（环境科学专业论文）具有群体感应抑制活性的海洋细菌的筛选与活性物质研究.pdf

s c r e e nf o rt h eq u o r u ms e n s i n gi n h i b i t o r ya c t i v i t yf r o m m a r i n eb a c t e r i a li s o l a t e sa n dt h es t u d yo fa c t i v ec o m p o u n d s a b s t r a c t t h ep r o b l e mo fb a c t e r i a ld r u gr e s i s t a n c ei sb e c o m i n gs e r i o u sd a yb yd a y s o m ep a t h o g e n i cb a c t e r i a a r ef o u n de a s i l yr e s i s t a n tt ot h et r a d i t i o n a la n t i m i e r o b i a ld r u g s t of u n d a m e n t a l l yr e m o v et h eb a c t e r i a l p a t h o g e n i c i t y ，i ti si m p o r t a n tt ob l o c kt h ee x p r e s s i o no ft h ed i s e a s e - c a u s i n gg e n e sb yb l o c k i n go rc h a n g e t h ei n t e g r a n tp a t h w a yd u r i n gt h ep a t h o g e n i cp r o c e s s t h i sw i l ln o to n l ye l i m i n a t et h eb a c t e r i a l p a t h o g e n i c i t y ，b u ta l s oa v o i dt h ed r u gr e s i s t a n c ep r o b l e m q u o r u ms e n s i n gr e g u l a t e sm a n yp h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n so fb a c t e r i a ，w h e r e a st h em o s tb a c t e r i a lp a t h o g e n i c i t yi sa l s oa f f e c t e db yt h eb a c t e r i a lq u o r u m s e n s i n gs y s t e mr e g u l a t i o n t oe s t a b l i s has c i e n t i f i cs c r e e nm o d e la n df i n ds o m en a t l 蝴p r o d u c t sw i t h b a c t e r i a lq u o r u ms e n s i n gi n h i b i t i v ea c t i v i t yt h r o u g ht h es t u d yo fb a c t e r i a lq u o r u ms e n s i n gs y s t e m , i sa l l e f f e c t i v ew a yi nt h ed e v e l o p m e n to fn o v e la n t i b a c t e r i a ls u b s t a n c e s i nt h i sp a p e r ，w eu s e dc h r o m o b a c t e r i u mv i o l a c e u m12 4 7 2a st h er e p o r t - s t r a i nt os c r e e nf o rt h e q u o r u ms e n s i n gi n h i b i t o r ya c t i v i t yf r o m2 7 2b a c t e r i as t r a i n si s o l a t e df r o mt h es p o n g et i s s u e sc o l l e c t e d a r o u n dt h es a nj u a ni s l a n d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，a m o n gt h ea c t i v es t r a i n s ，b a c t e r i u mn o 6 6a n d n o 10 8h a dt h es t r o n g e s tq u o r u ms e n s i n gi n h i b i t o r ya c t i v i t y t h e s et w ob a c t e r i aw e r et h e ni d e n t i f i e db y u s i n gi6 s r d n aa n a l y s i s t h r o u g ho t h e rs c r e e nm e t h