（植物病理学专业论文）集约化畜禽养殖废水高效氨氮降解菌的研究.pdf

山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 对采自上海崇明警备区富民养猪场污水处理池中的污泥和上海崇明县 污水处理厂污水处理池中的污泥，通过微生物的富集、分离，筛选出了有 氨氮降解功能的细菌，并对其进行了形态学、生理生化及1 6 s r d n a 鉴定， 对单菌株及复合菌降解特性进行了系统的研究，主要研究内容如下： 采用富集培养法筛选出数株能降解氨氮的高效降解菌，通过复筛最终 获得3 株高效氨氮降解细菌：c m 3 、c m 8 和w s c 5 ，其中c m 3 和c m 8 分离自养猪场污泥，w s c 5 分离自污水处理厂污泥。通过对其形态、生理 生化特征及1 6 s r d n a 的分析，经鉴定，菌株c m 3 为解淀粉芽孢杆菌 ( b a c i l l u sa m y l o 均u e f a c i e n s ) ，菌株c m 8 为地衣芽孢杆菌( b a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s ) ，菌株w s c 5 为枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 。 不同降解时间、温度、p h 、氨氮初始浓度、接种量、碳源及碳氮比等 因素对菌株降解氨氮能力的影响的研究结果表明，初始氨氮浓度、p h 值、 碳源和碳氮比等因素对菌株降解氨氮的效果影响较大。菌株c m 3 在初始 氨氮浓度为4 0 0 m g l 、p h 值为7 5 、碳源为比值1 ：1 葡萄糖和丁二酸钠， 碳氮比为8 ：1 的条件下4 d 内，其氨氮降解率在4 5 以上；菌株c m 8 在 初始氨氮浓度为4 0 0m g l - 1 、p h 值为7 5 、碳源为比值1 ：1 葡萄糖和丁二 酸钠，碳氮比为8 ：1 的条件下，4 d 内的氨氮降解率接近5 0 ；菌株w s c 5 对低浓度氨氮有较好的降解效果，在初始氨氮浓度1 0 0m g l 。1 时，其氨氮 降解率接近5 0 ；在初始氨氮浓度为4 0 0m g l 、p h 值为8 0 、碳源为比 值1 ：1 葡萄糖和丁二酸钠，碳氮比为8 ：1 的条件下，4 d 内的氨氮降解率也 能接近4 0 。 对3 株菌进行了不同比例的组合，构建成复合菌，对复合菌的降解条 件研究结果表明，复合菌比单一菌株的氨氮降解效果有所提高。3 株菌以 比例1 ：l ：l 组合得到的复合菌有较好的氨氮降解效果，在初始氨氮浓度为 6 0 0m g l 1 ，p h 值为7 5 ，温度为3 0 c 时，复合菌对氨氮的降解率在6 0 以上。 关键词：养殖废水；氨氮；降解菌；降解特性 集约化畜禽养殖废水高效氨氮降解菌的研究 a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , t a k i n gt h es l u d g e so ff u m i nh o g g e r yi nt h ej i n g b e id i r e c ta n d t h es l u d g e so ff e r t i l i z e rp l a n to fc h o n g r n i n gc o u n t y , s h a n g h a i ，t h r e es t r a i n s w h i c hw e r eg o o da td e g r a d i n ga m m o n i aw a si s o l a t e da f t e rt a m i n ga n d e n r i c h m e n t b a s e do na n a l y s i so fp h e n o t y p e ，p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l c h a r a c t e r sa n d16 s r d n a ，t h r e es t r a i n sw a si d e n t i f i e d t h e nt h ed e g r a d i n g c h a r a c t e r so fa m m o n i aw e r es t u d i e d c o n s t r u c to fc o m p o u n db a c t e r i ab yt h e s e s t r a i n sa n dt h ed e g r a d i n gc h a r a c t e r so fa m m o n i aw e r es t u d i e ds y s t e m a t i c a l l y t h er e s u l t sc o u l db es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： t h em i c r o o r g a n i s m sw e r ei s o l a t e dw h i c hc o u l dr e m o v ea m m o n i a e f