（环境科学与工程专业论文）渤海沉积环境硝化过程氨氧化细菌的研究.pdf

t h es t u d yo f a m m o n i a o x i d i z i n gb a c t e r i af r o ms e d i m e n t s i n b o h a is e a t i a nf a n g ( e n v i r o m e n t a ls c i e n c ea n de n g i n e e r i n g ) d i r e c t e db yp r o f e s s o rd a n gh o n g y u e a bs t r a c t n i t r o g e ni so n eo f 也eb a s i cd c n n e n t sf o re s s e n t i a ll i f ea c t i v i t i e s v a r i o u sf o r m so f n i t r o g e ne x i s ti nt h eb i o g e o c h e m i c a lc y c l i n g o c e a nn i t r o g e nc y c l ep l a y sa ni m p o r t a n tr o l e n i t r i f i c a t i o ni sam i c r o b i a lf a c i l i t a t e dp r o c e s so ft h eo x i d a t i o no fa m m o n i at on i t r a t ev i an i t r i t e a m o ag e n ew a sw i d e l yu s e di nt h e s t u d i e so fa m m o n i a - o x i d i z i n gb a c t e r i ad i v e r s i t y t o u n d e r s t a n dt h ec o m p o s i t i o na n ds t r u c t u r eo fa m m o n i a - o x i d i z i n gb a c t e r i ac o m m u n i t i e si n s e d i m e n t a r ye n v i r o n me n to fb o h a is e a , t h ed i v e r s i t yo fa m o ag e n ef r o mt h es e d i m e n t so f b o h a is e aw a si n v e s t i g a t e db yu s i n gap e r - b a s e dg e n ec l o n i n ga p p r o a c h , c o m b i n i n gt h e p r i n c i p a lc o o r d i n a t e sa n a l y s i s at o t a lo f5 6 3a m o ag e n ec l o n e sw e r eo b t a i n e df r o m6 s a m p l i n gs t a t i o n s r e s t r i c t i o na n a l y s i so fc l o n e da m o as e q u e n c e so b t a i n e dat o t a lo f4 9 o p e r a t i o n a lt a x o n o m i cu n i t s ( o t u s ) f r o ma l ls a m p l e s t h en u m b e ro fo t u si ne a c hs t a t i o n w a sr a n g e df r o m15t o18 ，w h i c hs h o w sal o wd i v e r s i t yo fa o bi nb o h a i t h el e v e l so f i d e n t i t yo ft h ea m o as e q u e n c e st ot h e i rb e s t - m a t c hk n o w ns e q u e n c e sr e t r i e v e df r o mt h e g e n b a n kd a t a b a s ev a r i e df r o m9 7 t o10 0 m o l e c u l a rp h y l o g e n e t i ca n a l y s i so fa m o a s e q u e n c e s ，b e i n ga s s i g n e di n t o5c l u s t e r s ( c l u s t e r si - v ) ，r e t r i e v e df r o mt h eg u l f o ff i n l a n d ， e s t u a r ys y s t e m ，s e d i m e n to fd e e p - s e a 、e u r o t r o p