（环境科学专业论文）人参硫酸酯多糖的合成方法及其有机氯多残留的分析方法研究.pdf

a b s t r a c t p a n a xg i n s e n gc a m e y i sap l a n to fa r a l i a c e a e g i n s e n gw i t hh i g hr e p u t a t i o na n d e x p e n s i v ev a l u ei su s u r a l l yr e g a r d e da so n ek i n do fc h i n e s et r a d i t i o n a lh e r bw h i c hh a sm a n y m e d i c a le f f e c e t s ，s u c ha sk e e p i n gt h eh a l t hi nb a l a n c e ，m a k i n gt h eb l o o dm o r ef r e s h ，k e e p i n g t h ec o u g ho f fe a r l i e r , a n dd e l a y i n gt h el i f ep e r i o d ，e t c e x t r a c t e df r o mp a n a xg i n s e n g ， p o l y s a c c h a r i d e ，a so n eo ft h em a i na c t i v ec o m p o n e n t s ，h a sv a r i o u sf u c t i o n ss u c ha sa n t i t u m o r , a n t i c a d u c i t y , d e c r e a s i n gb l o o ds u g a ra n db l o o df a t ，a n dm o d u l a t i n gi m m n i t y , e t c t h et h e s i si n t r o d u c e st h eg i n s e n gp o l y s a c c h a r i d e sw h i c ha r ee x t r a c t e df r o mf r e s hr o o to f g i n s e n ga n db e l o n g st oo n ek i n do fd - d e x t r a n s ak i n do fs u l f a t e dp o l y s a c c h a r i d e sw a s o b t a i n e da n di t ss t r u c t i o nw a sp r o v e d an e wm e t h o df o ra n a l y s i so fn i n e t e e no r g a n o c h l o r i n e p e s t i c i d er e s i d u e si ng i n s e n g i sp r o p o s e d 1 t h eb e s tc o n d i t i o n sa n dm e t h o d so fe x t r a c t i n gg i n s e n gp o l y s a c c h a r i d e sa r ei n d e n t i f i e d t h r o u g hc o m p a r i n gt h ew a t e re x t r a c t i o n e t h a n o ld e p o s i t i o n n ea v e r a g em o l e c u l a rw e i g h ti s a b o u t1 0 ，3 0 0o fg i n s e n gp o l y s a c c h a r i d e sb yh p l c t h em o l e c u l a rs t r u c t u r ei sp y r a n t y p e d 0 【一d d e x t r a n sb yf r i r 2 g i n s e n gs u l f a t e dp o l y s c c h a r i d e sw a so b t a i n e df r o mg i n s e n gp o l y s a c c h a r i d e sw i t h c h l o r o s u l f o n i ca c i d - p y r i d i n ei nt h i sp a p e rf i r s t t h eb e s tc o n d i t i o n so fs y n t h e s i st h r o u g h c o m p a r i n gt h ee f f e c t so fd i f f e r e n tc o n d i t i o n s s b c ha sv 0 1 p r o p o r t i o no fc h l o r o s u l f o n i c a c i d p y r i d i n e r e a c t i v et e m p e r a t u r