（材料学专业论文）壳聚糖明胶无毒交联体系的建立及其生物相容性评价.pdf

摘要 壳聚糖是一种氨基多糖，明胶为蛋白质，从仿生角度出发，二者在生物医学 领域均具有广泛的应用前景，而它们常采用的传统交联方法大都使用化学合成类 交联剂，而这类交联剂本身均具有很高或相对较高的细胞毒性，导致所得的生物 材料在植入人体以后，会影响受体f 常组织的生长。本文从降低交联剂对交联制 品毒性的角度出发，一方面通过壳聚糖与乳酸接枝共聚反应，成功制得了未添加 任何交联剂的壳聚糖一聚乳酸( c l ) 凝胶，并对其网络结构、力学性能、生物相容 性等进行了研究，结果表明c l 凝胶不仅具有较高的力学强度，更具有良好的生 物相容性；另一方面通过对交联剂的筛选，制备了以天然化合物一京尼平为交联 剂的壳聚糖凝胶、明胶凝胶及壳聚糖一明胶复合凝胶，并对其力学性能、溶胀性 能及生物相容性进行了研究，结果表明京尼平作为交联剂有良好的生物相容性， 从而建立了壳聚糖、明胶无毒化的交联方法：据此又制备了以京尼平为交联剂的 壳聚糖支架、明胶支架、壳聚糖一明胶复合支架，并对支架的孔隙率、力学性能 及形貌进行了研究，开发出了可望用于组织工程的支架材料。 关键词：壳聚糖：明胶；聚乳酸；凝胶；京尼平；支架 a b s t r a c t a sag l y c o s a m i n o g l y c a na n dp r o t e i n ，c h i t o s a na n dg e l a t i nh a v ee x t e n s i v e a p p l i c a t i o nf o r e g r o u n di nt h eb i o m e d i c a lf i e l d i no r d e rt or e d u c et h et o x i c i t yo ft h e n o r m a lc h e m i c a lc r o s s l i n k e ro fc m t o s a na n dg e l a t i n ，s u c ha sg l u t a r a l d e h y d e ，f i r s t l y c h i t o s a n g p o l y ( 1 a c t i ca c i d ) h y d r o g e l sw e r ep r e p a r e db yt h eg r a f tc o p o l y m e r i z a t i o no f c h i t o s a nw i t hl l a c t i ca c i dw i t h o u ta n yc r o s s l i n k e r u s i n gj r , x p sa n dk i n e t i cc o n t a c t a n g l ea n a l y s i s ，c lh y d r o g e l sw e r ec h a r a c t e r i z e d t h em e c h a n i c a lp r o p e r t i e sa n d c y t o c o m p a t i b i l i t yo fc lh y d r o g e l sw e r ea l s oi n v e s t i g a t e d t h er e s d t ss h o w e dt h a tt h e c r o s s l i n k i n go fc h i t o s a nr e s u l t e df i o mt h eh y d r o p h o b i ca s s o c i a t i o no ft h es i d ec h a i n s o fo l i g o ( 1 a c t i ca c i ms e g m e n t s t h em e c h a n i c a ls t r e n g t ho fc lh y d r o g e l sc o u l db e a d j u s t e db yt h ef e e dr a t i oo fl a c t i ca c i dt oc h i t o s a na n dt h ec y t o c o m p a t i b i l i t yo ft h e h y d r o g e l sw e r ef i m i l a r 诵mc h i t o s a no rg e l a t i nt h e m s e l v e s s e c o n d l y , c h i t o s a n g e l a t i na n dc h i t o s a n - g e l a t i nc o m p l e xg e l sw e r ep r e p a r e dw i t han a t u r a lc r o s s l i n k e r - - - g e n i p i n t h em e c h a n i c a l ，s w e l l i n gp r o p e r t i e sa n dc y t o c