h i cf r e s h w a t e ra n dc o r a lr e e fa n dj i a o z h o ub a y t h ea o ba l en i t r o s o m o n a sa n dn i t r o s o s p i r a ，t h el a t t e rb e i n gt h em a i na o bi nb 0 0 1 、b 0 0 5 a n db 011s t a t i o n c l u s t e re n v i r o n m e n t ，j a c k k n i f ec l u s t e ra n dp r i n c i p a lc o o r d i n a t e sa n a l y s i s ( p c o a ) i n d i c a t e dt h a tt h ea m m o n i a o x i d i z i n gb a c t e r i ac o m m u n i t i e so fb 0 01w e r eu n i q u e t h ec a n o n i c a lc o r r e s p o n d e n c ea n a l y s i si n d i c a t e dt h a tm u l t i - e n v i r o n m e n tf a c t o r s ，m a i n l y s e d i m e n tp o r e w a t e rc o n c e n t r a t i o no fn h 4 + - nc o n t r o l l e dt h e c o m m u n i t ys t r u c t u r e o f a m m o n i a - o x i d i z i n gb a c t e r i a k e y w o r d s ：b o h a is e a , s e d i m e n t ，a o b ，a m o ag e n e s ，e n v i r o n m e n tf a c t o r , d i v e r s i t y 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 第1 章引言 氮是大气中含量最为丰富的一种元素，也是生物体中合成蛋白质和核酸等物质必不 可少的成份【l l 。它存在于地球的各个角落，对全球氮循具有非常重要的意义。海洋是所 有生命诞生的摇篮，在地球上占了很大的比重，约6 5 以上的地球面积被海洋所覆盖【2 1 。 而自古以来，海洋孕育了大量的生命体，其中存在着大量的生物，尤其是海底沉积物中 更是生存着大量的微生物【3 】。因此，海底沉积物成为海洋中的微生物研究的热门对象。 全球氮循环过程是极其复杂的，它包含了氮气、无机氮化合物、有机氮化合物之间的相 互转换，氮元素的构成形式、电子价位在氮循环的过程中都会发生互相的变化【4 】。虽然 大气中含有7 9 的氮，但是一般生物却不能直接利用。现在已经被人们广泛接受的与氮 循环有关的几个作用是：固氮作用( n i t r o g e nf i x a t i o n ) 、氨化作用( a m m o n i f i c a t i o n ) 、 硝化作用( n i t r i f i c a t i o n ) 、反硝化作用( d e n i t r i f i c a t i o n ) 及最近发现的厌氧氨氧化作用 ( a n a m m o x ) 和d n r a 等过程。硝化作用一般分为两个阶段，氨氧化反应和亚硝酸盐的氧 化。第一个阶段是硝化过程的关键步骤，也是限速步骤，起着至关重要的作用。氨氧化 作用可以将引起氮源污染的氨消除，在一定意义上起到净化海洋环境的作用。 大河口既是生物生产、营养盐再生、环境净化的重要场所，同时也面临着富营养化、 生物多样性降低、环境污染、渔业资源衰退等问题。其中，引起这些环境问题的一个重 要因素就是氮营养盐的过剩。渤海作为中国的一个重要的海域，其生态环境一直备受关 注。渤海是一个半封闭的海湾，它的三面环陆，仅有一个出口，即仅以渤海海峡与外面 广阔的黄海相通。由于其半封闭的地理形态的影响，渤海与外界海域的海洋物质交换速 度便没有那么快速，污染物难以进行及时的扩散。而且，近几年来，随着环渤海区域经 济的快速发展，工业化进程加快，更多的工厂建立，随之排放的工农业废水大量的流入 渤海。人口的急速增加，也导致更多的生活垃圾、生活污水大量排放，过量的营养盐流 入了河口地区，从而导致了渤海的含氮量、含磷量不断增加，这也进而引起了海水的富 营养化问题。而硝化过程中各种存在形式的氮，包括铵盐、亚硝酸盐、硝酸盐等，都可 以引起海水的富营养化。近几十年来，氮的富营养化以及由此引发的赤潮问题是海洋尤 其是近岸和河口区域面临的主要环境问题之一。有关数据表明，渤海的污染问题逐年严 峻，这也引起了更多人的关注。 参与氮循环的微生物，可以调节氮营养盐的再生、转化、去除，对于缓解富营养化 的情况起着重要的作用，可以说是环境生态修复的关键菌群。其中，反硝化菌群与氨氧 第1 章引言 化菌群结合作用，可以将n h 4 + 转变为n 0 3 继而一步步还原为n 2 ，从而消除海洋大部分 的氮污染问题。