o d s ，t h eb a c t e r i u mn o 10 8w a sc h o s e nf o r t h ef u r t h e rs t u d y t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fn o 10 8w e r eo p t i m i z e d a f t e rt h a t ，e x t r a c to f 10 8a c t i v es t r a i n sw e r es e p a r a t e db yr e v e r s ep h a s ed e c o m p r e s s i o nc o l u m na n dh p l c ，a n dt h e b i o a c t i v ec h e m i c a l sw e r ei d e n t i f i e db yn m ra n dg c - m s n em a i nc o n c l u s i o n so ft h es t u d ya r e a sf o l l o w s ： ( 1 ) d i s cd i f f u s i o na s s a y ，d o u b l e l a y e rs o f ta g a ra s s a ya n dp i g m e n tp r o d u c ei n h i b i t i o na s s a yw e r e c o m b i n du s e dt os c r e e nf o r t h eq u o r u ms e n s i n gi n h i b i t o r ya c t i v i t yf r o m2 7 2b a c t e r i as t r a i n si s o l a t e df r o m t h es p o n g et i s s u e sc o l l e c t e da r o u n dt h es a nj u a ni s l a n d 即1 er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x t r a c t so f17 s t r a i n sh a dh i g h e ra c t i v i t yi nd i s cd i f f u s i o na s s a y , a m o n gt h e m ，s t r a i n sn o 6 6 ，7 4 ，10 8 ，5 5 2 s h o w e dh i g h e s ta c t i v i t yw i t ht h er a d i u so fi n h i b t i o nz o n el a r g e rt h a n2 0m m w h i l ei 1 1 d o u b l e - l a y e rs o f ta g a ra s s a y ，4 0p o s i t i v es t r a i n sw e r ef o u n d m o s to ft h e ma l s os h o w e ds o m e a c t i v i t yi nd i s cd i f f u s i o na s s a y t h ea c t i v i t yo f51 a c t i v ei s o l a t e sw e r ef u r t h e rs c r e e n e db yu s i n g p i g m e n tp r o d u c ei n h i b i t i o na s s a y s t r a i nn o 10 8h a dt h es t r o n g e s ta n ds t a b l ea c t i v i t y ，w h i c hi n h i b i t i o n r a t er e a c h e d2 0 c o m p a r e dt ot h ec o n t r 0 1 c o m b i n dr e s u l t so ft h r e es c r e e nm e t h o d s ，s t r a i n sn o 6 6a n d 10 8w e r ec h o s e nf o ri d e n t i f i c a t i o na n ds t r a i nn o 10 8w a sc h o s e nf o rf u r t h e rc o m p o u n di s o l a t i o ns t u d y ( 2 ) t h e16 s r d n aa n a l y s i sw a sp e r f o r m e dt oi d e n t i f yt w oa c t i v es t r a i n ，n o 6 6a n d10 8 t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt 1 1 e yw e r es i m i l a rt ob r e v i b a c t e r i u me p i d e r m i d i ss w 3 4a n ds t a p h y l o c o c c u s e q u o r u ms u b s p s ，r e s p e c t i v e l y ( 3 ) a c c o r d i n gt ot h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t ，w eo p t i m i z e dt h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa n d m e d i u mc o m p o n e n t so fs t r a i nn o 10 8 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r e f e r m e n tt i m e3 6h ，f e r m e n tt e m p e r a t u r e2 5 ，r o t a t es p e e d1 2 0r p m ，i n o c u l a t i n gq u a n t i t y5 ， p h7 ，m e d i u mc o n t a i n e dp e p t o n e15e d l ，y e a s te x t r a c t5 l ，n a c l15g l ( 4 ) s t r a i nn o 1 0 8w a sf e r m e n t e di nl a r g es c a l e ( 4 5 l ) u s i n go p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，a n d2 9g e x t r a c t sw e r eo b t a i n e df r o mt h ef e r m e n t a t i o nb r o t hb ye t h y la c e t a t e - a c e t o n ee x t r a c t i o n b a s eo n t h e i r p o l a r i t y , t h e e x t r a c t sw e r ep r i m a r i l ys e p a r a t e di n t ot h r e ep a r t s ，n - h e x a n ep h a s e ， d i c h l o r o m e t h a n e ( d c m ) p h a s ea n d6 5 m e t h a n o la q u e o u sp h a s e d i s cd i f f u s t i o na s s a y sw e r e c a r r i e do u tt ot e s tt h eq u o r u ms e n s i n gi n h i b i t o r ya c t i v i t yo ft h et h r e ef r a c t i o n s t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h ed i c h l o r o m e t h a n ef r a c t i o nw a st h em o s te f f e c t i v eo n e r e v e r s ep h a s ed e c o m p r e s s i o n c o l u m n 。w i t ht h ee l u t i o ng r a d i e n to f1 0 、2 0 、4 0 、6 0 、9 5 a n d1 0 0 m e t h o n a li n d i s t i l l e dw a t e rw a sp e r f o r m e dt os e p a r a t et h ea c t i v ed c mf r a c t i o n t h e6 0 m e t h o n a le l u a n t h a dt h es t r o n g e s ta c t i v i t y , w i t ht h ei n h i b i t i o nr a d i u so f7n l l na tt h et e s tc o n c e n t r a t i o no f2 5 0l x g p e rd i s c a r e an o r m a l i z a t i o na n a l y s i so fh p l cs p e c t r u ms h o w e dt h a tt h ep u r i t yo ft h eb i o a c t i v e c h e m i c a lw a s15 9 6 2 t h es t r u c t u r eo ft h es u b s t a n c ew a sp r i m a r l yi d e n t i f i e da sc y c l i c p r o l i n e l e u c i n eb yb l e n d1 hn m r a n dg c - m sa n a l y s i s k e yw o r d s ：c h r o m o b a c t e r i u mv i o l a c e u m ；q u o r u ms e n s i n gi n h i b i t o r ya c t i v i t y ；b i o a c t i v e c h e m i c a l s ；i d e n t i f i c a t i o n 目录 摘要i a b s t r a c t il i 目录。