f h c i e n t l yb ym e a n so fe n r i c h m e n tc u l t u r et e c h n i q u e a f t e rs e c o n d a r y s c r e e n i n g ，t h r e es t r a i n sc m 3 ，c m 8a n dw s c 5w h i c hc o u l dr e m o v ea m m o n i a m o r ee f f i c i e n t l yw e r eo b t a i n e d a m o n gt h e m ，s t r a i nc m 3a n ds t r a i nc m 8 w e r ei s o l a t e df r o mt h es l u d g e so ff u m i nh o g g e r y ；s t r a i nw s c 5w a si s o l a t e d f r o mt h e s l u d g e so ff e r t i l i z e rp l a n t b a s e d o n a n a l y s i s o fp h e n o t y p e ， p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r sa n d16 sr d n a ，c m 3w a s i d e n t i f i e d a sb a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i e n s ，c m 8w a si d e n t i f i e da sb a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ， a n dw s c 5w a si d e n t i f i e da sb a c i l l u ss u b t i l i s t h ee f f e c t so fd e g r a d a t i o nt i m e ，t e m p e r a t u r e ，p h ，i n i t i a lc o n c e n t r a t i o no f a m m o n i a ，i n o c u l a t i o na m o u n t ，c a r b o ns o u r c ea n dr a t i oo fc a r b o nt on i t r o g e n o n d e g r a d a t i o nw a sd e t e r m i n e d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei n i t i a l c o n c e n t r a t i o no fa m m o n i a ，p h ，c a r b o ns o u r c ea n dr a t i oo fc a r b o nt on i t r o g e n h a v et h ei m p o r t a n ti n f l u e n c eo nt h ed e g r a d a t i o nr a t eo fs t r a i n s t h ed e g r a d a t i o n r a t eo fs t r a i nc m 3r e a c h e du pt o4 5 i n4d a y su n d e rt h ec o n d i t i o n so fi n i t i a l c o n c e n t r a t i o no fa m m o n i a4 0 0 m g l ，p h 7 5 ，g l u c o s ea n ds o d i u ms u c c i n a t ea s c a r b o ns o u r c ew i t hr a t i oo f1 ：1 ，r a t i oo fc a r b o nt on i t r o g e n8 ：1 t h e d e g r a d a t i o nr a t eo fs t r a i nc m 8w a sv e r yc l o s et o5 0 i n4d a y su n d e rt h e c o n d i t i o n so fi n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fa m m o n i a4 0 0 m g l ，p h 7 5 ，g l u c o s ea n d s o d i u ms u c c i n a t ea sc a r b o ns o u r c ew i t hr a t i oo f1 ：1 ，r a t i oo fc a r b o nt on i t r o g e n 8 ：1 t h ed e g r a d a t i o nr a t eo fs t r a i nw s c 5w a sv e r yc l o s et o5 0 u n d e rt h e 2 