（分析化学专业论文）三苯甲烷类染料与g四链体的作用及其应用.pdf

著作权法规定范围内的学位论文使用权，e p - ( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文( 包 括纸质印刷本及电子版) 学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文， 并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开 的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文 摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向教育部 指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学 术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库， 通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：h 2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 l i n d e x h u n 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩； 提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字： 鄞俊红 2 0l o 年5 月2 8日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目三苯甲烷类染料与g 四链体的作用及其应用 姓名 郭俊红学号 2 1 2 0 0 7 0 5 1 4 答辩日期2 0 1 0 年5 月2 8 日 论文类别博士口学历硕士勿硕士专业学位口高校教师口同等学力硕士口 院系所化学院专业分析化学 联系电话2 3 5 0 5 2 4 4e m a i l g u o j u n h o n g m a i l n a n k a i e d u c n 通信地址( 邮编) ：南开大学西区公寓5 - 4 - 6 0 5 备注：是否批准为非公开论文否 注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书 馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。 。擎徘皇茸融珥毒岳妤非戥申鬲箪也素￥岳掣例彰革拱珥毒妊妤非乳 堆圈辫蕈兽专蒋( 铆丝单一) 皇辩晕勘甲。茸拱哥毒明千逊、千斟孽螂明士群群稚甘娶锋砰斟宰。娶 星l 茸砚妊影非裂褙显瞽l ：瑕号 纱1 l 零切翟耍 ：( 嘴卿) 弭骈兽礤 坳垆- 吲圳，删酗砷删分il ! 1 l 丑 硭打吧g i 婴印显张 是矽摊髟f 环每i 副蓉若 螅 邕嘲 口千、衄华杀翕刨口蛳磷辫掣口珥杀环牟千班阎千班组亲口千斟 眙柒茸现 目尉断匆o k l隧目铤嚣f7 l 蜘z o 硎cl 鲁杂i 巧男释 妙锣耖羁固一夕9 拌蛑国他軎7 目鹭茸硬 冒哥晕勒萃礤珥毒千车扭毒￥妊阜 曰 r 皆夕匆o j o z 1 了耩。专焉y 砰群磊岩勘 。型目勘锋圈哇捌雨妊掘甲船鲤摹一暑焉肆砰群牢。犁群娶丁皋瓤晕四y 章 。谚阜y 卓甲酱詈胃业翠疑心业圈蹲磋一晕早明茸观卓鹭狮与狲士审茸现再嘉朝蕈群 ：挺嚣茸砚r 娶1 己冀智勘阴翠举勤晤刨眸庄毒杀￥妊掣母著茸观珥杀朝y 卓：袅凄y 卓 。哪i i x 卵m 1 0 0 8 ：1 9 i 。0 乙。i i z o z ：d n q ：舆幽勘锋圈群要覃群列壬审茸砚 。茸砚拦影刨髟酣瞠驻群g 迥辫髟酣希群瞠萃鬻蟛叫业掣刮睹晕哿茸拱珥杀拦髟非 。唑砰明茸识擎髯璐渐劭并翠禺哿y 卓翱刨。苗酣冒署身蔡* 牲襄豳* 醉并罂藓 茸鬻嫌茸砚再杀珂群y 劲# 銎f 士印嚣谣茸观砑杀明固娶犁群蕈瞢群列印士审( 罂椠) 胜睁半 杀国申瞠蝈誓抱冒署辑性国七b 掣辫秦砰群擘勘茸拱珥秦( 争) 2 茸祺砑秦明妊影革鹫珥责犁群 僻旦辚刨杀￥妊单犁群￥阜蝇旦辚群诽( ) o 暂硼冒粤罐丐翁碡生、骠腱覃弓茸砚谣相群 茸、攀现咨目覃砚静群丁豳囡辫翠黧脚雨尘甲珥幂暂抬瞬鸯勘锋囤翠僻螟鬃勤茸观珥秦朝 妊影琳惘也辨泰明目抱健哇杀磷能( z ) 2 窜辫堵覃弓茸拱爵杂千避斟嘉￥妊掣y 嘴冀 茸砚珥杀甭延拯型哿靖士呜酉酉i 鹭疆由黪、由缮茸滥惘也珥杀( 硝士审理章0 4 y 由雪狮辨 回) 茸砚珥素蕈暂军群辫酵丽第眚： 雏玛杀( i ) ：曲砰茸辫茸砚珥杀明甲函罂犁群餮砰勤凳) 翠阜阱秦￥妊掣。犁群蟊暑明目唑咄襟劲茸砚砑杀甭延擒* 单嘉￥拦阜缚上弓举y 章 。列士砷珂醉谣章骝掳茸砚珥秦明y 章蕈瞥嘉￥妊阜掣澎瞬某勘 滩珥嘉千避、千科明辫禧餮哗靛葛目陛哇攀劲茸拱珥杀雨延擅士￥杂￥妊掣群戳 毕砰群甘科萃孤码去毒￥妊掣 、ir。 