o m p a t i b i l i t yo ft h eg e l sw e r e i n v e s t i g a t e du s i n gg l u t a r a l d e h y d e a sc o n t r 0 1 i tw a sf o u n dt h a tt h em e c h a n i c a l p e r f o r m a n c ea n dc y t o c o m p a t i b i l t yo ft h eg e n i p i nc r o s s l i n k e dg e l sw e r ei m p r o v e d s i g n i f i c a n t l y s ot w od i f f e r e n tn o n t o x i cc r o s s l i n k i n gm e t h o d sf o rc h i t o s a na n dg e l a t i n w e r ee s t a b l i s h e d f i n a l l y , c h i t o s a n ，g e l a t i na n dc h i t o s a n - g e l a t i nc o m p l e xs c a f f o l d s w e r ef a b r i c a t e dt h r o u g hf i e e z e d r y i n gu s i n gg e n i p i na sc r o s s l i n k e r t h ep o r o s i t y , m e c h a n i c a lp e r f o r m a n c ea n dm o r p h o l o g yo ft h es c a f f o l d sw e r ei n v e s t i g a t e da n dt h e r e s u l t s s u g g e s t e dt h a t t h eo b t a i n e ds c a f f o l d sh a v ep r o m i s i n gp o t e n t i a li nt i s s u e e n g i n e e r i n g k e yw o r d s ：c h i t o s a n ；g e l a t i n ；p o l y ( l - l a c t i ca c i d ) ；g e l ；g e n i p i n ；s c a f f o l d 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨洼盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 闳五漓 签字日期：加口岁年月，扩1 7 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解鑫盗盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫洼盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： ? 弛哥 签字r 期：如d s 年，月，孑日 翩签名：溯嘭誊 签字日期：岖年己胡扩r 第一章前言 第一章前言 壳聚糖来源丰富，制备简单，价格便宜，具有良好的物理化学性质。壳聚糖 同时含有氨基和羟基，通过对二者的修饰反应可形成不同结构和不同性能的衍生 物。壳聚糖及其衍生物具有无毒的特点和良好的生物相容性，在生物医学及制药 方面的应用极其广泛。胶原是动物体内含量最丰富的蛋白质，属于不溶性纤维蛋 白质，遍布于体内各种器官和组织，如皮肤、骨、软骨、肌腱、角膜等。明胶是 胶原部分变性衍生物，它主要由独特的氨基酸序列甘氨酸一脯氨酸一羟基脯氨酸组 成。这些序列使明胶可固定水分子而形成螺旋结构。 壳聚糖和明胶都是生物相容性良好的天然聚合物，能与交联剂反应形成交联 杂混聚合物网络，在组织工程等医学领域有着良好的应用，但由于传统交联方法 大都使用戊二醛等化学合成类交联剂，这类交联剂本身均具有很高或相对较高的 细胞毒性，导致使用它们进行交联处理的生物材料在植入人体以后，一定程度上 影响了受体正常组织的生长，进而影响到创口的愈合和功能的恢复。本文从减小 交联剂的毒性入手，一方面利用聚乳酸接枝壳聚糖后，疏水性聚乳酸链的互相聚 集会对壳聚糖起到物理交联的作用，以期获得不加任何交联剂且力学性能、生物 相容性良好的凝胶材料：另一方面挑选天然化合物京尼平作为壳聚糖、明胶的交 联剂，以期获得力学性能、生物相容性良好的凝胶材料。 组织工程的核心是构建由细胞与细胞支架结合的复合体，从临床应用的角度 出发，理想的细胞支架应具有一定的生物降解速度、良好的生物相容性和细胞亲 和性、有一定的力学性能、能灭菌消毒、具有特定三维多孔结构。据此我们以京 尼平为交联剂制备了壳聚糖支架、明胶支架、壳聚糖一明胶复合支架，以期获得 可望用于组织工程的支架材料。 