ea n dr e a c t i v et i m e r e p l a c ed e g r e eo fs i s2 0 5 3 b ym e a n so fh p l c u va n df r - i r ，t h es t r u c t u r eo fg i n s e n gs u l f a t e dp o l y s c c h a r i d e s w a sp r o v e d t h eh p l cc h r o m a t o g r a ms h o w sas i n g l ep e a k ；t h eu vs p e c t r u mo fg i n s e n g s u l f a t e dp o l y s c c h a r i d e ss h o w st h ec h a r a c t e r i s t i ca b s o r p t i o n so fs u l f a t ee s t e r b o n da t 2 5 0 。2 7 5 n m ；t h ef t - i rs p e c t r u mo fg i n s e n gs u l f a t e dp o l y s c c h a r i d e ss h o w st h ec h a r a c t e r i s t i c a b s o r p t i o n so fs u l f a t ee s t e rb o n da t1 2 5 7 c r n 1a n d8 2 6 c m t h e s es h o wt h a ts y n t h e s i so ft h e s u l f a t ee s t e ri sm a d e 4 t h eu cn m r s p e c t r u mo fg i n s e n gs u l f a t e dp o l y s c c h a r i d e ss h o w st h a th y d r o x y lo f c 6i sm o r ea c t i v et h a nt h o s eo fc 2 c 3a n dc 4 5 t h em u l t i r e s i d u ea n a l y s i sm e t h o do fn i n e t e e no r g a n o c h l o r i n ep e s t i c i d ew e r ee s t a b l i s h e d w h i c hq u a l i f i e st h ep r e c i s i o na n da c c u r a c yc o r r e s p o n d sw i t hr e q u i r e m e n to ft h ea n a l y s i so ft h e p e s t i c i d er e s i d u e s t h eg o o dl i n e a r i t yw e r eo b t a i n e df o rn i n e t e e no r g a n o c h l o r i n ep e s t i c i d e w i t ht h ea v e r a g er e l a t i v et o e f f i c i e n tl a r g e rt h a n0 9 9 2 t h em i n i md e t e c t a b l es a m p l ew a s 1 5 1 0 1 32 5 x l o - “a n dt h ea v e r a g er e c o v e r i e sr a n g ew a sf r o m7 5 7 t o11 5 2 6 i nt h et h e s i s ，g i n s e n gs u l f a t e dp o l y s c c h a r i d e ss y n t h e s i z e di n c l u d es o m ec h a r a c t e r i s t i c s o fh o m o g e n e o u sc o m p o n e n t ，l e s s e rm o l e c u l a rw e i g h t ，m o r er e p l a c ed e g r e eo fs ，w h i c h p r o v i d et h es a m p l ef o rt h em o r eb i o l o g y a c t i o no fa n t i a i d sa n da n t i t u r n o u t 7 t h em u l t i r e s i d u ea n a l y s i sm e t h o di nt h et h e s i sm a yb ea p p l i e di ns o m ef i e l d s w i d e s p r e a d l ya n dp r o v i d e sg o o dt e c h n o l o yo fs u p p o r t i n gg e n s i n gq u a l i t yi m p r o v e m e n tt