（环境科学与工程专业论文）石油烃对马粪海胆dna甲基化与补体c3的毒理效应研究.pdf

a b s t r a c t 上j e t r o l e 啪h y d r o c a r b o n si so n eo ft h em a i n p o l l u t a n t si nm a t i n e 锄v i r o l l i l l e n t i n m l sp 印e r ，s e au r c h i n ( h e m i c e n t r o t u s p u l c h e r r i m u s ) w e r es e l e c t e da st e s to r g a n i s m 乜x p e n m e 删r e s e a r c ho nt h es e au r c h i ng e n o m e - w i d ed n a m e t h y l a t i o nl e v e la n dt h e p r o b a b l i i t yo f c o m p l e m e n tc 3g e n em u t a t i o np o l l u t e dw i t ht h ep e t r 0 1 e 啪b y d r o c 甜怕n s 1 n v e s t i g a t i n gt h et o x i ce f f e c t so fp e t r o l e u mh y d r o c a r b o n so nt h em a r i n eo r g ；枷s m si n m 0 1 e c u l a rl e v e l a t1 a s t ，p r o b i n gt h et o x i c i t ym e c h a n i s mo f p e t r 0 1 e u mh y d r o c a r b o n p o l l u t i o no na q u a t i co r g a n i s m s s oi tc a np r o v i d er e f e r e n c et oe a r l yw 踟i 1 1 9 a 1 1 dr i s k a s s e s s m e mf o rp e t r o l e u mh y d r o c a r b o n p o l l u t i o no nt h em 撕n ee n v i r o i 瑚e n t a n a l y z i n gc h e i i l i c a ls u b s t a n c e so nb i o l o g i c a ld n a m e t h y l a t i o ni sa 1 1i m p o r t 锄 m o l e c u l a r t o x l c o l o g ym e 觚st oa s s e s st h el e v e lo fi t sb i o l o g i c a lt o x i c i t y i nt h i sp a p j 1 1 9 n 巾e r 内m l a l l c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h yi su s e dt o a n a l y z et h es e au r c k nd n a m e t h y l a t l o nc h a n g e sw h i c he x p o s e dt o d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sa n dt i m eo fn o 0 d l s p e r s e dd i e s e lo i l t h ee x p e r i m e n t sr e s u l ts h o w st h a t p e t r o l e u r nh y d r o c a r b o n sc a i l c a u s es e au r c l l i ng e n o m e c h a n g e si nt h eo v e r a l ll e v e lo fm e t h y l a t i o n ，晰t ht h ee x t e n s i o n o te x p o s u r e t i m e , 1 e r ew o u l d b eal o wm e t h y l a t i o np h e n o m e n o n ，b u tw e h a v e n tf o u n d s 1 舯1 1 c 锄l yd o s e 。