（环境科学专业论文）优势复合菌群降解氯酚类化合物的特性研究(1).pdf

l n c l e a s i n g c o m p a r e dw i t he x i s t e n c el o n e l y , w h e n2 - c h l o r o p h e n o la n d3 - c h l o r o p h e n o lc o e x i s t i n g ， t h e i rl a gp h a s ea n dt h et i m et or e a c hd e g r a d a t i o nb a l a n c ea l la p p e a r e do b v i o u sh y s t e r e s i s ， t h e i rh a l fl i f eh a do b v i o u sp r o l o n g ，a n dt h e i ru l t i m a t e l yw i p e o f fr a t ea l lh a dal i t t l er e d u c t i o n i tw a so b v i o u st h a tt w oc h l o r o p h e n o l i c c o e x i s t i n gc o u l db r i n gi n h i b i t o r ya c t i o n t ot h e d e g r a d a t i o no fm i x e db a c t e r i a ，a n dt h e i rc o m b i n e da c t i o nw a sa d d i t i v ee f f e c t b yr e s e a r c h i n g t h e b i o d e g r a d a t i o nd y n a m i c s o f c h l o r o p h e n o l s ，i t s h o w e dt h a t 3 。c f i l o r o p h e n o l sb i o d e g r a d a t i o nc o u l db r i n gt w ok i n d so fm o s t l yi n t e r m e d i a t ep r o d u c t ，a n d m e t a b o l i cp r o d u c th a de v i d e n tp r o c e s st h a ti tw a sd e g r a d e da f t e ra c c u m u l a t i o n w ep r e s u m e d t h a t3 - c h l o r o p h e n o l sm e t a b o l i cp a t h w a yw a s ：i to c c u r r e da d j a c e n tp o s i t i o n so x y g e n a t i o ni n t h ee f f e c to fo d d o x i d a s e ，a n dt h e np r o d u c e dc h l o r - c a t e c h 0 1 a f t e rt h i sp r o c e s s ，c h l o r - c a t e c h o l o c c u r r e da d j a c e n tp o s i t i o n sr i n go p e n i n gi nt h ee f f e c to f1 ，2 - d i o x y g e n a s e ；t h e nr e l e a s e d c h l o r i d ei o ni nt h ec o u r s eo fi n t e r n a le s t e r i f i c a t i o n ，a n dw a so x y g e n a t e dt ob em a l e o y ls c e t i c a c i d ；a tl a s t ，i tc a m ei nt r i c a r b o x y l i ca