（材料学专业论文）含吡咯烷酮基团的蛋白质印迹聚合物微球的研究.pdf

摘要 中文摘要 分子印迹技术是一种新兴技术，通常可以被描述成制造识别“分子钥匙”的 人工“锁”的技术。它可以制备出对所选目标分子具有高度亲和性及选择性的聚 合物材料。近来，分子印迹聚合物已在固相萃取、模拟酶催化、化学仿生传感器 等领域展现了良好的应用前景。 本文立足于水性环境中蛋白质分子的印迹，以聚合工艺( 反相悬浮聚合法) 的探索为主线，重点尝试了一种全新的功能单体乙烯基吡咯烷酮和交联剂单 体一聚乙二醇2 0 0 乙烯酸酯，并对其所得印迹微球的形貌和吸附性能做了分析 讨论，特别是s m i p 的印迹吸附效果、再生性能以及环境因素比如温度等对吸附 动力学的影响。另外，对其洗脱工艺做了探讨。 研究表明，本实验采用的反相悬浮聚合法能够制备得到外部形态非常规整的 s m i p 。当以甲苯为油相，油水比为2 5 ：1 ；e c 为分散剂且用量为0 2 0 9 ，搅拌速 度为3 0 0 r p m ，聚合温度在4 0 c ；引发剂为0 1 0 9 k ：s ：0 8 0 0 5 9 n a h s 0 3 且控制滴加 速度在6 0 m i n 左右能够得到粒径分布较窄、平均粒径在4 8 0um 左右、形貌非常 好的s m i p 。同时s m i p 在牛血清白蛋白与乙烯基吡咯烷酮比例为1 ：1 2 时出现特 殊形貌，选择吸附量达到最大；在p h 值为4 7 和9 时出现两个极大值，而且其 整个吸附过程基本符合l a n g m i u r 吸附模型；印迹聚合物对模板分子表现出很好 的专一识别特性和良好的再生使用性能，以1 0 h a c ( 含i s d s ) 为洗脱溶液，控制 洗脱温度为3 0 、时间为2 4 h 可以达到非常好的洗脱效果。 关键词：分子印迹聚合物微球，反相悬浮聚合法，牛血清白蛋白，分子识别， 乙烯基毗略烷酮，蛋白质模板，吸附 a b s t r a c t a b s t r a c t m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u ef m i t ) i sak i n do fr i s i n gt e c h n i q u e ，i t so f t e n d e s c r i b e d 船aw a yo fm a k i n gam o l e c u l a rl e e kt om a t c ham o l e c u l a rk e y i tc a n p r e p a r ep o l y m e r sw h i c hh a v eah i g ha f f m i t ya n ds e l e c t i v i t yt o t h ei m p r i n t e d m o l e c u l e s i th a sb e e nr e p o r t e dr e c e m l yt h a tm o l e c u l a ri m p r i n t i n gp o l y m e r sh a v ea g o o df o r e g r o u n da p p l i e di ns o l i dp h a s ee x t r a c t i o n , e n z y m e - m i m i c k i n gc a t a l y z e r , c h e m i c a l - b i o n i cs e n s o ra n ds oo n w em a d et h es p h e r em o l e c u l a ri m p r i n t i n gp o l y m e r si nr e v e r s a l - p h a s es u s p e n d p o l y m e r i z a t i o na c c o r d i n gt ot h e o r yo f m t , w h i c hw e r ei m p r i n t e dw i t hb o v i n es e r t m l a l b 啪i n u s e dv i n y i p y r r o l i d o n ea sf u n c t i o n a lm o n o m e r , w ed i d t h ee x p e r i m e n t s a c c o r d i n gt ot h eo p t i m i z e do ft e c h n i c sa n dt r i e dak i n do fe r o s s l i n k i n gr e a g e n t ；w e a l s oo b s e r v e dt h ed i f f e r e n c e sb e t w e e nt h ep r o d u c t i o n sw h i c ha r eo b t a i n e du n d e r d i f f e r e n tc o n d i t i o n s w ed i dt h er e s e a r c ho na d s o r