何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的 研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文 原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：郭俊红2 0 1 0 年5 月2 8 日 非公开学位论文标注说明 根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申请 和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本说明 为空白。 论文题目 申请密级 口限制( 2 年)口秘密( l o 年)口机密( 2 0 年) 保密期限 2 0 年月日至2 0年月日 审批表编号批准日期 2 0 年月日 限制2 年( 最长2 年，可少于2 年) 秘密1 0 年( 最长5 年，可少于5 年) 机密2 0 年( 最长1 0 年，可少于1 0 年) 摘要 摘要 三苯甲烷染料( t p m ) 自身由于共振去激发显示很弱的荧光。然而当它们 堆积在g 四链体的两个表面g 四分体时，由于共振被限制，它们的荧光显著增 强。因此t p m 染料可以开发为g 四链体识别荧光探针。本文考察了五种t p m 染料和g 四链体、双链和单链d n a 作用后的荧光光谱和荧光共振能量转移光 谱。结果表明四种t p m 染料的荧光光谱可用于区分分子内g 四链体和分子间 g 四链体、单链和双链d n a 。t p m 染料的荧光共振能量转移光谱和荧光共振能 量转移滴定可把g 四链体( 包括分子内g 四链体和分子间g 四链体) 与单链和 双链d n a 区分开。此外，还发现t p m 染料所带的正电荷数以及取代基的体积 是影响染料和g 四链体结合稳定性的两个重要因素。 此外，本论文利用无需标记的能形成伊四链体的富g 寡核苷酸链和廉价的 三苯甲烷染料一结晶紫( c v ) 开发了一种新型的钾离子检测方法。这种钾离子 定量检测方法是基于某些c v c r - 四链体配合物在k + 和n a + 中存在不同的荧光信 号，且荧光信号随k + 浓度改变而变化而建立起来的。根据荧光信号随k + 浓度变 化趋势，我们开发出了两种检测模式。一种是荧光猝灭模式，在此模式中，荧 光强度随k + 增加而降低，使用的寡核苷酸链是t 3 t t 3 ( 5 g g g l 盯g g g t g g g ”盯g g g ) ；另一种是荧光增强模式，在此模式中，荧 光强度随k + 增加而增强，使用的寡核苷酸链是h u m 2 1 ( 5 - g g g t t a g g g ”队g g g t t a g g g ) 。与已有的k + 检测方法相比，此方法有以下优点：如检 测费用低、检测体系中允许存在大量的n 矿、检测线性范围可调及具有更长的激 发和发射波长等等。 另外，以a g + 和c y s 为输入信号，t p m 染料的荧光强度为输出信号，我们 利用t p m 染料g 四链体配合物设计了一种d n ai m p l i c a t i o n 逻辑门。当没 有输入时，t p m 染料g 四链体配合物显示很强的荧光，此时的输出信号为l 。 c y s 的加入对t p m 染料g 四链体配合物没有影响，所以只有输入c y s 时，荧光 仍1 日很强，输出信号也是l 。然而因为a g + 能破坏g 四链体结构的形成，所以仅 有输入a g + 时，荧光猝灭，输出信号是0 。当同时有a g + 和c y s 输入时，c y s 作 摘要 为一种较强的a 矿结合剂，能使a g + 从d n a 中释放出来，从而荧光得到恢复， 输出信号是1 。与已有的d n a 逻辑门相比，此逻辑门快速、可逆并且有可靠的 输出信号和数字化行为( d i g i t a lb e h a v i o r ) 。基于a g + 和c y s 对t p m 染料g 一四链 体配合物的荧光调制作用，此体系还可以用于a g + 和c y s 的高特异性均相检测。 关键词：g 四链体；三苯甲烷染料；d n a t 钾离子检测；d n ai m p l i c a t i o n 逻辑门 a b s t r a c t a b s t r a c t t r i p h e n y l m e t h a n e ( t p m ) d y e sn o r m a l l yr e n d e rr a t h e rw e a kf l u o r e s c e n c ed u et o e a s yv i b r a t i o n a ld e e x c i t a t i o n h o w e v e r , w h e nt h e y s t a c ko n t ot h et w oe x t e r n a l g q u a r t e t s o fag q u a d r u p l e x ( e s p e c i a l l y