c i dc y c l e k e y w o r d s ：c h l o r o p h e n o l ，m i x e db a c t e r i a ，t o l e r a t i o a ，b i o d e g r a d a t i o n ，c o - m e t a b o l i s m 学位论文独创性声明： 本人所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同事对本 研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。如不实， 本人负全部责任。 论文作者( 签名) ： ( 注：手写亲笔签名) 堑) 圣 学位论文使用授权说明 磁多月舻 河海大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊( 光盘版) 电 子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件或电子文档，可以采用影印、缩印或其 他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的 保密论文外，允许论文被查阅和借阅。论文全部或部分内容的公布( 包括刊登) 授权河海 大学研究生院办理。 论文作者( 签名) ： ( 注：手写亲笔签名) 础6 只垡日 第一章绪论 第一章绪论 1 氯酚类化合物的使用现状及对环境的污染效应 氯酚类化合物是一类用途广泛的芳香族有机物，常用作防腐剂、除草剂、杀 菌剂、有机溶剂等，并且在世界范围内，其产量相当巨大。以美国为例，近几年 一氯酚及二氯酚的平均年产量分别达到1 8 8 0 0t 和3 9 0 0 0t 【1j 。 由于氯酚是一类用途广、毒性大的难降解有机化合物，因此经常因其未经处 理，或处理不完全就释放到环境中，而对自然环境造成极大危害，进而对人及动 物的生命安全带来威胁，在废弃物、污泥、土壤、地表水、地下水、雨水中均已 检测到氯酚的存在【2 1 。 在芳香族化合物中，氯酚类化合物在水中的溶解度是相对较大的。在2 0 下，2 一氯酚( 2 - c p ) 的溶解度为2 8 5 x 1 0 4 m g l ，2 , 4 一二氯酚( 2 ，4 d c p ) 的溶解度 为4 5 1 cm g ，l ，2 , 4 ，6 一三氯酚( 2 ，4 ，6 - t c p ) 的溶解度也达到约8 0 0m g l 【3 1 。同 时由于土壤等固体物质对它的吸附和固定作用较弱1 4 捌，故其可以通过水为载体 广泛地扩散。 由于上述种种原因，美国、日本以及我国等世界上很多国家都将氯酚类化合 物列入了优先污染物名单，如美国环保局( e p a ) 于1 9 7 6 年公布的1 2 9 种优先 污染物名单中，2 一c p 位列第2 4 位，2 , 4 d c p 位列第3 1 位，五氯酚( p c p ) 位列 第6 4 位。我国1 9 9 8 年颁布的国家危险废物名录规定的4 7 种优先控制废物 中，有机农药、木材防腐剂废物、含酚废物等含有大量氯酚类污染物的危险废物 被明确歹u 出。我国的污水综合排放国家标准( g b 8 9 7 8 1 9 9 6 ) 中对氯酚的排放也 做出了具体、严格的规定，要求1 9 9 8 年1 月1 日后建设的一切排污单位，对氯 酚的排放必须遵循以下标准( 列于表1 - 1 ) 。 表1 - 1 我国2 , 4 d c p 、2 , 4 6 - t c p 、p c p 排污标准 最高允许排放浓度( r a g l ) 洲海人学删i + 毕业论文优势复台菌群降解氯酚娄化台物的特性研究 2 氯酚类化合物的环境行为 2 1 吸附和挥发 吸附作用是有机化合物在土壤( 沉积物) 中吸着存在的主要机理之一，它是 指在非极性有机溶剂中，土壤矿物质对有机化合物的表面吸附作用或干土壤矿物 质对有机化合物的表面吸附作用，前者主要靠范德华力，后者则是各种化学键力 的结果。氯酚类化合物的亲脂性较强，因此，在环境中对沉积物和悬浮物上的有 机质的亲和力也较强。其吸附规律是胶体的表面积越大，吸附的量就越大。氯酚 在水体中沉积型粘土上的吸附不大，但在腐殖质上的吸附大。