p t i o nc a p a b i l i t i e sa n ds e l e c t i v i t yo f t h em e n t i o n e dd i f f e r e n tp r o d u c t i o n s ，r e c y c l i n gp e r f o r m a n c eo fs m i pa n de f f e c to f e n v i r o n m e n t a lf a c t o r ss u c ha st e m p e r a t u r et ot h e i rk i n e t i ca d s o r p t i o nc a p a b i l i t y i ts h o w e dt h a tt h er e v e r s a l p h a s es u s p e n dp o l y m e r i z a t i o nw eh a du s e dc a l lm a k e s p h e r e so fg o o ds h a p e e s p e c i a l l y , o i lt h ec o n d i t i o n st h a tu s e dt o l u e n e 舔o r g a n i c p h a s e ，t h er a t i oo fo i lt ow a t e rw a s2 5 ：1 ，t h ea m o u n to fv i n y l - c e l l u l o s ew a so 2 0 9 ， s t i r r e da t3 0 0 r p m ，k e p tt e m p e r a t u r ea t4 0c e n t i g r a d e ，d r o p p e di n i t i a t o rr e a g e n t c o n s i s t e do f o 1 0 9 k 2 8 2 0 8a n do 0 5 9 n a h s 0 3i n6 0m i n u t e s w ec o u l do b t a i ns m i po f g o o dc o n f o r m a t i o n ，w h i c hh a dd i a m e t e ra r o u n d4 8 0 p ma n di n n a r r o w e rs i z e d i s t r i b u t i o n w h e nt h er a t i oo ff u n c t i o n a lm o n o m e rt oi m p r i n t e dm o l e c u l ew a s1 2 ：1 ， t h em o r p h o l o g yo fs m l pt o o ko ns p e c i a lt o o ka n dt h ea d s o r p t i o na m o u n tr e a c h e dt h e m o s t i ta l s oh a d t w om a x i m 砌v a l u e sa n dt h ew h o l ea d s o r p t i o nc u r v ea c c o r d e d 聃j l h t h ea d s o r p t i o nm o d e lo fl a n g m i n r t h es m i ph a dv e r ye x c e l l e n ts e l e c t i v i t y 、 a d s o r p t i o na n dg o o dr e c y c l i n gp e r f o r m a n c e w ec o u l dg e tag o o dw a s h e de f f e c tw i t l l 1 0 h a cs o l m i o nc o n t a i n e di s d sa t4 0c e m i g r a d ea f t e r2 4h o u r s k e y w o r d s ：s p h e r e o fm o l e c u l a ri m p r i n t e dp o l y m e r , r e v e r s a l p h a s es u s p e n d p o l y m e r i z a t i o n , f u n c t i o n a lm o n o m e r , v m y l p y r r o l i d o n e ， m o l e c u l a ri m p r i n t e d , a d s o r p t i o n ，p r o t e i n 2 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨鲞太茎或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：本彳二日生签字日期：乒口一z 年月2 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫鲞盘茎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ， ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 辱乖闷生 签字日期：? 