氨氧化细菌可以将n t - h + 催化成n 0 2 。，是一种化能自养型的单细胞微生 物，相比于大型的动植物，它们对环境的指示作用更加灵敏，所以可以作为沿海水域环 境变化的敏感指标。它们的分布非常广泛，土壤、湖泊、海洋等环境中都可以发现它们 的存在【5 】。一般来说，氨氧化细菌生长缓慢，且很多不可培养，这样通过传统的研究方 法便有了很大的局限性。近年来，分子生物学手段越来越受到人们的广泛应用，因为不 需要对微生物进行实验室培养，而是直接对环境样品进行分子生物学分析，通过各种分 析软件得到结果，故灵敏度高，可操作性强【6 】。氨氧化细菌体内有一种其特有的胞内酶 氨单加氧酶( a m o ) ，其中a m o a 的基因产物含有氨单加氧酶的活性位点，往往被 用作功能基因进行序列分析，从而研究环境中a o b 的种类、数量、生态分布以及活性 笙【7 。8 】 1 ，o 1 1 海洋氮循环 海洋环境包括了海水和溶解或悬浮于海水中的物质，以及海底沉积物、海洋生物等。 其中，海底沉积物的覆盖面积占了地球表面积的2 3 9 。对海底沉积物中的海洋微生物 的研究，一直是人们关心的问题。随着人类对地球活动产生的影响越来越大，地球的氮 循环、碳循环跟气候的关系也逐渐影响整个地球系统。海洋占地球2 3 的面积，海洋的 氮循环更是有着极其重要的作用，对海洋氮循环的研究近年来也成为了热点。随着人类 开发海洋资源的规模越来越大，海洋环境也已受到人类活动的影响，一些近岸海域的环 境污染问题越来越严重。海洋在气候的调节方面也有重要的影响【1 0 1 。多年来，党宏月实 验室在海洋氮循环方面进行了大量的研究，已在国外刊物发表过多篇相关文献【1 1 以7 ，在 国内属于领先水平。 1 1 1 氮循环过程及其微生物 对于氮循环的研究，从上个世纪八十年代，已经成为热点。现在已经被人们广泛接 受的与氮循环有关的几个作用是：固氮作用、氨化作用、硝化作用、反硝化作用以及最 近发现的厌氧氨氧化作用和d n r a 等。目前被人们所熟知的氮循环如图1 1 所示。 2 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 囱氮作 陌： l 二l j 囡 氯氧化作用；? 亚硝化作用； e ” 1 一1 54 7$l，p”1 m 一园一囤一圆 圈1 1 海洋氦循环不惹图 f i 9 1 1n i t r o g e nc y c l ei nt h eo c e a n 通过物理、化学或是生物固氮的方法将大气中的大部分氮固定为无机氮化合物之 后，才能被生物所利用，这一过程称之为固氮作用。氨化作用是指蛋白质、核酸等含氮 有机大分子降解成为可被生物直接利用的无机氮的过程，是植物生长可利用氮素的重要 来源。硝化作用则是通过硝化细菌的作用，将这些氨氧化为硝酸盐的过程，该过程通常 是发生在通气良好的环境里，而反硝化作用则是在缺氧条件下由反硝化细菌将硝酸盐转 化为分子态氮和氮氧化物。 目前，人类对土壤草地、河流湖泊、河口和沿海湿地、海洋沉积物、水产养殖环境、 活性污泥等环境中的氮循环相关微生物都展开了一定的研究。人类对参与氮素循环的微 生物种类及其作用机制仍然缺乏了解，海洋氮循环相关微生物的研究大多集中在固氮、 硝化、反硝化细菌方面【1 8 之5 1 。固氮细菌种类丰富，包括固氮菌属( a z o t o b a c t e r ) 、假单胞 菌属( p s e u d o m o n a s ) 、脱硫弧菌( d e s u l f o v i b r i o ) 、硫杆菌属( 砌f d 施c f 批) 和蓝细菌等【2 2 1 。 d a n g 等人研究了鄂霍次克海的海底沉积物中固氮酶n i f h * on i f h - l i k e 基因的多样性【”】。 海洋氨化细菌的种类也比较多，各类水生环境中往往都能发现他们的存在【2 6 】。存在的比 较多的反硝化细菌是芽孢杆菌属和假单胞菌属口7 】。d a n g 等人利用n i t s 基因研究了胶州 湾沉积环境中反硝化细菌的多样性和分布 1 4 】。s a n t o r o 等人利用n i r k 和n i r s 基因研究了 加利福尼亚州海滩内的反硝化菌群，发现反硝化细菌的多样性十分丰富，同时也发现了 一些新的反硝化细菌类群【2 8 1 。 3 第l 章引言 硝化作用由氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌两种菌共同完成，至今为止没有发现一种菌 可以同时完成硝化过程的两个步骤。细菌的氨氧化作用在1 0 0 多年前首次被发现【1 4 】，一 直以来也人们以为a o b 占主导地位。然而随着泉古菌的发现，人们逐渐认识到氨氧化 古菌( a o a ) 的重要作用，对其研究也越来越热。在九十年代初，因为一个偶然的情况， 人们发现了厌氧氨氧化现象，且证明了这一现象是有微生物参与的过程。另外，有些异 养微生物也具有硝化作用，k i l l h a m 等人在土壤中发现了异养硝化作用 2 9 1 。d a n g 等人利 用a m o a 基因来研究胶州湾沉积物中的a o b 与环境的关系。多元统计分析表明：a o b 群落结构( 组成，结构，分布) 与环境因素( 如n 0 2 ) 有密切关系；a m o a 克隆文库及 定量p c r 表明，从附近的污水处理厂和污染的河流中输入到海洋中，对a o b 的组成及 丰度有很大影响【l 。