如p c p 在有机质 含量高的沉积物和悬浮物上的吸附效果非常明显，其吸附量正比于底泥中的有机 质含量。其次，氯酚的被吸附量与环境水体中氯酚的浓度也有很好的线性关系， 线性相关系数在o 9 8 以上【6 j 。 挥发作用是有机物质从溶解态转入气相的一种重要迁移过程，挥发速率依赖 于有机物的性质和水体的特征。氯酚类化合物分子中氯原子的个数越多，氯酚的 辛醇水分配系数则越大。但就总体来讲，较之大多数的芳香族化合物，氯酚的 分配系数较小。例如，2 - c p 的分配系数值仅为1 5 1 l ”。因此，虽然氯酚的蒸气压 较低，具有从水中挥发的趋势，但它们的高水溶性和高溶剂化作用减弱了它们的 挥发性。对于水环境中的绝大多数氯酚来说，挥发并不是其重要的消失途径【8 j 。 2 2 氧化、水解及光解 酚类化合物可在水中受分子氧的进攻而产生氧化作用，因此，在含氧量较高 的水体中，低氯代酚存在有非光化氧化的可能性，但多氯代酚不易被氧化。 因为苯环的负电荷密度高，共价键作用很强，因此不易发生水解作用。例如， 要使p c p 上的一个氯原子被羟基取代，必须给予1 3 0 ( 2 2 0 0 。c 的高温和高碱性的 反应条件【9 】a 因此，酚在自然水体中的水解不是其重要的消失途径。 尽管非解离酚的最大吸收波长k 。是2 7 0 n m ，但如与金属原子配合变为阴离 子，其k 。；可超过3 1 0 n m ，因此，酚阴离子容易发生光解作用，而非解离的酚亦 可借助光敏剂的能量转移作用而产生光解。例如，2 - c p 在3 1 3 n m 光作用下转化 为邻苯二酚；2 ，4 d c p 在日光辐射1 0 d 后可降解成黑色的2 一羟基苯醌高聚物；p c p 第一章绪论 在夏季阳光或波长在3 0 0 4 5 0 n m 的紫外光照射7 d 后，可生成氯酚、四氯二羟基 苯和非环分子二氯马来酸【。 2 3 氯酚类化合物在生态系统中的转移 芳香族化合物在生态系统中的环境行为非常复杂，总的规律是生态系统中生 物体吸收环境中芳香化合物的多少与环境中的存留量有关，也与生物种类和特性 有关。生长率较快的生物吸收量较大，脂肪性组织中芳香族化合物的积累较多， 代谢旺盛的生物能更多地降解芳香族化合物，当然还会与生物体本身的营养状况 和环境条件有关。 戴树桂等【1 1 】研究了三氯酚在土壤- d , 麦生态系统中的迁移和降解，结果显 示，在受2 , 4 ，6 t c p 污染的土壤j 、麦生态系统中，小麦的存在对污染物的降解能 够起到积极的作用，土壤中的三氯酚有很大的一部分向小麦迁移，并在其体内得 到完全降解。 2 4 生物降解 虽然氯酚被用作杀虫剂，但它们能被菌类微生物降解和脱氯，且降解的难易 程度与氯原子的取代数有关，含氯越多，稳定性则越高。氯酚被微生物降解的速 率取决于“适应时间”。在生活污水中加入2 - c p 和4 一c p ，浓度l m g l ，在2 0 。c ， 直至3 0 * ( 2 都不能降解【3 】o 但相同浓度的同样化合物却能在受氯酚污染的表层水中 得到降解。因此，可以认为，只有以氯酚为碳源的特殊菌种才能降解氯酚。微生 物对氯酚的降解作用将在本章第五节中作详细介绍。 3 氯酚类化合物在环境中的残留 3 1 大气 就目前来讲，对大气中酚的浓度了解较少，但许多对环境造成污染的酚是在 城市和工业区上空形成，随后沉积到水体和土壤中。 3 2 水体 氯酚广泛分布在水体中，尤其在水体的表面。其浓度根据废水排放源的不同 而存在很大的差异。另外，降雨和水的流动在很大程度上也影响了各种氯酚浓度 河海人学硕士毕业论文 优势复合菌群降解氯酚类化台物的特性研究 的变化。j o n e s 等人发现，纸浆厂排放的废水使加拿大的s u p e r i o rl a k e 的二氯酚 和三氯酚的浓度分别达到4 m g l 和1 3 m g l “】。p i e t 和d r u n t 也发现，在荷兰的 河流和沿海海域，一氯酚、二氯酚和三氯酚的浓度分别为3 之o 、o 0 1 1 5 和 0 0 0 3 0 1 m g l 1 3 1 。 3 3 沉积物 许多氯酚最后归宿到沉积物中，因此在河流底泥中经积累产生的氯酚的浓度 一般都比在水体中高得多，污染也更为严重。而且酚的氯取代基越多，其在沉积 物里的持留时间越长，危害也就更大。