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基于天然高分子和纳米金粒子的有机无机 复合材料的制备与应用 摘要 本论文主要围绕天然高分子，羟乙基纤维素( h y d r o x y e t h y lc e l l u l o s e h e c ) 、羟丙基纤维素( h y d r o x y p r o p y lc e l l u l o s e ，h p c ) 以及壳聚糖( c h i t o s a n ，c s ) 与纳米金粒子( g o l dn a n a p a r t i c l e s ，g n p s ) 构成的有机无机复合材料展开。本 论文由三个部分组成：第一部分，羟乙基纤维还原氯金酸及对纳米金粒子的稳 定作用；第二部分，羟丙基纤维素还原氯金酸与稳定金粒子的机理；第三部分， 壳聚糖、海藻酸钠、纳米金粒子及葡萄糖氧化酶( g l u c o s eo x i d a s e ，g o d ) 层 层组装结构纳米生物传感器的构造。 首先，通过光化学反应，以生物大分子羟乙基纤维素为还原剂和稳定剂制 备了金纳米粒子。采用紫外一可见吸收光谱( u v - v i s ) 、透射电子显微镜( t e m ) 、 红外光谱( f t i r ) 以及p h 值跟踪等对反应过程和产物进行了分析表征。结果 表明，氯金酸( h a u c l 4 ) 还原成金纳米粒子的反应几乎在6 0 分钟内完成；f t i r 分析证实了h e c 的氧化；金纳米粒子尺寸和紫外吸收峰的强度均与h e c 溶液 的浓度有关。另外，还考察了金离子的浓度对还原过程的影响。在紫外照射条 件下h e c 能够将金离子还原成具有独特钝角三角形、六边形和圆形等不同形状 的粒子，并将其稳定在水溶液中。 其次，研究了紫外光照射下，天然高分子羟丙基纤维素溶液中合成金纳 米粒子的过程，发现金纳米粒子在h p c 溶液中存在时间演化现象。红外光谱分 析表明h p c 在紫外光的照射下极易发生氧化，而本体粘度测试则表明h p c 分 子量在紫外照射下迅速降低。h p c 的氧化不仅为金离子的还原提供了自由电 子，同时还导致了h p c 分子链的断裂。文中，探讨了金纳米粒子的时间演化机 理，我们认为由于h p c 分子链的断裂导致h p c 溶液对金纳米粒子的稳定性减 弱，从而引起了金纳米粒子的演化，即金纳米粒子的持续聚集现象。 另外，构造了基于壳聚糖、纳米金粒子和海藻酸钠( s o d i u ma l g i n a t e ，s a ) 的新型玻碳电极纳米生物传感器，并对其性能进行了测试。首先，选用c s 作 为基体膜材料，使用电化学沉积的方法将c s 沉积于玻碳电极表面形成纳米薄 膜基体层。其次，将g n p s 通过电化学方法固定到基体膜上，在第三个阶段中， 将s a 和葡萄糖氧化酶的混合溶液滴加到电极上，得到性能稳定的葡萄糖纳米 生物传感器。由于带正电的壳聚糖与带负电的海藻酸钠之间的强烈的静电作用 力，葡萄糖氧化酶能够很好的被固定在电极表面。同时，纳米金粒子的存在提 高了电极的导电能力和检测灵敏性，所得到的传感器响应时间在1o s 以内。 关键词：天然高分子：羟乙基纤维素；羟丙基纤维素：金纳米粒子；生物传感 器 4 p r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o no fo r g a n i c - i n o r g a n i cc o m p o s i t e s b a s e do nn a t u r a lp o l y m e r sa n dg o l dn a n o p a r t i c l e s a b s t r a c t t h i st h e s i sf o c u s e so nt h ep r e p a r a t i o no fo r g a n i c - i n o r g a n i cc o m p o s i t e sb a s e d o nn a t u r a lp o l y m e r s ，i n c l u d i n g h y d r o x y e t h y lc e l l u l o s e ( h e c ) ，h y d r o x y p r o p y l c e l l u l o s e ( h p c ) ，c h i t o s a n ( c s ) a n dg o l dn a n o p a r t i c l e s ( g n p s ) t h e r ea r et h r e e s e c t i o n si n t h i s t h e s i s ，t h a ti s ，r e d u c t i o no fe h l o r o a u r i ea c i di n t og n p sb y h y d r o x y e t h y l c e l l u l o s eu n d e ru vi r r a d i a t i o n ，e