h e r r m a n n 和m a r t i n a 等人通过研究淡水大型植物根围中氨氧化微 生物的群落结构，发现氨氧化细菌a m o a 的基因拷贝数远远低于氨氧化古菌，表明氨氧 化古菌在该区域的硝化作用中起主导地位【3 0 1 。d a n g 等人通过a m o a 基因对长江口和东 海沉积物中a o a 多样性、群落结构和空间分布进行了研究，并发现河口附近表层海水 盐度及沉积物分选系数梯度对a o a 分布有影响 15 1 。d a n g 等人研究了热带西太平洋大陆 边缘深海沉积物中的a m o a 编码古菌( a e a ) 的多样性、结构和分布，为深海极端环境 下a e a 的生物地理学提供了一定的概况【1 2 1 。 1 1 2 海洋氮污染 氮循环的收支平衡直接影响了生态系统的稳定，若这个平衡被打破，会对人体健康 和生活环境产生严重的影响。但是，随着人类大量施用氮肥以提高农作物产量，以及工 业生活污水的排放和石油燃料副产物的增加，环境中的氮素含量都被直接或间接的增加 了。这些人为的固氮量已经超过了自然界的生物固氮量。随着工业化的进展和人们生活 水平的进一步提高，可以预见，氮素固定的量仍会持续增加。氮素可以通过河流输送和 降雨的方式进入海洋生态系统【3 1 1 。通过研究发现，北海中的氮营养盐含量在近年来有显 著的增加【3 2 1 ，这表明固定的氮素已经大量的进入了海洋生态系统。s e i t z i a g e r 等人【3 3 】进 行了模型预测，数据显示，若继续以现在的情况发展下去，n - 十一世纪中叶，海洋中 的无机氮含量将是1 9 9 0 年的两倍。由于氮、磷的超负荷增加，可能会导致水体的富营 养化，臭氧层的流失以及全球范围的酸雨。海水的富营养化导致了底层海水溶解氧的降 低，底层海水出现无氧和缺氧区，近年来，波罗的海、黑海等沿岸海域发现了多处无氧 区。富营养化的另外一个严重后果是底栖生物大量死亡，厌氧细菌迅速繁殖，浮游生物 4 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 多样性明显降低，生态系统遭到破坏，海底沉积环境和生物地化循环也发生了改变。 氮污染的危害蚓主要可以归结为环境问题和人类健康问题。所引起的环境问题即 “藻华 “赤潮 等水体富营养化现象，另外还有土壤和水体的酸化。氮循环中产生的 一氧化二氮是一种温室气体，还能破坏臭氧层，从而危害人体健康。因为环境的污染， 水体和土壤的污染，人类的健康必将受到威胁，另外氮污染还能引发人类各种身体疾病。 1 2 氨氧化细菌及其功能基因a m o a 的研究 硝化作用是全球氮循环中的非常关键的一个环节，该过程包括两个阶段：第一个阶 段是将氨氧化为亚硝酸，该过程叫做氨氧化作用；第二个阶段是亚硝酸进一步被氧化为 硝酸。其中，氨氧化过程又分了两个步骤：首先在氨单加氧酶( a m o ) 的催化下，氨被氧 化成羟胺，然后再在羟胺氧化还原酶的作用下，催化氧化生成亚硝酸盐【3 5 1 。其中，第一 步是限速步骤，整个氨氧化过程是生态系统中氮素循环的一个重要步骤，具有重大的全 球效应，因此，其研究受到了广泛的关注【7 1 。 氨氧化细菌( a o b ) 是一类化能自养型的微生物，它们广泛存在于土壤、湖泊、活 性污泥和海洋沉积物等环境中。人们从很早就展开了对氨氧化细菌的研究，其中最早被 人们研究到的是n i t r o s o m o n a se u r o p a e n 。之后，人们又在其他的各种环境中依次发现了 其他种属的存在。比如人们在各种水体、土壤、海洋沉积物中发现的n i t r o s o s p i r a 。另 外，在南极的湖泊中还发现了n i 印o s o c o c c u so c e a n u s 的存在【3 6 】。在不同的环境状态下， 往往同时存在n i t r o s o m o n a s 和n i t r o s o s p i r a 的各种不同种，而他们往往会在一定的条件 下成为优势种属存在。p h i l l i p t 3 7 】等人研究了地中海的氨氧化菌群的群落分布，发现了不 同生存环境下存在的优势菌群是不同的，在悬浮状态和自由状态的主体群落分簇分别是 n i t r o s o m o n a se u t r o p h a 和c l u s t e r l 。m u l l a n 等人f 3 8 】研究了蒙特里海湾的氨氧化菌群的群 落结构，发现在该海湾中存在的与饮用水的消毒系统中的优势种属不一样。i b e k w e 等人 【3 9 】研究了农林废水的处理系统和动物排泄物水处理系统中的的氨氧化菌群，发现也是分 别存在两种不同的氨氧化菌属的，分别是n i t r o s o s p i r a 1 i k e 和n i t r o s o m o n a s ，l i k e 为主。 l a v e r m a n 等人m 】研究对森林土壤中的氨氧化菌群进行了分子生态学分析，发现主要存 在的是n i t r o s o s p i r ac l s u t e r2 。o v e d 等人【4 l 】也研究了土壤环境中的氨氧化菌，他们分别 选取了两种不同的土壤环境，一种是经过污水浸透的，另一种是经过肥料水浸透的，结 果发现优势菌群是不同的。 