第二章文献综述 第二章文献综述 2 1 壳聚糖 2 1 1 壳聚糖的结构性质 壳聚糖( c h i t o s a n ) 是甲壳素的脱乙酰化产物，又称脱乙酰甲壳素、甲壳胺， 它的来源广泛，性质稳定，生物相容性和可降解性好，毒性极小，应用范围广 泛1 。近年来，有关壳聚糖的研究开发己成为基础研究前沿学科和高新技术产业 热点之一，每年发表论文数万篇，在口本每隔三天就申报颂甲壳素壳聚糖应 用专利罔。 壳聚糖，n p 3 ( 1 ，4 1 - 2 氨基- 2 去氧d 葡萄糖胺，是一种阳离子聚合物，在 1 3 5 分解，可溶解于有机酸及弱酸稀溶液中。壳聚糖具有复杂的双螺旋结构， 其螺距为0 5 1 5 r i m ，一个螺旋平面由6 个糖残基组成。其大分子链上分布着许多羟 基、氨基和乙酰氨基，它们会形成分子内的氢键一o h o 一型及一o h n 一 型从而导致大分子的二级结构；这将使得壳聚糖大分子之间存在一定的有序结 构脚。根据晶态结构的不同，可以分为n 、p 和t 三种多晶型物。这其中一壳聚糖是 由两条反向平行的糖链组成；i 3 - 壳聚糖是由曲条唰向平行的糖链组成；3 - 壳聚糖 是由三条糖链组成，两条同向，一条反向。其中，b 壳聚糖在6 m o l l 的盐酸中回 转变成为壳聚糖，这说明q 一壳聚糖对酸是稳定的州。 壳聚糖具有较多的侧基官能团，可在伯胜基、伯羟基、仲羟基上进行多种化 学反应，可像纤维素一样进行酯化、醚化、氧化、磺化以及接枝交联等反应对其 改件。例如，用甲壳素与环氧乙烷在高温、高压下反应制各的羟乙基化甲壳素可 溶于水、3 的乙酸和5 的氢氧化钠，具有良好的吸湿保湿性，适用于化妆品， 可使头发具有自然光泽；利用c o - 射线在水和v 醇巾引发羟乙基丙烯酸酯接枝壳 聚糖的反应，接枝产物相对壳聚糖柬说与血液的相容性有了很大的提高。特别是 磺化产品，其结构与肝素极茛相似，可作为肝素的代用品，用作抗凝血剂。聚乙 烯醇( p v a ) 与壳聚糖共混，可以提高壳聚糖膜的选择性和延展性，该膜可以用 作维生素b 1 2 渗透膜。若在菇混的同时加入蔗糖、山梨醇与水可蚍起到增塑的作 用，膜的伸长率和水蒸气的渗透性都大大提高，共混物的熔点可以降低n l o o 。c 用，膜的伸长率和水蒸气的渗透性都大大提高，共混物的熔点可以降低到l o o 2 第二章文献综述 第二章文献综述 2 1 壳聚糖 2 1 1 壳聚糖的结构性质 壳聚糖( c h i t o s a n ) 是甲壳素的脱乙酰化产物，又称脱乙酰甲壳素、甲壳胺， 它的来源广泛，性质稳定，生物相容性和可降解性好，毒性极小，应用范围广 泛【i 】。近年来，有关壳聚糖的研究开发已成为基础研究前沿学科和高新技术产业 热点之一，每年发表论文数万篇，在日本每隔三天就申报一项甲壳素壳聚糖应 用专利【2 1 。 壳聚糖，b 1 1 3 ( 1 ，4 ) - 2 氨基2 去氧d 一葡萄糖胺，是一种阳离子聚合物，在 1 8 5 。c 分解，可溶解于有机酸及弱酸稀溶液中。壳聚糖具有复杂的双螺旋结构， 其螺距为0 5 1 5 r i m ，一个螺旋平面由6 个糖残基组成。其大分子链上分布着许多羟 基、氨基和乙酰氨基，它们会形成分子内的氢键一o h o 一型及一o h n 一 型从而导致大分子的二级结构。这将使得壳聚糖大分子之间存在一定的有序结 构1 3 】。根据晶态结构的不同，可以分为a 、p 和t 三种多晶型物。这其中a 一壳聚糖是 由两条反向平行的糖链组成；1 3 - 壳聚糖是由两条同向平行的糖链组成；y 壳聚糖 是由三条糖链组成，两条同向，一条反向。其中，b 壳聚糖在6 m o l l 的盐酸中回 转变成为a 壳聚糖，这说明旺一壳聚糖对酸是稳定的 4 】a 壳聚糖具有较多的侧基官能团，可在伯胺基、伯羟基、仲羟基上进行多种化 学反应，可像纤维素一样进行酯化、醚化、氧化、磺化以及接枝交联等反应对其 改性。例如，用甲壳素与环氧乙烷在高温、高压下反应制各的羟乙基化甲壳素可 溶于水、3 的乙酸和5 的氢氧化钠，具有良好的l 及湿保湿性，适用于化妆品， 可使头发具有自然光泽；利用c o 射线在水和甲醇中引发羟乙基丙烯酸酯接枝壳 聚糖的反应，接枝产物相对壳聚糖来说与血液的相容性有了很大的提高。特别是 磺化产品，其结构与肝素极其相似，可作为肝素的代用品，用作抗凝血剂。聚乙 烯醇( p v a ) 与壳聚糖共混，可以提高壳聚糖膜的选择性和延展性，该膜可以用 作维生素b 1 2 渗透膜。若在共混的同时加入蔗糖、山梨醇与水可以起到增塑的作 用，膜的伸长率和水蒸气的渗透性都大大提高，共混物的熔点可以降低到1 0 0 第二章文献综述 左右i ”。 2 1 2 壳聚糖的应用 壳聚糖是天然多糖中唯一的碱性多糖，具有许多独特的物理化学特性和生物 功能。壳聚糖及其分解产物无毒性，具有生物相容性和生物可降解性，有抗菌消 炎、促进伤口愈合、抗酸、抗溃疡、降血脂和降胆固醇等多种作用，经硫酸化后， 能转变成肝素类似物还能起到抗凝血作用 8 】。由于肿瘤细胞具有比正常细胞表面 更多的负电荷，因此壳聚糖在酸性环境中对肿瘤细胞表面具有选择性吸附和电中 和作用，可直接抑制肿瘤细胞的生长，通过活化免疫系统显示抗癌活性，与现有 的抗癌药物合用可增强药物的抗癌效果。 2 1 2 1 缓释微球 常采用壳聚糖一海藻酸盐以复凝聚法制备微球。