i n t r a m o l e c u l a rg - q u a d r u p l e x ) ，s u c h v i b r a t i o n sw i l lb er e s t r i c t e d ，r e s u l t i n gi ng r e a t l ye n h a n c e df l u o r e s c e n c ei n t e n s i t i e s t h u s ，t p md y e sm a yb ed e v e l o p e da ss e n s i t i v eg - q u a d r u p l e xf l u o r e s c e n tp r o b e s h e r e ，f l u o r e s c e n c es p e c t r aa n de n e r g yt r a n s f e rs p e c t r ao ff i v et p md y e si n t h e p r e s e n c eo fg q u a d r u p l e x e s ，s i n g l e o rd o u b l e - s t r a n d e dd n a s w e r ec o m p a r e d t h e r e s u l t ss h o wt h a tt h ef l u o r e s c e n c es p e c t r ao ff o u rt p md y e sc a nb eu s e dt o d i s c r i m i n a t ei n t r a m o l e c u l a rg q u a d r u p l e x e sf r o mi n t e r m o l e c u l a rg - q u a d r u p l e x e s ， s i n g l e a n dd o u b l e s t r a n d e dd n a s t h ee n e r g yt r a n s f e r f l u o r e s c e n c es p e c t r aa n d e n e r g yt r a n s f e rf l u o r e s c e n c et i t r a t i o n c a nb eu s e dt od i s t i n g u i s hg - q u a d r u p l e x e s ( i n c l u d i n g i n t r a m o l e c u l a ra n di n t e r m o l e c u l a rg - q u a d r u p l e x e s ) f r o ms i n g l e a n d d o u b l e s t r a n d e dd n a s p o s i t i v ec h a r g e sa n ds u b s t i t u e n ts i z ei nt p md y e sm a yb e t w oi m p o r t a n tf a c t o r si ni n f l u e n c i n g t h e b i n d i n gs t a b i l i t y o ft h e d y e s a n d g - q u a d r u p l e x e s i na d d i t i o n , an o v e lc d e t e c t i o nm e t h o dw a sr e p o r t e du s i n gal a b e l - f r e e g q u a d r u p l e x f o r m i n go l i g o n u c l e o t i d ea n d at r i p h e n y l m e t h a n ef l u o r e s c e n td y ec r y s t a l v i o l e t ( c v ) t h i sm e t h o di s b a s e do nt h ef l u o r e s c e n c e d i f f e r e n c eo fs o m e c v g q u a d r u p l e xc o m p l e x e si n t h ep r e s e n c eo fk + o rn a + ，a n dt h ef l u o r e s c e n c e c h a n g ew i t ht h e v a r i a t i o no f1 0c o n c e n t r a t i o n a c c o r d i n gt o t h en a t u r eo ft h e f l u o r e s c e n c ec h a n g eo fc va saf u n c t i o no fi o n i cc o