o i n c r e a s et h ec o m p e t i t i v ec a p a c i t yo fi n t e r n a t i o n a lg i n s e n gm a r k e t ，a c c e l e r a t et h ed e v e l o p m e n t a n dm o d e m a z a t i o no ft h ep r o f e s s i o no fg e n s i n gw i t ht h ea d v a n c e dm e a n so ft e s t i n g k e yw o r d s ：g i n s e n gp o l y s c c h a r i d e s ；g i n s e n gs u l f a t e dp o l y s c c h a r i d e s ；s t r u c t u r ec h a r a c t e r ； o r g a n o c h l o r i n ep e s t i c i d e ；m u l t i r e s i d u ea n a l y s i s 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所取得 的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中作了 明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：辱显难 日期：趟。 么= 芏 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东 北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、 汇编本学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士学位论文全文数据库 ( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论文全文数据库( 中国科学技 术信息研究所) 等数据库中，并以电子出版物形式出版发行和提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：勉丕笙净指导教师签名：9 圭墨 学位论文作者毕业后去向： 工作单位：盔盐礁业燧别遗鱼鲤 通讯地址：盘金壹瓤逝2 避 电话：趔二丞笙彬彤 邮编：盆匠丛 东北师范大学博士学位论文 引言 一、多糖的研究概况 多糖广泛分布于多种生物体中，是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高 分子多聚物，是构成生命的四大基本物质之一i l j 。 早在1 0 0 年前，德国著名科学家f i s c h e r 就开始对糖进行研究。糖类的研究己有近百 年的历史，糖类的生命科学几乎与蛋白质的生命科学同时诞生1 2 。由于其结构的复杂性 和研究手段的局限性，使糖的研究远滞后于蛋白质和核酸，主要反映在多糖的结构与功 能的关系还不清楚。多糖在体内的作用机理大多未知【引。多糖结构的复杂性也大大增加 了多糖研究的难度1 4 j 。 糖类化合物不仅为生命有机体提供了碳骨架结构和能量来源，而且还广泛地参与细 胞的各种生命现象及生理过程的调节。尽管多糖是自然界中重要的高分子有机化合物， 但是因长期未受到重视，其研究发展较蛋白质和核酸慢得多。2 0 世纪5 0 年代，随着化 学和生物学的发展以及分离技术的提高，人们才开始认识到多糖的结构是非常复杂多样 的，其生物学功能也决非仅仅是能量和结构上的功能，而是具有复杂的、多方面的生物 活性。尤其是近二十年来，随着细胞生物学，分子生物学的发展，人们对糖类物质的认 识也有了质的飞跃，充分认识到糖类物质是除核酸和蛋白质之外的另一重要生物大分 子，涉及到多细胞生命的全部时间和空间，如受精、着床、分化、发育、免疫、感染、 癌变、衰老等等l 粥j 。 多糖类化合物在自然界高等植物、藻类、细菌类及动物体内均有存在，分布极广p j 。 多糖是指由1 0 个以上单糖分子缩合而成的高聚糖。多糖可分为匀多糖和杂多糖两类。 匀多糖由一种单糖聚合而成，如果胶、纤维素等；杂多糖由两种以上的单糖聚合而成， 如瓜儿豆胶、肝素等。除淀粉和肝素等几种多糖外，其他多糖类过去一直被认为无任何 营养价值和生理活性，被视为无用成分。上个世纪6 0 年代以来，随着对多糖的研究的 深入，人们逐渐发现多糖具有复杂的、多方面的生物活性和功能【舡1 2 】：多糖可作为广谱 免疫促进剂，具有免疫调节功能，如多糖能治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫 系统疾病，甚至抗a i d s 病毒等；还具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂以 及促进核酸与蛋白质的生物合成作用；能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老 【1 3 】。而且多糖作为药物其毒性极小，因而多糖的研究已经引起人们的极大兴趣，对糖类 物质的研究已成为人们关注的焦点，各国学者竞相从各种生物材料中寻找和提取具有生 理活性的糖类物质，从而使关于糖类物质的研究有了空前的发展。 