例如，加拿大不列颠哥伦比亚地区的木材 防腐厂向沿海水域排放含有大量氯代酚的生产废水，导致海底沉积物中的三氯酚 和四氯酚的浓度达到9 6 m g k g ，且持留时间相当长，污染相当严重1 1 2 】。 3 4 水生植物和无脊椎动物 水生植物对氯酚的吸收起初是很快的，随后达到稳态，时间大约需要 1 0 2 0 m i n ，依化合物种类、植物种类和起始浓度的不同而不同，且对绝大多数植 物来说，吸收速率随温度增加而增加，与p h 值成反比【1 4 】。 无脊椎动物可从水中或食物中吸收氯酚，速度也较快，随后达到稳态。富集 因子的大小与化合物类型、动物类型和吸收条件皆有关系。s c h i m m e l 等发现， 蛤砺对p c p 的生物富集因子( b c f ) 为4 1 7 8 ，而河螺对2 , 4 ，6 - t c p 的b c f 值可 达7 4 0 。3 0 2 0 1 5 1 。 3 5 鱼 鱼的身体组织可以吸收多种酚类化合物，经常可以在鱼体中检测到的酚就包 括氯酚。王芳等通过试验证明，鲫鱼的各个组织，包括胆、肝、肾、肌肉，对 2 - c p 、2 , 4 d c p 、2 , 4 ，6 t c p 和p c p 等四种氯酚都存在明显的吸收，其中鱼胆对 c p s 的b c f 值达到2 0 0 0 6 3 0 0 1 6 1 。k i s h i n o 等也研究了1 2 种氯酚对金鱼的毒性 及在其体内的富集效应，结果表明其毒性及富集因子都随着氯原子取代基的增多 而增加【1 7 】。 4 第一章绪论 4 氯酚类化合物的生物毒性 氯酚具有强烈的致癌、致畸、致突变作用，对细菌、藻类、脊椎动物等诸多 生物皆具有很强的毒性【1 8 1 。其原因是氯酚，尤其是高氯代酚是生命体生长的重要 前提氧化磷酸化作用的强有力抑制剂，即便是它们的代谢中间产物，也能抑 制水体中微生物的生长繁殖1 5j 。 李玉梅等人在研究氯代芳烃对江水细菌的生物毒性时发现，氯原子的存在， 对化合物毒性的贡献要比甲基( - - c h 3 ) 、胺基( - - n h 2 ) 更大，且氯原子个数越 多，其毒性越强【1 9 】。陆光华等人在研究氯代芳烃对绿藻的4 8 h 急性毒性时也发现， 氯酚能够有效抑制绿藻的生长，2 , 4 ，6 - t c p 对绿藻的半数有效浓度( e c 5 0 ) 约为 3 0m g l ，p c p 的e c s o 值仅为3 8m e , l ，作者认为，氯酚类化合物的毒性机理可 能是其对绿藻产生极性麻醉作用，毒性的强弱与空间参数或疏水性有关【2 0 】。氯酚 对脊椎动物也可产生很强的毒性，对其生长和繁殖都会起到明显的抑制作用。以 鱼类为例，4 - c p 的半数致死浓度( l c 5 0 ) 为3 8 - 1 4 0m g l ，而p c p 的l c s o 值不 足1 m g l ”。 5 氯酚类化合物生物修复技术的研究 5 1 微生物对氯酚类化合物的降解作用 人们早就发现微生物对自然界有机物的循环起着重要的作用。随着工农业的 快速发展，进入环境中的外来有机物越来越多，其中许多有机污染物对微生物的 生长和繁殖有抑制作用，甚至杀灭作用。但是，研究发现，经过长期的接触驯化， 有些微生物能通过自然变种，或形成诱导酶，具备了新的代谢功能，从而能降解 或部分转化这些外来化合物。到目前为止，已经发现、分离出多种对氯酚类芳香 化合物具有代谢功能的微生物。 5 1 1 细菌对氯酚的代谢 对节杆菌( a r t h r o b a c t e rs p ) 的研究证实甲基化是氯酚代谢的机制之一。例 如，五氯酚、4 一氯愈创木酚、4 , 5 一二氯愈创木酚经甲基化转变为响应的邻苯二甲 醚。但也有例外，如节杆菌1 3 9 5 可先将3 , 4 ，5 一三氯愈创木酚先羟基化，再甲基化， 随后产生的化合物不能再被该菌株进一步降解【2 “。 河海人学顾t 毕业论文 优势复台菌群降解氯酚类化合物的特性研究 另一种降解机制是由氯酚形成儿茶酚。诺卡氏菌( n o c a r d i as p ) 可将2 - c p 转变成3 一氯儿茶酚，将3 c p 和4 c p 转化成4 氯儿茶酚【2 2 1 。相似地，假单胞菌 b 1 3 能利用4 - c p 作为唯一碳源和能源，并随着4 - c p 的代谢，将2 - c p 和3 - c p 完全降解而不积累中问代谢产物【矧。