山东农业大学硕士学位论文 c o n d i t i o n so fl o wi n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fa m m o n i a f o ri n s t a n c et h ei n i t i a l c o n c e n t r a t i o no fa m m o n i aw a s10 0 m g i t h ed e g r a d a t i o nr a t eo fs t r a i nw s c 5 w a sv e r yc l o s et o4 0 i l l4d a y su n d e rt h ec o n d i t i o n so fi n i t i a lc o n c e n t r a t i o n o fa m m o n i a 4 0 0 m g l ，p h 8 0 ，g l u c o s ea n ds o d i u ms u c c i n a t ea sc a r b o ns o u r c e w i t hr a t i oo fl ：1 r a t i oo f c a r b o nt on i t r o g e n8 ：1 t h et h r e es t r a i n sw e r em i x e di nd i f f e r e n tp r o p o r t i o nt oc o n s t r u c tt h e c o m p o u n db a c t e r i a t h ed e g r a d a t i o n c o n d i t i o n so ft h e c o m p o u n db a c t e r i a s h o w e dt h a tt h ed e g r a d a t i o nr a t ew a si m p r o v e dc o m p a r e dw i t hs i n g l es t r a i n t h ec o m p o u n db a c t e r i aw h i c ht h r e es t r a i n sw e r em i x e di np r o p o r t i o n1 ：1 ：1 h a v ee 伍c i e n td e g r a d a t i o nr a t e t h ed e g r a d a t i o nr a t eo fc o m p o u n db a c t e r i a r e a c h e du pt o6 0 u n d e rt h ec o n d i t i o n so fi n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fa m m o n i a 6 0 0 m g l ，p h 7 5a n dt e m p e r a t u r e3 0 c k e yw o r d ：a q u a c u l t u r ew a s t e w a t e r ；a m m o n i a ；d e g r a d i n gb a c t e r i a ； d e g r a d a t i o nc h a r a c t e r i s t i c s 3 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，? + 是在导师指导下，独立进行科学 研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出 重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责 任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸 质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学 位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录 到中国学位论文全文数据库，并向社会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：搬 导师签名：盟争 日期：丑f 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 随着我国规模化、集约化养殖产业的快速发展，养殖废水的污染问题 日益严重。由于废水排放量大、有机质浓度高、含氮量高等特点，如果得 不到有效处理，会对我国城乡环境、饮用水源、农业生态产生直接威胁和 危害。脱除废水中的含氮化合物一直是生态环境保护的重要课题。因此， 研究开发经济、高效的脱氮处理技术，已成为废水污染控制处理的重点和 热点，废水的脱氮处理中，生物脱氮法以其操作简单、投资少、成本低、 不易造成环境污染，脱氮效果也较好等多方面的优点，被公认为更经济、 有效、对环境影响小的方法，也是最有发展前途的方法( m o r e n oe ta l ， 2 0 0 5 ) 。微生物脱氮经过几十年的发展，无论在理论上，还是在实践方面 都取得了很大的进步。 