国际上对糖类的研究日新月异，内容包括糖生物学、糖工程等，并且相继多次召开 了有关“糖生物学和糖工程”的专题会议，1 9 9 5 年3 月，亚洲分子生物学组织( a m b o ) 还 在日本举办了“糖生物学和糖工程”培训班”。日本、美国及欧盟十分重视糖类的研究1 1 4 , 1 5 j ， 东北师范大学博士学位论文 且在糖的研究与开发处于领先地位，并且提出各自的重大科研计划。 中国对多糖类的研究起步较晚，始于7 0 年代，但进展迅速，尤其在多糖类的生物 学功能研究方面取得了较快的发展。在研究糖类的作用机理时，与中医药理论紧密结合， 形成了迅速发展的趋势1 1 ”7 1 。值得指出的是我国对于糖的研究尚无重大计划。 到目前为止，已有近3 0 0 种的多糖类化合物从天然产物中被分离提取出来。其中， 从植物中尤其是从中药中提取的水溶性多糖最为重要。这些活性多糖的生理活性、化学 结构以及构效关系成为多糖研究的前沿阵地，取得了很大的进展i l 剐。由于我国是中药大 国，中药的发源地，多糖广泛地存在于许多中药材中。多糖是中药发挥独特疗效的重要 物质之一，对各种中药材的化学成分研究的过程中，人们都少不了对其中多糖的关注。 中药多糖的资源丰富，有巨大的发展潜力。 多糖由于其具有增强机体免疫功能及抗肿瘤等药理作用，而且几乎没有毒性并可通 过化学手段控制其质量，愈来愈引起了国内外药理学家、生物学家和化学家们的兴趣， 成为当前的研究热点之一i l 引。 ( 一) 多糖的来源和种类 多糖在自然界蕴藏丰富，种类繁多，主要有植物多糖、动物多糖、海藻多糖和微生 物多糖，是所有生命有机体的重要组成部分，与维持生命所必需的多种生理功能有关1 2 0 。 植物多糖来源于植物的根、茎、叶、皮、种子和花。 目前已发现的活性多糖有数百种之多，按其来源不同，可分为真菌多糖、高等植物 多糖、藻类地衣多糖、动物多糖、细菌多糖等五大类。 按多糖在生物体内的功能可分为两类：一类为非水溶性的，形成生物体的支持组织， 如植物的纤维素，蟹、虾等甲壳类动物、昆虫及其它无脊柱动物外壳的甲壳素等。另一 类为可溶于热水的、经酶或酸碱水解后能形成寡糖或单糖可以供应能量的物质。 细菌中的各种荚膜多糖研究得较早也是最多的，在医药上主要用于疫苗1 2 。 真菌多糖的研究既深又广，如酵母菌多糖、食用菌多糖等，食用菌多糖的报道频率 是相当高，其中以香菇多糖研究得较清楚。 植物多糖的开发也备受人们的青睐，研究得比较深入的是稻草多糖、麦秸多糖、竹 多糖、黄茂多糖和刺五加多糖。 在生物化学领域，通过人们的不断努力，一些活性多糖作用机制的研究逐渐进入微 观的细胞水平，如香菇多糖的作用机制已有了分子水平的发现【2 2 , 2 3 】。 ( 二) 多糖的提取、分离和纯化 1 多糖的提取 尽管多糖的种类繁多，但其提取分离的方法基本相同1 2 4 ，2 5 1 。动植物及微生物多糖， 首先要去表面脂肪【2 6 。原料经粉碎后加入丙酮、乙醚、乙醇、甲醇或1 ：1 的乙醇一乙 醚混合液，水浴加热搅拌或回流1 - 3 小时，脱脂后过滤得到的残渣般用水作溶剂提 取多糖俐。 ( 1 ) 动物多糖的提取 动物中所含多糖多是酸性多糖，主要存在于动物的结缔组织中，常与蛋白质牢固地 2 东北师范大学博士学位论文 结合在一起，因此目前常用如下三种方法提取分离，即：碱溶液提取法、中性盐溶液提 取法和蛋白酶水解法。其中以酶解法较好，因其具有产物降解少且产量高等优点，如鹿 茸中酸性多糖的提取：采用木瓜酶消化方法，将鹿茸渣加木瓜酶及酶活化剂，在6 0 c 水 浴中连续消化2 4 h ，取上清液进一步处理，加醇可得多糖。 ( 2 ) 植物多糖的提取 大部分植物多糖不溶于冷水，在热水中呈粘液状，遇乙醇能沉淀。这样从植物中分 离、提取较为单一的植物多糖并鉴定其纯度则极为困难。故提取时需注意对一些含脂较 高的根、茎、叶、花、果及种子类，在用水提取前，应先脱脂；而对含色素较高的根、 茎、叶、果实类，需进行脱色处理。科学家曾采用经水或甲醇等有机溶剂的水溶液浸泡， 低温减压浓缩，流水透析，凝胶柱层析，冷冻干燥等途径得到较单一的多糖成分，再经 高效液相色谱或凝胶层析测定其纯度、分子量，酸水解气液相层析或纸层析测定其单 糖组成，如黄芪多糖( a s t r a g a t a n ) 、人参多糖( p a n a x a n s ) 、苍术多糖( a t r a c t a n s ) 、乌头多糖 ( a c o n i t a n s ) 、栝萎根多糖( t r i c h o s a n s ) 7 f 【l 紫草多糖( l i t h o s p e r m a n s ) 等的提取。 ( 3 ) 菌类多糖的提取 各类真菌中所含多糖类化合物，其提取分离方法亦利用水提醇沉，除去小分子杂质 和蛋白质( s e v a g e 法、三氟三氯乙烷法等) ，即得多糖，如灵芝多糖、槐耳多糖、安络小 皮伞多糖等。 多糖的提纯常用的是“水溶醇沉法”，用乙醇沉淀是一种从溶液中定量回收多糖的简 单方法，由于不同性质或不同分子量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它同样也可以用于 样品中不同多糖组分的分级分离【2 8 1 。要根据具体情况使用不同浓度的乙醇，其中需要考 虑的包括多糖的浓度及盐浓度。