无色杆菌( a c h r o m o b a c t e rs p ) 静止细胞悬 浮液在与普通的儿茶酚2 , 3 双加氧酶不同的独特的儿茶酚1 , 6 双加氧酶作用下， 将4 一氯儿茶酚代谢成4 氯2 羟基粘康酸半醛，将3 , 5 一二氯儿茶酚代谢成3 ，5 一二氯 2 羟基粘康酸半醛，这两种产物均不能被进一步代谢【矧。恶臭假单胞菌将4 c p 代谢成4 氯儿茶酚，再在间位裂解酶即儿茶酚2 ，3 一双加氧酶作用下产生2 一羟基5 一 氯粘康酸半醛，这种产物可积累到起始底物的1 0 陋j 。 假单胞菌b 1 3 ( p s e u d o m o n a ss p b 1 3 ) 和产碱杆菌a 7 ( a l c a l i g e n es p a 7 ) 两株细菌被用于产生改变了代谢芳香化合物能力的遗传工程菌。假单胞菌b 1 3 能降解氯酚，产碱杆菌a 7 能通过问位裂解途径利用酚类，但不能直接利用氯酚。 将两菌杂合产生一突变因子a 7 2 ，它能通过邻位裂解途径利用酚类，同时，也 具备了代谢单氯代酚以及3 一氯苯甲酸的能力，即具备了原来两种细菌的降解特 征。从突变因子a 7 2 中最终可以分离出邻苯二酚酶，对氯代芳香化合物具有高 活力的环异构酶和在氯代芳香化合物降解途径中将氯代粘康酸脱氯化的专一性 酶等三种酶系【2 6 】。 陈勇生等从3 个不同地点采集的混合土壤中，分离到2 株可利用2 ，4 一d c p 为唯一碳源和能源的假单胞菌d c p 一1 和d c p - 2 。在此基础上，研究探索了菌株 d c p 1 降解2 , 4 - d c p 的影响因素和降解过程以及其遗传特性。结果表明菌株 d c p 1 可降解2 , 4 - d c p ，并有氯离子、邻氯酚和醌积累；经检测该菌株中有一条 迁移速率比p u c l8 小的质粒 矧。 可降解2 , 4 ，5 三氯苯氧乙酸的洋葱假单胞菌( p s e u d o m o n a sc e p a c i a ) a c l l 0 0 能够对多种氯酚类化合物进行脱氯。该菌株静止细胞悬浮液能够在3 h 内能够对 二氯酚、三氯酚、四氯酚，甚至五氯酚进行脱氯【2 8 】。 到目前为止，常见的可降解c p s 的细菌总结于表1 - 2 1 2 9 1 。 第一章绪论 表1 - 2 可降解氯酚类芳香化合物的细菌 5 1 2 真菌对氯酚的代谢 真菌对氯酚类的代谢通常也发生甲基化，其方式类似于细菌的甲基化方式 【3 0 】。对从鸡舍粪便中分离得到的1 1 6 株真菌的研究表明，5 9 的菌株能利用 2 ，3 ，4 ，6 四氯酚产生2 , 3 ，4 ，6 四氯愈创木酚，转化效率从1 到8 3 不等。将摇瓶 培养物密闭保温5 d ，使其在好氧和厌氧条件下转化，表现出这种转化能力的真 菌包括曲霉( a s p e r g i j j u ss p ) 、拟青霉( p a e c i l o m y c e s s p ) 、青霉( p e n i c i l l i u m s p ) 和帚霉( s c o p u l a r i o p s i ss p ) p “。一些菌株代谢2 ，3 ，4 ，6 四氯酚未积累苯甲醚，提 示存在另一种氯酚代谢机制【加】。生长在酚中的胶粘红酵母( r h o d o t o r u l ag l u t i n i s ) 能将3 一c p 转化成4 一氯儿茶酚i 埘。黄孢原毛平革菌( p h a n e r o c h a t ec h r y s o s p o r i u m ) 也是对氯酚类化合物具有非专一性降解作用的真菌，还能降解菲、蒽等多环芳烃 和多氯联苯，以及各种染料等【3 3 】。 白腐菌是属于担子菌亚门的一类真菌，因腐朽木材呈白色而得名，是能够降 解木材主要成分木质素的微生物之一。自1 9 8 5 年b u m p u s 等在s c i e n c e 上报道白 腐菌对持久性环境污染物质的降解之后i 州，白腐菌就受到微生物学家和环境毒理 学家的关注。根据大量的研究报道，白腐菌能够对芳香族化合物起到到目前为止 已知的最佳的降解效果，其中就包括氯酚类芳香化合物。