r e s p o n s er e l a t i o n s h i p ，w h i c hi n d i c a t et h a tp e 仃0 l e 啪h y d r o c 砷o n s c a ni m p a c ts e au r c h i nd n a m e t h y l a t i o na n di t sr e g u l a t i o ni nv i v o 1 h es e au r c h i nc o m p l e m e n ts y s t e mi s a i li m p o r t a n tf u n c t i o nt h a tr e s p o n s eb o d v 1 砌u n ec 印n y i nt h i sp a p e r , i no r d e rt oe x p l o r et h a ti ft h e 5 - m e t h y lc y t o s i n ei s ”n o ts p o t s t fo f m u t a t i o n , g e n e t i ci n d i c a t o r sc o m p l e m e n tc 3g e n em 似溉吣觚h e r s t u d l e do nt h e d a s i so f t h es t u d yo fi n d i c a t o r so fs e a u r c h i ne p i g e n e t i cd n a m e t h v l a t i o n e x p o s u r et ol o wc o n c e n t r a t i o np e t r o l e u mh y d r o c a r b o n s t h et e s tr e s u i t sf o u n dt h a t o n e p n m e r s ( p n m e r sb - 6 ) o ft h ep c r p r o d u c te x i s tt h ep 0 1 y m o r p l l i s m ，118 4o c c u r r e di nm e c o 州e r s l o no fc - t m u t a t i o n ，t h a tm n l i r l oa c i df r o mt h r e o n i n et oi s o l e u c i n e a n di tw a s a l s ot o u l l da s t h ec o n c e n t r a t i o no fp e t r o l e u m a n de x p o s u r et i m ei n c r e a s e d ， t h e p r o b a b i l i t yo fm u t a t i o no fs e au r c h i n c o m p l e m e n tc 3g e n ei n c r e a s e dt o o i ti s 1 n d l c a t e dt h a tp e t r o l e u mh y d r o c a r b o n p o l l u t i o nc a nc a u s ed n am u t a t i o n si ns e au r c l l i n h i sp a p e r a n a l y z et h ed n a m e t h y l a t i o nc o n t e n ta n dc o m p l e m e n tc 3g e n e 英文摘要 m u t a t i o nr a t eo ft h es e au r c h i na f t e rp o l l u t e db yp e t r o l e u mh y d r o c a r b o n t h e e x p e n m e n t sr e s u l t sf o u n dt h a tt h ed e g r e eo fd n am e t h y l a t i o nr e d u c e db u tt h er a t eo f c o m p l e m e n tc 3g e n em u t a t i o ni n c r e a s e da st h ee x p o s u r et i m ee x t e n do ft h eh i g h e x p o s u r ec o n c e n t r a t i o n sg r o u p i ti ss u g g e s t e dt h a tt h ee x i s t e n c eo ft h e5 - m e t h y l c y t o s i n em a yn o tb e ”h o ts p o t s ”o fg e n em u t a t i o n k e yw o r d s ：h e m i c e n t r o t u sp u l c h e r r i m u s ；m e t h y l a t i o n ；c o m p l e m e n tc 3 大连海事大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：本论文是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果， 撰写成硕士学位论文= = 互渔烃型呈粪漫塑旦丛里基丝星空b 佳笪的垂堡夔廛硒 灶。除论文中已经注明引用的内容外，对论文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均己在文中以明确方式标明。