壳聚糖是阳离子聚合物，海 藻酸是阴离于聚合物，二者可形成复合凝胶。从而增强囊膜的强度及抑n 4 , 球的 崩解，使药物溶出缓慢。s e z e r a d 9 等研究了壳聚糖一海藻酸凝胶小球对低分子 量的水溶性药物的缓释作用。以噻吗心安马来酸盐为模型药物，用离子交换凝胶 法制备小球。影响小球生成的因素有：海藻酸、壳聚糖和氯化钙的浓度，内相及 外相的体积，干燥方法等。结果表明用壳聚糖处理的海藻酸凝胶小球载药率高， 药物释放慢，与海藻酸凝胶小球相比，对低分子量水溶性药物的控制释放更好。 r i b e i r oa j l l 0 1 等研究了亲脂性药物的壳聚糖海藻酸微球。将亲脂性药物溶于大豆 油中，分散于含有碳酸钙微晶的海藻酸溶液中，然后在硅油中乳化形成o w o 乳剂，加入一种脂溶性酸使钙从碳酸盐中游离出来，使海藻酸凝胶化，形成的 海藻酸微球再包以壳聚糖膜，从而提高微球在人工肠液中的机械强度和稳定性。 微球的平均直径为5 0 0 8 0 0 n m ，包封率为6 0 8 9 。在人工胃液中很少释放， 一旦转移至人工肠液则开始释放。不包衣的微球释放水平较高，包壳聚糖衣的微 球释放速率比较慢，表明壳聚糖海藻酸微球适于油溶性药物的缓释给药系统。 r a m d a sm 1 等用溴百里酚蓝为模型药物，发现用聚丙烯酸，海藻酸和壳聚糖制 备的微球在胃酸条件下不释放，而在肠道长时间释放，显示有生物粘附性，体外 释放可长达8 天。药物长期停留在适当的地方，能产生最大的药理活性，这为口 服胰岛素、口服5 一f u 缓释肠道给药制剂的可行性提供了依据 1 2 】。 第二二章文献综述 另外，还可将壳聚糖制成中空纤维，两端封口，药物灌装于其中，即成埋植 制剂。特别适合于蛋白质、抗菌素、抗癌药、避孕药等，使药物均匀缓慢释放。 2 1 2 2 壳聚糖在组织工程方面的应用 壳聚糖在组织工程方面也有广泛的应用。组织工程学是8 0 年代由l a n g e r 和 v a c a n t i 首先提出的新概念，其基本原理是通过种子细胞附着在生物材料表面， 形成一个生物活性的种植体，当植入病变部位，生物材料降解吸收时，新的组织 或器官就形成，达到修复或重建缺损的组织或器官。其核心是构建细胞和生物材 料的三维复合材料，所用生物材料是一个关键，其基本要求是材料的生物相容性 好、无毒、易生物降解等。壳聚糖除具有上述特点外，还含有氨基葡萄糖基元， 与调控软骨细胞再生的胶原和糖胺聚糖的结构相似，因此，壳聚糖可用作软骨组 织细胞附着的支架材料。s u hjk 等对此做了比较全面的论述1 1 3 ，他们将软骨细 胞种植在由壳聚糖与硫酸软骨素形成的水凝胶上，并与聚苯乙烯培养板作对照， 发现前者附着的软骨细胞呈球形或聚多边形的正常形态，分泌的胶原主要是i i 型，而对照体附着的软骨细胞呈纤细状，形成的胶原主要是i 型。扫描电镜的结 果说明种植的软骨细胞的表面与支架材料有特殊的相互作用。壳聚糖还可用作皮 肤组织和骨组织的支架材料。如一种骨生长因子b m p s 与改性的壳聚糖形成杂化 材料时由于机体壳聚糖的降解，释放出的b m p s 促进了骨缺损处的骨组织再生。 此外由于壳聚糖无毒，生物相容性良好，可被溶菌酶降解，是一种性能较好的体 内植入性生物材料1 4 】。用壳聚糖制成的“人造皮肤”，与宿主亲和性好，柔软度适 宜、与创伤面结合密实，可以吸收从伤口渗出的体液，缓解疼痛。此外，壳聚糖 还可制成手术缝合线【1 ”，不仅强度好，易打结，伤口愈合后不用拆线，还能抑制 炎症细胞向创伤周围组织的浸润，加速伤口愈合。 2 2 明胶 2 2 1 明胶的结构性质 明胶( g e l a t i n ) 是胶原的水解产物，成品为无色或淡黄色的透明薄片或微粒。 是一种不均一的具有高平均分子量的水溶性蛋白质混合物，其分子链上包含1 8 种氨基酸，其中7 种为人体所必需。除1 6 以下的水分和无机盐外，明胶中蛋白 质的含量占8 2o 0 0 以上【6 1 ，是一种理想的蛋白源。 4 第二章文献综述 明胶侧链基团有很高的化学活性，在结构上不出现明显的内部有序，而在水 溶液中，当温度升高时，呈现无规构象。明胶不溶于冷水，但可缓慢吸水膨胀软 化，明胶可吸收相当于其重量5 1 0 倍的水；可溶于热水，形成热可逆性凝胶。 由于明胶大分子链具有聚电解质的性质，因此有较为明显的胶体保护性，此外它 还有很强的表面活性，吸水膨胀性，极好的成膜性等。极高的技术、经济价值使 明胶长期以来被应用于感光材料、医药、食品、印刷、造纸、月用化工等领域1 7 l 。 2 2 2 明胶的应用 动物胶特别是明胶用途极为广泛，目前我国已有三四十个行业用明胶作配套 材料，如医药、感光材料、食品、化工、纺织品、化妆品等部门，用量直线上升。 但国内目前产量仅能满足总消费量的十分之三，供需矛盾相当突出。 ( 1 ) 医药原料：在医药上，明胶血浆代用品有氧化聚合明胶、变性液化明胶、尿 素多联明胶等用于抗休克药物。吸收性明胶海绵是采用优质药用明胶为原料，配 制成适宜的胶液，进行打泡，并加入一定量的甲醛溶液作硬化剂，然后经冻结、 干燥、灭菌、无菌包装制得。它具有优良的止血特性，又能被机体组织吸收，因 此，在平时和战时广泛用于各种外科止血。 ( 2 ) 制剂中的作用：药物制剂中，常用作延效剂( 长效a c t h ) 、药物基质( 栓剂) 和生化药物冻于剂的支持剂。作为药物赋形剂( 胶囊剂) 是以食用明胶为主要原 料，辅料有甘油、琼脂、食用色素、防腐剂等，模压成空胶囊，即胶丸，可用来 做药物的内服包装丸，如速效感冒丸、氟哌酸胶丸等。胶囊剂不仅外表整洁美观， 容易吞服，而且可掩饰药物不适的臭味、苦味、异味；并且在胃内崩解快，一般 服后l o 分钟即能崩解释放药物，疗效比片剂更快。某些药物需要到肠中呈现药效 时，可制成肠溶胶囊剂。因此明胶在药物制剂中的应用极有发展前途【1 8 l 。 ( 3 ) 组织工程中的应用：组织生长是复杂的调控过程，细胞外基质( e c m s ) 中含 有许多生长因子，生长因子与细胞间的相互作用决定了细胞的锚定、迁移和生长 1 9 1 。发育、生长的组织会和一系列不同的调节剂发生相互作用，此作用都和细胞 表面特异的受体与e c m s 上的配体相联系，这些作用可调控细胞的增殖或凋亡。 构筑完善的组织工程装置，常需要提供细胞生长的微环境及力学环境，使生物材 料与细胞相互作用，以促进组织生长。生长因子在细胞增殖与分化的不同阶段会 第二章文献综述 对组织再生发挥作用。但是大部分水溶性生长因子在体内半衰期很短，不会持续 地发挥其作用。明胶会与荷电性相反的信号分子通过离子问的相互作用，形成聚 电解质配合物( p e c s ) 。明胶凝胶与生长因子的p e c s 较稳定，而且负载的生长因子 会随明胶在体内降解，实现生长因子的控制释放。o z e k i 等把明胶经戊二醛交 联后形成的水凝胶作为肝细胞生长因子( h g f ) 的载体，通过改变交联度来改变明 胶的降解，以调节生长因子的释放【2 ”。 2 3 聚乳酸及其在骨组织工程中的应用 聚乳酸( p l a ) 是一种重要的生物降解材料，其在生物体内可以降解且无毒、 生物相容性好，在药物缓释材料、体内植入材料、手术缝合线、骨科固定材料、 组织工程材料等医学领域都有很好的应用。其中，聚乳酸类复合材料在骨科固定 材料、组织工程材料等医疗领域的应用研究同渐深入，新的成果层出不穷，越来 越受到人们的关注【2 2 j 。 邓先模【2 3 1 等将高分子量聚乳酸用于狗骨固定，治疗效果良好。用聚羟基乙酸 纤维、碳纤维、氢氧化铝、羟基磷灰石等增强聚乳酸，可大幅度提高固定材料的 初始强度，具有相当的承载能力，可与金属螺钉的强度相媲美。 在骨组织工程领域中，经常使用的生物活性有机成分有：磷脂、同种异体骨、 异种骨、骨形成蛋白、去矿化骨等。它们具有高效骨诱导活性，但是当它们被单 独植入生物体内时，由于容易被生物体吸收，而难以充分发挥其高效骨诱导活性 的作用。因此，近年来人们将这些生物活性有机组分与聚乳酸复合作为修复材料， 发现这些复合物的骨修复能力显著增强。例如将生物活性玻璃( b g ) 与聚乳酸进行 复合，以庆大霉素为消炎药，获得的复合材料在植入人体后可同时诱导骨生长并 防止炎症感染，控制临床并发症的发生 2 4 1 。 作为一种重要的复合生物材料，聚乳酸类复合材料的应用领域虽然涉及骨折 内固定材料、组织工程支架材料、填充材料和抗凝血材料等方面，但主要应用于 骨修复领域，这是因为生物相容性好的聚乳酸类复合材料无需二次手术、与骨组 织的机械相容性好，不会释放金属离子而带来一系列不良反应，可以减少病人的 痛苦。因此，虽然目前金属材料在骨修复方面使用最广泛，但聚乳酸类复合材料 j “阔的应用前景是不可估量的。 第二审文献综述 2 4 新型交联剂京尼平 2 4 1 交联剂与生物医学 随着现代医学技术和生物技术的不断发展，异体、异种生物组织的应用变得 越来越广泛了。许多的异种生物组织，如心脏瓣膜、血管以及韧带等，已经被普 遍的应用于各种移植手术中【2 5 1 。为了减少植入组织的免疫原性，提高所利用的生 物组织的稳定性和持久性，在使用前需对这些植入组织进行处理，包括物理处理 和化学处理。物理处理的方式主要有加热、干燥、辐射( 紫外线或y 射线) ，而化 学处理就是应用各种化学试剂交联剂对生物组织进行固定处理。 通过交联剂的化学修饰，减少了植入物的抗原性，提商了机械强度和抵抗受 体组织降解的能力。在当前的实际应用中，较为常用的交联剂有甲醛、戊二醛、 二醛基淀粉和环氧化合物等。这些化学合成的交联剂在处理生物组织方面各有所 长，但它们的一些缺点也是有目共睹的：由于这些交联剂都是化学合成的，其本 身均具有很高或相对较高的细胞毒性1 2 6 2 7 1 。这导致了使用它们进行交联处理的 生物组织在植入人体以后，在一定程度上影响了受体正常组织的生长，进而影响 了创口的愈合和功能的恢复。 由于化学合成的交联剂存在着缺陷，研究人员一直致力于各种新的交联方式 及交联剂的研究开发。一方面，通过各种途径努力的减少现有交联剂的细胞毒性； 另一方面，一些新型的交联剂被逐步的认识并应用到生物医学领域之中，京尼平 ( g e n i p i n ) 就是它们的代表【2 8 】。 2 4 2 京尼平 2 4 2 1 京尼平的来源 京尼平是传统中药杜仲的活性成分之一，是从京尼平甙中分离、提纯而获得 的。杜仲是属于杜仲科的一种落叶乔木，为我国特产，主要分布于中西部地区。 