v 第1 章文献综述1 前言。1 刖舌。 1 1 群体感应现象1 1 2 群体感应抑制剂2 1 2 1o s l 的分类2 1 2 1 1 按来源分类2 1 2 1 2 按作用途径分3 1 2 1 3 按分子结构分3 1 2 2c t s l 的筛选方法4 1 2 2 1a h l 降解酶的筛选4 1 2 2 2 具有q s 抑制活性的化合物的筛选5 1 3 海洋微生物活性产物中q s i 的研究现状5 1 3 1 新型药物的研制6 1 3 2 抗海洋污损6 1 3 3 水产养殖病害的防治6 1 4 天然产物研究技术与方法7 1 4 1 天然产物的分离技术与方法7 1 4 2 天然产物的分析技术与方法7 1 5 论文的设计思路及研究目的8 第2 章群体感应抑制活性菌株的筛选及鉴定1o 2 1 材料1 0 2 1 1 测试菌来源1 0 2 1 2 报告菌来源1 0 2 1 3 实验培养基。1 0 2 1 4 主要仪器。1 0 2 1 5 主要试剂。1 1 2 2 方法1 1 2 2 1 海洋细菌培养及纯化1 1 2 2 1 1 海洋细菌的培养1 1 2 2 1 2 海洋细菌的纯化1 l 2 2 1 3 海洋细菌的保存1 l 2 2 2 海洋细菌粗提物的制备1 1 2 2 2 1 海洋细菌的发酵1 1 2 2 2 2 海洋细菌粗提物的制备1 1 2 2 3 群体感应活性的初筛1 2 2 2 3 1 滤纸片法1 2 2 2 3 2 双层软琼脂法1 2 2 2 4 群体感应活性的复筛。1 2 2 2 4 1 色素产量抑制法1 2 2 2 4 2 滤纸片法和双层软琼脂法复筛1 3 2 2 5 海洋细菌提取物对紫色杆菌生长情况的影响1 3 2 2 6 具有群体感应抑制活性的海洋细菌的鉴定1 3 2 3 结果1 4 2 3 1 群体感应活性的初筛。1 4 2 3 1 1 滤纸片法筛选结果1 4 2 3 1 2 双层软琼脂法筛选结果1 5 2 3 1 3 初筛结果小结1 5 2 3 2 群体感应抑制活性的复筛1 6 2 3 2 1 色素产量抑制法筛选1 6 2 3 2 2 滤纸片法和双层软琼脂法复筛结果1 6 2 3 2 3 复筛结果小结1 7 2 3 3 海洋细菌提取物对紫色杆菌生长情况的影响1 8 2 3 4 菌株的鉴定一1 8 2 3 4 1 海洋细菌6 6 的鉴定1 8 2 3 4 2 海洋细菌1 0 8 的鉴定2 0 2 4 讨论与小结一2 1 第3 章群体感应抑制活性菌株发酵条件的优化2 2 3 1 材料2 2 3 1 1 供试菌株2 2 3 1 2 培养基一2 2 3 1 3 主要试剂2 2 3 1 4 主要仪器。2 2 3 2 方法2 2 3 2 1 细菌发酵条件优化2 2 3 2 1 1 发酵时间2 2 3 2 1 2 接种量2 2 3 2 1 3 发酵温度2 3 3 2 1 4 转：速。2 3 3 2 1 5 培养基p h 2 3 3 2 2 培养基成分优化2 3 3 2 3 优化活性测试2 3 3 3 结果2 4 3 3 1 发酵时间优化一2 4 3 3 2 接种量优化2 5 3 3 3 发酵温度优化一2 6 3 3 4 转速优化一2 7 3 3 5 培养基p h 2 8 3 3 6 发酵培养基优化一3 0 3 3 6 1 蛋白胨3 0 3 3 6 2 酵母膏3 1 3 3 6 3n a c l 3 2 3 4 讨论与小结3 3 第4 章群体感应抑制活性物质的分离鉴定3 4 4 1 材料3 4 4 1 1 供试菌株3 4 4 1 2 培养基3 4 4 1 3 主要试剂3 4 4 1 4 主要仪器一3 4 4 2 方法3 4 4 2 1 粗提物的制备3 4 4 2 2 粗提物的初步分离3 4 4 2 3 活性物质的柱层析分离3 4 4 2 3 1 最佳分离条件的选择3 4 4 2 3 2 反相减压柱分离3 4 4 2 4 分离片段的群体感应抑制活性测试3 s 4 2 5 活性物质的鉴定3 5 4 2 5 1h p l c 分析3 5 4 2 5 2 核磁共振分析3 6 4 2 5 3g c m s 分析。3 6 4 3 结果3 6 4 3 1 粗提物的制备3 6 4 3 2 粗提物的初步分离3 6 4 3 3 活性物质的柱层析分离3 7 4 3 3 1 薄层层析分离3 7 4 3 3 2 反相减压柱分离3 9 4 3 4 分离片段活性测试3 9 4 3 5h p l c 分析结果一4 0 4 3 6 核磁共振分析结果一4 1 4 3 7g c m s 分析结果4 2 4 4 本章小结。4 4 第五章结论与展望4 5 5 1 讨论4 5 5 1 1 群体感应抑制活性的测定。4 5 5 1 2 活性菌株的分类鉴定4 6 5 1 3 活性菌株发酵条件的研究一4 6 5 1 41 0 8 活性菌株的活性物质分离4 7 5 2 结论与展望4 7 参考文献。4 9 附图。5 4 致谢5 9 攻读学位期间发表的学术论文目录6 0 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书6 1 丁碧婷具有群体感应抑制活性的海洋细菌的筛选与活性物质研究 1 第1 章文献综述 前言 细菌感染一直威胁着人类的健康，自1 9 世纪晚期德国科学家r o b e r tk o c h 证实了感染 性疾病细菌起源学说起，人们对抗感染性疾病的治疗才有了相对明确的目标，以青霉素为 代表的抗生素的出现使有效治疗各种细菌感染成为可能【l 】。