本论文中不包含任何未加明确注明的其他个人 或集体已经公开发表或未公开发表的成果。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：到萎经 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连海事大学有关保留、使用研究生学 位论文的规定，即：大连海事大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论 文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连海事大学可以将本 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士 学位论文全文数据库( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论 文全文数据库( 中国科学技术信息研究所) 等数据库中，并以电子出版物形式 出版发行和提供信息服务。保密的论文在解密后遵守此规定。 本学位论文属于：保密口在年解密后适用本授权书。 不保密一( 请在以上方框内打。，) 论文作者签名： 到稽 日 石油烃对马粪海胆d n a 甲基化与补体c 3 的毒理效应研究 第1 章绪论 1 1 研究背景 世界石油分布和消费的不均衡性以及航运的相对廉价性，使得世界石油消费的6 0 是通过海上运输来完成的。为了增加运量，降低成本，油轮越造越大，海上溢油事故日 益频繁，污染规模也不断扩大。 据统计，每年通过各种渠道泄入海洋的石油和石油产品，约占全世界石油总产量的 0 5 ，倾注到海洋的石油量达2 0 0 万吨1 0 0 0 万吨，由于航运而排入海洋的石油污染物 达1 6 0 万, 屯- 2 0 0 万吨，其中l 3 左右是油轮在海上发生事故导致石油泄漏造成的【2 j 。 1 9 7 8 年3 月，“阿莫戈卡迪兹号”超级油轮，满载着优质的伊朗阿特阿拉伯的原油， 从波斯湾向荷兰的鲁特丹驶去，不幸在法国西北部的布雷斯特海区触礁失事，所载万吨 原油几乎全部倾泻入海，成为目前为止世界上最大的一次油污染事故。1 9 8 9 年美国“瓦 尔迪兹号”油轮溢油，清污费用和污染造成的损失达8 0 亿美元。1 9 9 5 年“檀家号”油轮 在广州港溢油，轰动世界，造成重大损失。1 9 9 7 年，俄罗斯“纳霍德卡号油轮在日本 海域溢油，清污费用和污染造成的损失达2 7 0 亿日元。 自1 9 9 3 年我国从石油出口国转为石油净进口国以来，石油进口数量不断上升，沿海 的石油运输量大幅增加。而进口的石油9 0 是通过海上船舶运输来完成的，中国海事局 最新公布的一组数据显示，目前中国拥有远洋运输船舶逾百万艘，列世界第9 位。2 0 0 6 年我国沿海石油运输量达到4 3 1 亿吨，其中运输原油1 8 7 亿吨。石油进口量的迅速增加， 使港口和沿海油轮密度增加，2 0 0 6 年航行于我国沿海水域的船舶已达至0 4 6 4 万艘次，平 均每天1 2 7 0 0 艘次，其中各类油轮达至1 j 1 6 2 9 4 9 艘次，平均每天4 4 6 艘次。油轮特别是超大 型油轮在我国水域频繁出现，使得原已十分繁忙的通航环境更加复杂，导致船舶溢油污 染，特别是特大船舶溢油污染的风险增大。我国海上各种溢油事故每年约发生5 0 0 起， 沿海地区海水含油量已超过国家规定的海水水质标准2 倍 - - 8 倍，海洋石油污染十分严 重。 1 9 9 6 年2 月2 8 日1 4 时，福建省轮船总公司“安福”号油轮满载5 7 万吨原油前往 福建炼油化工有限公司，在台湾海峡乌丘屿附近与不明物撞击后船壳受损，1 5 时全速前 第1 章绪论 进入港，1 9 时3 0 分靠泊福建炼化公司专用码头，2 1 时开始在没有采取任何有效防范措 施的情况下加温加压卸油，乌黑的原油此时从海底涌上海面，共有6 3 2 吨原油泄入海中。 这起福建省最大的环境污染事故、也是最大的原油泄漏事故，使湄州湾的海滩养殖业遭 到重大破坏，造成直接经济损失2 8 6 9 1 5 万元，渔民报损达1 3 亿元。 2 0 0 2 年1 1 月2 3 日凌晨，马耳他籍“塔斯曼海”轮装载8 万吨原油在渤海湾与中 国籍“顺凯1 号”轮相撞，大量原油泄漏，造成严重污染。2 0 0 4 年1 2 月7 日，巴拿马 籍“现代促进”轮与德国“地中海伊伦娜”轮在珠江口担杆岛东北处海域发生碰撞，德 国“地中海伊伦娜”轮燃油舱破裂，4 5 0 吨重油漂向大海，在海上形成一条长9 海里的 油带，成为我国最大的船舶碰撞溢油事故1 3 j 。 就总量上来说，我国海域石油污染的情况是8 0 年代近海石油污染超标率在1 0 左 右，1 9 9 3 年上升n 3 7 0 ，在其分布上，南部海域较北部严重，其中以南海最为严重， 超标率达6 2 0 ，且有明显的扩展趋势。东海的舟山渔场、黄海南部也受到不同程度的 污染。1 9 9 5 年起北部海域的石油污染逐步增强。可见，海洋石油污染己大大超过海洋的 负荷，破坏了海洋生态平衡，影响海洋养殖业的发展，威胁人类健康，石油污染己成为 海洋环境科学关注的焦点和热点问题。然而在中国发生的溢油索赔金额却小于同量溢油 污染的国际事件【4 i 。 