v o l u t i o no fg n p sp r e p a r e di n h y d r o x y p r o p y lc e l l u l o s es o l u t i o n su n d e ru vl i g h ti r r a d i a t i o na n dt h ec o n s t r u c t i o n o fan e wg l u c o s eb i o s e n s o rb a s e do nc h i t o s a n ，s o d i u ma l g i n a t e ( s a ) ，g n p sa n d g l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) t h r o u g hl a y e r b y l a y e ra s s e m b l y i nt h ef i r s ts e c t i o n ，p r e p a r a t i o no fg n p si nh e cs o l u t i o n sw a si l l u s t r a t e d t h e r e d u c t i o np r o c e s sw a sc h a r a c t e r i z e db yu v _ v i ss p e c t r a ，f t i r ，p ht r a c i n ga n dt e m r e d u c t i o no fh a u c l 4t og o l dn a n o p a r t i c l e sa l m o s tc o m p l e t e dw i t h i na b o u t6 0m i n f t i ra n a l y s i sc o n f i r m e dt h eo x i d a t i o no fh e c ，w h i c hp r o v i d e de l e c t r o n sf o r r e d u c t i o no fg o l di o n s b o t hp a r t i c l es i z ea n dt h eu v - v i s i b l ea b s o r p t i o np e a kw e r e d e p e n d e n to nt h eh e cc o n c e n t r a t i o n t h ee f f e c t so fh a u c l 4c o n c e n t r a t i o nw e r e a l s os t u d i e d t h ep a r t i c l e sw i t ho b t u s et r i a n g l e ，h e x a g o na n dr o u n ds h a p e s w e r e s y n t h e s i z e da n di ns i t us t a b i l i z e db yt h eb i o p o l y m e r i nt h es e c o n ds e c t i o n ，p r e p a r a t i o no fg n p si na n o t h e rn a t u r a lp o l y m e r ，h p c s o l u t i o n su n d e ru vi r r a d i a t i o nw a si n v e s t i g a t e d a na p p a r e n te v o l u t i o no fg n p s w a so b s e r v e d f t i ra n a l y s i si n d i c a t e dt h a th p cw a se a s yt ob eo x i d i z e du n d e ru v l i g h ti r r a d i a t i o n r e s u l t so b t a i n e df r o mi n t r i n s i cv i s c o s i t ym e a s u r e m e n ts h o w e d t h a tm o l e c u l a rm a s so fh p cd r o p p e dq u i c k l yu n d e ru vi r r a d i a t i o n o x i d a t i o no f h p cn o to n l yp r o v i d e df r e ee l e c t r o n st or e d u c eg o l di o n s ，b u ta l s ol e a dt ot h e b r e a k a g eo fh p cm o l e c u l a rc h a i n s i tw a ss u p p o s e dt h a tt h es t a b i l i t yo fh p c