然而，经过半个多世纪的发展， 越来越严重的细菌耐药性问题凸现出来，建立新的治疗模式变得十分必要。目前认为，最 有前景的治疗措施应是清除细胞的致病能力而非损伤细胞，以防抗性突变株的形成。研究 发现，病原菌的致病性是一种被称为群体感应( q s ) 的调控机制控制的，q s 通过介调致 病基因表达以下调致病毒性，帮助免疫系统根除侵染病原菌【2 1 。 海洋生态环境独特，是一个亟待开发的重要生物资源库，海洋微生物种类约为陆生微 生物的2 0 倍以上，各类生物代谢途径各异，可产生完全不同于陆地微生物的结构新颖的 活性物质【3 】。因此，从海洋微生物中寻找具有q s 抑制作用的天然活性物质，已成为抗菌， 抗病毒，抗肿瘤等方面研究的热点。 1 1 群体感应现象 群体感应( q u o r u m s e n s i n g ，q s ) 是由f u q u a 等在1 9 9 4 首先提出的【4 】，是细菌根据自 身细胞密度变化进行自我调节的一种群体行为【5 】。 研究表明，许多细菌能产生一种被称为自诱导物( a u t oi n d u c e r ，a i ) 的信号分子，随着 细菌密度的增加，该类分子也会逐渐积累，到一定浓度时就会与细菌胞浆受体蛋白结合， 调控相关基因的表达，使细菌间形成一种群体行为来有效地抵御环境中的压力，或者攻击 宿主等【6 1 。在一些机会致病菌( 如粘质沙雷氏菌、铜绿假单胞菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、 聚团肠杆菌等) 中，群体感应系统也能调控致病因子的产生，如促进细菌毒素的产生、黏 附以及生物膜( b i o f i l m ) 的形成等【7 1 。大量科学研究表明，群体感应系统的的缺失使菌株的 致病能力大大降低。因此，细菌群体感应系统已成为抗菌抗感染药物研发的新靶标【8 】。 q s 系统调节细菌诸多生理功能，如竞争、共生、发光、抗生素的合成、毒性因子的 释放、胞外多糖的合成和分泌、细菌的聚集以及生物膜的形成等【9 】。有研究报道，海洋生 物膜对某些海洋污损生物( 如h y d r o d e se l e g a n s ，b a l a n a se m p h i t r i t e 等) 的附着有促进作用， 使污损生物的附着污染加剧，而群体感应系统中的信号分子在海洋生物膜的形成、生长和 成熟过程中也起着重要的作用 z o , l q 。 目前发现的细菌q s 系统主要有三类：革兰氏阴性菌的由a h l 介导的l u x i l u x r 型的 2 扬州大学硕士学位论文 群体感应系统、革兰氏阳性茵的由寡肽介导的群体感应系统和杂合型的群体感应系统。 1 2 群体感应抑制剂 群体感应系统对微生物的很多生命活动都具有控制作用，所以关于群体感应抑制剂 ( q u o r u ms e n s i n gi n h i b i t o r , q s i ) 的研究也越来越多。 1 2 1q s i 的分类 1 2 1 1 按来源分类 ( 1 ) 天然来源的q s i 自然界中的植物和微生物中已经分离到了很多种q s i 。由于植物和微生物与q s 细菌 共同生活了千百万年，所以我们有理由相信其中的某些种属能够产生q s i 来抑制细菌的繁 殖、竞争以及感染性微生物的致病能力。首先被发现具有q s i 抑制活性的天然产物是红藻 d e l i s e a p u l c h r a 代谢产生的溴化呋喃，在很多细菌中能够有效抑制q s 系统，大幅降低生物 膜对抗生素的敏感性【1 2 】。 植物中，多变小冠花、胡萝b 、大豆、荷花、番茄、豆苗、红辣椒、大蒜等能够产生 化合物来干扰微生物的q s 系统 1 3 , 1 4 。进一步研究表明，大蒜提取物包含至少3 种q s 抑 制物，其中之一为环状的二硫化合物，该化合物对l u x r 为基础的q s 具有很强的作用， 但对于只a e r u g i n o s a 中的q s 没有作用【1 3 】。 ( 2 ) 人工合成的q s i 以天然信号分子的化学结构为模板人工合成q s i 已成为获得q s 抑制剂的重要途径， 其中一些小分子化合物在q s 系统中对信号分子的竞争性抑制效果已经得到验证【1 5 】。 结构类似物：一般而言，通过人工合成途径获得a h l 结构类似物的方式主要有三 种：在内酯环中引入取代基或替代物同时维持酰基侧链不变、在酰基侧链中引入取代基同 时保持内酯环结构不变、在酰基侧链和内酯环中同时进行结构的修饰。 非结构类似物：r a s m u s s e n 等采用q s i s 筛选体系，获得了几种与信号分子结构不相 关的q s i 化合物16 1 ，如4 硝基吡啶n 氧化物( 4 n p o ) 、吲哚、2 ，4 ，5 三溴咪唑、p 苯 醌等，其中3 硝基苯磺酰胺和吲哚是首先被证实具有q s i 活性的非结构类似物。实验表明， e c o l i 中杂合l u x r 的q s 体系能被4 - n p o 所阻断，其结构对pa e r u g # l o s a 菌中的l a s b - g f p 融合体也有类似的阻断作用，能够显著降低尸a e l 2 1 9 i n o s a 菌中3 7 以上的q s 介调基因的 表达，包括一些已知的毒素因子【1 6 1 。 丁碧婷具有群体感应抑制活性的海洋细菌的筛选与活性物质研究 3 1 2 1 2 按作用途径分 目前已经发现通过许多途径可以干扰细菌的群体感应系统，并减弱与细菌耐药性相关 因素的产生。