石油烃类作为众多海洋污染物中毒性最大的物质之一，其危害己波及全球；石油污 染是海洋环境中的主要污染之一，海上溢油事故的发生和日益繁盛的海上运输业、捕捞 业使得海域中石油污染的面积和程度不断扩大加深，影响了海洋生物的生长、存活和繁 殖进而破坏海洋生态系统的结构和功能。石油污染可引起鱼虾的回避反应使渔场破坏或 引起鱼类死亡，造成渔获量的减产。长期低浓度的石油污染可影响海洋生物生长、发育、 繁殖等生理活动，造成疾病如瘤形成，严重的溢油事故往往对局部海域的生态系统造成 毁灭性破坏。海洋生物对石油的蓄积不仅降低商业水产品的品质，而且还可以通过食物 链影响人类的健康。目前，石油烃类己被联合国环境规划署( u n e p ) g i j 为重点监控对象之 f 5 】 o 因此石油污染对海洋生物的影响正日益引起人们的重视。研究石油污染对海洋生物 的毒性作用和机制，有助于理解石油污染对海洋生物和海洋生态系统的危害，寻找合适 _ i 油妊对马粪海日d n a 甲基化与补体c 3 的毒理效应研究 的生物标志物用于石油污染的监测，为制定海洋环境污染标准和保护政策提供依据。 圈11 海上溢油 f i g1 lm a r i t i m eo i ls p i l l 1 1 1 海洋石油烃污染的来源 海洋石油污染按石油输入类型可分为突发性输入和慢性长期输入。突发性输入包 括油轮事故和海上石油开采的泄漏与井喷事故，而慢性长期输入则有港口和船舶的作业 含油污永排放、天然海底渗漏、台油沉积岩遭侵蚀后渗出、工业民用废水排放、含油废 气沉降等【5 】。而造成污染的原因主要体现在：石油的海上运输频繁使海上溢油事故发生 几率增大：港口装卸油作业频繁，存在溢漏油的隐患：油轮的大型化增添了发生重大海上 第1 章绪论 溢油事故的可能性，提高了溢油处理的难度；海上油f r 石油勘探开发中的泄漏和采油废 水排放等【6 1 。 表1 1 海洋石油污染源 t a b l e1 1s o u r c e so fm a r i n eo i lp o l l u t i o n 油轮事故 油轮 船舶正常、违章排放 突发性输入贮油泄漏 海上石油开采井喷事故 钻井正常、违章排放 沿海工业民用废水 工业民用废水 内陆工业民片j 废水经河流入海 _ 业含油废气沉降 含油大气沉降 慢性长期输入车辆含油废气沉降 海底、大陆架渗漏 天然来源沉积岩的侵蚀输入 微生物的合成 1 1 2 溢油在海洋环境中的变化及归宿 石油进入海洋后，在海面迅速扩散，由于石油的粘度和表面张力的差异，所形成的 油膜厚薄不同，轻组分含量越高，粘度越低：氮、氧、硫等极性化合物含量越高，其油 的表面张力越小，所形成的膜就越簿。随着油膜的扩散和风、波、流的作用，油膜会变 得越来越薄；油的扩散面积越大，就越有利于各种形式的转化1 7j 。石油烃在海洋环境中 有着复杂的物理、化学和生物变化过程，并通过这些变化，最终从海洋环境中消失。低 分子量的烃类( c 1 5 以下) 受蒸发过程的影响进入大气，这些轻组分的烃在大气中受光化 学氧化、降解之后，能以原来的形式回到海洋中的数量是极少的。进入海洋环境的石油 烃经过海空输移可减少一半以上。海面油膜能进行光氧化作用，而表层海水中油组分也 能进行光氧化降解，这种转化对于芳烃和杂环芳烃有较大的作用。生物化学变化可分为 石油烃对马粪海胆d n a 甲基化与补体c 3 的毒理效应研究 两个方面，一是海洋中微生物降解石油，二是海洋生物摄取石油烃的代谢作用。微生物 降解石油烃的速率主要与微生物的种群和茵数及其介质的温度有关，还与石油组分的性 质和分散的程度有关，分散程度大，降解的速率也大。另外，海洋植物也能富集和降解 海水中的部分石油烃。吸附与沉淀作用可使海洋中的石油烃进入沉积物中，该途径通常 有3 种类型：( 1 ) 由于轻组分的挥发和溶解使残留物的密度增加，从而生成固态的小球下 沉。( 2 ) 油膜或分散的油滴附着悬浮颗粒沉降海底。( 3 ) 溶解的石油烃吸附在固体颗粒物 上沉积。这种向海底迁移的速率主要与海域的沉积速率有关。进入沉积物的石油烃又会 受到底泥中微生物的降解。然而，由于沉积物中缺氧，又不易受到阳光的照射，降解的 速率要比海水中的降解缓慢。综上所述，海洋环境中石油烃的转化和归宿问题受诸因素 的影响，其主要过程是溶解、蒸发、光解、颗粒物的吸附、沉积、表层水体的混合、分 散和微生物的降解等【8 】。 1 1 3 石油烃污染对海洋生物的影响 石油中造成水体污染的主要成分是各种烃类化合物，烷烃、环烷烃、芳香烃等，它 的毒性取决于这些组分的性质及其分散程度。其中芳香烃类化合物的毒性较大，尤其是 多环芳烃( p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，p a h s ) ，这是指分子含有两个或两个以上苯 环以稠合方式连接起来的广泛存在的一类有机污染物，包括苯并( a ) 芘 b e n z o ( a ) p y r e n e ， b a _ p 、芘( p y r e n e ，p y ) 、菲( p h e n a n t h r e n e ，p h ) 【9 1 ，多环芳烃碳氢化合物是石油组分中对海 洋生态系统破坏性最大的化合物。