1 1 脱氮微生物的研究现状 传统的生物脱氮技术通常利用微生物培养物直接对含氮废水进行处 理，由于硝化细菌是一种无机化能自养细菌，增殖速度慢且难以维持高生 物浓度( s h r e s t h ae ta 1 ，2 0 0 1 ) ，系统抗冲击能力弱，对环境冲击非常敏 感( f o c h t e t a l ，1 9 7 7 ；m o b a r r y e t a l ，1 9 9 6 ) ，高浓度氨氮会抑制硝化菌 生长极易被处理系统淘汰( 钱易等，1 9 9 3 ) 。新型生物脱氮工艺中生物脱 氮微生物成为脱氮工艺研究的重点，并且在脱氮微生物筛选方面做了许多 研究。 1 1 1 硝化细菌的研究 硝化细菌叫i t r i 研n gb a c t e r i a ) 遍布于陆地和水生生态系统，是一类具有 硝化作用的化能自氧细菌，包括亚硝化细菌和硝化细菌两个生理亚群。 亚硝化细菌是格兰氏阴性微生物，在废水的氨氮降解中起着重要的作 用。亚硝化细菌是一种无机化能自养菌，生长极其缓慢，且对环境的变化 ( 如温度、p h 、有机物等) 非常敏感，在实验室对亚硝化细菌的分离通常较 为困难，以致有关它们的细菌学和生物化学的研究工作进展缓慢。亚硝化 细菌早期的分离主要采用先富集培养再进行平板分离的方法，并根据细胞 形态以及内细胞膜的排列方式对其进行菌种分类。共有1 6 株亚硝化菌分布 在5 个属中：亚硝化单胞菌属( n i t r o s o m o n a s ) 、亚硝化球菌属 集约化畜禽养殖废水高效氨氮降解菌的研究 ( n i t r o s o c o c c u s ) 、亚硝化螺菌属( n i t r o s o s p i r a ) 、亚硝化弧菌属( n i t r o s o v i b r i o ) 以及亚硝化叶菌属( n i t r o s o l o b u s ) ( 马英等，2 0 0 7 ) ，郭爱莲等( 1 9 9 6 ) 和 孙玉华( 1 9 9 9 ) 等报道在土壤和活性污泥中分离出纯亚硝化细菌。 硝化细菌为革兰氏阴性细菌。自氧生长时，以亚硝酸盐为唯一能源， 以c 0 2 为唯一碳源。混合生长时能同化有机物，适合大多硝化细菌的条件 为：温度2 5 3 0 ，p h 7 5 8 0 。倍增时间为1 0 小时至数天。主要分布在以 下4 个属中：n i t o b a c t e r 、n i t r o c o c c u s 、n i t r o s p i n a 、n i t r o s p i r a 。 由于硝化细菌化能自养的特殊性，导致了硝化细菌在自然界中非常易 受外界因素的影响，其影响因素主要有以下几个方面：溶解氧、温度、p h 值和有机负荷。其中有机物的存在刺激异养细菌的迅速生长，从而与硝化 细菌竞争溶解氧、氨和微量营养物质，使得硝化细菌的生长受限制，而有 机物本身并不影响硝化细菌的生长与硝化作用( o k u n ，d a ，1 9 7 8 ；o k a b e s 甜a 1 ，1 9 8 4 ) 。 目前对硝化细菌的研究与其它一些细菌相比还是比较落后的，这主要 表现快速、低成本地获得高效硝化细菌相当困难。但是随着人类活动的加 剧，水环境的主要污染之一氮污染问题己越来越突出，因而硝化细菌治理 环境、改造环境的功能也越来越受到人们的重视。 异养硝化现象早在1 9 世纪末和2 0 世纪初，就在土壤的硝化过程中被 发现，( k i l l h a m ，1 9 8 6 ) 但有关这方面的报道一直较少。这主要是因为硝 化作用通常是通过测定其氧化产物( 硝酸盐和亚硝酸盐) 来确定，而异养 硝化很少积累这类产物。所以长期以来，人们总认为自然界的硝化过程基 本上由自养硝化菌完成的，异养硝化在硝化过程中的重要性不大。 在q u a s t e l 和s c h o l e f i e l d 以丙酮酸肟作为选择性培养基，采用连续灌 注土柱的方法分离获得具有产生n 0 2 能力( 不经过氨化) 的异养菌株以 来，( q u s a t e le t a l ，1 9 5 0 ；s c h w a r t ze t a l ，1 9 4 9 ) 异养硝化微生物和异养 硝化作用重新引起研究者们的广泛关注。同时由于异养硝化菌在生物脱氮 中特有的优势，自2 0 世纪8 0 年代以来，国内外许多生物科学家先后投入 了对它的研究。异养细菌的研究越来越受到重视，有些异养性的细菌，如 产碱菌属( a l c a l i g e n e s ) 和节杆菌属( a r t h r o b a c t e r ) ，具有较好的硝化作用。 c a s t i g n e t t i 等( 1 9 8 4 ) 首次报道了土壤中常见的假单孢杆菌等1 2 种细菌可 6 山东农业大学硕士学位论文 产生异养现象。 近几年来，越来越多的异养硝化细菌被分离得到。林燕等( 2 0 0 6 ) 采 用将传统微生物学方法与现代分子生物学手段相结合的新型异养硝化细 菌的分离筛选方法，从具有8 0 1 的s n d 效果的m b r ( 膜生物反应器) 系统中分离筛选出2 株异养硝化细菌b a c i l l u ss p l y 及b r e v l b a c i l l u s s p l y 。