在传统中医草药学中以其树皮入药，性温、味甘，京尼平和它的环烯醚萜化合物 常被作为一种消炎利胆药应用于治疗各种肝胆疾病( 可以促进胆汁的分泌) 和感 染症状。 2 4 2 2 与其它化学交联剂的比较 要想成为一种理想的、能够应用于生物医药领域的交联剂，其首要的特点是 第二章文献综述 能够形成稳定而持久的交联制品。以猪动脉瓣膜为例，因其在形态大小和解剖学 结构上与人的瓣膜非常相似，所以常被作为一种瓣膜的替代品而应用于瓣膜的置 换手术。但是所有的这些替代品在植入人体以前，都需要经过一些特定的交联处 理，来降低这些替代品的免疫原性和提高它们的抗降解能力。其次所用交联荆的 毒性要尽可能的小，否则就会严重影响受体组织的正常生长。 a ) 细胞毒性： 细胞毒性包括交联剂本身的细胞毒性及其交联制品的细胞毒性。细胞毒性的 高低，对于植入性交联制品与宿主组织之间的相容性有着很大的影响。显而易见， 细胞毒性越低的交联剂和它交联所得的生物组织，其组织相容性就越好。在植入 宿主体内后，它们所引发的炎症反应程度就越轻，从另一方面讲，也说是加速了 宿主组织的生长和愈合。 交联剂的细胞毒性，是通过体外的鼠源性3 d 成纤维细胞( b a l b 3 t 2 c 1 a 3 1 一卜1 ) 细胞株的短期试验和长期试验来进行评估的。短期试验是通过m t t 试 剂 3 一( 4 ，5 - 二甲基噻唑) 一2 ，5 一二苯基四唑溴化物 ，与活细胞发生特定的反 应来测定存活细胞的数量。长期试验则是测定使用交联剂培养后的细胞，所能形 成细胞集落的数量来评估细胞毒性的( 集落形成试验) 。而对交联制品细胞毒性的 测定，是直接在其上面接种3 t 3 细胞，培养后用显微镜进行检查 2 9 】。 与目前使用的各种交联剂相比较，京尼平作为交联剂的最大的优点就是低细 胞毒性，各项试验的结果也说明了这一点。以d m e m 为培养基，通过m t t 试验测定 的交联剂的细胞毒性显示，京尼平的细胞毒性比戊二醛要d q 0 0 0 0 倍1 3 0 】。而通过 细胞集落形成试验测定的细胞毒性显示，暴露于京尼平的细胞的增殖能力大约是 同样暴露于戊二醛的细胞的5 0 0 0 倍3 1 】：而在对交联制品的试验中，无论所使用的 戊二醛的浓度为多少，戊二醛交联制品上所接种的细胞无一存活；相反的，在培 养3 天后的京尼平交联的制品上就布满了3 t 3 细胞，而且还观察到了由这些细胞所 产生的新生的胶原纤维吲。 b ) 基因毒性： 基因毒性也是细胞毒性的一个方面，对交联剂而言，也是其能否应用于临床 的一个指标。在一系列的体外实验中，通过姊妹染色单体互换试验( s c e 试验) 和 第二章文献综述 小核试验( 试验) 能检测交联剂潜在的基因毒性。 姊妹染色单体互换试验( s c e 试验) 是通过测量染色体中，姊妹染色单体之间 互换现象的出现数量来评价所测试的交联剂的潜在的使染色体断裂的能力。数据 表吲3 3 1 ，在使用浓度为5 0 p p m 以下的京尼平进行试验时，其结果与阴性对照组之 间没有统计学上的差异( p o 0 0 1 ) 。而同样浓度的戊二醛却表现出了较强使染色 体断裂的能力，所观察到的s c e 数量与阴性的对照组之间存在着显著的统计学差 异( p o 0 0 1 ) 。 小核是指两个细胞核中较小的一个，其中含有基因材料和繁殖功能；小核试 验( m n 试验) 是，通过计算培养后细胞的有丝分裂指数和双核细胞中小核的数量， 来评价交联剂对细胞分裂和遗传复制的影响。从l p p m 到5 0 p p m ，各浓度京尼平所 培养细胞的有丝分裂指数都很相近，且与正常对照组之间无显著的差异；而浓度 大于0 0 0 0 5 p p m 的戊二醛就会对细胞的有丝分裂产生了一定影响【3 4 】。 2 4 3 应用前景 虽然京尼平在某些方面还存在着不尽如人意的地方，但其极低的细胞毒性和 基因毒性，优良的生物相容性和抗降解的能力，仍是其作为一种新型的、天然的 交联剂所具有的合成交联剂所无法比拟的优越性 3 5 1 。因此京尼平是一种非常有发 展潜力、用途广泛的天然交联剂。 2 5 组织工程支架材料 2 5 1 组织工程在器官修复和治疗中的重要作用 临床上对受损组织和器官的修复和治疗目前主要有自体组织器官移植、异体 组织器官移植、异种组织器官移植和采用人工替代物等几种方法。自体组织器官 移植的最大优点是可以避免免疫排斥，然而从患者自体获取移植供体不但供源有 限，而且会造成患者更多的损伤。异体组织器官移植虽增加了人体组织和器官的 供应来源，但也同样存在着供体来源不足的问题，此外异体间的免疫排斥常常引 起移植最终失败。异种组织器官移植虽然可以完全解决组织器官的供体来源问 题，但异种组织和器官间的组织相容性问题使移植体难于存活。人工替代物由人 工合成制备，既可以无限制地大批量生产，解决供源的问题，又由于它是惰性物 质、可以避免免疫排斥，具有其他器官移植所无法相比的优点，然而人工替代物 9 第二章文献综述 并不能完全具备组织和器官的全部功能，且有时也会产生异物反应【3 6 1 。可以认为， 至今临床上还没有一个十全十美的方法可以真正解决受损组织和器官的修复问 题。组织工程将工程学原理同细胞学和组织生物学原理结合起来，以替代有缺陷 ( 已老化、受损伤或病态) 的组织和器官。