海洋环境中的石油烃有三种存在形式，分别是：漂 浮在海面的油膜；凝聚态的残余物( 包括海面漂浮的焦油球以及在沉积物中的残余物) 【1 0 】；溶解分散态( 包括溶解和乳化状态) ，其主要危害有： 1 生态危害 ( 1 ) 影响海气交换：油膜覆盖于海面，阻断0 2 、c 0 2 等气体的交换。0 2 的交换被 阻碍导致海洋中的0 2 被消耗后无法由大气中补充，c 0 2 交换被阻首先破坏了海洋中c 0 2 平衡，妨碍海洋从大气中吸收c 0 2 形成h c 0 3 、c o s 盐缓冲海洋p h 值的功能，从而破 坏了海洋中溶解气体的循环平衡。 ( 2 ) 消耗海水中溶解氧：石油的降解大量消耗水体中的氧，然而海水复氧的主要 途径大气溶氧又被油膜阻碍，直接导致海水的缺氧。 第1 章绪论 ( 3 ) 影响光合作用：油阻碍阳光射入海洋，使水温下降，破坏了海洋中0 2 、c 0 2 的平衡，这也就破坏了光合作用的客观条件。同时，分散和乳化油侵入海洋植物体内， 破坏叶绿素，阻碍细胞正常分裂，堵塞植物呼吸孔道，进而破坏光合作用的主体。 ( 4 ) 毒化作用：石油中所含的稠环芳香烃对生物体呈剧毒，且毒性明显与芳环的 数目和烷基化程度有关。首先大分子化合物的绝对毒性很高，而在水中，低分子类由于 具有很强的水溶性和后续的很大生物可利用率，也表现出剧烈毒性影响。烃类经过生物 富集和食物链传递能进一步加剧危害。有证据表明，烃类有致突变和致癌作用，而慢性 石油污染的生态学危害更难以评估。 ( 5 ) 破坏滨海湿地：石油开发等人为活动导致中国滨海湿地丧失严重。据初步估 算【2 】，中国累计丧失滨海湿地面积约2 1 9 万公顷，占滨海湿地总面积的5 0 。 ( 6 ) 全球温室效应：石油污染必将加剧温室效应，也可能促使厄尔尼诺现象的频 繁发生，从而间接加重“全球问题”。 2 社会危害 ( 1 ) 石油污染刺激赤潮的发生：据研究，在石油污染严重的海区，赤潮的发生概率 增加，虽然赤潮发生机理尚无定论，但应考虑石油烃类在其中的作用。 ( 2 ) 石油污染对渔业的危害：由于石油污染抑制光合作用，降低溶解氧含量，破坏 生物生理机能海洋渔业资源正逐步衰退。 ( 3 ) 石油污染对工农业生产的影响：海洋中的石油易附着在渔船网具上，加大清 洗难度，降低网具效率，增加捕捞成本，造成巨大经济损失。而对海滩晒盐厂，受污海水 无疑难以使用。对于海水淡化厂和其他需要以海水为原料的企业，受污海水必然大幅增 加生产成本。 ( 4 ) 石油污染对旅游业的影响：海洋石油极易贴岸而玷污海滩等极具吸引力的海 滨娱乐场所，影响滨海城市形象。2 0 0 2 年巴拿马籍油轮“威望号”的搁浅漏油事故，使 得原本风光迷人的西班牙加里西亚海岸成了黑色油污的人间地狱，给当地旅游业造成沉 重打击。 6 石油烃对马粪海胆d n a 甲基化与补体c 3 的毒理效应研究 1 2 国内外研究现状 1 2 1 石油烃对水生生物的影响国内外研究现状 有关石油烃对海洋生物的毒性效应，国内外学者进行了大量研究，其中以急性毒性 方面的研究最为广泛，内容包括柴油、汽油、燃料油等对海洋浮游植物、浮游动物乃至 鱼类、贝类、牡蛎等的急性毒性效应，得到了l c 5 0 、e c 5 0 等基础数据。以鱼为受试生物， 一些学者还研究了溢油分散剂的使用对油污染效应的影响。 我国海洋生态毒理学起步较晚，近年来的主要研究在于污染物在生物体内的累积与 排放，在海洋食物链中的转移和潜在放大作用及生物转化和生物降解和污染物对海洋生 物的急性毒性、慢性毒性，海洋底栖生物贻贝、蛤、蚝等由于可较准确反映背景水体的 各种污染物质含量，长期以来一直作为一种良好的生物监测物被广泛地应用于海洋环境 痕量污染物的监测。魏玉银等对海湾扇贝进行研究发现，当海水中石油浓度在0 1 6 m g l 以上时，扇贝的行为和生长受到一定的影响，在试验范围内，水中的油浓度越高扇贝的 生长越缓慢，体内油的蓄积量也越耐。周名江等研究了冀东原油对中国对虾受精卵， 幼体各发育阶段到成体的影响，吴彰宽等进行t 2 3 种毒物对中国对虾急性毒性的研究， 所得结果表明，石油烃和其产物的毒性大小顺序为：汽油 煤油 轻柴油 原油 润滑 油【1 2 】；贾晓平和林钦( 1 9 9 8 ) 沏j j 定了南海原油、o 柴油和2 0 # 柴油对斑节对虾( p e n a e u s m o n o d o n ) 、日本对虾( p e n a e u sj a p o n i c u s ) 、刀额新对虾( m e t a p e n a e u se n s i s ) 3 署o p 仔虾和黄鳍 鲷( s p a r u s l a t u s ) 、黑鲷( s p a r u sm a c r o c e p h a l u s ) 、前鳞鲻( m u g i lo p h u y s e m ) 和七星鲈 ( l a t e o l a b r a xj a p o n i c u s ) 4 种仔鱼的急性毒性，发现油类对仔虾和仔鱼的毒性顺序均为： o 撑柴油 2 0 撑柴油 南海原油，而且油类分散液的毒性大于其水溶性组分3 j ；贾晓平等 在另一项研究中报道0 4 柴油对四种贝类的9 6 hl c 5 0 值在1 4 1 6 4 6 m g l 之间，但是文蛤的 l c 5 0 超过3 2 m l 【1 4 】；在石油水溶性成分对无脊椎动物抗氧化系统的影响方面，张景飞， 王晓蓉选择太湖石油烃污染物2 0 号柴油和当地经济鱼类鲫鱼为材料，在室内模拟条件 下，研究了低浓度下柴油的长期暴污对鲫鱼幼体肝脏抗氧化系统的影响，结果表明，在 实验梯度范围内，油污为0 0 0 5 m g 1 时即对鱼体肝脏超氧化物歧化酶( s o d ) 活性表现出 显著的诱导作用；而当暴污浓度达n o o l m g 1 时，过氧化氢酶( c a t ) 活性、谷胱甘肽过 第1 章绪论 氧化物酶( s e - g p x ) 活性和还原型谷胱甘肽( g s h ) 含量均明显被诱导；g s t 活性总的来说 表现为被抑制【j 引。 