一口，年月2 日 导师签名：悄l 印什 签字嘞年、月以 第一章绪论 1 1前言 第一章绪论 分子印迹技术是近年来得到广泛关注的一种新兴技术，通常可以被描述成制 造识别“分子钥匙”的人工“锁”的技术。它可以制备出对所选目标分子( 一般 称为模板分子) 具有高度亲和性及选择性的聚合物材料。此聚合物称为分子印迹 聚合物( 亦称分子模板聚合物) 。分子印迹聚合物( m o l e c u l a ri m p r i n t i n gp o l y m e r s 简记m p s ) 带有许多固定形状和大小的孔穴，孔穴内通常带有确定排列的功能 基团，它对印迹分子的立体结构具有记忆功能。 分子印迹思想的起源可以追溯到f i s c h e r 的“锁和钥匙”、p a u l i n g 的“抗原 一抗体”以及d i c k e y 的“专一性吸附”的概念。然而现代分子印迹技术的建立 应归功于w u l i t 和m o s b a c h ，他们开创性的工作使得分子印迹技术得到了突飞猛 进的发展。1 9 7 2 年，分子印迹技术的先驱德国的w u l f f l l 等人已合成出了对 糖类和氨基酸衍生物有识别作用的聚合物。2 0 0 0 年，第一届分子印迹技术国际 会议在英国的加的夫大学召开，并成立了分子印迹技术协会( s m i ) 。近来，分 子印迹聚合物已在固相萃取、酶模拟、药物控制释放、仿生传感器等领域展现出 了良好的应用前景。 本章将对分子印迹技术原理、印迹分子与分子印迹聚合物的结合作用、分子 印迹聚合物的原材料、分子印迹聚合物的制备方法及应用和面临的问题进行简单 的介绍，重点对蛋白质分子印迹聚合物的相关知识做阐述，在此基础上提出本实 验拟研究的内容。 1 2 分子印迹技术原理 前面已经提到，分子印迹聚合物的内部带有许多固定大小和形状的孔穴，孔 穴内带有特定排列的功能基团。分子印迹聚合物对分子的识别作用就是基于这些 孔穴和功能基团的定位作用。 印迹分子与功能单体、基材单体、交联剂引发聚合，形成一定程度交联的聚 合物，洗脱掉印迹分子就得到留下与印迹分子形状相似的孔穴的聚合物母体，且 孔穴内功能基团在空间位置和结合位点上与印迹分子互补，可与印迹分子发生结 合作用，从而实现分子识别。( 如图1 1 所示) 第一章绪论 o 、骂 梗譬岔子鼎b 功譬黔( ) )cj 分子印逛聚 合物cd ) 图1 1 分子印迹和识别原理示意图 f i g u r e1 1t h ep r i n c i p l eo fm o l e c u l a ri m p r i n t i n ga n dr e c o g n i z i n g 1 3印迹分子与分子印迹聚合物的结合作用 印迹分子与分子印迹聚合物之间的相互作用主要是孔穴内固定排列的结合 基团与印迹分子间的相互作用。 结合基团和印迹分子之间的结合作用主要有以下几种：( 1 ) 共价键；( 2 ) 氢 键；( 3 ) 疏水范德华力；( 4 ) 一丌键；( 5 ) 离子键；( 6 ) 冠醚与离子；( 7 ) ( 过渡) 金属配基。不管哪种结合作用，都要求符合两个条件： ( 1 ) 印迹分子与结合基团间的键合作用要有一定的强度，以便把印迹分子固 定住，使其按确定的空间位置排列；但是强度不能过大，因为生成聚合 物后，印迹分子还要被洗脱掉。 ( 2 ) 结合基团与印迹分子有很好的相互作用，结合要尽可能地快，以便用于 快速色谱分离和催化，要具有很好的可逆性，以便多次反复使用。 1 4 分子印迹聚合物原材料 1 4 1 原材料简介 制备m i p s 一般需要以下几种原材料：印迹分子、交联剂、基材单体、功能 单体、溶剂，同时还可通过加入致孔剂调节聚合物的吸附分离性能。 1 4 1 1 印迹分子 根据所要识别的化合物的结构和性质，印迹分子可以是低分子化合物、低 聚物、金属离子或金属络合物，也可以是分子聚集体，习惯上统称它们为印迹分 子。应用较多的有糖类及其衍生物、氨基酸及其衍生物、蛋白质、核酸、激素、 杀虫剂、酶或辅酶、农药、染料及肽和多肽等拉。钔。 1 4 1 2 交联剂与基材单体 2 第一章绪论 y w m 丫l n h y n ，n - m e t h y l e n e d i a c r y l a m i d en ，n - i ，4 - p h e n y l e n e d i a c r y l a m i d e n 它h y j 沙凡 3 ，5 - b i s ( a c r y l o y l a m i d e ) b e n z o i ca c i d r l 。