t o g o l dn a n o p a r t i c l e sw a sw e a k e n e dd u et ot h eb r e a k a g eo fh p c c h a i n s ，w h i c hf u r t h e r r e s u l t e di nt h ee v o l u t i o n ，t h a ti s ，c o n t i n u o u sa g g r e g a t i o no fg o l dn a n o p a r t i c l e s i nt h el a s ts e c t i o n ，an e wg l u c o s eb i o s e n s o rb a s e do nc s ，g n p sa n ds a m o d i f i e dg l a s sc a r b o ne l e c t r o d ew a sf a b r i c a t e d ，a n dt h ep r o p e r t i e so ft h eb i o s e n s o r w e r ec h a r a c t e r i z e d c sw a sc h o s e na st h em a t r i xm a t e r i a la n dw a sd e p o s i t e do nt h e s u r f a c eo ft h ee l e c t r o d et of o r man a n o f i l m t h e n ，g n p sw e r ei m m o b i l i z e do nt h e f i l mt h r o u g ha ne l e c t r o c h e m i c a lp r o c e s s l a s t l y ，am i x t u r es o l u t i o no fs aa n dg o d w a sd r o p p e do n t ot h ee l e c t r o d et oc o n s t r u c tt h eg l u c o s eb i o s e n s o r t h a n k st ot h e 5 s t r o n ge l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o nb e t w e e np o s i t i v e l yc h a r g e dcsa n dn e g a t i v e l y c h a r g e ds a ，g o d w a ss t e a d i l yi m m o b i l i z e do nt h es u r f a c eo ft h ee l e c t r o d e a tt h e s a m et i m e ，t h ep r e s e n c eo fg n p se n h a n c e dt h ee l e c t r o n i c a lc o n d u c t i v i t ya n d s e n s i t i v i t yo ft h eb i o s e n s o ra sw e l la sb i o c o m p a t i b i l i t yt ot h ee n z y m e t h er e s p o n s e t i m eo ft h eb i o s e n s o rw a sl e s st h a n10 s k e y w o r d s ：n a t u r a lp o l y m e r ；h y d r o x y e t h y lc e l l u l o s e ；h y d r o x y p r o p y lc e l l u l o s e ； g o l dn a n o p a r t i c l e s ；b i o s e n s o r 6 图1 1 图l - 2 图1 3 图1 - 4 图1 5 图2 1 图2 2 图2 3 图2 2 图2 5 图2 - 6 图2 7 图3 1 图3 2 图3 3 图3 4 图3 5 图3 - 6 图4 1 图4 2 图4 3 图4 4 图4 5 插图清单 羟乙基纤维素的结构式一2 羟丙基纤维素的结构式2 甲壳素的结构式3 壳聚糖的结构式3 海藻酸钠的结构式一3 照射时间对于h e c h a u c l 4 溶液吸光度的影响1 0 h e c 还原氯金酸过程中溶液的p h 值变化情况1 l h e c ( a ) 和还原氯金酸后的h e c ( b ) 的红外光谱1 2 不同h e c 浓度对于还原氯金酸过程的影响1 2 不同浓度h e c 还原得到的纳米金粒子的透射电镜照片1 3 不同a u ( i i i ) 浓度对于h e c 还原氯金酸过程的影响1 4 不同放置时间对纳米金粒子的紫外一可见吸收的影响1 4 h a u c l 4 溶液浓度为2 5 x 1 0 。