石油烃等有机污染在生物体内可进行两个阶段的生物转化，第一阶段是在细胞色素 p 4 5 0 1 a 依赖的混合功能氧化酶( m i x e df u n c t i o no x i d a s e ，m f o ) 作用下引进一个氧分子，使 底物活化，活化的底物在第二阶段酶的作用下与体内一些小分子物质结合，形成低毒和 易于排出的化合物。第一阶段酶主要有7 乙氧基香豆素o 脱乙氧基( e r o d ) 、7 乙氧基 香豆素o 脱乙氧基( e c o d ) 、芳烃轻化酶( a h h ) 等，第二阶段酶主要有谷胱甘肽硫转移 酶( g s t ) 、葡萄糖醛酸转移酶( u d p g t ) 等。石油污染可影响这些生物转化酶的活性。在 对石油烃生物代谢过程中往往产生大量自由基，因此水生生物体内抗氧化酶的活性也将 随之波动。此外，石油污染还可影响水生生物体内多种与代谢有关酶的活性。刘发义， 孙凤1 1 7 1 等发现梭鱼在石油浓度为0 1 3 0 1 6 m g l 的海水中，肝脏芳烃羟化酶活性显著升 高；谷氨酰转肽酶( g g t ) 属于第- g r 段代谢酶，可催化亲脂性异生物质与硫醚氨酸的结 合，石油污染可抑制贻贝消化道细胞和胃细胞g g t 活性。b r o n w e n 和r o n a l d l l 8 1 发现大 西洋蹲鱼暴露于2 0 士1 0 m g l ，柴油水溶性成分9 d 后，肝胆红素u d p g t 活性被抑 而苯酚u d p g t 活性增加，柴油水溶性成分或与松脂油的混合液可以诱导肝细胞色素 p 4 5 0 1 a ，并提高细胞质中谷草转氨酶( g o t ) 、乳酸脱氢酶( l d h ) 和i 碱性磷酸酶( a l p ) 的含 量。余群等研究了0 。柴油分散液对真鲷幼体抗氧化酶活性的影响，结果表明：不同浓度 的0 4 柴油污染对抗氧化酶活性变化的影响表现为抛物线型剂量一效应作用形式，同一剂 量组随着污染时间的延长，超氧化物歧化酶( s o d ) 活力上升，硒谷胱甘肽过氧化物酶 ( s e g p x ) 和过氧化氢酶( c a t ) 的活力下降，受污染幼体在污染解除之后，其抗氧化酶活 性得到不同程度的恢复i j 圳。 而从分子水平上了解污染物对海洋生物致毒和解毒机制及生物标志物的研究较少。 实验条件下研究石油烃对水生生物d n a 的损伤作用，大多是以单一或几种癌性芳香烃尤 其是b a p 作为代表，缺乏复杂组分如水溶性成分的研究。石油烃造成的水生生物d n a 损伤包括d n a 碱基修饰、d n a 断链、d n a j j h 合物。8 羟基，2 - 脱氧鸟嘌呤是d n a 碱基的 主要形式，c a n o v a 等【2 0 】发现贻贝暴露于不同浓度的b a j p 后消化腺和腮8 一o h d g 含量都显 著增加，而消化腺含量比腮高。n a c c i 等在b a p 引起的水生生物d n a 断链方面也有一些 石油烃对马粪海日巨d n a 甲基化与补体c 3 的毒理效应研究 报道【2 l 】。e r i e s o n 和b a l k ，a k e h a 等发现用3 2 p 后标记法可以检测出水生生物体内石油烃等 有机污染造成的d n a 加合物 2 2 - 2 3 。 在一些野外调查和移植实验中有人研究了石油污染或p a h 对水生生物的d n a 损伤。 女n m a l i n s 等【2 4 】发现采自被致癌物木馏油严重污染的华盛顿卅 e a g l e 港的鲽鱼 ( p l o u r o n e c t s v e t u l u s ) 肝中有瘤形成发生，在发生瘤形成的肝组织的d n a 中存在着2 ， 6 二氨4 羟5 甲酰胺基嘧啶，这被认为是羟自由基攻击鸟嘌呤c - 8 位点后造成的基本损 伤，这种损伤在无瘤形成的组织和无污染对照位点的鱼体组织中都未发现。x ul i h o n g 等采用移植实验发现蚌类腮d n a 加合物的含量与组织中b a l p 含量及体内总p a h s 含 量有关。陈荣通过研究栌柴油水溶性成分对僧帽牡蛎d n a 损伤的研究指出d n a 断链可作 为石油烃污染的生物标志物【2 3 。2 6 1 。 1 2 2 污染物对生物d n a 甲基化影响国内外研究现状 目前，在低剂量环境污染暴露对生物的损害影响研究中，表观遗传性的改变是分子 生物毒理学研究的最新热点，主要在脊椎动物，尤其是哺乳动物的致癌机制以及植物生 长发育、生理调控方面的研究中展丌，研究表明c u 、z n 、p b 、c d 及其混合重金属离子 能极大地提高鲫鱼肝脏d n a 的总甲基化水平。