对其研究结果表明在充分利用有机碳进行有氧呼吸的同时具有较 强的硝化及脱氮能力：2 4 d 好氧培养后，c o d 的去除率分别为7 1 7 及 5 2 6 ；氨氮的转化率分别为7 8 2 及5 1 2 ；总氮的转化率分别为6 9 2 及3 5 6 。王成林，吴振斌等( 2 0 0 8 ) 从复合垂直流人工湿地表层基质中 分离出一株硝化活性较强的异养硝化细菌。经鉴定可能为a l c a l i g e n e s a f a e c a l i s 。亚硝化性能试验结果显示，当温度为3 0 ，p h 为7 5 ，接种 量为1 07 c f u ，溶氧2 2 5 m g l 时，该菌株亚硝化反应效果最佳。影响亚硝 化反应效果的因素顺序为：溶解氧 温度 p h 接种量；温度和溶解氧影响 极显著，p h 和接种量影响相对不显著。曹喜涛，常志州等( 2 0 0 6 ) 从高 温堆肥中分离出1 株高温异养硝化细菌。初步鉴定为芽孢杆菌属( b a c i l l u s s p ) ，经研究发现该菌株以乙酰胺为唯一碳源和氮源时，能通过氨化和硝 化作用产生亚硝酸。王李宝，万夕和等( 2 0 0 6 ) 从养殖池塘浅层底泥中分 离得到四株具明显硝化活性的异养硝化细菌，通过形态学和生理生化研 究，将上述菌株初步鉴定为芽孢杆菌( b a c i l l u ss p ) 。 相对于自养性的硝化菌而言，异养性菌种虽有较低的分解速率，但由 于它在环境中的数量往往大于自养性细菌，而且有些异养性菌种可同时行 硝化和反硝化( 脱硝) 作用，因此也是硝化作用中不可或缺的一个群体( 马 英等，2 0 0 7 ) 。亚硝化细菌的研究尚处于基础研究阶段，大多集中于利用 固定化技术对其进行富集培养及应用的研究。 1 1 2 反硝化细菌的研究 反硝化细菌( d e n i t r i f y i n gb a c t e r i a ) 是兼厌气性微生物，主要处于养 殖池底的污泥中，将池底污泥中的硝酸盐转化为无毒的氮气排入大气。传 统理论认为反硝化只能在厌氧条件下进行，且反硝化菌都是细菌。影响污 水脱氮过程中反硝化菌活性的因素主要有以下几个方面：( 1 ) 有机碳源： 不同的反硝化细菌有不同的最适合生长碳源，污水处理系统中碳源的种类 7 集约化畜禽养殖废水高效氨氮降解菌的研究 不同可导致反硝化细菌的类群及反硝化活性不同。一般情况下，甲醇作为 碳源时反硝化速率高，被分解后的产物为c 0 2 和h 2 0 ，但处理费用较高。 ( 2 ) p h 值：反硝化过程最适宜的p h 范围为6 5 - - 7 5 ，不适宜的p h 值 会影响反硝化细菌的生长速率和反硝化酶的活性。当p h 值低于6 0 或高 于8 0 时，硝化反应受到强烈抑制。( 3 ) 温度：反硝化细菌适宜的生长温 度在2 5 3 5 之间，低于1 5 时增殖速率和代谢速率降低，导致反硝化 速率降低。实际中反硝化一般控制在1 5 一- - 3 0 。( 4 ) 溶解氧：当同时 存在分子态氧和硝酸盐时，反硝化细菌优先进行有氧呼吸。微生物从有氧 呼吸转变为无氧呼吸的关键是合成无氧呼吸的酶，而分子态氧的存在会抑 制这类酶的合成及活性。为了保证反硝化过程的顺利进行，必须保持严格 的缺氧状态。一般认为，系统中溶解氧保持在o 5 m g l 以下时反硝化才能 正常进行。 近年来，一些新的发现突破了细菌反硝化的传统认识，为细菌反硝化 理论添加了新的内容。上世纪r o b e r t s o n 和k u e n e n ( 1 9 9 9 ) 在反硝化和脱 硫系统中首次分离出好氧反硝化菌：t h i o s p h a e r ap a n t o t r o p h a ， p s e u d o m o n a ss p 4 r r l t a l c a l i g e n e s f a e c a l i s 等。 在国外，继r o b e r t s o n 在反硝化和脱硫系统中首次分离出好氧反硝化 菌t h i o s p h a e r a ，p a n t o t r o p h a 之后，m e i b e r g 等( 1 9 8 0 ) 筛选出来一菌株 h y p h o m i c r o b i u mx ，该菌株以三甲胺或二甲胺为唯一碳源和氮源，在限氧 的条件( o 0 9 5 m g l ) 进行反硝化。反硝化能力随着溶解氧( o d ) 的增加而 下降。1 9 9 9 年s c h o l t n e 在垃圾渗沥液处理系统中分离出异养硝化菌角 u a e a r 好氧反硝化现象仅发现在细菌中存在，在放线菌、真菌中尚没有报 道。目前越来越多的研究证明好氧反硝化的存在，并分离出了一些在有氧 条件下有较高反硝化率的细菌。许多菌属如粪产碱菌( a l c a l i g e n e s f a e c a l i s ) ( s ue ta 1 ，2 0 0 1 b ) 、生丝微菌( h y p h o m i c r o b i u mx ) ( m e i b e r ge ta 1 ，1 9 8 0 ) 、 脱n 副球菌( p a r a c o c c u sd e n i t r i f i c a n s ) ( r o b e r t s o ne ta 1 ，1 9 8 8 ) 、芽孢杆 菌( b a c i l l u ss p ) ( l uje ta l ，2 0 0 8 ；l i nye ta 1 ，2 0 0 7 ) 等都进一步证明 具有很强的好氧反硝化能力。