4 m 时，h p c h a u c l 4 溶液的紫外一可见吸收图1 8 h a u c l 4 溶液浓度为2 5 x1 0 4 m 时，照射停止放置1 6 小时后h p c h a u c l 4 溶液 的紫外一可见吸收图1 9 h a u c l 4 溶液的浓度变化时，h p c h a u c h 溶液的紫外一可见吸收图1 9 h a u c l 4 溶液的浓度不同时，金纳米粒子的透射电子显微镜照片一2 0 紫外照射前后h p c 的f t i r 谱图2 0 h p c 溶液的本体粘度与紫外照射时间的关系图2 l c s s g n p s g o d 修饰的玻碳电极构造过程示意图2 6 c s s g n p s g o d 的紫外一可见吸收光谱2 7 g c e c s g n p s g o d s a 的循环伏安曲线2 8 0 2 m 葡萄糖p h 7 4 的p b s 溶液中，不同扫描速率( 3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 t n v s ) 下的循环伏安曲线2 9 工作电压7 0 m v 时，持续加葡萄糖后电极的安培响应图2 9 1 0 表格清单 表2 1 羟乙基纤维素还原氯金酸制备金纳米粒子所用的主要试剂8 表2 2 羟乙基纤维素还原氯金酸制备金纳米粒子所用的主要仪器设备9 表3 1羟丙基纤维素还原氯金酸制备金纳米粒子所用的主要试剂1 6 表3 2 羟丙基纤维素还原氯金酸制备金纳米粒子所用的主要仪器设备1 7 表4 1葡萄糖生物传感器制备所用的主要试剂一2 4 表4 2 葡萄糖生物传感器制备所用的主要仪器2 4 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 金匿王些太堂 或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名 签字日期：2 0 1 0 年4 月名日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解金壁王些太堂有关保留、使用学位论文的规定，有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权金胆王些盍堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 签字日期：2 0 1 0 年 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 签字日期：2 0 1 0 年牛月日 电话： 邮编： 致谢 本论文是在导师丁运生教授和郝文涛副教授的共同指导下完成的。在两年 半的硕士研究生课程学习、实验研究和论文撰写的全过程中，我得到了两位导 师的悉心指导和帮助。无论是课程学习还是实验研究，无不倾注了导师们的大 量心血。两位导师渊博的专业知识，严谨的科学精神，踏实的工作作风以及平 易近人的人格魅力对我产生了深远的影响，使我不仅在学术上受益匪浅，更让 我明白了许多为人处世之道。在此，谨向两位导师表示崇高的敬意和衷心的感 谢! 本论文的顺利完成，还离不开各位老师、同学和朋友们的关心和帮助。我 要感谢的老师们有：杨文老师、何建波老师、徐红梅老师、晋冠平老师以及张 洪斌老师。感谢课题组的其他同学对我的帮助，他们是吴淑莹、熊仁艳、高钧、 孙小虎、陈龙、王川行、刘洋、张涛、韦力达、李博轩、王平、苏江林、杨绪 锋、陆晶晶、靳丹萍、胡嘉维、余芸、刘志、赵磊、王中立、孙晓红、朱春华、 崔辉、王炜、张少怡等，他们在课题研究中给予了我很大的帮助和支持。感谢 我的朋友李鑫、王鹏、闫小宇、胡进明、王峰、章周舜、闫宁、李仲庆、李汝 灿等在平时的生活与学习中给我带来的许多快乐和帮助。 感谢我的家人对我的培养，感谢你们在我成长道路上所给予的关心、理解 和支持。 感谢所有关心我、帮助我的人们。 7 作者： 罗明灯 2 0 10 年0 3 月 第一章绪论 1 1 引言 有机无机复合材料综合了有机、无机材料各自的优点，具有较高的稳定性， 在力学、热学、光学、电磁学和生物学等方面具有许多优异性能，因而成为材 料学科研究的热点i l 4 】。在有机无机复合材料研究中，天然高分子与纳米金粒 子所形成的复合材料尤为引人注目。 在自然界中存在着大量的天然高分子资源，其中包括纤维素( c e l l u l o s e ) 、 壳聚糖( c h i t o s a n ，c s ) 和海藻酸钠( s o d i u ma l g i n a t e ，s a ) 等【5 】。这些天然 高分子材料不仅来源广泛，价格相对低廉，而且与合成高分子不同的是，它们 具有固有的生物相容性，因而在生物、医学等领域具有广阔的应用前景。目前， 围绕天然高分子所开展的研究工作异常活跃，并取得了非常多的成果1 6 - 9 。 纳米金粒子是指尺寸在几个纳米到几十个纳米之间的单质金原子的聚集 体。由于其独特的光、电、磁、热、化学等性能，受到了人们广泛的关注，并 得到了极大的发展【l o 。13 1 。