n d i t i o n s ，t w oc d e t e c t i o nm o d e s c a nb ed e v e l o p e d o n ei saf l u o r e s c e n c e d e c r e a s i n gm o d e ，i nw h i c ht 3 t t 3 ( 5 - g g g t t t g g g t g g g t t t g g g ) i su s e d ，a n dt h ef l u o r e s c e n c eo fc v d e c r e a s e s w m 缸i n c r e a s e dc o n c e n t r a t i o no fk + t h eo t h e ri saf l u o r e s c e n c e - i n c r e a s i n gm o d e ， i nw h i c hh u m 21 ( 5 - g g g t t a g g g t t a g g g t t a g g g ) i su s e d ，a n d t h e n u o r e s c e n c eo fc vi n c r e a s e sw i t ha ni n c r e a s e dc o n c e n t r a t i o no fk + c o m p a r e dw i t h s o m ep u b l i s h e dk + d e t e c t i o nm e t h o d s ，t h i sm e t h o dh a ss o m ei m p o r t a n tc h a r a c t e r i s t i c s ， 吼l c ha sl o w e rc o s to ft h et e s t ，h i g h e rc o n c e n t r a t i o n so fn a + t h a tc a nb et o l e r a t e d ， i i i a b s t r a c t a d j u s t a b l el i n e a rd e t e c t i o nr a n g ea n dl o n g e re x c i t a t i o na n de m i s s i o nw a v e l e n g t h s p r e l i m i n a r yr e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h em e t h o dm i g h tb eu s e di nb i o l o g i c a ls y s t e m s ， f o re x a m p l ei nu r i n e i nt h i sp a p e r , ad n ai m p l i c a t i o n l o g i cg a t ew a sa l s oc o n s t r u c t e db a s e do n t r i p h e n y l m e t h a n e ( t p m ) d y e g q u a d r u p l e xc o m p l e x e s ，u s i n ga 矿a n dc y sa st w o i n p u t sa n df l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo ft p md y ea st h eo u t p u ts i g n a l t h ef o r m a t i o no f t h et p md y e g - q u a d r u p l e x c o m p l e x e s r e n d e r e dt h e d y eg r e a t l y e n h a n c e d f l u o r e s c e n c es i g n a la n dt h eo u t p u ts i g n a lo ft h eg a t ew a s1 t h ea d d i t i o no fc y sh a d n oe f f e c to nt h ef l u o r e s c e n c es i g n a la n dt h eo u t p u ts t i l lw a s1 h o w e v e r , t h ea d d i t i o n o fa g + i n s t e a do fc y sc o u l dg r e a t l yd i s r u p tt h eg q u a d r u p l e xs t r u c t u r e ，a c c o m p a n i e d b yt h ef l u o r e s c e n c ed e c r e a s eo ft h ed y e ，r e n d