5 第l 章引言 氨单加氧酶( a m o ) 是氨氧化菌特有的一种胞内酶，它是由a m o a 、a m o b 和a m o c 一 共三个亚基组成【8 】o 这三个亚基的分子量分别为2 7 1 0 3 、3 8 1 0 3 和3 1 4 1 0 3 。它们在 一个操纵子中，以a m o c 、a m o a 和a m o b 的顺序进行着排列【3 5 】。其中，a m o a 的基因产 物含有氨单加氧酶的活性位点，通过吸收一个氧原子，将n h 3 催化氧化成羟胺( n h 2 0 h ) ， 该过程也为氨氧化菌群提供了一定的能量。我们通常会说氨氧化过程是硝化作用的限速 步骤，这也正是跟a m o 有关，因为它只能催化非离子态的氨( 即n h 3 ) 的氧化，而对于 离子态的氨( 即n h 4 + ) ，是没有催化氧化作用的。而往往环境中存在的n h 3 的浓度低于 n h 4 在环境中的浓度。 1 2 1 氨氧化细菌种群特征及分类 氨氧化细菌是一种化能自养型的细菌，大多数以氨盐作为能源。氨氧化细菌的基本 特征可以概括如下：氨氧化细菌是专性化能的自养菌，一般除了氨是不需要其他的外源 生长元素的；生长的速度比较缓慢，实验室培养也是有相当大难度的；无芽孢，一般都 是革兰氏阴性菌；生长非常容易受到环境的影响，比如氧的浓度、温度、p h 等。因此 也可以作为环境变化的指示生物。 人们对氨氧化细菌的研究越来越广泛和深入，现今发现的氨氧化细菌主要包括了变 形菌纲( p r o t e b a c t e r i a ) 的b 亚纲和y 亚纲中的成员。它们的分类可以参考伯杰氏细菌 鉴定手册的第九版，在该手册中将其分为了5 个属【_ 7 】：亚硝化单胞菌属( n i t r o s o m o n a s ) 、 亚硝化螺菌属( n i t r o s o s p i r a ) 、亚硝化叶茵属( n i t r o s o l o b u s ) 、亚硝化弧菌属( n i t r o s o v i b r i o ) 和亚硝化球菌属( n i t r o s o c o c c u s ) 。其中，亚硝化单胞菌属( n i t r o s o m o n a s ) 、亚硝化叶菌 属( n i t r o s o l o b u s ) 、亚硝化弧菌属( n i t r o s o v i b r i o ) 、亚硝化螺旋菌属( n i t r o s o s p i r a ) 和 亚硝化球菌属中的n i t r o s o c o c c u sm o b i l i s 属于b 亚纲，而亚硝化球菌属中的n i t r o s o c o c c u s h a l o p h i l u s 和n i t r o s o c o c c a so c e a n i 属于y 亚纲。 1 2 2a m o a 基因在氨氧化细菌研究中的应用 氨氧化细菌往往不可培养，且生长缓慢，世代长。对于环境中的硝化菌群分析，如 果采用传统的微生物培养分析方法，往往存在一定的限制性。利用a m o a 基因作为目的 基因，通过其基因文库的建立来研究环境中不可培养的氨氧化细菌的分子生态学，已经 得到了广泛的应用。目前，已有多篇文献报道通过功能基因研究河流湖泊、海洋沉积物、 水产养殖、土壤、污水处理厂等环境下硝化菌群的数量、时间和空间分布等 4 z - 4 s 】。 r o t t h a o u w e 2 6 1 利用a m o a 基因作为分子标记，采用p c r 特异性扩增技术研究了淡水 6 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 湖、活性污泥、水稻根系等不同环境下的氨氧化细菌。d a i l g 等人【l l 】利用口m 叫基因来研 究胶州湾沉积物中的a o b 与环境的关系。多元统计分析表明：a o b 群落结构( 组成，结 构，分布) 与环境因素( 如n 0 2 。) 有密切关系；a m o a 克隆文库及定量p c r 表明，从附近 的污水处理厂和污染的河流中输入到海洋中，对a o b 的组成及丰度有很大影响。袁飞等 人【4 9 】利用功能基因a m o a 结合d g g e 的方法研究了土壤环境下的氨氧化菌，发现红壤中的 种属跟潮土以及黄泥土的都不相同。陈岭等【倒研究了污水处理系统中氨氧化菌a m o a 基 因的多样性，发现欧洲亚硝化单胞菌是硝化池中的优势菌。马少杰等人通过a m o a 基因 研究了南美自对虾养殖环境下氨氧化菌的种群分布，并同池塘周边土壤环境下的氨氧化 菌群落结构进行了比较【5 0 】。p u r k h o l d 等利用的是a m o a 基因结合1 6 sr r n a 比, 较分析，对 氨氧化细菌的系统发育关系进行了比较细致的研究。 1 2 3 环境因子对氨氧化菌群的影响 生物硝化过程受到多种环境因素的影响，人们对影响氨氧化细菌的各类环境因子的 关注越来越广泛。近年来许多科学家的研究方向主要是一些环境因子对氨氧化细菌群落 结构和数量的影响，例如溶解氧，温度，p h ，盐度，铵浓度等【7 】。一般来说，不同的氨 氧化细菌都有自己最合适的生长环境，温度、盐度、溶解氧等各种环境因素都会对氨氧 化细菌的生理特性、硝化速率、菌群分布产生一定的影响。