慨心 e t h y l e n eg l y c o ld i m e t h a c r y l a t e 一雌c 心 c h r c q h 3 6 c 也 p e n t a c r y t h r i t o lt r i a c r y l a t e t r i m e t h y l o l p r o p a n et r i m e t h a c r y l a t e 吼式h 一量一一c 旷l _ c 归c 叱 p e n t a c r y t h r i t 0 1t e t r a a c r y l a t e 图1 - - 2 几种常用交联剂的化学结构式 f i g u r e1 2s t r u c t u r eo fs o m ec o n l o nc r o s s 一1i n k i n ga g e n t s 交联剂与基材单体聚合得到的聚合物母体的结构对分子印迹聚合物的制备 起到非常重要的作用。因为模板孑l 穴的识别性能是由印迹分子和聚合物链的固定 排列共同决定的，因此聚合物结构的优化极为重要。聚合物母体应具备如下性能： 1 ) 有足够的硬度，以便模板除去后孔穴能保持形状而不变形。 2 ) 有一定的柔性，以使它们能与嵌入的底物迅速达到平衡。 3 ) 可制成特定的形态，既有尽可能高的交联度，又有良好的底物可近性。 4 ) 有良好的热稳定性，以便于在对动力学有利的高温条件下使用。 第一章绪论 5 ) 有良好的机械稳定性，以便在高压或搅拌环境下使用。 聚合物母体材料可以是多孔的有机聚合物、无机聚合物和生物高分子。在有 机聚合物中，具有大孔型网络结构的聚合物在实际中应用最多。图1 2 所示为 些常用的交联剂的分子结构式。 1 4 1 3 功能单体 选取合适的功能单体一般要求单体的一端能和聚合物结合，而另一端能和印 迹分子结合。与聚合物应有足够强的结合力，以使除去模板后孔径稳定，而与模 板的结合力则要适中，因为结合力过大则印迹分子难以洗脱，而过小则孔穴对印 迹分子的选择效率不高。 图1 - - 3 所示为几种常用的功能单体，其中应用最广泛的是甲基丙烯酸。带 有双键的胺类和吡啶类也是性能优异的功能单体，如丙烯酰胺、乙烯基毗啶等。 最近以丙烯酰胺为功能单体的分子印迹聚合物亦有报道i l 卯。 弋洲 丙烯酸甲基丙烯酸甲基丙烯酸甲酯 饥 一坩h 4 - 乙基苯乙烯p 一乙烯基安息香酸 何仓 卜乙烯基眯唑4 一乙烯基吡啶 乌头二酸 徇 2 一乙烯基吡啶 图1 3 几种常用的功能单体结构式 f i g u r e1 3s t r u c t u r eo fs o m ec o i n l n o nf u n c t i o n a lm o n o m e r s 功能单体可以是一种也可以用多种，例如s e r g e y 1 6 】等以二甲基丙磺酸酰胺 和环糊精作为双功能单体，印迹苯基丙氨酸；t o s h i f u m i ”】等以甲基丙烯酸和2 一 ( 三氯甲基丙烯酸) 作为双功能单体制备了分子印迹聚合物。采用多种功能单体 的优点是聚合物与印迹分子的作用力较强，选择专一性更好。 1 4 1 4 致孔剂 第一章绪论 致孔剂在一些体系中可能影响模板分子与单体间作用的强度或者聚合反应 的动力学，但是由于其的加入能够形成大孔型网络结构的聚合物对整个的印迹和 吸附性能都有利，所以一般都加入一定量的致孔剂。目前，常用的致孔剂有乙腈、 氯仿、甲苯、石蜡和吐温【1 8 】等。最近，也有一些极性溶剂如四氢呋喃、甲酵等作 为致孔剂的报道0 9 1 。它们在分子印迹技术中的应用将极大地扩展分子印迹聚合物 的应用范围。 1 4 1 5 溶剂 聚合过程中所用的溶剂对聚合过程、产物后处理以及实际应用都有定的影 响。目前，常把聚合环境分为水相和非水相两大类。 非水相中，常用的溶剂主要有二氯甲烷、氯仿、丙酮、甲苯等。近来， m o s b a c h 阻2 1 1 等人采用全氟代碳化物也收到了很好的效果。 然而，目前在水相体系下进行的印迹研究工作却很少，只有为数极少的几篇 研究报道。如c o n gy u 等【1 6 】以丙烯酰胺为功能单体已经成功地在极性溶剂( 乙腈) 中印迹了几种氨基酸；k a r s t e n 1 川等在甲醇水混和体系中，以4 一乙烯基吡啶为 功能单体印迹了2 ，4 一二氯苯氧基乙酸；h o s o y a 2 2 和y o s h i d a 2 3 j 等以水为溶剂 进行印迹等。这些工作取得了一定的进展，但依然不完善，需进一步深入开展。 因此，研究在极性环境尤其是水相中m i p s 的印迹过程，寻找可行的聚合方案具 有重要的意义。 1 4 2 乙烯基吡咯烷酮 n v p 是n 乙烯基毗咯烷酮( v i n y l p y r r o l i d o n e ) 的简称，是合成p v p 的单体。 n v p 常温下是一种无色或者淡黄色、略有气味的透明液体，易溶于水，其主要 的物理性质如下： 相对密度：1 0 4 ( 2 5 ) ；熔点：1 3 5 ； 折光率：n d = 1 5 1 2 0闪点：9 8 3 3 ； 沸点：1 4 8 ( 1 3 3 3 2 2 4 p a ) ，5 8 6 5 ( 1 3 3 2 6 6 4 p a ) ； n v p 除易溶于水外，还易溶于许多有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、 三氯甲烷、乙酸乙烯酯等，所以n v p 具有优良的溶液特性，这也为n v p 溶液聚 合的溶剂提供了较大的选择范围。 