e r i n ga no u t p u ts i g n a lo f o t h ea d d i t i o n o fc y si n t oa g + - q u e n c h e df l u o r e s c e n c es y s t e ml e dt ot h er e c o v e r yo ft h ef l u o r e s c e n c e d u et ot h er e l e a s eo fa g 十f r o md n ab yc y s ，g i v i n ga no u t p u ts i g n a lo f1 c o m p a r e d w i t l lp r e v i o u s l yp u b l i s h e dd n a l o g i cg a t e s ，t h eg a t eo p e r a t i o ni sr a p i da n dr e v e r s i b l e w i t hr e l i a b l e ，n o n d e s t r u c t i v er e a d o u ta n de x c e l l e n td i g i t a lb e h a v i o r i na d d i t i o n , t h e m o d u l a t i o no ft h ef l u o r e s c e n c eo ft h et p m d y e g - q u a d r u p l e xc o m p l e x e sb ya 鼋 o r a n dc y sc a na l s ob eu s e dt od e v e l o ph i g h l ys e l e c t i v eh o m o g e n o u ss e n s i n gm e t h o d s o f a g + a n dc y s k e yw o r d s ：t p md y e s ；g - q u a d r u p l e x ；d n a ；p o t a s s i u m i o nd e t e c t i o n ；d n a i m p l i c a t i o n l o g i cg a t e 目录 目录 第一章绪论1 第一节关于核酸和g 一四链体的介绍1 1 1 1 有关核酸的介绍1 1 1 2g 一四链体的形成及其结合能力1 1 1 3g 一四链体的多态性2 1 1 4g 一四链体的功能3 第二节g 一四链体结构的研究方法4 1 2 1 利用圆二色光谱法进行研究4 1 2 2 利用紫外可见光谱进行研究4 1 2 3 利用x 一单晶衍射进行研究5 1 2 4 利用核磁共振光谱进行研究5 1 2 5 利用荧光光谱进行研究5 1 2 6 利用凝胶电泳进行研究6 第三节有关三苯甲烷类染料的介绍及钾离子的检测6 1 3 1 三苯甲烷类染料6 1 3 2 钾离子的检测方法7 第四节有关逻辑门的介绍9 1 4 1 分子逻辑门9 1 4 2 核酸逻辑门1 0 第二章三苯甲烷染料作为g 一四链体识别荧光探针1 2 第一节引言1 2 第二节实验部分1 2 2 2 1 实验仪器与试剂1 2 2 2 2 荧光光谱和荧光共振能量转移光谱1 3 2 2 3 荧光滴定和荧光共振能量转移滴定1 3 第三节实验结果与讨论1 4 v 3 2 4 检测方法的响应时间和重现性研究3 0 3 2 5 圆二色光谱( c d ) 研究3 0 3 2 6 竞争透析法3 1 第三节实验结果3 l 3 3 1c v 在不同g 一四链体存在下的荧光光谱3 1 3 3 2 荧光猝灭的k + 检测模式3 2 3 3 3 荧光增强的k + 检测模式3 7 3 3 4 圆二色光谱的研究4 3 3 3 5 竞争透析分析4 4 第四节讨论4 5 3 4 1c v g 一四链体配合物在不同离子条件下荧光变化机制的讨论4 5 3 4 2 此k + 检测方法的特点4 7 第五节结论4 8 第四章三苯甲烷染料_ g 四链体在d n a 荧光i m p l i c a t i o n 逻辑门的设 计与a g + 和c y s 的检测中的应用4 9 第一节引言4 9 第二节实验部分5 0 4 2 1 实验仪器与试剂5 0 4 2 2t p m 染料g - 四链体配合物的制备5 0 v i 目录 4 2 3a g + 的测定5 1 4 2 4 半胱氨酸( c y s ) 的测定5 1 4 2 5 可逆性的测定5 1 第三节结果与讨论5 l 4 3 1a g + 的检测5 1 4 3 2c y s 的检测5 5 4 3 3d n ai m p l i c a t i o n 逻辑门的设计5 8 4 3 4i n h i b i t 逻辑门的设计6 0 第四节结论6 2 参考文献6 3 致谢7 2 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果7 3 v i i d n a ) 。