由组织工程再造的组织和器官不但可以 同人工替代物一样进行大批量的生产，而且这样的组织和器官同天然的组织和器 官具有相同的功能，还可防止免疫排斥的产生，被认为是最有希望彻底解决组织 和器官修复难题的途径口7 1 。 2 5 2 细胞支架的功能和性能要求 组织工程的核心是构建由细胞与细胞支架结合的复合体，细胞、生物材料所 构成的细胞支架，以及组织和器官的形成和再生是组织工程的三大要素 3 8 1 。其中， 细胞支架的功能是为细胞的增殖提供三维空间和新陈代谢的环境，并决定新生组 织、器官的形状和大小。为了实现细胞支架的功能，细胞支架必须保证能让细胞 很好地贴附、生长和增殖，因此细胞支架必须具有良好的细胞亲和性；为了保证 细胞能在支架的各部分都得到增殖生长、可以很好地进行新陈代谢，细胞支架必 须具有一定的孔径和互相沟通的三维孑l 结构，为了保证新生的组织和器官与需要 再生的组织和器官有相同的形状和大小，细胞支架必须具有一定的几何形状：为 了保证细胞支架能随着细胞的生长而逐渐消失，细胞支架必须具备生物降解性， 最终被机体代谢或吸收，此外还必须保证支架的降解产物不对细胞繁殖产生不利 的影响，并使细胞支架的降解速度与细胞的增殖速度相匹配【3 9 1 。从临床应用的角 度出发，组织工程的细胞支架不仅应在细胞培养过程中能保持一定的形状、不会 在操作中破碎，而且还应能耐受灭菌消毒；需具有一定的柔韧性，使之既能同机 体组织缝合并贴合，又不会对机体组织造成机械损伤。因此，理想的细胞支架应 具有一定的生物降解速度、良好的生物相容性和细胞亲和性、有一定的力学性能、 能灭菌消毒、具有特定三维多孔结构。 2 5 3 细胞支架用生物材料 目前，作为组织工程细胞支架的生物材料主要有合成高分子材料、天然无机 材料和天然高分子材料。 ( 1 ) 可降解合成高分子材料：国内外研究较多的是聚羟基乙酸( p g a ) 、聚乳酸 o 第二章文献综述 ( p l a ) 、聚羟基乙酸与聚乳酸的共聚物( p l g a ) 等。这些材料具有可标准化生产、 可降解、细胞相容性好等优点，但其酸性降解产物有可能对细胞的活性产生不利 影响；同时其亲水性、细胞相容性、力学强度等均尚待改进【4 ”。采用多种改性技 术有可能满足组织工程对支架材料的要求。 ( 2 ) 陶瓷类材料：目前研究较成熟的是多孔羟基磷灰石( h a ) 、磷酸三钙等。 这类材料生物相容性好，有定强度，是骨的无机盐成分，常用作骨组织工程的 支架材料。但由于它们降解慢，脆性大，降低了这类材料的实用性。 ( 3 ) 复合材料：将有机材料! t f f p g a 与无机材料如 i a 复合，或将h a 与胶原、生长 因子如骨形态发生蛋白( b m p ) 复合形成复合材料，可克服单纯材料的缺点，并能 综合其优点。近几年对纳米材料或纳米复合材料的研究有了新的突破 4 2 1 ，这已成 为组织工程支架材料研究的方向之一。 ( 4 ) 天然高分子材料：应用较多的有壳聚糖、海藻酸盐、胶原蛋白、葡聚糖、 透明质酸、明胶和琼脂等，这些材料一般都无毒，亲水性、生物相容性及细胞亲 和性也都较好。但由于产地和来源的不同，质量的重现性差，强度和加工性能也 较差，降解速度无法调节。 ( 5 ) 生物衍生材料：生物组织经过处理后获得的材料称为生物衍生材料。来 源于人体的生物衍生材料保留了正常的网架结构。组织相容性好，是较为理想的 组织工程支架材料。如胶原凝胶、脱细胞真皮构建组织工程皮肤4 3 1 。纤维蛋白凝 胶构建组织工程软骨等。脱细胞、去抗原处理的生物衍生骨支架构建的组织工程 骨已有临床应用个案报道i 矧。 2 5 4 细胞支架的形态结构 细胞支架不但起着决定新生组织、器官形状大小的作用，更重要的是为细胞 增殖起着提供营养、进行气体交换、排除废物，为细胞增殖、繁衍提供场所的重 要作用，因此组织工程细胞支架的形态结构必须具有互相贯通的丌放孔结构，孔 径大小必须符合不同细胞的要求；此外细胞支架还必须与需要再生、修复的组织 或器官具有相同的形状和大小。 由于不同组织和器官的细胞不但在形状和大小上有所不同，而且在细胞生长 的取向及结构密度上也不甚相同。所以为了使细胞能长入支架，除了细胞支架必 第二章文献综述 须具有一定大小的孔径和呈开放的孔结构外，有时还需要孑l 结构呈一定的方向 性。对于多种细胞的组织工程细胞支架，由于不同组织的细胞不但在大小上不同， 在生长繁衍速度上也不相同，因此还需要由几种不同的材料制成、且各材料又呈 不同的孑l 结构的复合结构细胞支架h 6 l 。 p l u r o n i c ( 骨水泥) 是目前最重要的可塑性细胞支架材料，可以在室温下通过 注射的方式注人体内，再在体温下凝固成型。但由于这种水凝胶强度差、凝胶化 时间难以控制，在室温下溶于水，无法进行体外细胞培育，在应用上受到一定的 5 艮肯l j 4 7 。生物降解性高分子微球由于既可以注射，又具有一定的强度，还可以在 体外进行细胞培育，有望成为新一类潜在的可塑性组织工程细胞支架材料m j 。 通常用于构筑细胞支架孔结构的技术有溶液浇铸和制孔剂成型技术、相分离 技术、气体制孔技术、乳液冻结干燥技术、快速成型技术、纤维编织技术，以及 多种方法联合应用的技术等，可制备不同材质、孔径从几啪到几百帅、呈单一孔 结构或多种孑l 结构、不同形状、不同厚度、不同面积的各种细胞支架棚。