1 9 9 9 年s c h o l t n e 在垃圾渗沥液处理系统中 分离出异养硝化菌t h a u r e am e c h e r n i c h e n s i s ，该菌株可以进行好氧反硝化。 2 0 0 0 年s u 等从猪圈废水处理系统的活性污泥中分离出p s e n d o m n a s 山东农业大学硕士学位论文 s t u t z e r is u ，该菌株可使含氧量为9 2 大气中硝态氮的去除达9 9 2 4 。 在国内，张亚光等( 2 0 0 3 ) 发现红球菌属( r h o d o c o c c u s ) 也具有好氧反 硝化能力。马放、王弘宇等( 马放等，2 0 0 5 ；王弘宇等，2 0 0 7 ) 筛选得到 好氧反硝化菌株x 3 1 ，经鉴定为p s e u d o m o n a sc h l o r i t i d i s m u t a n s 。并且利用 间歇培养装置研究了好氧条件下丁二酸盐、乙酸盐和苹果酸盐3 种不同碳 源对好氧反硝化细菌x 3 1 脱氮性能的影响，并就不同碳氮比( c 椰条件下 菌株x 3 1 的反硝化能力展开了研究。结果显示，不同碳源种类对菌株硝 酸还原酶活性有明显影响。以丁二酸盐和乙酸盐作为碳源时，其脱氮效果 均要明显好于苹果酸盐作为碳源。以乙酸盐作为碳源时菌株的反硝化速率 要稍高于丁二酸盐作为碳源，其反硝化速率可以达到11 8 6 m g g - 1 h - 1 。不 同碳氮比( c n 3 条件下，x 3 1 菌株的好氧反硝化能力亦不相同。当c n 大 于5 时，脱氮率能达到9 0 以上最适宜的碳氮比是5 6 ，在此区间能 进行完全的反硝化。当c n 在1 - 1 4 之间变化时，硝酸盐还原基本都发 生在菌株生长的第4 l o h ，整个反硝化过程中亚硝酸盐浓度一直保持在 极低的水平。于爱茸等( 2 0 0 5 ) 从鱼塘中分离得到1 株高效的好氧反硝化 菌，经初步鉴定，为b a c i l l u s 。廖绍安、王安利等( 2 0 0 6 ) 禾1 j 用间歇曝气选 择性富集并对所获菌株的好氧反硝化活性进行检测。筛选到一株亚硝酸盐 去除活性较高的好氧反硝化细菌。在溶懈氧( d o ) 为3 8 0 - - - 5 2 1 m g l 的培 养条件下。该菌株l o h 内将亚硝态氮由2 6 1 8 m g l 降至0 ；在盐度为0 2 5 之间2 0 h 内均可达到同样的去除效果。通过形态学特征、生理生化反 应及部分长度1 6 s r d n a 序列分析对筛选菌株进行鉴定，鉴定为 p s e u d o m o n a ss t u t z e r i 。龙雯、陈存社等( 2 0 0 6 ) 从实验室驯化培养的活性污 泥反应器中，分离获得l 株反硝化细菌鉴定为丛毛单胞菌属( c o m a m o n a s s p ) 的睾丸酮假单胞菌( c o m a m o n a st e s t o s t e r o n i ) 。 1 2 固定化微生物脱氮的研究 固定化微生物( i m m o b i l i z e dm i c r o b e ) ( 马放等，2 0 0 4 ) 技术是生物工 程领域中的一项新技术，始于2 0 世纪6 0 年代后期，其后得到迅速发展， 应用领域越来越广泛。该技术是通过化学或物理手段，将游离的微生物固 定在载体上，使其高度密集，在可能或必要的情况下保持微生物的活性， 使之可以反复、连续使用的方法。 9 集约化畜禽养殖废水高效氨氮降解菌的研究 在微生物脱氮系统中，微生物菌体与水的密度差小，从反应器中流出 的水中回收微生物进行重复利用较为困难。改善的办法是采用固定化技 术，将微生物通过一定的技术手段使微生物保持在反应器内，以利于提高 生物反应器内微生物的数量，利于反应后的固液分离，利于去除氨氮、去 除高浓度有机物或难以生物降解物质，提高系统的处理能力和适应性。 微生物的固定化方法，目前在国内外尚无一个统一的分类标准，而固 定化方法也多种多样，但主要的有表面吸附固定化、交联固定化、包埋固 定化和自身固定化等几种方法( 沈耀良等，2 0 0 2 ) 。 1 2 1 固定化微生物脱氮的研究 由于固定化微生物用于废水生物处理，与传统的悬浮生物处理法相 比，能纯化和保持高效菌种，微生物浓度高，污泥产量少，固液分离效果 好。因此，该项技术在废水生物处理，尤其是在特种废水处理领域中，得 到了广泛的研究。 近年来，微生物脱氮技术在养殖水质控制上的应用非常广泛，并取得 了令人瞩目的成就。张玲华等( 2 0 0 2 ) 研究结果表明经富集后的硝化细菌 的氨氮去除率由原来的5 4 提高到8 6 ；吴伟等( 2 0 0 0 ) 采用p v a 包埋 固定的沼泽红假单胞菌、诺卡氏菌和假丝酵母菌3 种菌株，研究其对养殖 水体中n h 4 + - n 和n 0 2 - - n 转化作用，结果表明菌株经固定后对养殖水体 中n i - h + - n 和n 0 2 - - n 的转化效率明显优于其游离细胞；h i s a s h in 等( 1 9 9 9 ) 比较了p v a 和海藻酸2 种材料固定化光合细菌对鱼池水质净化与反硝化 的效果，结果表明固定化p v a 球比海藻酸盐固定化球的水质净化能力强。 