一般的氨氧化细菌最适宜的 生长温度是2 0 3 0 ，然而有关文献也报道了低温下存在的a o b ，如阿拉斯加海水中的 n i t r o s o m o n a sc r y o t o l e r a n s ”】，它可以在零下五度的环境中生长；还有从南极发现的 f l - p r o t e o b a c t e r i a 乒5 2 】。盐度对氨氧化细菌的分布也有影响，一般来说，b 氨氧化菌在淡水 和海水中均有一定的分布，但丫氨氧化菌一般主要存在于海洋环境中【8 1 。c o c i 等人f 5 3 通 过使用不同盐度的水进行灌溉，考察了盐度对沉积物中a o b 群落组成和分布的影响，证 明了盐度发生变化后，生物的群落结构会发生变化，且不同的盐度变化差异会影响种群 演替速率。c o l e 等人p 4 j 通过_ 研究生物膜，发现氨氧化菌群的分布跟溶解氧浓度的变化有 关，溶解氧浓度越高的区域菌群密度越大。b r i o n e s 等人【5 5 】研究了土壤中氨氧化细菌的组 成、数量以及分布特征，提出来溶解氧可能是造成差异的主要因素。c h o u c r t 等人【5 6 】利 用一系列公式研究了低温下的活性污泥工艺中，产生最大硝化速率的主导因素，包括氧 含量、氮容积负荷率、c o d t k n 、污泥停留时间等。s o n g m i n gz h u 等人【5 7 】研究了固定 膜生物滤池中温度对硝化作用的影响，发现没有v a i l th o f f - a r r h e n i u s 方程式计算结果那 么明显，硝化速率主要是受氧浓度的影响。胡杰等人研究了不同的c n 下硝化细菌和异 7 第1 章引言 养菌群的生物多样性，发现在c n = 0 时，主要的优势菌为自养菌和贫营养菌，而c f n 高 达8 8 2 时，反硝化菌占了主导地位【5 8 1 。罗鹏【4 7 】等研究了养殖系统内从海湾沿海到对虾肠 壁各种环境下的细菌群落，发现多样性由高到低，而且在不同的环境下群落组成差异较 大，每个环境都有自己的优势种群。m c c a i g 5 9 】等也是应用了等多种分子生物学方法研 究发现，污染程度越高的海域海底沉积物所含的a o b 越多，其中主要是f t r o s o m o n a s 。 1 3 研究海域的特点及意义 渤海( 如图1 2 ) 是我国四大海域之一，以辽东半岛和山东半岛为界。近年来，渤 海已成为最繁忙的海上航线之一。它包含三大海湾：莱州湾南部、辽东湾北部、渤海湾 西部。在渤海东端，辽东半岛南端和山东半岛北端之间，是渤海海峡。流入海湾的河流 有黄河、海河、辽河、滦河等。渤海湾包含了几个重要的岛群和岛屿，包括长山列岛、 长兴岛和西中岛。绕渤海海岸线，坐落着中国很多的省份：有山东省、河北省、天津市、 辽宁省等。但是近几十年来，虽然环渤海区域的经济发展迅猛，对国家g d p 的贡献巨大， 然而伴随而来的污染问题也不容人们忽视，而研究表明渤海区域的污染物主要是陆源污 染物，如工业废水废气以及生活污水的任意排放，从而导致渤海河口处氮、磷逐渐富集， 使得海水富营养化，引起赤潮等各种污染现象的发生。据报道，渤海已经成为中国污染 最严重的区域之一，严重影响了附近居民的渔业、生产和人体健康，对该地区的生态环 境也造成了严重的破坏。因此，对渤海的污染治理成为人们亟待解决的重要问题。 8 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 图1 - 2 渤海示意图旧l f i 9 1 - 2m a po fb o h a i 1 3 1 渤海生态环境 渤海是一个半封闭的沿海海洋，包括多个岛屿与沿海入口。渤海平均深度约2 0 米， 最深的地区位于渤海海峡北部海岸附近，约7 0 米。渤海通过渤海海峡与黄海相接，在海 峡两岸还存在着几个岛屿，从而使得两个海洋之间的水交换过程更为复杂，因此增加了 对渤海污染的研究难度。而渤海湾的沉积物主要是淤泥和粉沙淤泥，其降水量大约为5 5 0 毫米左右，由于受大陆性气候的影响，其平均水温大约为1 20 0 。渤海海水盐度较低，这 是因为大陆的多条淡水河均与渤海相连，从而注入渤海大量的淡水，所以使得渤海的盐 度成为近海海域中最低的。渤海的沿岸有大小河流四十多条纵横，包括莱州湾、渤海湾、 辽东湾等沿岸各河流，一起形成了渤海沿岸的三大水生系统。 1 3 2 渤海氮污染现状 过去的几十年中，环渤海地区的经济得到了迅速的发展，然而，渤海的生态环境也 受到了严重的破坏。渤海的环境质量恶化情况见图1 3 。目前渤海海域的污染主要包括 以下几个方面：一是大量的陆源污染物向渤海排放，渤海周围有大量的化工企业，生活 污水和工业废水随着渤海周围的4 0 多条河流注入渤海，导致近岸海域污染较重，大量鱼 冒 曰 第1 章引言 虾死亡，严重影响人类的生活和健康；二是各类海洋污染和海洋灾害事件频发，近来常 发生的漏油事件、海洋石油的过度开发、水产养殖的大量扩增等都对海洋生态环境产生 了巨大压力；三是海底沉积物中所含污染物对海底微生物群落结构、分布、多样性造成 了一定影响，各类陆源污染物经由辽东湾，渤海湾，莱州湾三大海口排入后通过水体运 动的影响，扩散到渤海的水体，同时在重力作用下，通过沉降作用沉积到海底淤泥中， 这些沉积物中所含污染物必定对海底的微生物的生态环境造成影响。 