纳米金粒子在生物医学领域有着广阔的用途，已经被 应用于早期病症的诊断【1 4 1 ，药物释放载体【1 5 】和医学造影剂等【16 1 。但是，纳米 金粒子本身不具有生物相容性，而且对于活体细胞来说是有害的。对于纳米金 粒子研究的挑战之一在于如何选择合适的还原剂及稳定剂以改善其生物相容 性，并降低其毒性。 虽然在天然高分子，如壳聚糖等与纳米金粒子复合材料研究方面已经有了 不少的相关报道，但是在这个领域还有许多工作要做，研究具有重要的理论价 值和应用前景。 在本课题组的前期工作中，已经对羟丙基纤维( h y d r o x y p r o p y lc e l l u l o s e ， h p c ) 还原纳米金粒子的独特现象开展过研究【1 7 】。结果表明，h p c 还原纳米金 粒子过程中存在时间演化现象。那么这就促使我们思考，究竟是由于什么原因 造成了这种时间演化现象? 与h p c 分子结构非常相像的羟乙基纤维素 ( h y d r o x y e t h y lc e l l u l o s e ，h e c ) 在还原纳米金粒子的过程中是否也会产生类 似的时间演化现象? 此外，在研究过程中，我们注意到，壳聚糖( c s ) 和海藻酸钠( s a ) 的分 子结构虽然与纤维素类天然高分子结构非常相像，都是由葡萄糖单体单元经糖 苷键连接形成的天然多糖。但是，其分子侧基却与h p c 或h e c 有着本质的差 别。壳聚糖的侧基为氨基，即该天然高分子在水溶液中带有正电荷【l3 j ：海藻酸 钠的侧基为羧酸基，即该天然高分子在水溶液中带有负电荷【l 9 1 。两者可以通过 强烈的静电作用形成水凝胶，对于由c s 和s a 经自组装所形成的纳米微胶囊已 经有了报道【2 0 ，2 1 1 。那么，c s 与s a 的自组装过程能否应用于纳米金粒子以及生 物酶的固定化，并进而将其应用于新型纳米传感器的制备过程中呢? 所有这些都深深地吸引着我们，驱使我们开展了一系列的研究工作。从目 前的文献报道中，我们还没有发现有相关的研究报道。 在对本论文的研究工作总结汇报之前，首先让我们先来了解一下关于天然 高分子的一些背景知识。 1 2 天然高分子简介 1 2 1 羟乙基纤维素与羟丙基纤维素 1 羟乙基纤维素 羟乙基纤维素( h y d r o x y e t h y lc e l l u l o s e ，h e c ) 是一种水溶性的非离子型纤维 素醚，其结构式如图1 1 所示，可以看至u h e c 分子上存在着大量的羟基。 图1 - 1 羟乙基纤维素的结构式 h e c 的合成方法为在碱存在的条件下，由醚化剂环氧乙烷作用于碱纤维素， 在反应过程中，纤维素上的羟基( 一o h ) 被羟乙基( 一o c h 2 c h 2 0 h ) 取代。 其结构特点为羟乙基取代了原纤维素上的1 3 个羟基【2 2 1 。这种结构上的变化， 在很大程度上破坏了原纤维素的分子内与分子间氢键作用，使之水溶性变好。 2 羟丙基纤维素 与羟乙基纤维素( h e c ) 一样，羟丙基纤维素( h y d r o x y p r o p y lc e l l u l o s e ， h p c ) 也是一种非离子型纤维素醚，其结构式如图1 2 所示。同样，h p c 分子 上也存在着大量的羟基，而不同的是，h e c 上的羟基为羟乙基，h p c 的则为 羟丙基。 o o h i o h i 图1 2 羟丙基纤维索的结构式 h p c 由于取代比h e c 充分，所以它有更好的抗生物降解性能。 羟丙基纤维素可以在适当的条件下形成微凝胶，能够形成独特的纳米粒子 网络，并在药物控制释放方面具有广阔的应用前景【2 3 啦! 。 2 1 2 2 壳聚糖 1 8 1 1 年，法国人发现了甲壳素( c h i t i n ) ，它的结构与纤维素非常相似，只 是在其链节结构中相差一个基团，n 一乙酰基取代了原来的羟基，其结构式如图 1 3 所示；它在自然界存在的数量，也仅次于纤维素。 啪 i c h 3 图1 3 甲壳素的结构式 甲壳素结构式中糖基上的n 一乙酰基大部分去掉的话，就是甲壳素的最为 重要的衍生物壳聚糖( c h i t o s a n ) ，其结构式如图1 4 。 c h 3 图1 4 壳聚糖的结构式 从图1 4 中可以明显看出，壳聚糖的分子侧基为n h 2 基团，在水溶液中， 特别是在弱酸性水溶液中可呈现为n h 3 + 离子。因此，壳聚糖可归于带有正电荷 的阳离子天然高分子聚电解质。 1 2 3 海藻酸钠 海藻酸钠( s o d i u ma l g i n a t e ) 是从褐藻类的海带或马尾藻中提取的- 二种天 然线性多糖，是由p d 一甘露醛酸( m 单元) 和a l 一古罗糖醛酸( g 单元) 通过 1 ，4 糖备键连接而成，其结构式如图1 - 5 所示。 m a m 图1 5 海藻酸钠的结构式 3 伽 h o 一 萋啦 睁 0 一 艄辜 伊她h 尽管s a 的分子结构与纤维素以及壳聚糖都有许多相似之处，但是与壳聚 糖和纤维素存在本质不同的是，其分子结构中带有羧酸钠侧基。如此，海藻酸 钠在水溶液中呈现为典型的，带负电荷的聚阴离子型电解质。 