r n a 是由a m p 、g m p 、c m p 和u m p 四种核糖核苷酸经磷酯键缩 合而成的长链状分子。r n a 一般以单链形式存在，但是很多r n a 也需要 通过a u 、g c 、g u 碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行 使生物学功能。r n a 在蛋白质合成过程中起着重要作用。根据生物结构功 能的不同，r n a 又可分三类，即信使核糖核酸( m e s s e n g e rr n a ，m r n a ) 、 核糖体核糖核酸( r i b o s o m a lr n a ，r r n a ) 和转移核糖核酸( t r a n s f e rr n a ， t i 斟a ) 。d n a 则由d a m p 、d g m p 、d c m p 和d t m p 四种脱氧核糖核苷酸通过 3 ，5 磷酸二酯键连接而成的一种长链聚合物。d n a 是储存、复制和传递遗 传信息的主要物质基础，是一类很重要的生命物质。大多数d n a 以a t 、g c 碱基互补配对原则，5 端对应3 端所构成的双螺旋结构存在于生物体内。这种 结构是由w a t s o n 和c r i c k 在1 9 5 3 年根据c h a r g a f f 等人揭示的碱基组成规律，并 结合d n a 的钠盐晶体的x 射线衍射分析提出的。此外，d n a 也可形成其它结 构。 1 1 2g 四链体的形成及其结合能力 富含鸟嘌呤( g ) 的核酸序列能折叠形成一种特殊的二级结构的四链结构 即g 四链体( g q u a d r u p l e x ) 。四个鸟嘌呤碱基g 通过h o o g s t e e n 氢键配对方式 首尾相连形成的平面排列称为g - 四分体或四联体( g t e t r a d 或g q u a r t e t ) ，在此 过程中，乌嘌呤的糖苷键可以采用反( a n t i ) 或顺( s y n ) 排列。两个、三个或四 个g 四分体通过觚作用堆叠而形成g 四链体( 图1 1 ) 【1 5 】。g 四链体能与金 属离子作用而且g 四分体之间的空腔是结合位点，所以金属离子的半径决定其 结合强度。l ( + 离子的半径是1 3a ，与g - 四分体间的空腔很吻合，可以极大地稳 第一章绪论 定g 四链体结构。对于碱金属来说，稳定性顺序是：k + n a + r b + c s + l i + ； 对于碱土金属，稳定顺序是：s r + b a 2 + c a + m g + 6 - 8 。除了金属离子，一些 有机小分子如葸醌、卟啉衍生物以及其它平面化合物能选择性促进g 四链体结 构的行成或稳定【9 1 3 1 。这些小分子配体的共同特征是拥有阳离子取代的广大的芳 环平面缺电子发色团。另外，某些蛋白质的存在也能稳定g 四链体结构，如凝 血酶( t h r o m b i n ) 与凝血酶适配体( 5 g g t t g g t g t g g t t g g ) 特异性结合时， 凝血酶适配体程g 四链体结构【1 4 6 1 。 1 1 3g 四链体的多态性 g 四链体构型的多态性主要取决于三个因素：( 1 ) 核酸链的数目：( 2 ) 链 的走向：( 3 ) 环的类型。g 四链体根据形成时所需链的条数可分为分子内g 四 链体( i n t r a m o l e c u l a rg q u a d r u p l e x ) 和分子间g 四链体( i n t e r m o l e c u l a r g q u a d r u p l e x ) 。一条富含四段gt r a c k s 的d n a 链可以折叠形成分子内g 四链 体，两条或四条d n a 链能形成分子间四链体( 图1 1 c ) b y 。对于分子间g 四 链体而言，其形成速度相对较慢，且稳定性随核苷酸链浓度的增加而增加。而 对于分子内g 四链体而言，其稳定性不随链的浓度发生变化。 即使相同数目的d n a 链所组成的g 四链体也可以根据链的走向呈现不同 的拓扑结构。构成g 四链体的四条链的走向存在三种组合方式：( 1 ) 四条链的 走向均相同，这样的g 四链体称为平行g 四链体( p a r a l l e l ) ；( 2 ) 两条链的走 向相同，而与另外两条链的走向相反，这样的g 四链体称为反平行g 四链体 ( a n t i p a r a l l e l ) ；( 3 ) 三条链的走向相同，而与另外一条链的走向相反，这样的 g 四链体称为混合类型的g 四链体( m u l t i p a r a l l e l ) 【l 引。 支撑g 四分体的富gt r a c k s 由不同的环( 1 0 0 p ) 相连接。这些环可分为三 种：侧环( 1 a t e r a ll o o p s ) 、对角环( d i a g o n a ll o o p s ) 和边环( p r o p e l l e rl o o p s ) 。 侧环连接两个相邻的反平行链，对角环连接两个相对的反平行链，边环连接两 个相邻的平行链( 图1 1 ) 。