脂肪酸组成分析 . 27 3.3 本章小结 . 28 第 4 章 高脂肪藻种单因子培养条件优化 . 29 4.1 不同浓度氮源对藻种的影响 . 29 4.1.1 氨态氮 . 29 4.1.2 硝态氮 . 31 4.1.3 尿素 . 34 4.2 不同浓度磷对藻种的影响 . 36 4.3 co2对藻种的影响 . 39 4.4 光照对藻种的影响 . 42 4.4.1 光照强度对藻种的影响 . 42 4.4.2 光照周期对藻种的影响 . 46 4.5 金属离子对藻种的影响 . 49 4.5.1 fe3+对藻种的影响 . 49 4.5.2 mg2+对藻种的影响 . 51 4.6 初始 ph 对藻种的影响 . 52 4.7 不同水质对藻种的影响 . 54 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 -vii- 4.8 本章小结 . 56 第 5 章 高脂肪藻种多因子培养条件优化 . 58 5.1 影响因子 . 58 5.2 试验方案 . 58 5.3 结果分析 . 59 5.3.1 回归方程的建立与分析 . 59 5.3.2 回归方程验证与性能预测 . 61 5.4 本章小结 . 62 结 论 . 63 参考文献 . 65 哈尔滨工业大学硕士学位论文原创性声明 . 70 哈尔滨工业大学硕士学位论文使用授权书 . 70 致 谢. 71 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 -1- 第1章 绪论 本论文以高脂肪藻种为研究对象，对 5 种可利用城市污水培养的高脂肪藻 种进行筛选，并对筛选出的蛋白核小球藻进行培养条件优化。 1.1 课题背景 1.1.1 水资源污染问题 我国淡水资源短缺，人均拥有量 2300m3，只有世界人均水平的 1/4。目前 全国 600 多个城市已有一半城市水资源短缺，而水污染加剧了水资源的短缺问 题，全国 75%的湖泊出现了不同程度的富营养化；七大水系有一半河段受到污 染；90%的城市水域污染严重，南方城市总缺水量的 60%-70%是由于水污染造 成的。随着工业化、城市化加快，中国面临的水污染问题将更加严峻。 目前，我国城市污水多采用活性污泥法，生物膜法，虽然可去除污水中的 悬浮固体和部分有机物，降低 bod、cod，但出水的氮、磷含量仍然偏高，容 易引起水体富营养化，其中以物化处理和微生物处理为主的脱氮除磷工艺则成 本较高，还会使潜在的营养物质丢失1，而近几年兴起的藻类污水处理技术也 许是解决这些问题的有效方法。 1.1.2 能源短缺问题 能源是经济社会发展的重要动力，随着全球经济的迅速发展，能源的需求 量也日益增长，长期以来，化石燃料一直是人们消费的主要能源，按照目前已 探明的世界石油储量和开采速度，全球石油的平稳供应只能维持 40.6 年。另一 方面，化石燃料燃烧所产生的有害物质污染环境，导致气候变暖、温室效应、 生物物种多样性降低和荒漠化等诸多生态问题，严重影响世界的资源安全和社 会经济的持续发展，威胁人类的生存。为满足对能源的需求，实现资源的可持 续利用，维持和促进资源、环境、经济的协调发展，世界各国都在大力研究和 利用一种新型清洁能源-生物柴油2。 生物柴油是典型的“绿色能源”，与燃料乙醇和化石柴油等其他液体燃 料相比，有着突出的特性：(1)属于可再生能源； ；(2)硫、氮含量较少，使用过 程可以减少产生 so2和 no；(3) 闪点高，不含石蜡，燃烧性能和效率要高于普 通柴油3。 当 前国内外 生产生物柴 油的原料主要来自油料作物和林树油植物 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 -2- 两大方面，但是它们都存在成本高，产量低，与农作物争地，受季节性 影响高等缺点，不能源源不断的长期供应 4。微藻产量高，一年四季都 可生长，受季节性影响小，同时还可以利用非耕地进行培养 ，不会产生 与农作物争地问题，因此藻类是制备生物柴油的良好原料。 综上所述， 藻类既可以利用污水中的氮、 磷， 还可以作为生物柴油的原料。 因此我们设想利用污水培养高脂肪藻，同时回收培养的藻类作为生物柴油的原 料，这样既可以降低污水的氮磷含量，还能解决生物柴油的原料问题。 1.2 微藻在污水领域的国内外研究现状 藻类可以通过光合作用利用污水中的氮、磷合成自身需要的物质，避免了 潜在营养物质的丢失，同时还降低了去除氮、磷的成本。此外，藻类还可以去 除有毒有机物，重金属离子等物质。近年来，藻类应用于污水处理技术已引起 广泛关注5。 1.2.1 n、p 等营养物的去除 利用藻类去除污水中的氮磷污染物在国内外研究历史较长， 早在50多年前， oswald等人就提出利用藻类去除污水中的氮、磷等物质以及释放氧气供好养微 生物分解代谢。