s h a nh 等( 2 0 0 1 ) 用固定化的硝化细菌去除对虾养殖池中高浓度的氨氮， 结果表明固定化细胞能有效去除养殖池中的总氨氮，去除率高达2 0 m g l ， 即使投入的固定化颗粒密度较小，也能获得较高的总氨氮去除率。赵兴利 等( 1 9 9 9 ) 矛1 j 用p v a _ h 3 8 0 3 包埋粉末活性炭和驯化硝化菌，以流化床为生 物反应器，采用s b r 运行方式，固定化硝化菌寿命长达7 个月以上，n h 3 耵 去除率维持在9 0 以上。王磊等( 1 9 9 7 ) 选用聚乙烯醇( p v a ) 作为包埋载体， 添加适量粉末活性炭，包埋固定硝化污泥处理以唧4 ) 2 s 0 4 和葡萄糖为主 的合成废水，实验结果表明：在2 4 , - - , 2 8 。c 下颗粒填充率7 5 ，h r t 为8 h 的条件下，进水n h a + - n 负荷由0 6 k g ( m 3 - d ) _ 提高至3 4 9 k g ( m 3 d ) ， 1 0 山东农业大学硕士学位论文 n h 4 + - n 去除率可达9 5 5 ，c o d 去除率保持在8 0 以上。 硝化菌、反硝化菌单独包埋利用了固定化细胞微生物浓度高的特点， 将传统生物处理中的悬浮生物固定在包埋剂中，该法固定化技术相对较简 单。谭佑铭等( 2 0 0 3 ) 研究固定化反硝化菌对富营养化水体中硝酸盐氮的还 原能力，以及对水体中有机物的降解情况，探索富营养化水体原位生物脱 氮的新途径。结果，经过4 0 d 的处理后，原水中的亚硝化菌和硝化菌能将 水样中的氨氮转化成硝酸盐氮，转化率约为5 7 5 ，但原水中的反硝化细 菌作用较微弱，对照水样中总无机氮的去除率约为6 7 。固定化反硝化 菌能利用原水中的部分有机物作碳源，进行反硝化作用。曹国民等( 2 0 0 0 ) 用海藻酸钠包埋硝化菌和反硝化菌，在好氧条件下同时进行硝化和反硝化 的脱氮研究，系统至少可稳定操作2 2 d ，其脱氮速率约为o 1 l k g ( m 3 - d ) 。 除了将硝化细菌和反硝化细菌分别固定外，有人探索将两种细菌联合 固定的方法。根据日本的u e m o t o 和s a i k i ( 1 9 9 6 ) 研究表明，混合固定的硝 化菌和反硝化菌运行一段时间后，自然会形成硝化菌集中于外层、反硝化 菌集中于内层、中间过渡层者共存的现象，因此，通过聚乙烯醇( e v a ) 、 海藻酸钠、交联树脂等多聚体化合物将硝化菌和反硝化菌混合包埋，其内 部空间具有氧扩散能力，可以自然形成由外向内的好氧区、缺氧区和厌氧 区，实现了好氧条件下的同时硝化和反硝化，从而实现单级生物脱氮。s n d 与单纯的硝化与反硝化的传统污水水处理过程相比，减少了反应容器的体 积，缩短了反应时间，提高了氨的转化率。 1 2 2 固定微生物技术的应用前景 近2 0 年来，固定化微生物技术发展迅速，已取得阶段性成果，尤其 是在美国和日本已有不少具有一定规模成功应用的工业实例，此项技术在 处理生活污水和纺织、屠宰、造纸等废水及核污染中正得到广泛的应用。 固定化微生物用于脱氮研究的报道近来较多。国内外学者采用不同的固定 化方法及不同的载体进行了大量的研究发现，利用固定化技术可在较低 p h 值、较低温度和较高溶解氧的条件下获得较好的处理效果，可增加脱 氮处理对寒冷气候、入水条件的适应性，脱氮微生物在固定化载体中能增 殖，因此可获得较高的微生物浓度，提高处理效果。微生物固定化技术能 够高效地使养殖水体脱氮，净化养殖水体。建立高度净化的废水处理系统， 集约化畜禽养殖废水高效氨氮降解菌的研究 有利于减少或避免养殖废水的排出，降低环境污染，并有利于建立高效率 的循环式高密度养殖系统，降低生产成本，从而促进养殖业的发展。因此 微生物固定化技术在养殖废水处理中的应用前景十分广阔，相信通过不断 的研究和改进，固定化微生物技术一定能在养殖废水生物处理的实际应用 中发挥其巨大的潜力。 1 3 微生物脱氮工艺的研究 一 废水中氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮等氮化合物的去除是废水处理系 统中重要的问题。用来处理养殖废水中的氮化合物污染方法主要有物化 法、生化法和生物脱氮。传统的物理法及化学法虽然见效快，但容易引 起二次污染，而生物法被认为是未来最有潜力、最有发展前景的方法。 1 3 1 传统脱氮工艺 传统生物脱氮技术作为氮污染的工程控制手段，其理论基础是微生物 作用下的硝化作用和反硝化作用，即在好氧条件下用好氧硝化菌把氨氮氧 化成硝酸盐氮或亚硝酸盐氮，再在厌氧或缺氧条件下用缺氧反硝化菌把硝 酸盐氮和亚硝酸盐氮还原为氮气达到从水环境中完全去除氮元素的目的 f 周育红等，2 0 0 4 ) 。根据传统脱氮理论发展起来的脱氮工艺将硝化、反硝 化严格分开，形成了后置反硝化和前置反硝化工艺，在工程应用中主要有 m o 工艺、b a r d e n p h o i 艺、丸姐工艺等( 张军等，2 0 0 4 ) 。 n o 脱氮工艺其主要特点是将反硝化段设置在系统之首，故又称前置 反硝化生物脱氮系统，这是目前采用较为广泛的一种脱氮工艺。反硝化反 应以污水中的有机物为碳源，曝气池中含有大量硝酸盐的回流混合液，在 缺氧池中进行反硝化脱氮，在反硝化反应中产生的碱度可补偿硝化反应中 所消耗碱度的5 0 左右。