同一原料，不同的提取方法所得的多糖结构有差别；不 同组织部位得到的多糖结构也不一样【2 9 3 0 】。一般应避免在强酸、碱溶液中进行，否则极 易造成多糖中糖苷键断裂及构象变化。 2 多糖的分离 采用上述方法得到的多糖一般为粗多糖。其中往往混杂着蛋白质、色素、低聚糖等 杂质，必须分别除去【3 1 。3 8 1 。 ( 1 ) 蛋白质的去除 常用的方法有以下几种： ( d s e v a g e 法： 根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，用氯仿：戊醇( 或正丁醇) 体积比5 ：1 或4 ：1 的混合物剧烈振摇2 0 到3 0 分钟，蛋白质与氯仿戊醇( 或正丁醇) 生成凝胶物而 分离，离心，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。此种方法在避免降解上有较好效 果，但效率不高，如能配合加入一些蛋白质水解酶，再用s e v a g e 法效果更佳f 3 9 舯】。 三氟三氯乙烷法： 多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合，低温下搅拌1 0 m i n 左右，离心得上层水层， 水层继续用上述方法处理几次，即得无蛋白质的多糖溶液，此法效率高，但溶剂沸点较 低，易挥发，不宜大量应用【4 1 1 。 3 东北师范大学博士学位论文 三氯醋酸法 在多糖水溶液中滴加5 3 0 三氯醋酸，直至溶液不再继续混浊为止，在5 一- 1 0 c 放置过夜，离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖溶液。此法会引起某些多糖的降解【4 2 1 。 以上方法均不适合糖肽，因糖肽也会象蛋白质那样沉淀出来。对于对碱稳定的糖蛋 白，在硼氢化钾存在下，用稀碱温和处理，可以把这种结合蛋白质分开。 ( 2 ) 色素的去除 常见的脱色方法有：双氧水脱色法和活性炭脱色法，由于双氧水脱色方法是提取液 中直接氧化其中的色素，并未脱除。因此，氧化后的色素仍然作为杂质留在提取液内， 并不能保证其最后品质。而活性炭脱色后，色素便被分离出来，从而提高了粗多糖的纯 度，因而是一种较可取的脱色方法。 植物来源的多糖，可能含有酚型化合物而颜色较深，这类色素大多呈负性离子，不 能用活性炭吸收剂脱色，可用弱碱性树脂d e a e 纤维素或d u o l i t ea 7 来吸附色素；若 糖与色素结合，易被d e a e 纤维素吸附，不能被水洗脱，这类色素可进行氧化脱色：以 浓氨水( 或n a o h 溶液) 调至p h = 8 0 左右，5 0 。c 以下滴加h 2 0 2 至浅黄色，保温2 小时： 发酵来源的多糖颜色一般较浅。对于动物，微生物等提取到的多糖也可根据不同情况按 上述方法处理。一般情况下，尽量避免用活性炭处理，因活性炭会吸附多糖，造成多糖 损失。 ( 3 ) 低聚糖等小分子杂质的去除 利用透析袋或透析装置，通过逆向流水透析除去低聚糖等小分子杂质，这样得到的 就是多糖的半精品。 3 多糖的纯化 多糖制品，去除蛋白质后，还必须经过纯化步骤。纯化是将多糖混合物分离为单一 多糖的过程，而实际上分离和纯化是很难明显区别开的，因为有的分离过程已经在纯化 了，反过来在纯化过程中又使多糖进一步得到分离。一般组织中存在多种多糖，因而需 要对多糖混合物进行分级分离。对多糖进行分级分离的方法有多种，其中利用多糖在乙 醇中的溶解度不同是一最为常用的简单而有效的方法【4 3 1 。根据多糖阴离子电荷密度的不 同，可利用季铵络合物的生成、离子交换色谱和电泳进行分级分离1 4 4 4 5 1 。根据分子量大 小的不同，用凝胶色谱、超滤等技术进行分级分离也是工业生产常用的方法1 4 4 ，4 6 1 。多糖 的分离纯化是困难的，用一种方法不易得到均一成分。多糖的分离纯化方法很多，一般 随多糖组成的复杂性不同而有所区别。常用的多糖分级纯化方法有【4 7 4 8 】： ( 1 ) 沉淀法 包括分步沉淀法【4 9 1 、盐析法【5 0 l 、金属络合物法f 5 1 】和季铵盐沉淀法 5 2 】。 分步沉淀法 不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中具有不同的溶解度，一般随着聚合度和相对分 子质量的增大，在乙醇中的溶解度逐步降低。根据这一性质，在糖的浓水溶液中，逐次 按比例由小而大加入这些醇或酮( 常见的有甲醇、乙醇和丙酮) ，使浓度渐增，进行分步 沉淀，此方法适用于分离各种溶解度相差较大的多糖。 4 东北师范大学博士学位论文 盐析法 根据不同多糖在不同盐浓度中具有不同溶解度的性质，加入不同盐析剂使之逐步析 出。常用的盐析剂有n a c i 、k c i 、( n n 4 ) 2 s 0 4 、c h 3 c o o k 等，以( n h 4 ) 2 s 0 4 最佳。这种 方法实质上是分部沉淀法的一种。 金属络合物法 根据不同多糖能与c u 2 + 、c a 2 + 、p b “、b a 2 + 形成不溶性络合物而沉淀的性质。常用 的络合物有斐林试剂、铜盐溶液( c u c l 2 、c u s 0 4 等) 、b a ( o h ) 2 和c h 3 c o o p b 等。得到 的络合物沉淀经水充分洗涤后，用5 无机酸乙醇液或硫化氢分解。