白腐菌通过分泌胞外酶 河海人学顶l 毕业论文优势复台菌群降解氯酚类化台物的特性埘f 究 木素过氧化酶和锰过氧化酶降解氯酚，通过对中间产物进行分析表明，醌和 醛类物质是主要的中间产物【3 5 1 。以2 ，4 d c p 为例，2 ，4 d c p 首先经木素过氧化 酶氧化形成2 一氯一1 ，4 苯二醌，然后被还原形成2 氯1 ，4 一二苯酚，再甲基化后，又 可形成木素过氧化酶的底物2 氯一1 ，4 羟甲基苯。在木素过氧化酶和锰过氧化酶的 相继作用下，最终发生破环反应，苯环开裂后的产物就容易被其他微生物代谢了。 5 1 3 复合茵培养物对氯酚的代谢 废水污泥上清液使1 6 m g l 的2 - c p 和3 一c p 完全降解，需要1 4 2 5 d 的时间。 但其经过驯化之后所得的污泥培养物，可以在一周之内将3 种单氯酚以及 2 ，4 一d c p 降解完全，同时对2 , 5 二氯酚( 2 ，5 一d c p ) 、2 , 4 ，6 t c p 产生一定的降解能 力【3 6 】。接种1 0 的城市污水污泥，在厌氧条件下保温培养，以完全降解浓度为 5 0 m g l 的一氯酚，结果2 c p 需要3 周，3 一c p 需要7 周，4 一c p 需要1 6 周【”1 。 通过测定甲烷的净产量这种方法可以检测氯酚的矿化程度，s u f l i t a 等人驯化所得 的污泥培养物可以在短时间内使2 - c p 完全矿化；而用来处理3 - c p ，则需要5 周 的滞后期，方可产生甲烷；而4 - c p 则不能矿化。在2 - c p 的降解过程中，可回收 到酚这种起始代谢产物，进而产生甲烷，这与在3 一氯苯甲酸的还原代谢中的起始 步骤是脱氯的研究结果是吻合的【3 8 】。 未稀释的污泥样品通过不断接种2 0 m g l 单氯酚底物进行驯化，能够达到在 一周内代谢2 5 m g l 单氯酚的水平。经2 - c p 驯化的污泥培养物可以同样的速率 代谢2 - c p 和4 - c p ，代谢2 ，4 d c p 时速率稍慢一些，但不能代谢3 - c p 、2 , 3 。d c p 、 2 ，5 d c p 和2 , 6 一d c p 。经3 - c p 驯化的污泥培养物可代谢4 - c p ，经3 , 4 d c p 和 3 ，5 d c p 驯化的污泥可代谢3 一c p ，也可以较慢的速率代谢2 - c p 、2 , 4 d c p 和 3 , 4 一d c p 。经4 - c p 驯化的污泥培养物比经其它氯酚驯化的似乎可适应更广泛的底 物范围【3 9 】。 经实验证明，驯化所得的混合微生物对氯酚的降解效果比单一菌更高，更明 显。温桂照等人从s b r 系统的活性污泥中筛选、培育得到优势菌，经组合，选 取具有高效降解芳香族化合物的优势混合菌，即假单胞菌和诺卡氏菌的组合菌， 应用于氯代芳香族化合物的降解试验。通过与白腐菌的对比降解试验结果比较， 除了p c p 外，优势混合菌对其余氯酚的降解效果均优于白腐菌。且混合菌对温 度、p h 值等的要求也较低，易于在各种环境中保持竞争优势 4 0 1 。 第一章绪论 5 1 4 高效工程茵的创建及其对氯酚的降解 难降解污染物高效降解工程菌的创建已经成为当今环境生物技术的研究热 点，特别是分子生物学和生物技术的发展极大地推动了各种氯代芳烃的微生物降 解研究，这方面已经有不少成功的例子。恶臭假单胞菌的p a c 2 5 、p w r l 质粒能 编码4 氯儿茶酚氧化酶系，故能够完全降解3 一氯苯甲酸( 3 一c b a ) ，但由于起始 酶要求底物高度专一性，不能降解4 ，氯苯甲酸( 4 c b a ) 。t o l 质粒是具有自转 移能力的编码苯甲酸类降解的质粒，c h a k r a b a r t y 等利用它的基因转座特性，在 4 - c b a 存在的条件下，将含有t o l 质粒的4 - c b a + 细胞与带p a c 2 5 质粒的4 - c b a 细胞混合培养，通过接合转移，t o l 质粒1 1 7 k b 中的3 9 k b 的基因片段转座至 4 - c b a 细胞的染色体上，结果提供了苯甲酸氧化特异的酶系的基因，故可将 4 - c b a 转化至4 一氯儿茶酚，同时，质粒p a c 2 5 ( 1 1 7 k b ) 突变为p a c 2 7 ( 1 1 0 k b ) ，保 持了全部3 - c b a 的降解基因，可将4 氯儿茶酚彻底降解1 4 “。 