尤其是自20世纪80年代以来，生物技术的发展，使藻类大规模 培养技术不断完善，国内外对进一步发挥藻类净化污水的潜力进行了大量实验 室和各种规模的实验性研究。大量的研究表明，藻类对生活污水、食品加工废 水、工农业混合废水和工业废水中的氮、磷等营养物去除的作用和效果十分显 著。应用和研究最广的是高效藻类塘(hrap)，主要是利用塘内藻类、细菌的共 同作用形成菌藻体， 通过协同作用共同促进污染物的去除， 优点是占地面积少， 可以较高的去除氮磷等营养物质，同时产生的藻类还可以创造经济效益，如作 为肥料、发酵、动物饲养、制药和颜料等原料, 受到越来越多专家的关注，并 相继对高效藻类塘展开了广泛的研究。 张国治等用固定藻处理鸡粪厌氧发酵液，nh4+-n 除去率可达到 84%，tp 去除率达 73.8%，运行效果稳定6。tam 等研究结果表明，小球藻和栅藻在一 级处理出水中的生长情况比二级处理出水好，对氮、磷的去除率在培养后第一 周即达到 70%以上，较对二级处理出水的净化效率更高。王翠红等利用体积百 分比为 80%的生活污水，nahco 为 38mg/l 为培养基培养钝顶螺旋藻，结果表 明 nh4-n 的去除率达 91.8%7。罗加等利用藻类防治河水黑臭，通过在模拟河 床中及小段河道内的试验结果表明，黑臭河水中的 do 有明显的提高，cod、 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 -3- nh3-n 有不同程度的降解，水质显著改善8。吕福荣等通过分别添加不同浓度 氮、磷溶液，研究小球藻净化氮、磷的能力，试验结果表明不同浓度的氮磷组 合对小球藻吸收氮、 磷有一定影响； 在 ph 为 8.08.5 时， 吸收率可达 80%左右； 温度升高或光照加强都有利于小球藻对磷、氮的吸收，随着培养时间的延长小 球藻对氮、磷的吸附逐渐升高8。 1.2.2 重金属的富集和吸收 利用藻类去除污水中金属离子，特别是重金属离子的研究已有大量报道。 藻类特有的结构特点使它对金属离子可进行有效的吸收和富集。pascucci 等将 铜、铁、镍、铝等金属化合物与蛋白核小球藻的混合物分别接种于蒸馏水、海 水、废水中。经过培养后发现铜、镁能被最有效去除9。liang 等发现小球藻能 够在含有重金属及过量铵的污水中生长，处理污水的同时实现了污水中资源的 利用10。李坤等利用淡水小球藻对含 cu2+、cd2+、zn2+的水体分别处理，观察 藻细胞对上述 3 种离子的清除能力，并用金鱼存活检测，结果表明淡水小球藻 对不同密度的 cu2+、cd2+、zn2+都具有一定的清除能力，其中 zn2+的去除率可 达到国家污染物的二级排放标准11。 1.2.3 有机化合物的降解 藻类在生长繁殖过程中，能以水中的一些有机物如农药、多环芳烃等作为 碳源、氮源、及硫源进行富集吸收。王翠红等采用海藻酸钠作为包埋剂，制成 直径为 4 mm，含有 1.8l05个小球藻的海藻酸钠小珠，利用固定化小球藻技术 处理浓度为 220.5mg/l 的含酚废水， 处理 72h 后， 出水的酚浓度降到 0.306 mg/l， 达到国家一级排放标准12。利用普通小球藻、蛋白核小球藻和斜生栅藻可处理 偶氮染料废水，孙红文利用这三种藻种去除 10 种不同结构的染料， 结果表明蛋 白核小球藻的处理生长最好。13。普生小球藻则可以净化含油沸水，陶永华等 利用小球藻去除含油浓度为 18.4 mg/l 的废水，其去除率高达 94%-95%14。 利用微藻处理废水， 可有效地去除废水中的有机物质、 磷、 氮和重金属等， 处理水可用于农业灌溉和工业生产，既可降低生产微藻的成本，还为废水资源 化处理提供了一条新的高效经济的途径。 1.3 生物柴油原料的国内外研究概况 生物柴油原料的主要来源包括动植物油脂，微生物发酵，餐饮废油，产油 微藻等，根据目前的技术，使用动植物油脂制备生物柴油，原料成本占生物柴 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 -4- 油成本的 50%-85%15。因此，成本过高一直是限制生物柴油发展的关键问题。 目前世界上主要的生物柴油生产国都是根据本国的实际情况来选择不同原料制 备生物柴油。 1.3.1 动植物油脂 植物油脂主要包括大豆、油菜籽、花生，向日葵、棕榈、椰子、麻风树、 油茶等，动物油脂主要是指动物含有的脂肪。不同植物油脂生产生物柴油效 率的比较见表 1-1。在美国，生物柴油的制备主要利用转基因大豆；欧洲是全 球最大的生物柴油生产地，耕地资源丰富，农业高度发达，大规模种植油菜， 采用菜籽油生产生物柴油；而东南亚则利用一些热带植物的种子为原料，如棕 榈等。 