m e i e r 曾用不同浓度 ( o 0 3 0 2 m o l l ) 的氢氧化钡沉淀b ( 1 _ 4 ) d 甘露糖及半乳聚糖。 季铵盐沉淀法 十六烷基溴代三甲基铵( c r a b ) 、十六烷基吡啶( c p c ) 等和酸性多糖阴离子可以 形成不溶于水的沉淀使酸性多糖从水溶液中沉淀出来，中性多搪留在母液中而分离。若 再利用硼酸络合物，中性多糖也可沉淀，或在高p h 值的条件下，增加中性醇羟基的解 离度而使之沉淀。 ( 2 ) 柱层析法【3 9 】 常用的柱层析法有：凝胶柱层析法、纤维素柱层析法、纤维素阴离子交换剂柱层析法 凝胶柱层析法 它是根据多糖分子的大小和形状不同而达到分离目的的。常用的凝胶有葡聚糖凝胶 ( s e p h a d e x ) 及琼脂糖凝胶( s e p h a r o s e ) 。洗脱剂为各种浓度的盐溶液及缓冲液，但它 们的离子强度最好不低于0 0 2 。凝胶柱层析也是多糖分离中常用的一种方法。凝胶柱层 析其柱子装填好坏对分离效果及分离所需时间有很大影响，一般要一次装柱，平衡时流 速要慢且稳定。关于凝胶层析我国已有专著【5 3 1 ，可供多糖他离的借鉴。凝胶柱层析不适 宜粘多糖的分离。 纤维素柱层析法 将多糖混合物全部沉淀于惰性多孔的纤维素柱上面。然后用不同浓度乙醇水溶液 洗脱，不同多糖就按次洗脱出来。例如纤维素柱先用乙醇平衡，加多糖混合物于柱顶， 多糖则全部沉淀析出于柱上端，然后按浓度由高到低的乙醇水溶液洗脱。洗脱过程中， 各种多糖在柱上进行无数次的溶解和沉淀过程，最终将各种多糖分离开来。这种方法实 质上与分步沉淀法相反，可称“分步溶解法”。 纤维素阴离子交换剂柱层析法 阴离子交换纤维素问世以来，许多高分子水溶性成分，如蛋白质、核酸和多糖等都 得以分离纯化，效果很好。常用的有d e a e 纤维素( 二乙基氨基乙基纤维素) 和 e c t e o l a 纤维素( 3 氯1 ，2 环氧丙烷三乙醇胺纤维素) 。洗脱剂可采用不同浓度碱溶液、 硼砂溶液以及盐溶液。目前此法最为常用，它一方面可纯化多糖，另一方面还适于分离 各种酸性多糖、中性多糖和粘多糖。太子参粗多糖加水溶解，透析，然后进行d e a e 纤维素柱色谱，以0 2 m o l ln a c i 水溶液梯度洗脱，再以s e p h a d e x g 1 0 0 柱色谱精制， 得两种均一性多糖。党参总多糖加水溶解，b a ( o h ) 2 沉淀，沉淀物除尽b a 2 + ，再将沉淀 s 东北师范大学博士学位论文 物上d e a e 纤维素( 碱型) 色谱柱，依次用水、不同浓度的n a h c 0 3 溶液及0 0 5 m o l l 的 n a o h 溶液洗脱，得四种单一多糖。此法优点是可吸附杂质，纯化多糖，并适用于分离 各种酸性、中性多糖和粘多糖。多糖在交换柱上的吸附力与多糖结构有关，一般随酸性 集团的增加而增加。对于线状分子，分子量较大的多糖吸附力强，直链多糖较分支多糖 易吸附。 ( 3 ) 冻融分级法 利用温度不同、溶解度不同而分级，分子量大或水溶性差的先析出。 ( 4 ) 超过滤法 超过滤法是利用物质分子量的不同而进行分离的方法。根据所得多糖与其杂质分子 量的不同，选取合适的超滤膜进行超滤，根据需要保留膜上部分或膜下部分；对所得溶 液进行浓缩及冷冻干燥，即可得到所需多糖样品。该方法不使用任何化学试剂，不会改 变多糖分子的结构和构象，同时操作简单、运行周期短，因此成为一种新兴的发展迅速 的多糖纯化方法。 纯化除采用上述方法外，还有制备型区域电泳、活性炭柱色谱等等。另据报道，国 外多采用l k b 柱层析系统，用比旋度、示差折光及紫外检测器，各组分的峰位自动记 录，分离效果好且方便。 综上所述，仅利用一种纯化方法难以获得组分较纯的多糖产品，只有将上述两种或 多种分离纯化方法有机地结合起来，充分利用每种分离方法的优势，才能达到多糖组分 高效的分离纯化。 ( 三) 多糖的纯度鉴定 多糖的“纯”指的是一定分子量范围的均一组分，纯度只代表相似链长的平均分布， 即便是多糖纯品，其微观结构也是不均一的，因此，多糖的纯度标准不能用通常化合物 的纯度标准来衡量。最好的纯度标准是建立多项指标，每一项指标测定一种不同的特性。 常用多糖纯度鉴定的方法有比旋度法、超离心法、高压电泳法、凝胶层析法等。要确定 某一多糖的均一性，必须要有两种以上的结果，才能确定其均一性。目前，常用的且较 准确的方法是第四种方法，即凝胶层析法。通常在纯化的各个阶段应测定其灰分、含氮 量、功能团( c o o h 、n h 2 、c h o ) 的摩尔比、比旋度、粘度、水解后各种单糖的含 量。一般说来，多糖反复精制到这些数值不再变动，才能断定该多糖较纯 5 4 1 。 比旋度法是利用不同分子量的多糖在不同浓度低级醇中溶解度差别进行的。多糖水 溶液经不同浓度乙醇沉淀，所得沉淀物具有相同比旋度，则可说明该多糖为均一组分。 超离心法是将多糖溶液进行密度梯度离心，待转数达到6 0 0 0 0r m i n 以上后，间隔 照相，如得到单一峰则证明该多糖为均一组分。用此法需有分析用带照相设备的超速离 心机。 高压电泳法1 3 9 4 5 】是利用不同多糖与硼砂形成不同复合物，这些复合物具有不同的电 荷，在电场作用下其迁移率不同，电泳结果呈单一色斑，则表明该多糖为均一组分。 