根据中国国家海洋局北海分局发布的 2 0 0 8 年渤海海洋环境公报【8 9 】指出：渤海中 部海域环境良好，近岸海域污染较重；水质污染使部分区域海洋功能受损；生态问题日 益突出；海洋污染事故及灾害时有发生；陆源超标排放现象依然严重。 1 1 8 1 2 0 、 1 2 2 图1 - 3 渤海污染情况示意图删 f i 9 1 - 3p o l l u t i o ns i t u a t i o no fb o h a i 1 4 本论文研究意义与技术路线 1 4 1 选题背景 目前，海洋的开发越来越受到人们的关注，越来越多的人力和物力投入到海洋中， 海洋石油、海水养殖等的发展越来越快，但是在发展之余海洋生态也发生了很大的变化， 1 0 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 海洋沉积物是海洋生态系统物质和能量循环的重要组成部分，利用海洋沉积物研究海洋 氮循环更是应时代的要求日益发展起来，很多学者都对海洋沉积物中的氮循环做了一些 相关研究，最近几年本实验室在设备先进、实验方案和实验技术成熟的基础上也取得了 一些丰硕的成果。 党宏月等【1 5 】以a m o a 基因作为长江口及东海沉积物的分子标记，构建了长江口和东 海海域氨氧化古菌的基因文库，研究表明海水的盐度、沉积物的营养盐等都对氨氧化古 菌的菌落分布、结构有很大影响。党宏月等【1 2 1 通过对热带西太平洋深海海域厌氧氨氧化 古茵a m o a 的菌落结构、分布以及多样性的研究，阐述了深海环境和气候对于厌氧氨氧 化古菌a m o a 的影响，对深海极端环境中厌氧氨氧化古菌的研究方面做了更新的诠释。 党宏月等【1 3 1 对鄂霍次克海深海中的，z 归和n i f h 的相似基因的多样性和群落结构等的研 究发现一些以归和n i y n 的相似菌落来自于某些细菌和古菌，两者比较之下发现某些是 鄂霍次克海深海中所特有的，有些则在世界各个地方海域都有分布而且分布广泛。党宏 月等【1 7 】通过对胶州湾1 6 s r n a 和h z o 基因的群落结构，丰度和多样性等方面的研究，通 过基因文库法和定量p c r 的实验手段得到胶州湾厌氧氨氧化与胶州湾生态环境的关系， 并指出在胶州湾中沉积物中的c n 、亚硝酸盐的含量等影响着厌氧氨氧化细菌的分布及 群落结构，定量实验表明亚硝酸盐可能是影响厌氧氨氧化细菌分布的主要因素。党宏月 等【1 4 】以反硝化细菌n i r s 基因作为胶州湾反硝化研究的分子标记，研究表明胶州湾海域反 硝化群落的结构的多样性，以及群落结构与胶州湾海域有着很大的关系，研究表明胶州 湾大多数的反硝化菌株都是不可培养的，胶州湾中不仅还有全球分布的菌群，也含有某 些特殊的反硝化菌群。 以上研究成果表明本实验室的科研条件，科研方法都是较为成熟的，科研团队的工 作态度认真，科研实验工作严谨、周密，取得的科研成果丰硕，在本实验室开展渤海沉 积物硝化作用功能菌群a m o a 基因研究的科研工作具有明显的条件优势和科研力量，为 本次实验的顺利进行起了很好的导向作用。本论文的课题来源是国家自然科学基金“黄 河口氮循环微生物关键功能群分子生态学研究”，项目批准号为4 1 0 7 6 0 9 1 ，为本论文的 研究提供了坚强的后盾。 1 4 2 研究目标与意义 鉴于渤海近岸海域污染严重性及氨氧化细菌重要生态功能和环境效应，本课题以渤 海沉积环境为研究对象，采用现代分子生物学手段，利用氨单加氧酶a m o a 基因作为氨 第1 章引言 氧化的分子标志构建渤海沉积环境沉积物a m o a 基因文库，获得渤海沉积环境沉积物氨 氧化细菌的种类、分布、群落结构及与生态因子的相互关系；以期阐释硝化过程氨氧化 细菌的生态规律及环境作用，为渤海沉积环境监测和生态修复提供科学依据。总的说来， 本课题有以下几个创新之处： ( 1 ) 目前有关硝化过程氨氧化细菌国外开展的较多，但国内的研究相对较少。另 外，对渤海整个海域硝化过程氨氧化细菌的群落结构及与环境的关系的研究目前国内还 没有。 ( 2 ) 本课题以a m o a 功能基因为分子标记，研究氨氧化细菌群落结构与环境因子的 关系，采用的是现代分子生物学的手段，直接分析环境样品，灵敏度高，更具科学性。 ( 3 ) 本课题利用各种统计学分析软件对硝化作用功能菌群的分布与环境的关系进 行分析，这个在国内的文献中体现的很少。 1 4 3 技术路线 本论文主要技术路线图如图1 4 所示。 图1 4 实验技术路线图 r i 9 1 - 4 t e c h n i c a lr o u t eo ft h i sp a p e r 1 2 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 第2 章渤海沉积环境氨氧化细菌a m o a 基因文库的建立 2 1 引言 基因文库( g e n el i b r a r y ) 是指某生物类型所有基因的一个集合。广义的基因文库是 指一个基因组所有的d n a 克隆的集合，狭义的基因文库包括基因组文库和e d n a 文库。 构建基因文库的意义是既可以将遗传信息通过基因重组的方式在另一个生物体内储存 下来，同时也可以分离出特定的目的基因。