不同g 四链体拓扑结构中存在不同的环并且同一 g 四链体拓扑结构中也可同时存在几种不同的环，环的长度和类型影响g - 四链 体的性质和功能【i 训。 2 c d i a g o n a ll o o p 0 回国p 二e a rl o o p 嘲。p ( a ) ( b ) ( c ) 图1 1( a ) g 四分体( b ) 鸟嘌呤构造( c ) g 四链体：( a ) 分子间四链g 四链体；( b ) 分子间双链g 四链体：( c ) 分子内g 四链体 1 1 4g 四链体的功能 富含鸟嘌呤的d n a 序列很普遍而且多存在于生物体中一些关键的基因组区 域，比如染色体末端的端粒( t e l o m e r e s ) 、基因启动因子( g e n ep r o m o t e r s ) 、 生长控制基因( g r o w t hc o n t r o lg e n e s ) 、m r n a 、免疫球蛋白开关领域【2 羽。此 外，g 四链体在很多生物过程中发挥着重要作用。例如，g 四链体结构不仅参 与端粒活性的调控而且还与癌症、h i v 和其它疾病的形成机制相关【2 3 五引。值得 一提的是g 四链体可以与一些蛋白质特异性结合从而被用来识别蛋白质【1 4 以6 】。 正是由于这些重要性，近些年g 四链体得到越来越多的关注与研究，有关g 四 链体的研究已经成为国际上的一个研究热点。这些研究集中于g 四链体构型的 3 第一章绪论 探索【2 6 】、g 四链体稳定剂的找寻及g 四链体在各方面的应用等领域【2 7 1 。其中， g 四链体结构的有效识别显得尤其重要，因为它是发展癌症、h i v 和其它疾病 抑制剂的必要前提。 第二节g 四链体结构的研究方法 目前多种技术如圆二色光谱法( c d ) 、紫外可见光谱( i v _ - v i ss p e c t r o s c o p y ) 、 x 单晶衍射( x r a yd i f f r a c t i o n ) 、核磁共振技术( n m r ) 、荧光光谱( f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y ) 、质谱( m a s ss p e c t r o m e t r y ) 、凝胶电泳( g e le l e c t r o p h o r e s i s ) 等已 被广泛地用来研究g 四链体的形成及性质。 1 2 1 利用圆二色光谱法进行研究 圆二色光谱法( c d ) 不仅能判断g 四链体的形成与否而且还能区分g 。四链 体的平行结构和反平行结构。光谱图上若在2 1 0n n l 处有一正峰，则表明g 四链 体结构的形成【2 8 j 。若在2 6 4n l l 处有一正峰，在2 4 0n m 附近有一负峰，则表明 平行( p a r a l l e l ) g 四链体结构的形成；若在2 9 5n l n 附近存在一个正峰，在2 6 4n l n 附近存在一个负峰，则表明反平行( a n t i p a r a l l e l ) g 四链体结构的形成；若在2 6 8 n l n 和2 9 5n n l 处均有正峰，则表明混合( m i x e d h y b r i d ) g 四链体结构的形成【2 ”0 1 。 1 2 2 利用紫外可见光谱进行研究 研究发现：对于某一富含鸟嘌呤g 的寡核苷酸链而言，当其形成g 四链体 结构时，2 9 5s i n 处的吸光度值会相应地增加。反过来说，随着温度的升高，当 g 四链体结构遭到破坏时，其2 9 5n n l 处的吸光度会相应地降低。那么，考察2 9 5 n n l 处吸光度值随温度的变化，得到相应的吸光度温度变化曲线，该曲线的一阶 导数的最大值处所对应的温度即为g 四链体结构的t m 值。紫外可见光谱除了判 断g 四链体的形成与否还能区分分子内g 四链体和分子间g 四链体。d n a 在 2 9 5n m 处紫外吸收值在0 9 0o c 升温和降温过程中随温度变化若是可逆的，则表 明分子内g 四链体形成，相反，若变化缓慢出现滞后现象不可逆则形成分子间 g 四链体【3 l 】。该方法的优点在于不需要对形成g 四链体的寡核苷酸链进行任何 的修饰，对仪器的要求也比较简单，只需一台配有控温装置的紫外可见分光光 度计即可。但在整个实验过程中产生的信号变化相对较小。 4 x 单晶衍射因其高分辨率而成为一种研究g 四链体结构的强大方法。x - 单晶衍射不仅能检测结构重组( s t r u c t u r e sd e n o v o ) 而且还能为明确的g - 四链体 核心骨架( c o r em o t i f ) 和多变的环结构提供高分辨的坐标数据。晶格环境下g 一 四链体的紧密堆积提供了分子结合的信息：通过平面四分体结合或环- 环相互作 用结合。这种方法的缺陷是只能对固态结构进行研究，而固态下的结构并不一 定与溶液中的结构相同。此外，获得可靠的单晶还不是件易事【3 2 1 。 1 2 4 利用核磁共振光谱进行研究 相反，核磁共振光谱能提供溶液中g 四链体结构的重要信息。