在国内对这一领域的研究也日趋活跃。钟文辉从污水厂中分离出一菌株 s s l 6 ，可利用苯酚、水杨酸等为唯一碳源和能源，但不能利用2 , 4 d c p 、儿茶 酚、2 一氯苯甲酸等为唯一碳源生长。菌株d t 2 4 1 1 携带有完整可降解2 , 4 d c p 的 的2 , 4 一d c p 羟化酶基庆q ( d c p a ) ，作者从d t 2 4 1 1 上提取出这种基因片段p b s l 1 2 用h i n d j 1 酶切后克隆至s s l 6 基因载体p k t 2 3 0 上，获得了r b s k l 1 等几十个 转化子。经实验证明，新获得的工程菌已具有很好的降解2 , 4 。d c p 的能力i 捌。 5 2 微生物对氯酚类化合物的代谢方式 氯酚类化合物受微生物的作用而被降解是一个微生物细胞与化学物质相互 作用的过程，主要有以下几个步骤：第一步，污染物通过自由扩散或者其他方式， 主要是需要消耗能量的被动形式，而进入微生物细胞内，消耗能量的形式如微生 物细胞的主动吸收；笫二步，微生物产生合适的酶，酶在细胞体内与氯酚类芳香 化合物反应，生成一种或几种中间物；第三步，苯环裂解前体物在酶的进一步作 用下而发生苯环裂解：第四步，苯环裂解后被再转化为其他中间产物；最后，将 各种裂解后的降解中间产物转化为可被其它微生物细胞所利用的物质。氯酚的这 种代谢过程可由单一微生物，也可由多种微生物完成。 微生物对氯酚的代谢方式主要有生长代谢( g r o w t hm e t a b o l i s m ) 和共代谢 河海人学顿t ：毕业论文优势复台菌群降解氯酚类化台物的特性研究 ( c o m e t a b o l i s m ) 两种。 5 2 1 生长代谢 生长代谢是指部分微生物具有分解氯酚的酶系，氯酚作为这些微生物生长的 唯一碳源和能源而被分解利用。微生物之所以能将氯酚类芳香化合物当做自身所 需的碳源物质，一是因为氯酚的化学组成和分子结构适合于这些微生物的代谢特 点，二是环境中缺少更适合的碳源物质。 目前，对于这种以获取能量为目的的微生物代谫f 过程及环境条件对其代谢途 径及底物消耗速率的影响，己经有了深入的了解，但是将氯酚作为碳源物质的分 解代谢常常是在实验室中氯酚浓度较高的情况下进行的，而对于受氯酚污染的自 然水体的微生物修复研究，还相对较少。 5 2 2 共代谢 共代谢是微生物降解难降解有机物的重要的代谢方式。共代谢又称协同代 谢，最早由l e a d b e t t e r 于1 9 5 9 年提出，其定义为在生长基质的存在时，对非生 长基质的氧化【4 3 】。后来，j e n s o n 将概念进行了扩展，称之为共代谢，不仅指生长 基质存在时繁殖细胞对非生长基质的利用，而且也指生长基质不存在时休眠细胞 对非生长基质的转化 4 4 1 。 微生物的共代谢作用主要存在以下两种情况： ( - - ) 共基质代谢 共基质代谢是指微生物在正常生长代谢过程中对非生长基质的共同代谢。这 种代谢是指当生长基质存在时，生长基质的代谢能够提供足够的碳源和能源供微 生物生长，并诱导产生相应的降解酶来降解非生长基质，改变非生长基质的化学 结构，最终达到降解非生长基质的目的。但是，微生物不能从降解非生长基质的 过程中受益，既不能从基质的氧化代谢中获取足够能量，也不能从基质分子所含 的c 、n 、s 或p 中获得营养进行生物合成。 ( 二) 混合菌株作用 混合菌株作用主要体现在微生物问的协同代谢上，是指特定微生物对污染物 的降解不能为微生物的生长提供碳源和能源，但是其降解产物在第二个菌株的作 用下，可以继续共代谢或完全矿化。例如，p c p 完全脱氯就是由几种不同细菌分 第一章绪论 别进行，脱氯后生成的苯酚再由其他细菌进一步分解为甲烷和二氧化碳【4 5 】。徐向 阳等人利用从受酚污染的水体中分离出的两株菌s p l 和s p 2 的混合培养物作用 于氯酚时，较之它们各自单独作用时，具有了更高的降解活性【蚓。 当然，两种可以对同一目标物起作用的不同菌株之间不一定就存在着协同作 用，有时候甚至存在着竞争1 4 w 。因此，共代谢中混合菌株的选择很重要，选择不 当就有可能对共代谢的结果造成不利的影响。 