凝胶层析法1 5 5 5 6 】是目前应用最多的方法，凝胶具有一定大小的孔径，不同形状和大 小的分子在凝胶层析相中移动速度也不同，其规律是较大分子移动得较快，较小的分子 6 东北师范大学博士学位论文 移动得较慢，流出液经检测仪检测，如只有一个对称峰，且呈高斯分布，则说明分子量 分布相对均一，表明该多糖为均一组分。 ( 四) 多糖含量的测定 多糖的含量检测方法可分为两大类【5 7 ，5 剐，一类是直接测定多糖本身，如：高效毛细 管电泳法、高效液相色谱法和酶法。前两种方法需要昂贵的仪器设备和多糖的纯品，后 者操作步骤繁琐，并且需要特定的酶，因此这些方法在实际应用中受到了很大的限制。 另一类是利用组成多糖的单糖的性质进行测定，其中利用单糖缩合反应而建立的方法最 多。这些方法简单、快速，无需多糖纯品和高级仪器，因而被广泛采用。 1 比色法：目前使用的比色法有地衣酚硫酸法、葸酮硫酸法、苯酚硫酸法。其 原理【5 8 】为多糖在强酸性条件下水解后脱水生成糠醛及其衍生物，然后再与酚类、胺类、 葱酮化合物缩合，生成有特殊颜色的物质这一性质进行比色定量测定，间接求出多糖的 含量。在9 0 年代a o a c 将苯酚硫酸法列为标准方法。 2 气相色谱法：气相色谱法可定性、定量分析多糖的组分及含量，常采用衍生物 法以增加其挥发性【5 4 郧】。一般是将多糖酸水解物或甲醇解物，用三甲基硅烷基化( t m s ) 或三氟乙酰化( t f a ) 转化为硅烷化产物或二酰化产物进行气相色谱分析。但乙酰化之 前，先用k b h 4 或n a b h 4 作还原剂，将糖还原成开链的糖醇化合物较好。多糖用甲醇解 方式把半缩醛甲基化，形成甲基糖甙后再t m s 化，异构物减少，有利于分辨。 常以甘露醇或肌醇为内标，用已知的各种单糖做标准。 3 高效液相色谱法：高效液相色谱法选用t s k 、s w 凝胶排斥色谱柱为分离柱， 样品经简单预处理，在示差折光检测器中进行检测，以不同分子量的标准右旋糖酐作标 准，同时测定样品中多糖的分子量分布情况及其含量，该方法较其它多糖测定法具有快 速、简便、准确等优点，是目前较为行之有效的测定方法1 5 9 。 ( 五) 多糖的分子量测定 多糖的分子量分布比较分散，所以一般测得的分子量是一种统计平均值。常用的方 法有渗透压法、蒸汽压法、端基法、粘度法、光散射法等【3 9 , 4 6 l ，这些方法操作复杂且误 差较大。目前较常用的方法有凝胶过滤法和高效液相色谱法，但这两种方法需先用己知 分子量的标准多糖做对照，才能测定样品的分子量。 利用不同方法测定多糖分子量可以从不同角度对多糖分子量进行确证，同时也是对 多糖纯度的考察。在测定过程中要注意标准品的选择，尽量使用与被测多糖结构相似的 标准品，因为不同结构的标准品虽然其绝对分子量相同而在一定的条件下所表现的分子 量会有所不同。多糖分子量的测定没有一种绝对的方法，其分子量只代表相似链长的平 均分布而不是确切的分子大小。用不同的测定方法会得到不同的分子量，多糖的性质往 往与它的分子量大小有关。 1 渗透压法：利用膜渗透压计( m o 仪) 可以测定分子量范围在1 万一5 0 万之间的 多糖分子量，此法不需用标准品，但要有合适的半透膜，且测定比较费时。 2 蒸汽压法：利用蒸汽压计( v p o 仪) ，可测定分子量范围在5 0 0 1 0 0 0 0 之间的多 糖分子量。方法简单、快速，但必须选用标准品。 7 东北9 币范大学博士学位论文 3 端基法：不分支的糖链，通常具有一还原性与一非还原性末端，如具有分支链 则非还原和还原末端比例增加。通过测定单位重量样品中所含可测端基数计算检样的分 子量。 4 粘度法：先测定样品特性粘度1 1 ，然后通过换算公式r i = k m 8 ，计算出分子量m 。 但粘度法不是一个绝对的方法，k 值常用已知结构相似的多糖决定，0 【值经张翼伸【5 5 j 等 实验一般葡聚糖定为1 尚接近。 5 光散射法：利用光散射分子量测定仪测定多糖分子量，此法不用标准品。 6 凝胶过滤法：将充分膨胀好的s e p h a d e xg 2 0 0 、g 1 5 0 或g 7 5 湿法装柱，用一 定离子强度的氯化钠水溶液进行平衡，然后将各种不同的已知分子量的多糖分别相继上 柱，同一离子强度的氯化纳水溶液洗脱，分步收集，苯酚硫酸法监测，分别求得洗脱 体积v e ，然后再将蓝葡聚糖( m w 2 0 0 万) 上同一条柱，求出柱的空体积v o ，根据v e t r v o 与l o g m 之间存在着线性关系，可绘制标准曲线。最后，将待测样品按上述不变的条件 上柱，求得待测多糖的v e 。通过标准曲线上的姚，查得待测多糖的分子量对数，便 可求出m t 5 6 1 。 7 高效液相色谱法：方积年1 3 9 】认为高效液相色谱仪法是多糖最好的分子量测定法， 以不同标准分子量的葡聚糖d e x t r a n t 系列( 分子量4 0 0 0 2 0 0 万的1 0 个标准品) 做对 照，获得标准曲线，然后在相同条件下获得样品图谱，通过g p c 计算机软件计算分子 量【删。 ( 六) 多糖的生物活性 多糖的生物活性研列6 1 】始于1 9 4 3 年。6 0 多年来，人们从动物、植物、微生物中提 取分离了大量多糖和多糖类物质用作治疗或辅助治疗药物。