有关重金属异常提高d n a 甲基化水平 已被研究证实，h i x 和a u g u s t o 2 7 】报道，f e 3 + 诱导产生的大量甲基自由基攻击d n a ，导 致d n a 高度甲基化。重金属能影响某些组织如肝脏、肾脏中d n a 甲基化水平且与浓 度有关，但是具体的机制还不清楚。周新文【2 8 1 发现，混合重金属离子能提高娜鱼肝脏、 肾脏和鱼鳃中d n a 总甲基化水平，其中p b 、c d 两种元素改变水平要明显高于c u 、z n 且与离子浓度呈正相关。葛才林等口9 1 对水稻和小麦做重金属( c u ”、c d 2 + 、h 9 2 + ) 胁迫实 验研究发现，重金属能明显导致水稻和小麦叶片。d n a 的甲基化水平的提高，随离子 浓度的升高5 - m e c 含量也明显升高。但是这与m a s u f o m i 等【3 0 j 研究的结果有所不同，鼠 肝细胞t r l l 2 1 5 在0 - 0 2 5 u mc d 2 + 暴露1 周后，整个基因组呈现低甲基化状态但是没发 现有浓度依赖关系，然而在暴露1 0 周后，细胞发生变形，整个基因组甲基化水平反而 增高了。 有文献报道了多环芳烃类化合物如萘、苯并芘对植物、哺乳动物的甲基化的影响。 土壤萘污染胁迫对玉米叶片中d n a 全甲基化无明显规律，对玉米幼苗期和灌浆期d n a 第1 章绪论 全甲基化影响较大，提出这是胁迫玉米生长发育的一种机制【3 】。s h u g a r t 指出，翻车鱼 暴露于苯并 a 芘污染后，全基因组将出现低甲基化p2 l 。s a d i k o v i cb 指出，在将4 种细 胞株暴露于苯并 a 芘的污染下，没有发现全基因组的甲基化水平的变化f 3 引。l e er 等 指出：苯并 a 芘的加合物能阻止d n a 甲基化酶的特异性，阻止d n a 的甲基化。这常常 会导致低甲基化发生1 3 引。r u s i e c k 等使用北极监测与评价项目收集的血样和以前用于分 析一组p o p s 中收集的血样，评价了从7 0 个格陵兰岛因纽特人血液样本中提取的d n a 的全d n a 甲基化( 5 甲基胞嘧啶) 与血浆p o p s 浓度间的关系。全甲基化水平与血浆中 几种p o p s 的浓度呈负相关。这些结果支持这一假设，即暴露于潜在的致癌化合物例如 p o p s 可能会影响d n a 甲基化【3 引，但未见石油类污染对海洋底栖生物甲基化的相关报 道。 杨建平等认为不管是体内还是体外实验，评估化学物质潜在的毒性时评价一下d n a 甲基化状态作为一种辅助措施，可以提供必要的信息去鉴定在什么情况下这种化合物可 以以一种安全的方式被人类使用。把d n a 基化状态的评价作为毒理学评价项目的前景 正因为d n a 甲基化是一种基因表达调控的重要机制，并在众多疾病及毒物毒性中扮演着 重要角色，所以d n a 甲基化状态评价在毒理学评价中理应占得一席之地，把甲基化状态 评估结合起来作为整个化学物安全评价体系的一部份，可能有助于加强和真正地使评价 过程程序化p 6 l 。 1 2 3 海胆补体c 3 国内外研究现状 c 3 是补体系统的中心成分，补体激活3 条途径中都需要c 3 的参与。在动物的基因 组中出现c 3 基因是证明出现补体系统的主要标志。构成无脊椎动物c 3 和脊椎动物c 3 核 苷酸和氨基酸序列分析比较显示：二者都具有激活蛋白水解酶的能力，都有硫酯键和1 3 q 作用位点( p ( i t p r o c e s s i n gs i t e ) 。c 3 a 结构区在海鞘和海胆体内是变化的，从七鳃鳗开 始一直到高等脊椎动物体内都是保守的，该结果表明：c 3 a 片段中过敏毒素活性在脊椎 动物体内才出现。从获得的c 3 基因全序列进化分析可知：海鞘、文昌鱼和海胆体内的 c 3 基因是由共同祖先c 3 c 4 c 5 基因直接进化而来，然而在七鳃鳗体内的c 3 基因形成了 类似于高等脊椎动物体内的c 3 基因簇【37 1 。c 3 , 1 c 4 ，c 5 在结构上是同源的，都是由系统 发生上共同祖先血清蛋白水解酶抑制因子a2 巨球蛋n ( a 2 一m a c r o g l u b i n ) 进化而来 石油烃对马粪海胆d n a 甲基化与补体c 3 的毒理效应研究 【3 引，它们都包含一个能和靶分子共价结合或作用的硫酯键位点。从原口动物( 两侧对称 的多细胞非后口动物) 体内就发现存在q2 巨球蛋白【3 9 】。q2 巨球蛋白基因在线虫基因 组中以单拷贝形式存在4 0 1 ，而在果蝇基因组却以多拷贝形式存在。在线虫和果蝇基因 组内却无c 3 c 4 c 5 基因存在，在海胆【4 2 】、海鞘【4 3 】、文昌鱼【4 4 1 、七鳃鳗【4 5 】体内发现存 在单个的类似的c 3 c 4 c 5 基因，明显和a2 巨球蛋白基因部分序列相似，显示c 3 和补 体系统只存在于后口动物。张士璀等【4 6 】运用绵羊抗人c 3 抗血清通过免疫比浊法首次测定 了文昌鱼体液中f l 勺c 3 浓度，同时还提出人的c 3 和文昌鱼体液c 3 具有部分抗原相似性4 7 1 。 最近在紫色海胆中鉴定出了一种简单的与人的旁路途经同源的补体。这种海胆的与 c 3 同源的补体是由可以激活血淋巴细胞的脂多糖诱导产生的。补体化合物已经在所有 的脊椎动物中被鉴定出来，现在又在原索动物和棘皮动物中被发现，这显示了补体系统 的起源比较原始的特性。