1 2 4 小结 天然高分子的结构多样性带来了性能的多样性，这种结构与性能上的多样 性必然会对天然高分子在稳定纳米金粒子方面带来不同的影响。天然的阳离子 型和阴离子型聚电解质，也必将能够在适当的地方发挥其应有的作用。 下面，将对天然高分子对纳米金粒子的稳定作用以及包含了壳聚糖、纳米 金粒子的纳米传感器的研究进展分别作一回顾和总结。 1 3 天然高分子对纳米金粒子的稳定作用研究概述 由于金纳米粒子在催化、生物传感器以及光电纳米器件中的潜在应用前景 2 7 - 2 9 j ，其制备方法已经被人们广泛研究，并取得了一系列进展。在传统的制备 金纳米粒子的方法中，比较常见的是在水溶液中通过柠檬酸盐直接还原氯金酸 制得1 3 叽3 2 】。此外，硼氢化钠也经常被用于在有机溶剂中合成金纳米粒子【3 3 1 。由 于纳米金粒子自身的性质，其在溶液中会聚集并产生沉降，因此，在合成金纳 米粒子的过程中必须使用稳定剂。其中，硫醇【3 4 】是金属纳米粒子的一个经典的 稳定剂，而一些含二硫键3 3 1 、胺基【3 5 】以及羧基 3 6 】的配体都被作为稳定剂用于 金纳米粒子的制备过程中。此外，一些含功能基团的高分子也被应用于稳定金 属纳米粒子。 但是，有机配体稳定的纳米金粒子通常生物相容性比较差，而且对于机体 和活体细胞的毒性较大，因此限制了纳米金粒子在生物医学领域的应用。而天 然高分子具有良好的生物相容性，且对机体的毒性很小，因此，近年来人们已 经广泛的开展了将天然高分子用于稳定纳米金粒子的研究，其中主要的天然高 分子是聚多糖。已有文献【3 7 】报道了壳聚糖对纳米金粒子的稳定作用。但是，由 于壳聚糖在中性及碱性溶液中溶解性较差，所以对金粒子的稳定作用只能在酸 性条件下进行，因此，研究者们通过对壳聚糖的改性，扩展了其在合成纳米金 粒子方面的用途。z h a i l 3 8 】等研究了羧甲基化壳聚糖溶液中一步法合成尺寸可控 的纳米金粒子，并纳米金粒子的荧光特性进行了探讨。a n j a l ip a l 等 3 9 1 则报道 了海藻酸钠稳定的纳米金粒子的制备。 目前，对于天然高分子纤维素作为纳米金粒子的稳定剂的研究甚少。 以羟乙基纤维素为稳定剂制备纳米金粒子的研究尚未见报道，因此，很有必要 开展这方面的工作。而我们之前研究了在羟丙基纤维素溶液中一步法合成纳米 金粒子，并发现纳米金粒子在羟丙基纤维素溶液中表现出其独特的时间演化现 象【17 1 ，但对于羟丙基纤维素为什么能够稳定纳米金粒子的机理尚不清楚。同时， 4 羟乙基纤维素与羟丙基纤维素在稳定纳米金粒子方面是否存在异同点，也是一 个值得探讨并引人深思的问题。 1 4 纳米生物传感器的研究进展 纳米生物传感器已经被广泛地应用于过氧化氢( h 2 0 2 ) 检测、葡萄糖 ( g l u c o s e ，g l u ) 检测、农药残留物检测及免疫检测等许多方面【4 0 。4 5 1 。构造新 型的纳米生物传感器是当前电化学研究的热点之一。 作为生物传感器，有这样几个方面的要求：1 ) 生物相容性好；2 ) 灵敏度 高：3 ) 结构稳定性好。通常，纳米生物传感器主要包含两个重要的组件【4 6 ，4 7 】： 1 ) 电极，包括铂或金电极等金属电极和玻碳电极；生物酶，根据监测领域不同 可以选择辣根过氧化物酶( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，h r p ) ，或葡萄糖过氧化物 酶( g l u c o s eo x i d a s e ，g o d ) ，分别用于检测h 2 0 2 或g l u 。 在纳米生物传感器的构造过程中，为了避免对电极表面产生破坏性的影响， 往往在电极表面涂覆一层高分子材料作为基体膜。早期的手工涂覆方式由于不 能保证膜厚度的均匀性而被摒弃，目前通常采用直接沉积法【4 8 】或电化学沉积法 【4 9 ，5 0 1 。电化学沉积法的优势在于膜沉积厚度可控、均匀程度高、耗费时间少， 因此电化学沉积法是构造纳米生物电极的首选方法。 在基体膜材料的选择方面，天然高分子材料壳聚糖由于其生物相容性好， 成膜性能佳而被广泛地采用【5 1 1 。简单地说，壳聚糖是氨基葡萄糖通过糖苷键结 合起来的高分子材料，在弱酸性水溶液中呈正电性 5 2 1 。 为了提高纳米生物传感器的检测灵敏度，通常会将纳米金粒子或纳米金铂 合金粒子加入到基体膜材料中去。纳米金粒子的制备方法有紫外照射壳聚糖 氯金酸溶液还原法【5 3 1 ，硼氢化钠还原法f 5 4 1 和直接电解还原法1 5 5 】等。 据此，我们已经了解到传统意义上的纳米生物传感器构造方法为：首先， 将壳聚糖沉积在电极表面形成纳米基体膜；然后，通过壳聚糖分子主链上的氨 基与纳米金粒子的结合形成单层c s g n p s 结构：第三，将酶通过物理吸附固定 于电极表面，形成纳米传感器。 酶的固定化过程是构造纳米生物电极的重要研究方面，目前主要有这么几 种方式：1 ) 物理吸附法【5 5 】；2 ) 化学交联法f 5 6 j ：3 ) 硅溶胶凝胶法【5 。其中化 学交联法一般采用戊二醛等将酶与电极表面的基体材料结合在一起，但是可能 会部分影响酶的生物活性，因此，目前化学交联法的研究应用并不多见。