也可构 建用一种或几种材料制备、呈一种或多种孔结构的复合结构细胞支架，以供各种 不同组织工程细胞培养的需要【5 0 】。 2 5 5 发展前景 组织工程的研究成果将会为临床医学提供工程化组织，以修复组织缺损，重 建或改善组织、器官功能、是在体外复制有生命的组织，具有重大的科学意义及 实践意义，同时也将产生一类新兴产业酬。加快组织工程的研究步伐，早日用优 质的组织工程产品造福患者是所有科学研究工作者、临床医学工作者的共同愿 望。 2 6 本论文的工作及意义 明胶、壳聚糖都是天然聚合物，有着良好的生物相容性，在组织工程等医学 领域有着广泛的应用，而它们常采用的传统交联方法大都使用化学合成类交联 剂，而这类交联剂本身均具有很高或相对较高的细胞毒性，导致所得的生物材料 在植入人体以后，会影响受体正常组织的生长。本文从降低交联剂对交联制品毒 性的角度出发，分别通过壳聚糖与乳酸接枝共聚和天然化合物京尼平交联壳 聚糖、明胶的方法，以期获得力学性能良好、生物相容性优异的组织工程用材料。 第三章聚乳酸交联壳聚糖凝胶 第三章聚乳酸交联壳聚糖凝胶 3 1 引言 根据仿生原理，选择细胞外基质或类似物作为构建生物支架的基质材料，这 样制各的支架材料生物相容性良好，能够促进细胞粘附、增殖和分化，利于细胞 表型的表达，但同时还应考虑基质材料的力学适应性。如何调控这两方面的影响 因素，使其生物相容性和力学适应性为主的综合性能得到提高，满足临床需要， 这是组织工程领域的一个挑战。 壳聚糖是一种天然的聚阳离子多糖( p k a = 6 3 ) ，分子结构类似细胞外基质中 的多糖结构，本身具有生理活性，可生物降解。它带有游离的自由氨基，呈弱碱 性。聚乳酸作为一种可降解合成高分子材料，在生物医学领域中广泛应用。但由 于聚乳酸降解初期产物乳酸的酸性较强，其局部积累，会对组织有一定的刺激作 用1 5 2 1 。 若能将壳聚糖与聚乳酸置于同一个分子链上【5 3 1 ，制得聚乳酸交联的壳聚糖凝 胶，利用二者的生物降解性及生物相容性，一方面用生物相容性良好的聚乳酸作 物理交联剂，避免戊二醛等毒性较大的化学交联剂的引入：另一方面由于壳聚糖 的引入而使聚乳酸炎症反应减轻。本章拟化学合成壳聚糖一聚乳酸凝胶网络( c l 凝胶) ，其主要成分仍为壳聚糖，由于侧链聚乳酸链的疏水性，其相互聚集可以 对壳聚糖主链产生物理交联作用。 3 2 实验部分 3 2 1 实验原料 本实验所用到的主要化学试剂如表3 一l 所示。 表3 一l 实验原料 t a b l e3 - 1e x p e r i m e n tm a t e r i a l 试剂规格生产厂家 壳聚糖 乳酸 2 0 万，脱乙酰度8 5 青岛海汇生物制品有限公司 8 8 水溶液荷兰p u r a c 公司 第三章聚乳酸交联壳聚糖凝胶 无水甲醇 无水乙醇 戊二醛 磷酸盐缓冲液( p b s ) m e m 培养基 胎牛血清 h a n k s 液 胰蛋白酶( t r y p s i n ) 乙二胺四乙酸( e d t a ) 四甲基偶氮唑蓝( m t t ) 二甲基亚砜( d m s o ) 苔盼蓝 瑞士一姬姆萨染液 纯净水 分析纯 分析纯 5 0 o 0 l m 高糖 特级 无c j + 、m 9 2 + 特级 分析纯 特级 分析纯 特级 特级 特级 天津市化学试剂三厂 天津市化学试剂二厂 天津华真特种试剂公司 自制 g i b c a l t b d b i 0 自制 d i f c o 上海试剂一厂 s i g m a 天津市登峰化学试剂厂 s i g m a 天津灏洋生物有限公司 m i n i q 系统 3 2 2c l 凝胶的制备 称取一定量的壳聚糖溶于乳酸水溶液中，机械搅拌过夜，待其完全溶解后， 将其倒入聚四氟乙烯模具中，在8 0 。c 下常压反应4 h ，然后在i 0 6 x1 0 3 p a 、8 0 真空条件下继续反应6 h 。将所得共聚物置于索氏提取器中，甲醇溶剂连续抽 提4 8 h ，真空干燥制得约为0 1 m m 厚的膜，待用。所得壳聚糖与乳酸接枝共聚物 用c l ( c sl a ) 表示。本文以c l x 来标记样品号。 表3 2 不同组成的c l 凝胶的编号 t a b l e3 - 2t h e n u m b e ro f d i f f e r e n tc o m p o s i t e so f c lg e l s 编号lacs(wtwt) c l - l0 5 c l - 21 0 c l - 31 5 c l - 42 0 c l 一5 3 0 c l 64 0 第三章聚乳酸交联壳聚糖凝胶 3 2 3 红外光谱测试 将壳聚糖与乳酸的共聚得到的聚合物薄膜c l 真空干燥。在红外光谱仪上将 膜材直接红外透射，进行红外光谱分析。所用仪器为b i o r a df t 3 0 0 0 型红外光 谱仪，扫描次数为2 5 6 次，分辨率为2 c m 一 3 2 4 光电子能谱测试 采用光电子能谱分析仪对不同配比的c l 薄膜表面的c 、0 、n 元素进行分析， 激发源为a 1 k ，电荷位移校正取c i s =