通过构建基因文库，从而得到某环境条件下 目的基因的多样性及分子生态学信息的方法，越来越受到广泛的应用。基因文库的构建 一般包括以下几个方面：提取宏基因组，目的基因的特异性扩增，目的基因与质粒重组 转入宿主细胞，目的基因的筛选，序列测定等。本研究采用基因文库的方法，利用氨单 加氧酶基因a m o a 做为分子标记，构建了渤海沉积环境氨氧化细菌菌群的基因文库，并 结合多元分析软件来研究渤海硝化过程氨氧化细菌的多样性及分布。这种方法主要的优 点是，不仅能够获得我们需要的目的基因a m o a 的大量序列信息，同时在某些条件下， 微生物的多样性分析可到种的水平。本实验的a m o a 基因文库的建立流程如图2 1 所示。 0 萤组羲体的转化 儿 l 铷财嘎基因鲍o c r 扩增一 儿 l 限制性酶切分析i 图2 1a m o a 基因建库流程图 f i 9 2 - 1 t h ea m o ag e n el i b r a r yc o n s t r u c t i o n 1 3 第2 章渤海沉积环境氨氧化细菌a m o a 基因文库的建立 2 2 试剂和材料 2 2 1 样品及站位来源 本实验的研究对象为渤海区域，2 0 0 8 年8 月出海采样，共选取了b 0 0 1 、b 0 0 3 、b 0 0 5 、 b 0 0 7 、b 0 1 1 、b 0 1 5 一共六个采样地点( 如图2 2 ) 。采样时，用抓斗采样器采取表层沉 积物，其中，以备基因文库的建立需要提取宏基因组d n a 的样品，要用无菌的注射器 采集，然后立刻放到无菌的密封袋里面。采集大约2 0 0 0 9 左右的泥样用于后续的间隙水 理化性质分析。所有的样品在船上用干冰保存，约2 0 。带回实验室后，放入一8 0 超 低温冰箱进行保存。 图2 2 渤海沉积环境六个采样站位图 f i 9 2 - 2 s i xs a m p l i n gs t a t i o n sa tb o h a is e a 2 2 2 实验试剂 实验中主要用到的试剂盒见表2 1 ，主要试剂见表2 2 。 1 4 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 表2 - 1 实验所用试剂盒 t a b l e 2 - 1 e x p e r i m e n t a lk i t s 试剂盒 生产公司 土壤d n a 快速提取试剂盒 f a s td n a s p i nk i tf o rs o i l 琼脂糖凝胶d n a 回收试剂盒 t l g e lm i d ip u r i f i c a t i o nk i t 天根生化科技有限公司 天根生化科技有限公司 p m d l 9 - ts i m p l ev e c t o r 连接试剂盒大连宝生物工程有限公司( t a k a r a ) d n i p m s p i 限制性内切酶 t a q i 限制性内切酶 t a q d n a 聚合酶 - h a1 限制性内切酶 引物a m o a 2 r 引物a m o a i f h y 引物m 1 3 d 引物r v - m 异丙基硫代b d 半乳糖苷( 口t g ) 5 - 溴- 4 氯- 3 - 吲哚- b - d 一半乳糖苷( x - g a l ) 溴化乙锭( e b ) 琼脂糖 无水乙醇( c h 3 c h 2 0 h ) 氯化镁( m g c l 2 ) 氯化钠( n a c l ) 氯化钾( k c i ) 氯化钙( c a c l 2 ) m b i u s a m b i ，u s a m b i u s a m b i ，u s a m b i ，u s a 生工生物工程( 上海) 有限公司 生工生物工程( 上海) 有限公司 生工生物工程( 上海) 有限公司 生工生物工程( 上海) 有限公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 西班牙 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 1 5 第2 章渤海沉积环境氨氧化细菌a m o a 基因文库的建立 试剂公司 葡萄糖 羧苄青霉素 甘油 酵母提取物( y e a s te x t r a c t i o n ) 琼脂( a g a r ) 胰蛋白胨( t y p t o n e ) m a r k e r 伉d n a h i n dh i ，d 2 0 0 0 ，1 0 0 b p l a d d e r ) 国药集团化学试剂有限公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 天根生化科技有限公司 2 2 3 培养基及试剂配制 实验所用主要培养基见表2 3 ，表2 4 ，表2 5 。其中液体l b 培养基和固体l b 培 养基均需经1 2 1 下高压灭菌2 0 m i n 后使用。s o c 培养基高温高压灭菌后冷却至5 0 c 左 右，加入2 0 m ll m o l l 除菌处理后的葡萄糖溶液。 表2 - 3 液体l b 培养基( g l ，p h = 7 2 7 4 ) t a b l e 2 - 3 l i q u i dl bc u l t u r em e d i u m ( g l ，p h