因为补体系统是由一些比较原始的基因通过基因的复制和分歧 进化而来【4 8 1 。 已在北方球海胆s d r o e b a c h i e n s i s 中发现有补体样活性的因子。有研究表明，用脂多 糖刺激海胆体腔细胞后，能够从中检测到c 3 补体的活性。从海胆中已分离出两种脊椎 动物c 3 和b ( b f ) 因子的物质，分别称之为s p c 3 和s p b f 。对海胆进行免疫攻击能诱导 产生s p c 3 ，其在体腔液中浓度明显升高，而s p b f 在体腔液中浓度则较低。已确定编码 s p b f 的基因s p l 5 2 在紫球海胆体腔细胞中有表达，。这种表达是构成性的而非诱导性的 【4 8 】 o 多指标的综合研究利于全面评价污染物对生物的各种可能的影响，目前已经有一些 这样的工作。而国际上尚未有石油水溶性成分对马粪海胆甲基化活性影响及补体c 3 基 因p c r s s c p 研究报道，缺乏比较全面系统的研究，本文选取上述两种指标做初步研究。 1 3 研究内容、研究目的和意义 1 3 1 研究内容 本文选择马粪海胆作为实验的受试生物，实验内容如下： 1 、o “柴油分散液对马粪海胆全基因组d n a 甲基化的影响。 2 、0 4 柴油分散液对马粪海胆补体c 3 基因p c r s s c p 分析试验。 第1 章绪论 1 3 2 研究目和意义 1 、本文探讨和建立石油成品油的使用对马粪海胆的毒性研究方法，在实验基础上获得 石油成品油分散液对马粪海胆全基因d n a 甲基化及补体c 3 基因p c r s s c p 分析的实 验室数据，为开展海洋环境评价工作以及海洋环境的生物检测提供可参考的数据。 2 、对生物标志物更详尽和精确的描述应该是通过测量体液、组织或整个生物体，能够 表征对一种或多种化学污染物的暴露和( 或) 其效应的生化、细胞、生理、行为或能量 上的变化【4 9 】。笼统的说，生物标志物就是可衡量环境污染物的暴露及效应的生物反应【5 0 1 。 在污染物作用下，各个层次的生物组织，从分子水平到生态系统，都有各自相对应的污 染效应及相适用的生物标志物，形成完整的体系。反映种群、群落、生态系统变化的生 物标志物具有较高的生态学意义，但相比较于分子和细胞水平的生物标志物，它们反应 较慢，而且反映的是不可逆的损害。而分子和细胞水平的生物标志物对环境胁迫反应迅 速，具有高度的毒理学意义，可在生态系统发生不可逆损害之前作为环境变化的早期警 报指标。种群、群落、生态系统层次的生物标志物目前还处在研究阶段【5 ，而许多分子 和细胞水平的生物标志物己经有透彻的研究，污染物引起的这类生物标志物的变化值得 引起充分重视和利用【5 2 。引，因此在一些国家和国际的监测计划( 如美国，加拿大，法国， 瑞典，北海沿海国家等) 中广泛采用生物标志物。 通过本研究结果明确低浓度石油烃污染对水生生物海胆的毒性效应，进一步寻找灵 敏可靠的分子生物标志物来指示低水平石油烃污染可能产生的毒性效应。为制定预防性 的管理措施提供科学依据，及时避免或减轻石油烃污染对水生生态系统造成的损害。并 就石油烃污染对生物的致毒机理做一定的探讨，从表观遗传学及遗传毒理学角度就石油 烃污染对生物的毒性进行分析，为我国石油烃污染的生物毒性研究提供一条可参考的途 径。 本文通过对石油烃污染下海胆补体c 3 的p c r s s c p 分析，探讨无脊椎动物海胆 d n a 甲基化及d n a 突变作为石油烃污染的生物标志物可行性。 石油烃对马粪海胆d n a 甲基化与补体c 3 的毒理效应研究 第2 章石油烃污染对海胆d n a 甲基化影响 致突变不是遗传表型改变的惟一机制，相当多的物理、化学因子通过影响表观遗传 而导致基因组遗传变化。基因遗传毒性是指毒物本身及其代谢产物与d n a 的直接作用， 导致d n a 序列的改变，最终导致突变发生。非遗传毒性的化合物( 例如，化合物及其代 谢物与d n a 没有发生结合反应) 可能通过一个间接地、甚至是次间接的方式造成基因表 达的改变，部分甚至可以影响下一代，具有遗传毒性的特征。因此可以说致突变作用不 是基因组遗传改变的惟一机制，表观遗传学强调的是非基因序列导致的基因表达的改 变，比如d n a 甲基化、组蛋白乙酰化等。 d n a 甲基化是指在甲基转移酶作用下，d n a 碱基加上甲基的过程，最常见且最有 代表性的是胞嘧啶5 位上的甲基化，甲基化胞嘧啶一样也可与鸟嘌呤进行碱基配对，这 种改变不是突变，它参与了动物胚胎发育、基因印迹和x 染色体失活等过程。在基因表 达的调控中具有重要作用。异常甲基化可以导致肿瘤的形成。d n a 甲基化与组蛋白去乙 酰化协同调节基因的表达。d n a 甲基化可以随着外界环境因素的变化而改变。在哺乳动 物胚胎移植和体细胞核移植( s c n t ) 过程中，人工操作会引起d n a 甲基化修饰改变，从而 影响成功率【5 4 - 5 5 1 。 反应如下 l d o o d 鼢平簦化謦 。 瑚口鼍默孵 麓趣 图2 1d n a 甲基化反应过程 f i g z 1d n am e t h y l a t i o nr e a c t i o n o 麓o 冀 第2 章石油烃污染对海胆d n a 甲基化影响 d n a 甲基化是