该工艺流程简单，无需外加碳源，基建费用及运 行费用较低，脱氮效率在7 0 左右。 b a r d e n p h o i 艺是在n o 脱氮工艺的基础上增设了一个缺氧段i i 和好 氧段i i ，所以该工艺又称四段强化脱氮工艺。增设的缺氧段i i 能对从好氧 段i 流入的混合液中的n 0 3 n 在反硝化菌作用下进行反硝化脱氮，使脱氮 率高达9 0 9 5 ，而增设的好氧段i i 能提高出流混合液中的d o 浓度，防 止在沉淀池内因缺氧产生反硝化，干扰污泥的沉降，从而改善了沉淀池中 1 2 山东农业大学硕士学位论文 污泥的沉降性能。 丸蛆工艺原理是通过开闭空气阀，使反应器中交替保持好氧和缺氧状 态，在好氧状态，水中的氨氮在自养硝化菌的作用下发生硝化反应，生成 硝酸盐或亚硝酸盐，在缺氧状态，硝酸盐和亚硝酸盐在异养反硝化菌的作 用下生成氮气或其它气态氮氧化物而排出，这样硝化反硝化可以在同一个 反应器中进行。交替好氧缺氧工艺中硝化和反硝化在一个池里进行就会降 低污水回流的能耗。同时，硝化反应是一个产酸反应，会使水的p h 降低， 在普通的生物除氮工艺中，有时要加碱维持溶液的p h ，而反硝化反应是 一个产碱反应，会使水的p h 值升高。a a a 工艺将硝化和反硝化设计在同 一个反应器中进行，可以节约化学药剂的投加量。在对出水氮含量要求不 太高的情况下，a a a 工艺可以作为一种有效的除氮工艺( h a o ，o l i v e rj e t a 1 ，1 9 9 6 ) 。 1 3 2 生物脱氮新工艺 近年来，异养硝化细菌和好氧反硝化细菌的发现，打破了传统理论认 为的硝化反应只能由自养细菌完成和反硝化只能在厌氧条件下进行的观 点。k u e n e n 及r o b e r t s o n 等还研究发现，( r o b e r t s o n e ta 1 ，1 9 8 3 ) 许多异养 硝化菌同时具有好氧反硝化作用。这些发现为开发设计新的脱氮工艺，提 高脱氮效率，提供了新的理论基础。目前提出的新的生物脱氮工艺主要有： 短程硝化反硝化( v e r s t r a e t ee t a l ，1 9 9 8 ；z h a n gs je ta 1 ，2 0 0 7 ) ( s n d ) 、 同时硝化反硝化( 李丛娜等，2 0 0 1 ；b a e k s h e ta 1 ，2 0 0 8 ) ( s n d ) 以及厌 氧氨氧化( s t r o u se ta 1 ，1 9 9 7 ) ( a n a m n i o x ) 等。 1 3 2 1 短程硝化反硝化工艺 1 9 7 5 年v o e t s 等发现了硝化过程中n 0 2 - 积累的现象，并首次提出了短程 硝化反硝化生物脱氮的概念。随后国内外许多学者对此进行了试验研究。 这种方法就是将硝化过程控制在h n 0 2 阶段而终止，随后进行反硝化。耿 艳楼、钱易等( 1 9 9 3 ) 研究了焦化废水的短程硝化反硝化，并获得了较高 的氮去除率。周少奇等( 1 9 9 8 ) 从计量学角度研究了以n o z - 作为电子受体 的反硝化过程。并在研究高氨氮垃圾填埋场渗滤水的同时稍化反硝化过程 中发现，部分氨氮的去除是通过了短程硝化反硝化途径。近年来，猪场废 水处理过程中也观察到了短程硝化现象( 杨朝晖等，2 0 0 4 ) 。短程硝化反 集约化畜禽养殖废水高效氨氮降解菌的研究 硝化的缺点是不能够长久稳定地维持n 0 2 积累。目前荷兰d e l f t 技术大学应 用该技术开发的s h a r o n 工艺，已在荷兰鹿特丹的d o k h a v e n 废水处理厂 建成并投入运行( 娄金生等，2 0 0 2 ) 。s h a r o n 工艺要求水温在3 0 - - 3 5 才能稳定实现短程硝化，此外，p h 一般要求8 以上才能获得稳定的亚硝酸 盐积累( 方士等，2 0 0 i ) 。也有试验表明：ph 7 4 时亚硝酸盐氮所占比率 高于9 0 ，短程硝化要求的p h 最好控制为7 4 8 3 ( 徐冬梅等，1 9 9 9 ) 。 由于一般的城市污水很少能满足水温3 0 和p h 8 的要求，因此，控n d o 被认为是实现短程硝化最简单有效的方法。h a n n a k ik 等研究表明，在2 5 时，控制低d o ( 0 5m g l ) ，硝化细菌的增殖速度将远远低于亚硝化细菌， 从而达到亚硝酸盐的积累。而r u i z 等在研究高浓度氨氮废水的短程硝化试 验中发现，当d o 为0 7m g l 时能达到亚硝酸盐的最大积累( 徐晓宇等， 2 0 0 6 ) 。 另外，游离氨、泥龄、有机物浓度都对亚硝酸盐的积累有一定作用， 游离氨对硝酸菌和亚硝酸菌的抑制浓度分别为0 1 i n g l - - - 1 0 m g l 和 1 0 m g l - - 一1 5 0 m g l 。当游离氨浓度超过了两类菌群的抑制浓度时，则整个 硝化过程都受到抑制。当游离氮的浓度高于硝酸菌的抑制浓度，而低于亚 硝酸菌的抑制浓度时，则亚硝酸菌能够正常增殖和氧化，而硝酸菌被抑制， 此时就会发生亚硝酸的积累。泥龄介于亚硝酸菌和硝酸菌的最小停留时间 ( h r t ) 之间，系统中硝酸菌逐渐被冲洗掉，亚硝酸菌成为系统优势菌，从 而形成亚硝酸型硝化。实验表明