n v p 的分子是一个含有n 原子的五元环，属于内酰胺类化合物，在n 原子 上连有一个乙烯基，这是n v p 分子重要的基团，n 原子上的这个基团给n v p 的 第一章绪论 聚合和应用提供了比较特殊的性质。n v p 分子式为c o n o ，结构式为 a 午呱 ( n v p ) 图1 - 4n v p 的结构式 f i g u r el 一4s t r u c t u r eo fn v p n v p 这种特殊的分子结构赋予了它一些特殊的化学性质，其中最重要的就 是易聚合性和易水解性，现分述如下： 1 易聚合性 n v p 在适当的引发剂作用下，或者光照下即可发生聚合反应得到聚乙烯毗 咯烷酮，反应式为： 即使在没有引发剂的情况下，n v p 放置的时间过长或者在运输过程中由于 震动也可能发生不同程度的自聚合而影响其质量，所以在市售的商品n v p 中一 般都加有阻聚剂，而在进行聚合反应前需要去除其中的阻聚剂。处理方法有两种： 一是采用减压蒸馏的方法得到纯净的n v p ；二是加入活性炭，利用其吸附作用 除去阻聚剂，然后过滤得到纯净的n v p 。 2 易水解性 n v p 的另一个重要的化学性质是在酸性或盐类存在的条件下很容易发生水 解反应，生成吡咯烷酮和乙醛。j f e r g u s o n 等人2 4 1 对n v p 在酸和盐存在下的水 解进行了比较全面的研究，得到了n v p 水解速率与时间的关系曲线，如图( 1 6 第一章绪论 毫 并 蓑 时旧 图l 一5 丙烯酸存在下n v p 水解速率一时间曲线 0 , r v p - - - 2 0 x1 0 1 m o l l ，t = 7 4 c 丙烯酸 = 2 o x1 0 一* m o l l 对同缸曲 图l 6k 2 s 2 0 s 存在下n v p 的 水解速率一时间曲线 【n v p 】咤0 x1 0 一m o l l ，t = 7 4 c ； k 2 s 2 0 d = o 7 4 x1 0 。2 m o l l 通过进步研究，得到丙烯酸或k 2 s 2 0 8 存在下n v p 的水解机理如图1 7 所示。由图可见，n v p 分子内的乙烯基电荷不平衡，即双键相连的两个碳原子 上电荷密度不一样。这种电荷不平衡为n v p 的水解提供了可能性，当在酸性或 有碱金属离子存在时，n v p 分子内就发生异构化，形成一系列过渡态，最终生 成吡咯烷酮与乙醛，这是n v p 水解的第一步。n v p 水解的第二步为第一步生成 的吡咯烷酮与n v p 分子进行加成反应，然后在水的参与下进一步分解为吡咯烷 酮和乙醛。从n v p 水解机理来看，n v p 能否发生水解主要依赖于第一步一系列 过渡态是否可以形成，或者说n v p 分子内异构化反应能否发生是n v p 是否发生 水解的关键，溶液中或者碱金属阳离子的存在正好使n v p 的分子内异构化得 以实现，所以n v p 的水解得以进行。n v p 的水解速率主要取决于第二步，当 k + 存在时，会与第一步生成的吡咯烷酮反应首先生成吡咯烷酮钾盐，然后再与 n v p 进行加成反应。显然，吡咯烷酮钾盐更易与n v p 进行加成反应，导致在 k 2 s 2 0 8 存在时n v p 的水解速率也较大，从图1 5 、1 - 6 也可看出，k 2 $ 2 0 8 对n v p 水解速率影响较大。 由于n v p 易水解，所以在n v p 的生产和使用中应注意两点：一是合成n v p 时必须注意把水去除完全，保证产品中不含水分；二是在贮存、运输过程中，要 叠一*：番 第一章绪论 卫乃， 乃手乃一 旦2 队慨 h h ， 隅一、 0 c h 。 c h l ( ：嚆 o 图1 7n v p 的水解机理 f i g u r el 一7h y d r o l y z e dm e c h a n i s mo fn v p 使产品成中性或弱碱性，从而防止水解与自聚合反应发生，通常的方法是加入 o 1 的碱( 如氢氧化钠、氨或低分子量的胺类) 。 踽 阶卟r 第一章绪论 大约8 0 年前，德国人j w a l t e r r e p p e 以乙炔为起始原料通过多步反应合成了 n v p ( 即乙炔法或r e p p e 法) ，2 0 年后，美国的g a f 公司、德国的b a s f 公司 相继采用r e p p e 法实现了n v p 的工业化生产。我国是从2 0 世纪8 0 年代开始n v p 的合成及应用研究工作的，迄今不到2 0 年的时间。但就是在这短短的不到2 0 年 的时间里，我国n v p 合成及应用研究方面已取得可喜的成就：浙江省化工研究 院是国内较早的研究单位，通过几年的努力，于2 0 世纪8 0 年代后期开发出y 一 丁内酯法生产n v p 的工艺路线，并与河南省博爱精细化工厂合作兴建了一套年 产5 0 吨n v p 的中试装置。到目前为止，r e p p e 法仍是n v p 生产的主要方法。 n v p 是一种具有重要用途的化合物。但n 乙烯基吡咯烷酮单体在工业上并 没有实际应用价值，只有将n v p 聚合或者共聚为具有一定结构、一定组成和一 定分子量的高分子化合物之后，才能在工业上应用。也就是说，工业上能够实际 应用的是p v p 以及n v p 与其他不饱和单体共聚而成的共聚物。