表 1-1 不同植物油脂生产生物柴油效率的比较3 植物油 planl source 生物柴油产量 (升/公顷/年) biodiesel (l/ha/year) 生产全球生物 柴油用地年纪 (公顷106) area production global oil demand (hactares106) 用地面积占全 球总面积百分 比 area required as percent global land mass 用地面积占全 球可耕地年纪 百分比 area as percent arable land 棉籽油 325 15,002 100.7 756.9 大豆油 446 10,932 73.4 551.6 芥子油 572 8,524 57.2 430.1 葵花油 952 5,121 34.4 258.4 油菜油 1,190 4,097 27.5 206.7 麻风树油 1,892 2,577 17.3 130 棕榈油 5,950 819 5.5 41.3 油藻 (三酰甘油含量 30%) 12,000 406 2.7 20.5 油藻 (三酰甘油含量 50%) 98,500 49 0.3 2.5 1.3.2 餐饮废油 以植物油为原料生产生物柴油成本较高，而回收餐饮业废油作为生物柴油 原料则是一个相对较好的方法16，既减少污染，又废物资源化利用。但餐饮废 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 -5- 油脂含有较多游离脂肪酸、聚合物、分解物等杂质，在酯交换反应之前，必须 对其进行预处理，包括废油脂物力精炼和甲醇预酯化17。此外餐饮业废油供应 量有限且不稳定，同时还存在性能变化大等影响因素。日本已在东京和长野建 成 4 家生物柴油工程，利用饭店废食用油年生产生物柴油 4108kg2。 1.3.3 微生物 某些微生物，如酵母、霉菌和藻类等在一定条件下能将碳水化合物转化为 油脂贮存在菌体内，称为微生物油脂。随着工业生物技术的发展，微生物油脂 发酵各方面都取得新进展。 美国国家可再生能源实验室(nrel)的报告特别指出 微生物油脂发酵可能是生物柴油产业和生物经济的重要研究方向18。大部分微 生物油脂的脂肪酸组成主要以c16和c18脂肪酸为主，及棕榈树、油酸、硬脂酸 等，和植物油的脂肪酸组成相似，不容易受到季节、气候的影响，同时生长周 期短， 除了正常的设备维修外可以连续生产， 此外可以产油的微生物种类较多， 因此利用微生物转化法获取油脂具有非常大的发展潜力19。 1.3.3.1 产油酵母和真菌 一些产油酵母菌可以高效的利用木质纤维素水解得到各种碳水化合物，包 括五碳糖和六碳糖，同时生产油脂并贮存在菌体内，其油脂含量达到细胞干重 的70%以上。据报道国内已开始广谱碳源产油酵母菌的筛选20，这些产油酵母 菌能利用和转化各种农林废弃木质纤维素原材料21。研究表明,产油酵母可利 用海洋滩涂耐盐植物大米草的水解液转化产生微生物油脂22。 1.3.3.2 产油微藻 含油微藻同样也可作为生产生物柴油的原料。与其他油料作物相比，微藻 生长繁殖快；热解简单易行、不需要复杂的仪器设备，生产成本相对较低23； 藻类生长在水体中，不占用耕地资源，也不依靠土壤特性，可高密度大规模生 产（如生物反应器） ；种质资源丰富，不因收获而破坏生态系统；生长繁殖和热 转化较易实现自动化，是生产生物柴油的优良原料。chisti24, 25通过建立数学 模型和工程计算得出目前来自于作物生产生物柴油取代石化油是不可能的，唯 一可能取代石化油的生物柴油只能是来自于微藻的生物柴油。 缪晓玲等26使用微藻热解所得的生物质燃油热脂高达 33 mj/kg， 是木材或 农作物秸秆的 1.6 倍。通过调节小球藻的培养条件异养培养，可获得 57.9%高 品质生物质燃油，是自养培养细胞产生生物柴油的 3.4 倍27。 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 -6- 1.3.4 高油脂微藻作为生物柴油原料的优点 生物柴油和化石染料本质上都来源于光合作用产物。绿色植物进行光合作 用，将水、二氧化碳和其他无机物依靠光能合成各种有机物并释放出氧气，动 物和微生物才能生长繁殖。 各种生物的油脂都是从植物合成的有机物转化来的， 任何形式的来自动物、 植物和微生物的脂肪酸都能用作生物柴油的原料。 因此， 油脂含量高的植物才是制备生物柴油的最重要原料。 我国是植物油脂资源短缺国家，现有的油料作物产油尚不足以满足国内食 用油消费市场的需求，因此仿效西方发达国家依靠扩大油料作物来获取油脂资 源不符合我国国情；而其他非食用油料作物虽然也可以作为生物柴油的原料， 但 会 产 生 与 粮 油 棉 等 农 作 物 争 地 的 问 题 ， 而 木 本 油 料