硅溶 胶一凝胶法是一种比较不错的酶固定化方法，但是该过程步骤繁多，难于在较短 时间内构造纳米生物传感器。物理吸附法指的是将电极浸没于酶溶液中一段时 间后取出或将酶溶液滴加在电极表面，然后自然干燥得到生物传感器。该方法 的不足在于，酶与电极表面基体材料的结合仅仅通过范德华力实现，传感器的 结构稳定性不佳。 5 因此，急需开展相关的研究工作以改善酶的固定化过程，从而获得一种新 型结构稳定、检测灵敏度高的纳米生物传感器。 在文献中可以发现，研究者除了使用了硅溶胶凝胶方法，还试图利用羧甲 基壳聚糖的羧基与h r p 氨基之间的静电作用增强物理吸附效果【5 7 1 。此外，还 有人报道了多层c s g n p s g o d 复合结构，其目的也在于提高酶的固定化稳定 性1 5 引。事实上，在构造纳米生物传感器过程中，层一层组装技术正在逐渐引起 人们的注意，这是由于通过层层组装形成的纳米生物传感器的检测灵敏度和结 构稳定性都得到了相应的提高【4 5 1 。但是目前的层层组装结构往往还是局限于 壳聚糖自身的组装过程，其结构稳定性有待进一步提高。 海藻酸钠具有与壳聚糖相似的分子结构，都是由葡萄糖残基经糖苷键结合 而成。但是s a 与c s 的本质不同在于，羧基取代了氨基所在的位置，从而赋予 s a 在水溶液中的负电性。曾经有研究利用了负电性的s a 与正电性的c s 之间 强烈的静电作用构造纳米微胶囊，用于药物及d n a 缓释f 2 叫。从而可知，如果 利用s a 与c s 形成层层组装结构，将酶作为中间层，那么必将能够获得结构 十分稳定的纳米生物传感器。近期内曾经有研究者将s a 与c s 一起用于纳米生 物传感器的构造过程，但是在该研究报道中，s a 仅仅起到了酶与c s 之间连接 介质的作用，酶与s a 之间的结合仍然是简单的物理吸附1 5 j 。 1 5 本论文的提出 纤维素作为一种天然高分子，具有生物相容性和无毒等特性，而成为生物 医学领域的理想材料。在本课题组前期的研究工作中发现，羟丙基纤维素与氯 金酸溶液在紫外照射下表现出了独特的性质。经紫外光照射一段时间后，表面 上看溶液没有发生任何变化，但是在停止照射的数十分钟内，溶液颜色就逐渐 从透明转变为了酒红色。也就是说，金纳米粒子在羟丙基纤维素溶液中经历了 一个典型的时间演化现象，但是我们之前对于产生这一现象的原因并不了解。 虽然羟乙基纤维素与羟丙基纤维素在结构上相似度很高，但羟乙基纤维素 还原和稳定纳米金粒子的机理与羟丙基纤维素存在着明显不同之处。论文试图 通过进一步的研究，探讨羟乙基纤维素与羟丙基纤维素对于氯金酸的还原作用 以及它们对纳米金粒子的稳定作用的机理。 此外，考虑到目前纳米生物传感器的构造过程中普遍存在的酶的固定化效 果不甚理想的状况，我们通过采用层层组装的形式，利用天然高分子壳聚糖和 海藻酸钠间的静电作用力，提高酶的固定化效果。并结合金纳米粒子的优良特 性，构造出具有较高检测灵敏度的生物传感器。 1 6 本论文的研究目标和研究内容 本论文的研究目标在于结合天然高分子材料的生物相容性与纳米金粒子独 6 特的物理、化学性质构造基于天然高分子材料的有机无机复合材料。 第一，采用操作简单且容易实施的紫外照射的方法合成了纳米金粒子，并 探讨了纳米金粒子的形成机理。 第二，探索金纳米粒子在羟丙基纤维素溶液中的时间演化现象的实质。以 粘度法和红外分析表征考察羟丙基纤维素的紫外降解过程，同时，用透射电镜 照片观察金纳米粒子在羟丙基纤维素溶液中演化过程的形貌。 此外，本论文还初步探讨了将纳米金粒子应用于纳米生物传感器的构造， 结合纳米金粒子的优良特性与天然高分子壳聚糖及海藻酸钠良好的生物相容 性，实现了葡萄糖的检测。 具体来说，本文的研究内容主要包括以下三个方面： 1 制备羟乙基纤维素稳定的纳米金粒子，并了解羟乙基纤维素对于纳米金 粒子的还原作用与机理； 2 探讨羟丙基纤维素在紫外光照射下对氯金酸的还原作用，并研究羟丙基 纤维素对金纳米粒子的稳定机理； 3 制备基于壳聚糖、葡萄糖氧化酶、纳米金粒子及海藻酸钠的层- 层组装 纳米生物传感器。 7 第二章羟乙基纤维还原氯金酸及对纳米金粒子的稳定作用 2 1 引言 由于其独特的物理、化学性能，金纳米粒子被广泛应用于生物学及生物医 学等方面，如生物造影剂【6 1 1 ，肿瘤的治疗【6 2 1 ，蛋白质检测【6 3 1 ，药物释放【6 4 1 及 生物传感器的构造等【65 1 。该领域的一个重要挑战是合成出具有无毒性和生物相 容性好的金纳米粒子。近年来，已经有许多方法用于合成具有可控尺寸和表面 化学性质的金纳米粒子，如电磁辐射方法( 包括紫外光、可见光、1 ，射线等) 【6 6 。7 0 1 ， 超声法【7 1j 以及热降解法1 7 2 j 等。与其他方法相比，紫外照射是一种更为直接的并 且在温和条件在就能得到金纳米粒子的方法i 7 1 。 纤维素作为一种天然高分子，具有生物相容性和无毒等特性，而成为生物 医学领域的理想材料。在本章中，我们提出了一种简单的合成纳米金粒子的方 法，即在紫外照射下，以羟乙基纤维素( h e c ) 作为还原剂与表面稳定剂获得 金纳米粒子，并对反应过程和产物进行了表征。