如在国外，n v p 的共聚研究起始于2 0 世纪5 0 年代，主要应用在化妆品方面。其中，n v p 共聚 物( n v p 乙酸乙烯酯共聚物) 的出现是发型保持剂( 发胶、摩丝等) 成功销售 的重要原因。吸水性n v p 共聚物由于吸水、保水性能、透氧性能、生物相容性 好、无刺激性而在国外被用于人造角膜和隐形眼睛材料、医药缓释剂等。 1 4 3 牛血清白蛋白 牛血清白蛋白( b s a ) 作为抗原的优点是易于分离，可大量获取，分子量适 中，溶于水，结构稳定，免疫原性较强【”1 。牛血清白蛋白为不含糖的蛋白质，约 占牛血清蛋白总量的一半以上，可用硫酸铵在其等电点p h 为4 7 时盐析沉淀， 也可用三氯醋酸使之沉淀，再用乙醇或丙酮抽提不溶性的沉淀，然后对水透析除 去沉淀中的三氯醋酸和有机溶剂即可得牛血清白蛋白。 。牛血清“( 或血浆) 白蛋白分子中只有一个n 一端为a s p n r ，这说明它的 分子是由一条肽链所组成，分子量为6 7 0 0 0 ，含1 9 种氨基酸，5 7 9 个氨基酸残基。 每个牛血清白蛋白分子含一个半胱氨酸残基。如果这个半胱氨酸残基同另外一个 蛋白质分子的半胱氨酸残基相结合，即形成二聚体。 牛血清白蛋白同多种阴离子如酸性偶氮染料、脂酸、盐酸或硫酸烷酯( a l k y l s u l f a t e s ) 等化合物的阴离子结合能力强，其分子表面带正电荷基团，是脂酸和许 多阴离子的有效载体。 1 5 分子印迹聚合物的制备方法及性能的表征 第一章绪论 1 5 1 制备方法 最早的分子印迹聚合物多是用本体聚合法或溶液聚合法制得。所得的块状 聚合物经研碎、过筛得微米级颗粒，再经抽提、洗脱后使用。 这两种方法聚合过程简单，但后续工艺繁琐，研筛过程中产品有所损失， 所得的颗粒形状不规则，且分散性较差。相比之下，单分散性好的球形分子印迹 聚合物在使用时有更好的优越性。因此，近年来分子印迹聚合物微球的制备成为 研究的热点。瑞典的m o s b a c h 2 6 - 2 7 最早制备了微球形的m i p ，日本的h o s o y a l 2 8 1 、 g o t o z 3 1 在这方面也做了卓有成效的工作。 1 5 1 1 分散聚合 m o s b a c h 2 1 工啦7 捌等人首先采用分散聚合法制得了分子印迹聚合物微球。他们 制备了一系列全氟代高聚物表面活性剂( p f p s ) ，并在具有化学惰性的全氟代碳 化物分散体系中聚合得到粒径在1 2 5 岬的微球。 1 5 1 2 沉淀聚合 上述的分散聚合法虽然印迹效果很好，但其制备过程非常繁琐，制备周期较 长，惰性分散剂氟碳化合物昂贵且不易得到。l e iy e 等【3 伽在原有的技术基础之 上，采用一种制各简便、成本低、产率和印迹效果也很好的沉淀聚合法。 1 5 1 3 多步溶胀悬浮聚合 多步溶胀悬浮聚合主要分为两个步骤聚合完成：第一步采用无皂乳液聚合法 合成粒径较小的微球；第二步以此微球为种球，将其用一定的乳液进行多次溶胀， 然后再引发聚合得到粒径稍大的微球。 h o s o y a 等人嘶0 8 3 ”在这一方面作了大量的工作。这种方法的特点是，聚合反 应在水溶液中进行，所得印迹聚合物可应用于极性环境中，这更能够满足诸如酶 模拟等实际应用环境的要求，同时产物的规整性和单分散性也很好。近来，成国 祥等【3 2 】采用种子溶胀悬浮聚合法，以粒径约11 1m 的聚苯乙烯微球为种子，t r i m 为交联单体，制备了氨基酸分子印迹的s m i p s ，该微球对其模板分子显示了一定 的吸附选择性。此外，g a l d 等f 3 3 j 以微悬浮聚合法得到的聚t r i m 微粒( 粒径约 5 1 0 u m ) 为种子，并由氯仿、m a a 、e d m a 、a i b n 和模板分子( b o c - l - p h e o h ) 制得的溶液进行溶胀后，加热引发聚合得到可用于h p l c 的s m i p s ，该微球的比 表面积可达到4 8 6 m 2 g 。 1 5 1 4 表面模板聚合 1 0 第一章绪论 表面模板聚合法是近年内出现的一种全新的方法。g o t o 等人【2 7 3 4 j 5 1 首先将此 法用于分子印迹技术中。制备过程中，功能单体与印迹分子在乳液界面处配合， 形成的配合物就留在反应界面。交联剂单体聚合后，这种配合物结构就印迹在了 聚合物的表面。因此，这种方法被称为表面模板聚合。其最大特点是由于结合位 点在聚合物表面。 1 5 2 分子印迹聚合物的性能测试 1 5 2 1 色谱法 高效液相色谱法( h p l c ) 是应用最广泛的测试方法。该方法的操作过程是： 将处理好的分子印迹聚合物作为固定相装入色谱柱内，用洗提液洗提，然后将含 有印迹分子的溶液或混合物注入色谱柱内，从扫描仪所记录的图像来分析聚合物 对印迹分子选择性的大小。目前，气相色谱法和毛细电泳色谱法( c e c ) 也有所应 用【3 6 1 ，c e c 在一定程度上改善了液相色谱中吸收峰峰宽较大、强度较弱以及拖尾 现象严重等不利影响。 1 5 2 2 电势测定法 这种方法由m o s b a c h 口7 1 等人提出，其原理是当液体沿固体表面流动时会产生 流动电位，液体浓度的变化将影响流动电位的大小。