大致有以下三种： ( 1 ) 产生a h l 降解酶使a h l 分子灭活，从而使病原菌q s 系统不能启动它所调控的 基因，例如a h l 1 a c t o n a s e ，可以破坏酞基高丝氨酸内酯类分子的高丝氨酸内酯环使之失活 1 7 , 1 8 。又如a h l a c y l a s e ，则可以使酞基高丝氨酸内酯类分子n 酞基的碳链上的酞氨键水 解使之失活【1 9 2 0 1 。 ( 2 ) 利用q s 系统中的信号分子来诱发抗性，这在植物中比较常见。 ( 3 ) 产生病原菌信号分子的类似物与信号分子受体蛋白竞争性结合来阻断病原菌q s 系统。 近年来相关研究主要集中在下面两种q s 系统。 1 2 1 3 按分子结构分 到目前为止，科学家通过从自然界发掘或者人工合成的途径，已经得到多种群体感应 抑制剂，根据其化学结构的不同以及抑制的q s 信号不同，可以划分成以下几种【2 1 】： ( 1 ) 吡咯酮类化合物 作为与呋喃酮类相似的先导化合物，吡咯酮类化合物在q s i 的研究方面也有不小的成 果。k a u f m a n n 等【2 2 】合成的吡咯二酮可以破坏细菌生物膜的形成过程，从而抑制细菌信号 交流过程。 ( 2 ) 二酮呱嗪类化合物 二酮呱嗪类化合物在高浓度情况下能交叉作用于一些a h l - 生物传感器，对高等生物 体细胞有相当高的生物学和药理学作用。例如d k p s ，c y c l o ( l - p r o l t y r ) 等化合物能对 s z q u 咖c i e n s 利用q s 系统调控的群居现象起到拮抗作用【2 3 1 。 ( 3 ) 呋喃酮类化合物 m 觚n y 等通过实验合成到一种化合物呋喃酮5 6 ，该化合物能阻断a h l 分子和受体 蛋白的结合，从而有效抑制q s 系统作用；h c m z c r 等【8 1 合成得到一种新的呋喃酮衍生物 c 一3 0 ，用于阻断尸a e r u g i n o s a 的q s 系统的作用，使细菌对抗生素的敏感性显著增强。 ( 4 ) a i p 类化合物 研究表明，合成细菌a t p 信号分子的类似物与细菌蛋白抢断性结合能有效抑制其q s 系统的作用，例如合成金黄色葡萄球菌群体感应所需的a t p 分子类似物参与反应，破坏其 q s 系统，能有效减弱其病原菌的致病性【2 5 ，2 6 1 。 4 扬州大学硕士学位论文 ( 5 ) 取代的h s l 类化合物 科学家们通过研究证实，经过取代的h s l 化合物也能与a h l 受体蛋白抢断性结合， 从而抑制a h l 反应的启动，实现对q s 现象的抑制作用【2 7 1 。 ( 6 ) 激素类 哺乳动物体内产生的一些激素能与细菌群体感应系统中的受体相结合，促使细菌毒性 因子的释放。s p e r a n d i o 等2 8 1 研究表明哺乳动物的肾上腺素和去甲肾上腺素具有替代埃希氏 菌在群体感应过程中所需的a i 3 的作用，两者都可以与细胞外膜中同种受体相结合，实现 毒性因子的表达。 ( 7 ) 其他类 除了上述结构的q s i ，研究表明更多结构【2 9 1 、作用机制不同的新型q s i 也在陆续发现 与合成中。 1 2 2q s i 的筛选方法 目前已出现很多种筛选q s i 化合物的方法，其中最常用的方法是利用ai 报告菌来分 析和检测待筛选化合物，从而获得具有相关活性的q s i 3 0 1 。该m 报告菌由不包括l u x i 同 系物的q s 体系构成，系统中的q s 介调启动因子会与报告基因相融合。当有外源信号分 子存在时，启动因子被外源信号分子诱导，使报告菌的报告基因得以表达；而当外源信号 分子和q s i 同时存在时，q s 介调启动子的转录活性将被抑制，导致报告基因的表达减弱 或丧失。 1 2 2 1a i ：i l 降解酶的筛选 a h l 降解酶的筛选通常是通过检测其底物信号分子的浓度变化来实现的，由于信号分 子的浓度极低，一般手段无法检测出来。近年来国内外广泛采用了对扩散性信号分子较为 敏感的微生物作为生物检测菌，能够快速检测出信号分子的存在。多数用于生物监测的菌 是无法自身合成a h l 的突变株的，所以只有在加入外源a h l 后才能表现出野生型的表型。 例如紫色杆菌筛选模型，c h r o m o b a c t e r l e rv i o l a n c e u m 紫色杆菌素的产生由a h l 调节， 菌株c v 0 2 6 是不产生紫色杆菌素的最小化的t n 5 突变株，但它在含有外源a h l s 的培养基 中培养时可积累产生紫色杆菌素。利用c v 0 2 6 的这一特性，在培养的过程中加入a h l s ， 帮助其产生紫色杆菌素，然后对不同种类的化合物进行筛选，若发现能有效抑制其色素产 生的化合物，则说明该化合物中含有降解外源a h l s 的物质3 1 1 。 特定微生物q s 抑制活性的强弱可由检测系统中信号分子a h l s 的量的变化来表征， 相应的检测方法有h p l c 法( 高效液相色谱法) 、e s i 。m s 法( 电喷雾质谱法) 、t l c 法( 薄 丁碧婷具有群体感应抑制活性的海洋细菌的筛选与活性物质研究 5 层色谱法) 、琼脂平板生物检测法等3 2 1 。 1 2 2 2 具有q s 抑制活性的化合物的筛选 袁茵等【3 1 】利用根癌农杆菌平板筛选模型从2 1 7 株海洋细菌中筛选出1 株能显著抑制 细菌群体感应效应的海洋细菌y 2 ，该海洋细菌具有蜡样芽孢杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 的典型 特征，能有效降解根癌农杆