用核磁共振 技术，样品制备比较简单，不过纯度要求比较高。核磁共振n o e s y 光谱上若出 现亚胺基特征峰( 1 0 0 1 1 5p p m ) 和g a m i n o 与g h 8 交叉峰表明g 四链体结 构的形成。g 四链体结构中键合的亚胺基质子与d 2 0 作用比非键合的质子要慢 得多。多位核磁技术被用来阐述更精确的结构1 3 弼4 1 。 1 2 5 利用荧光光谱进行研究 荧光光谱尤其是能量转移光谱( f r e t ) 因其高灵敏性和多维性成为一种有 效的研究g 四链体结构方法。利用各种荧光参数如强度( i n t e n s i t y ) 、各向异性 ( a n i s o t r o p y ) 、寿命( 1 i f e t i m e ) 、光谱( s p e c t r a ) 和能量转移光谱( f l u o r e s c e n c e r e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ) ，我们不但可以描述分子结构的各个方面而且还可以 获得浓度( c o n c e n t r a t i o n ) 、键合事件( b i n d i n ge v e n t s ) 、内部链移动( i n t e r s t r a n d m o t i o n ) 等信息。d n a 分子本身在常温条件下不发射荧光，但是可以将d n a 链 进行荧光修饰从而观察d n a 构型的变化【3 5 。3 7 1 。另外，一些蛋白质和小配体也能 识别特殊的g 四链体结构1 3 8 也】。有些自身荧光较低的金属配合物与核酸作用后 因荧光猝灭受到抑制，荧光强度增强；而有些本身有荧光的分子与核酸作用后 会产生荧光猝灭，荧光强度减弱。利用这些现象可进行热力学和动力学分析。 荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中，如果供体( d o n o r ) 的发 射光谱与受体( a c c e p t o r ) 的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团在 足够靠近时( c v m e g m v e v ：o x y 2 8 与t p m 染料的结合常数大小为：m g c v m e g e v m v 。这五种t p m 染料中，每个m g 、c v 和e v 携带一个正电荷。它们的 主要区别是取代基的数目和大小。m g 有两个二甲基氨基取代基，c v 有三个二 甲基氨基取代基，e v 有三个二乙基氨基取代基。也就是说，三苯甲烷骨架的取 代基大4 , j r 序为：m g c v e v ，这刚好与结合常数大d , j i 顷序相反。当t p m 染 料与g 四链体结合时，有可能是染料的三个苯环堆积在g 四链体的两个外侧 g 四分体上，而取代基嵌插在g 四链体的沟槽内【1 3 7 1 。结合稳定性与取代基大小 顺序刚好相反表明取代基越大越能阻碍取代基向沟槽内的嵌插，从而减小结合 稳定性。m v 有两个二甲基氨基取代基和一个甲基氨基取代基，其取代基的体积 比c v 的小，然而m v 与g 四链体的结合稳定性也比c v 与g 四链体的稳定性 弱，这也许与染料所带的正电荷有关。c v 带有一个正电荷，而m v 没有带电荷。 虽然甲基氨基的质子化能提供m v 一个正电荷，但是质子化须在酸性条件下进 行。根据上面的结果，我们可以推出这样的结论：正电荷和取代基的大小是决 2 7 定分子内g 四链体t p m 配合物稳定性的两个重要因素。第一个正电荷的存在 对于促进结合稳定性很重要( 可以从比较c v 与m v 得到) ，但是第二个正电 荷的存在没有取代基的大小重要( 可以从比较c v 和m e g 得到) 。m e g 有两 个正电荷和一个大的取代基，但是结合稳定性却比c v 弱。 第四节结论 为了评价5 种t p m 染料区分g 四链体和单链、双链d n a 的能力，我们对 这五种染料在十种不同结构d n a 中的荧光光谱和荧光能量共振转移光谱进行了 研究。研究结果表明，除了e v 外，其它四种t p m 染料的荧光光谱都可以用于 区分分子内g 四链体和分子间g 四链体以及单链、双链d n a ，但不能把分子 间g 四链体与单链、双链d n a 区分开。染料的荧光共振能量转移光谱尤其是 m g 、c v 和m e g 的不仅能区分分子内g 四链体和分子间g 四链体而且能区分 g 四链体( 包括分子内g 四链体和分子间g 四链体) 和单链、双链d n a 。根 据染料荧光随d n a 浓度增加的变化趋势，能量转移荧光滴定试验可用于区分 g 四链体和单链、双链d n a 。五种t p m 染料与g 四链体的作用模式是外部堆 积且其化学计量比是2 ：1 。t p m 染料的正电荷数以及取代基大小是影响染料与 g 四链体结合稳定性的两个重要因素。这些研究为开发灵敏的g 四链体识别荧 光探针提供了重要信息。 第三