因此，根据所测定的流动电 位的大小即可得知液相浓度的大小，在特定条件下，就可以确定液相内溶质和固 相之间的亲和作用的大小。其操作过程是，将模板聚合物装入流通池，用含有印 迹分子的溶液或混合物进行洗涤，由电位计读出流通池两端的电压，再推算聚合 物的识别性能。 1 6 分子印迹聚合物的应用 分子印迹聚合物具有制作简单、成本低廉且坚固耐用、适用范围广等优点， 而被誉为“万能的分子识别材料”。这些优点使之能够取代天然的或通过其它方 法获取的具有分子识别性能的材料，如抗体等。目前，分子印迹聚合物已经在很 多方面表现出了良好的应用前景。 1 6 1 分子印迹聚合物固相萃取 目前，利用分子印迹聚合物为基体进行固相萃取成为样品分离的有力手段。 m i p s 用于s p e 的研究已有很多报道，作为s p e 的吸附相，吸附待测物或与其结 第章绪论 构相似的一组化合物，由于待测底物与m i p 识别位点特异性的结合，对待测底物 保留时间或容量因子的不同，通过洗脱，待测物可被分离。与l c 联用，对许多 化合物具有强的对映体选择性，如药物、氨基酸衍生物、多肽和抗体。( 1 ) b j a m a s o n 等人【3 8 】利用一个由分子印迹聚合物和c 。广- s i 组成的组合柱系统从腐殖 质中提取三嚷，表现出极高的萃取效率( 7 4 - - 7 7 ) 。( 2 ) m o l d o o n 等人【3 9 喇用 m i s p e 对牛肝中农药阿特拉津的提取，使萃取极限降低到0 0 0 5 p p m 。在h p l c 检 铡下，精确度达到8 8 7 ，比一般s i d e 的6 0 9 9 6 显示出极大的优越性。( 3 ) z a n d e r 等人m o 以( s ) 一( 一) 一尼古丁为模板合成分子印迹聚合物，成功实现对口香糖中 尼古丁及其氧化物的清除。( 4 ) m l m e n a 等人【4 1 悃一个流动注射系统配以一个 t i p 微柱提供一种简单、方便、快速的方法像对抗蚜威这样环境显著性细小 分析物的预浓缩。一旦它们得到优化，使用分子印迹固相萃取技术相对于其它固 相萃取方法有显著的实际优越性。( 5 ) 徐筱杰等人【4 2 】以骆驼蓬种籽中抗肿瘤活性 化合物哈尔明及哈马灵的结构类似物哈尔满作为模板，用非共价键法制备了对哈 尔明及哈马灵具有强亲和性的分子印迹聚合物，直接分离鉴定了草药骆驼蓬种籽 甲醇粗提物中所含的哈尔明及哈马灵的两种抗肿瘤活性成分。( 6 ) 刘勤等人【4 3 1 采用自制分子印迹聚合物一固相萃取柱对加入甲基磷酸酯的大米样品进行预处 理，杂质干扰小，提取率较高，结果稳定，且自制柱可反复使用十几次而不影响 使用效果。众多研究表明m i p 性能较好，是理想的专用固相萃取材料。 1 6 2 酶模拟 m i p 内的孔穴有类似于酶的活性，且孔穴内可以制定出与底物结合兼有催化 作用的基团，因而m i p 可模拟酶用于催化反应中h 4 , 4 5 l 。用这类催化剂与用酶做催 化剂有许多相似之处，均适合m i c h a e l i s - m e n t e n 动力学，催化活性与k 。k 有 依赖关系( k 。，是催化反应的速率常数，已是结合常数) 。而且，这些酶模拟物具 有制备容易、稳定性好、催化效率高等优点而被用于醅水解反应、d i e l s - a l d e r 反 应和b 一消去等反应中。尽管在催化速度上m i p 还不如天然酶，但它却具备天然 酶所无法可比的许多优点：与有机溶剂良好的相容性，高温稳定性，可设计性等。 因此，m i p 大大补充了天然酶在应用中的不足，丰富了酶催化反应的内容。 1 6 3m l p 膜的传感器 m i p 膜或其表面可以用作化学传感器的基本材料。这些材料要比生物传感器 稳定得多，因此有较长的使用寿命。用能与分子专一结合的m i p 代替以酶或抗 第一章绪论 体为基础的生物传感器的生物元件会得到一个更为强有力的传感单元系统。在许 多情况下不能得到合适的生物分子，而分子印迹技术为某一分子“定做”它的结 合部位有很大的潜力。m o s b a c h 4 6 l s f j 得的吗啡传感器装置，使m p 材料在传感器 上的应用取得了一个很大的突破。 1 7 分子印迹技术的现存问题 分子印迹技术的研究已经取得了一定的进展，在不久的将来m i p 有望在分 离、催化、传感器等领域获得广泛的应用，但仍然存在许多需要进一步研究和解 决的问题。( 1 ) 分子印迹技术的机理研究相对肤浅，对模板分子和聚合物单体功 能基之间的相互作用缺乏系统研究。结合位点的作用机理、聚合物的形态和传质 机理仍然不够明晰，需要进一步深入研究。( 2 ) 多年来分子印迹聚合物的制备研 究主要集中在非水体系中，主要是因为m 口的制备和识别过程多是利用功能单 体与模板分子之间形成的氢键作用，而水被认为是削弱它们之间氢键作用的强极 性溶剂。然而，实际的待识别体系多为水相，分子识别过程也多是在水相中完成 的，天然的分子识别系统，如酶和底物、抗原和抗体、给体与受体等就是在水环 境中进行识别的典型例证，而非水体系制备的分子印迹聚合物在水相环境中的应 用效果较差，故水相中的分子印迹是不容回避的问题。