作为对生命活动起重要作用 的基本物质，多糖具有能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老等复杂的功能； 同时，作为一种免疫调节剂，多糖能起到刺激机体的各种免疫活性细胞的成熟、分化、 和繁殖，增加巨噬细胞非特异性细胞毒，诱导白细胞介素1 、白细胞介素2 、肿瘤坏死 因子、干扰素等细胞因子的产生和细胞因子受体的表达，促进抗体形成，活化补体系统 的经典途径及变更途径等作用。而且多糖是通过宿主中介起作用，所以多糖药物没有细 胞毒性，不影响正常细胞。目前，多糖药物的研究主要集中在它们的结构和免疫调节活 性的关系、分子水平的作用机制和如何通过化学修饰增强其生物活性上。 多糖类化合物由于其独特功能和低毒性，临床中显示出越来越广阔的前景。在抗肿 瘤、提高免疫、抗衰老、降血糖、抗病毒、降血脂、抗炎、抗氧化作用和骨折愈合等方 面都呈现出喜人的效果。 多糖的生物活性主要有： 1 抗肿瘤和抗病毒活性 多糖类成分的抗肿瘤和抗病毒活性主要是通过提高宿主免疫功能，对细菌、病毒、 真菌和肿瘤呈细胞毒害作用。 大量研究表明，许多多糖对一些病毒有抑制作用，如艾滋病毒( h i v ) 、单纯疱疹病 毒、巨细胞病毒、流感病毒、囊状胃炎病毒、劳斯肉瘤病毒、乌肉瘤病毒等。王岳五等 r 东北师范大学博士学位论文 【6 2 】研究发现甘草多糖( o p s ) 对牛艾滋病毒( ( b l v ) 、腺病毒i i i 型( a d v h i ) 和柯萨奇病毒 ( c b v 3 ) 有抑制作用。辜红梅等【6 3 】报道，黄精多糖具有明显的抗单纯疱疹病毒的作用。 在已发现的抗病毒多糖中，活性较强的是硫酸化多糖。如牛膝多糖有免疫增强作用而无 抗病毒活性，但在牛膝多糖中引入部分硫酸基团后，就具有较强的抗乙肝病毒u a s a g 与h b e a g 的活性【硎。另外，灰树花多糖、灵芝多糖等也有抗h i v 的作用【6 5 l 。 研究结果显示1 6 6 - 7 0 1 ，香菇多糖对实体瘤有显著的抑制作用。茯苓多糖、猪苓多糖、 银耳多糖、灵芝多糖、碱性的冬虫夏草多糖、棕色海藻多糖和地衣多糖等多种中草药多 糖都对实验小鼠肉瘤1 8 0 有显著抑制作用。从云芝中得到的复合蛋白多糖是肿瘤的有效 抑制剂，在国内外已应用于临床。黄芪多糖能显著抑制结合杆菌的生长【7 1 1 。 c r a i g 等【7 2 】从一种香椿属植物( c e d r e l at u b i f l o r a ) 叶子中提取出的酸性多糖对囊状口 炎病毒( v s v , v e s i c u l a rs t o m a t i t i sv i r u s ) 和单疱疹病毒( h s v ) 具有抑制作用。灵芝中的糖蛋 白也具有抑制单疱疹病毒( h s v ) 的活性，它的作用机制是通过糖蛋白与病毒分子相结合， 从而阻断了病毒分子与细胞之间的结合感染1 7 引。 自c h i h a r a 等【7 4 】报道香菇多糖具有抗肿瘤活性和免疫调节活性以来，天然多糖以其 疗效显著、无毒副作用等特点而引起人们极大的兴趣。多糖的分子结构、给药剂量、给 药途径、给药时间、联合应用等是影响多糖抗肿瘤作用的重要因素【7 5 j 。刘伟国等1 7 6 j 报道， 红毛五加茎皮多糖对体外培养人粒细胞白血病k 5 6 2 细胞株超微结构的影响，认为该多 糖破坏癌细胞的细胞器和细胞核，干扰癌细胞代谢与复制，导致细胞死亡。n a n b a 等【7 7 1 从灰树花( g r i f o l af r o n d o s a ) 子实体提取的两种多糖在不同剂量下对s 1 8 0 肉瘤都有明显 的抑制作用，且抑制率比香菇多糖高一倍以上。a r i n a g a 等1 7 8 j 报道对胃癌患者静脉注射 香菇多糖具有良好的治疗效果。s t r i c l d a n d 等1 7 9 j 报道植物多糖能减少紫外线( u v ) 对机体 组织造成的损坏，防治u v 造成的皮肤癌。h a m a n o 等【舳j 报道香菇多糖也能促进心外科 手术患者的c d “免疫细胞的快速恢复，增强患者的机体免疫力。魏小龙等【8 1 】利用 n o r t h e r n 杂交和狭线杂交的定量检测方法，发现低分子量地黄多糖( l r p s ) 在体内抗肿瘤 有效剂量下可使小鼠l e w i s 肺癌细胞内的正调控基因c f o s 基因表达明显增加，负调控 基因c m y c 基因表达明显减少，表明地黄多糖对癌基因表达有明显影响。 多糖的抗肿瘤作用与单糖间糖苷键的结合方式有关。水溶性d 葡聚糖有抗肿瘤作 用，尤其是直链、无过长支链、不易被体内d 葡聚糖酶水解的多糖具有明确的抗肿瘤 活性。 2 免疫调节活性 大量研究表明，多糖对机体免疫系统的调节，主要是通过对免疫细胞的调节来实现 的。免疫调节是多糖抗肿瘤作用的主要机制之一。多糖是一种免疫增强剂，不但能激活 t 细胞、b 细胞、m 叭n k 细胞、c t l 细胞、l a k 细胞等免疫细胞的活性、激活网状 内皮系统( r e s ) 吞噬、清除老化细胞和异物以及病原体的作用，还能促进i i 广1 、i l - 2 、 t n f - o 【、i n f y 、n o 等生成，调节机体抗体和补体的形成，提高机体抗肿瘤免疫力。田 庚元等【8 2 】认为，多糖对机体免疫调节作用主要通过以下方式和途径实现：( 1 ) 激活巨噬细 胞；( 2 ) 激活网状内皮系统；( 3 ) 激活t 和b 细胞；( 4 ) 激活补体；( 5 ) 促进干扰素生成；( 6 ) o 东北师范大学博士学位论文 促进白