这种新颖的纳米金粒子将可以 被应用于细胞传输媒介和药物输送研究方面【7 3 7 4 1 。 2 2 实验部分 2 2 1 试剂与仪器 a 试剂 实验中所用到的试剂如表2 1 所示。 表2 1羟乙基纤维素还原氯金酸制备金纳米粒子所用的主要试剂 b 实验所用仪器设备 实验中所用到的主要仪器设备如表2 - 2 所示。 8 表2 2 羟乙基纤维素还原氯金酸制备金纳米粒子所用的主要仪器设备 仪器名称 产家 j a 2 0 0 3 n 电子天平 7 8 一l 型磁力加热搅拌器 j c l 0 1 型电热鼓风干燥箱 d z 1 b c 型真空干燥箱 s h z d ( ) 型循环水真空泵 r z 5 2 c s 旋转蒸发器 低压紫外灯( 3 0 w ) 石英试管 上海精密科学仪器有限公司 江苏省金坛市荣华仪器有限公司 上海成顺仪器仪表有限公司 天津市泰斯特仪器有限公司 郑州科丰仪器设备有限公司 上海亚荣生化仪器厂 佛山市华亮电器有限公司 2 2 2 金纳米粒子的制备 取一定量的h a u c l 4 水溶液( 5 x 1 0 4m ) 与一定量的h e c 水溶液( 1 0w t ) 混合于石英试管中，再加入蒸馏水到溶液总体积为5 m l 。然后用低压紫外光源 ( 3 0 w ，波长2 5 3 7 n m ) 对溶液进行紫外照射一定时间，其中，紫外灯与试样 距离为15 c m 。 2 2 3 结构表征与性能测试 ( 1 ) 紫外可见光谱( u v - v i s ) ：含金粒子的h e c 溶液的紫外吸收在s h i m a z u 2 5 5 0 型紫外光谱仪上进行。 ( 2 ) 透射电镜测试( t e m ) ：将一滴金胶体滴于涂敷碳膜的铜网上，室温 下干燥，然后在h i t a c h ih 8 0 0 型透射电子显微镜上进行观察。 ( 3 ) 傅立叶变换红外光谱( f t i r ) ：k b r 研磨压片制样，用p c r k i ne l m e r s p e c t r u m1 0 0 型傅立叶变换红外光谱仪对样品进行红外分析。 ( 4 ) 紫外照射过程中溶液的p h 值变化情况由p h s 2 5 型p h 计进行跟踪。 2 3 结果与讨论 在紫外照射下，溶液颜色由无色逐渐变为淡紫色，再变为红色，表明金纳 米粒子在逐渐形成。这一变化也可由紫外吸收光谱清晰地反映出来，如图2 1 所示。图2 1 反映的是在h e c 质量分数为o 2 ，h a u c l 4 的浓度为5 1 0 q m 时， 溶液的吸光度与照射时间的关系。5 4 0 n m 左右的紫外吸收峰是由金纳米粒子的 表面等离子共振引起的【7 ”。反应初期，随着照射时间的增加，吸收峰的强度迅 速增大，反映了金粒子数目的增加【6 7 1 。照射6 0 分钟后，吸收峰强度的增长幅 9 度趋缓，预示着还原过程在6 0 分钟内基本完成，金粒子的浓度也基本趋于稳定。 o c 再 正 l o o 五 w a v e l e n g t h ( n m ) 图2 1 照射时间对于h e c h a u c h 溶液吸光度的影响 在光化学还原中，由紫外照射产生的水合电子或有机自由基能够将金属离 子还原成金属单质。光化学引发剂可以吸收紫外可见光，然后形成反应性中间 体如自由基。a n j a l ip a l 7 6 j 曾报道了多巴胺( 一种含酚羟基化合物) 在紫外光照 射下产生自由基( 或溶剂化电子) ，进而还原金离子a u ( i i i ) 为金单质a u 。在 此反应中，多巴胺起到了光化学引发剂的作用。同时，e s u m i 等【77 】报道了单糖 取代的聚胺树枝状聚合物可以把金离子a u ( i i i ) 还原为单质金a u ，在该反应 中羟基起到了还原剂的作用。而h e c 分子中的羟基也可能作为还原剂，并被氧 化为羧基。因此，我们可以通过测试溶液的p h 值来监控反应的过程。 图2 2 是照射过程中溶液的p h 值的变化情况，可以看到，在紫外照射的 前6 0 分钟，h e c h a u c l 4 溶液的p h 值迅速降低，随后溶液的p h 值基本稳定 在3 3 左右。这是因为，随着照射时间的延长，h e c 分子上的羟基被氧化成羧 基，氯金酸逐渐被还原，而生成的羧基使溶液的p h 值降低。当照射时间继续 延长，超过6 0 分钟以后，氧化还原反应已经基本结束了，不再有新的羧基生成， 因此体系的p h 值基本保持不变。这一结果与紫外吸收谱的结果十分吻合。 1 0 i r r a d i a t i o nt i m ei r a i n ) 图2 - 2h e c 还原氯金酸过程中溶液的p h 值变化情况 为了进一步明确反应机理，我们对反应产物作了结构表征。首先将反应产 物混合溶液中的大部分水分通过旋转蒸发方式去除，后将样品置于真空干燥箱 中干燥至恒重，然后对样品进行红外光谱测试，f t i r 分析的结果如图2 3 所示。 在h e c 金粒子混合物的红外图谱( b ) 中，1 7 3 5c m 以处出现了一个新的吸收峰， 该吸收峰对应于羰基( c = o ) 或羧基( c o o h ) 基团，而在原始的h e c 分子 的红外光谱( a