为满足实际应用环境的需 要，进一步拓宽印迹环境，解决水相中的印迹问题日益迫切。( 3 ) 目前可用于制 备m i p 的功能单体、交联剂都有较大的局限性。尤其是功能单体的种类太少以 至于不能满足某些分子识别的要求；交联剂的局限使所得产物均是高度交联的刚 性聚合物，这样的聚合物母体对于体积庞大的生物大分子( 如蛋白质) 的印迹很 不利。因此，研究开发种类更丰富、更有效的功能单体和交联剂是保证分子印迹 技术能够继续高速发展的重要前提。( 4 ) 目前为止，分子印迹聚合物的制备方法 仍以本体聚合和溶液聚合为主，制得的产物通常为块状，需经研磨( 或粉碎) 并 过筛后使用。这种方法虽聚合过程简单，但后续处理工作繁琐、费时，研筛过程 中产品损失严重，而且产物形状不规则，分散性较差。相比之下，分子印迹聚合 物微球( s m i p ) 不仅形状规整、比表面积大、吸附能力强、粒径可根据需要进 行调整，而且后处理工序简单，只需经过模板分子的洗脱便可直接使用。因此， s m i p 的制各和应用研究正成为m i p 研究的熟点。( 5 ) 目前得到广泛使用的模板 主要是氨基酸等小分子化合物，对于多肽、酶、蛋白质和天然药物等生物大分子 的印迹研究报道则很少，且其印迹效果也无法令人满意。这主要是因为这类分子 第一章绪论 的体积庞大，现有的方法很难使之“印”在聚合物上，即便可以“印”上其洗脱 和识别再结合也比较困难，此外这类分子还相当“脆弱”，稍有不慎就可能破碎 或者变性，从而导致印迹失败。这就要求对现有的m p 的制备方法进行革命性 的改进或改变，以满足生物大分子的印迹要求。 1 8 蛋白质分子印迹聚合物 蛋白质是生物体的重要组成部分，存在于一切生物体中，从高等动植物到低 等微生物，从人类到最简单的生物病毒，都含有蛋白质，都是以蛋白质为主要的 组成部分。蛋白质与生命活动有着十分密切的关系，生命现象和生理活动往往都 是通过蛋白质来实现的。当前医学界普遍认为疾病不单单是由某个基因或染色体 的病变造成的，而是与某种蛋白质机体有着更加密切的关系，有时即便组成蛋白 质的所有单个基因都很正常，但机体仍成病态表现，因此继基因研究热以后，蛋 白质再次成为研究的热点。蛋白质分子的检测与分离是蛋白质研究和应用的基 础，但与基因相比，蛋白质的种类相当繁多，其特性也各异，这就给蛋白质的检 测和高纯度分离带来了很大的困难。分子印迹聚合物以其可设计性强、品种丰富、 坚固耐用、成本低廉以及独特的分子识别性能为蛋白质的检测和高纯度的分离带 来了希望，因此也成为当今分子印迹领域最炙手可热的课题之一【4 7 - 6 2 1 。为此，本 节对蛋白质的性能以及当前分子印迹领域对蛋白质印迹的研究进展进行单独介 绍。 1 8 1 蛋白质的种类 根据蛋白质分子的形状，人们将蛋白质分为球蛋白和纤维蛋白。 1 球蛋白：分子似球形，较易溶解。如血液的血红蛋白，豆类的球蛋白等。 2 纤维蛋白：形状似纤维，不溶于水。如指甲、羽毛中的角蛋白，蚕丝的 丝蛋白等。 根据蛋白质分子组成的繁简，也有人将蛋白质分为简单蛋白和结合蛋白。 l 简单蛋白：分子中只含a 一氨基酸，不含其它物质。根据溶解度的不同， 简单蛋白质又可分为白蛋白、球蛋白、谷蛋白、精蛋白、组蛋白等。 2 结合蛋白：由简单蛋白质与非蛋白物质结合而成。酶蛋白中的非蛋白质 部分称为辅基或辅酶。结合蛋白又分为色蛋白、磷蛋白、糖蛋白、脂蛋白、核蛋 白等五小类。 第一章绪论 1 8 2 蛋白质的结构 6 3 - 6 5 1 蛋白质分子的结构单位是氨基酸。组成蛋白质分子的氨基酸只有二十种左 右，主要可分为脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸和杂环氨基酸三大类，其结构可用 图1 8 表示。 c o o h i 图1 1 8 氨基酸的通式 h - - c - - n h 2 。 k f i g 1 - 8g e n e r a ls t r u c t u r eo f a m i n oa c i d 上式具有两个特点：第一，具有酸性的羧基( c o o h ) 及碱性的氨基( n i - - 1 2 ) ， 因而是双性物质或称两性物质。第二，r 基团如不是氢( h ) ，则具有不对称碳 ( 甘氨酸分子的r 为h ，不具有不对称碳) ，因而是光活性物质，有旋光性。第 一个特点使不同氨基酸具有某些共同的化学性质，第二个特点使各种氨基酸具有 共同的物理性质。蛋白质分子的化学结构包括了肽链中氨基酸残基的排列顺序 ( 即一级结构) 、二硫键的连接方式以及辅基的结合方式。蛋白质分子中氨基酸 连接的基本方式是肽键c 0 n h 。最简单的肽是由两个氨基酸分子之间失去1 个 水分子而形成的二肽，即由一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基连接起来， 反应失去一分子水。肽键具有部分双键的性质，其结果使肽键处于一个分子平面 上。任何数目的氨基酸都能以这种方式连接成多肽链，多肽链中氨基酸由于参加 肽键的形式已经不是原来完整的氨基酸分子了，因此称之为氨基酸残基。连续排 列的酰胺平面构成蛋白质分子的主链骨架结构，每个氨基酸残基的r 基团构成 蛋白质分子的侧链基团。 氨基酸的化学性质与其分子结构是分不开的