共代谢是需能的，需要一级基质来提供碳源和能源，或者通过对一级基质的 代谢诱发可降解二级基质的酶来达到降解二级基质的目的，并提供碳源和能源， 一级基质和二级基质之间可能会存在竞争性抑制作用。 共代谢过程不仅要选择合适的一级基质，而且要求一级基质与二级基质保持 合适的浓度比。此外，营养物质的加入对提高共代谢率也很重要。 微生物的共代谢过程是目前难降解物质生物降解的主要研究热点。许多传统 意义上的难降解物质的生物降解均是以共代谢过程开始而完成降解全过程的。氯 酚类芳香化合物的微生物降解很多属于共代谢类型。例如，j o h n 等人用酚和甲 苯混合物富集的污泥培养物能够迅速降解2 , 4 d c p 等多种氯酚l 蚓。尽管共代谢 的基质还没有完全研究清楚，但是其作为一种代谢机制广泛存在于共基质的生物 降解过程中。深入研究共代谢不仅有助于我们更加准确地认识环境中共代谢情况 下物质的生物降解，而且为我们寻求对受氯酚污染的自然水体的生物修复工作提 供了思路。 5 3 微生物对氯酚类化合物的脱氯机制 氯代芳香化合物在好氧、厌氧环境中的生物降解研究表明，其与一般芳香化 合物相比，主要是脱氯过程，不同的氯代程度和氯原子在苯环上的位置都与脱氯 有直接的关系。氯原子的存在使苯环的降解难度增加，同一个化合物中的两个苯 环，一个环上有氯基取代，另一个环上没有氯，在微生物的作用下首先被降解的 是没有取代氯的苯环。如4 氯联苯在被微生物降解时，总是无取代氯的苯环先破 裂，并被降解形成乙醛和丙酮，以及4 氯苯甲酸。4 氯苯甲酸即由原氯取代苯环 未被降解的产物，这时4 一氯苯甲酸要重新经过脱氯、开环等一系列的降解过程1 4 9 1 。 因此，对于氯代芳香化合物，生物降解过程影响最大的一个关键步骤是将苯环上 的氯原子去除。 海人学硕j ：毕业论文优势复合菌群降解氯酚类化合物的特性研究 氯原子的去除受外界环境的影响很大，尤其是环境中的氧化还原电位，因此 脱氯存在着氧化脱氯和还原脱氯，并且在好氧和厌氧生物降解的条件下脱氯机制 是不同的。 5 3 1 好氧生物降解的脱氯机制 迄今为止，人们己对氯代芳香化合物的好氧生物降解作了较深入的研究。大 量研究表明，在好氧条件下一些氯代程度较低的芳香化合物能够被生物降解，降 解速率也较快；而一些氯代程度较高的芳香化合物，如p c p 、p c b 往往就很难 被生物降解【5 0 l 。只有当苯环断裂成代谢中间产物、有机氯离子转化为无机氯离子 时，氯代芳香化合物的生物降解才可被认为是完全的。一般认为分子内相邻两个 碳原子问的直接脱h c i 或c 1 2 而形成双键的反应只能发生在链烃类化合物上，而 不可能发生在芳香环上，因为芳香环上的c c l 键是非常稳定的，对亲核取代反 应具有极强的抵抗性。其脱氯作用通常只有在伴随其他一系列反应、削弱了c c l 键的稳定性后才能进行。氯代芳香类化合物好氧生物降解中的脱氯作用可分为先 开环再脱氯和先脱氯再开环两种情况： ( 一) 先开环再脱氯 氯代芳香化合物是抗亲核反应的，但脱氯过程过程若在氯代芳烃转化成非芳 香类的中间产物后再进行，则将轻松得多。研究表明上述途径最常见的历程是氯 代儿茶酚邻位裂环后脱氯，氯是在碳卤键经异构酶或还原酶的不稳定化后自发去 除的【5 1 】。 所有能利用氯代芳香类化合物的好氧微生物均含有催化邻位裂解途径的酶 系，几乎所有的氯代芳香类化合物都将在微生物的这种酶的作用下转化为儿茶 酚。下面以4 一c p 为例介绍这种降解过程：在p s e u d o m o n a ss p 好氧培养中，4 - c p 首先在单氧化酶作用下发生邻位氧化，生成4 一氯儿茶酚；4 - 氧儿茶酚在1 ，2 双加 氧酶的作用下发生邻位开环生成氯代顺，顺一粘糖酸，内酯化过程中释放出氯离子， 并被氧化成马来酰基乙酸进入三羧酸循环【5 2 】，如图1 - 1 。 第一章绪论 与 图1 - 1 4 - 氯酚的邻位开环降解途径 - - o o h h 通常认为，在氯代芳烃的生物降解过程中，氯代儿茶酚只发生邻位开环，很 少发生问位开环。但近年的研究表明，在一定条件下，也存在间位开环。h o l l e n d e r 等在以4 一c p 和4 一甲基苯酚( 4 - m p ) 为底物富集培养过程中筛选得菌株 c d 日历d h 口5t e s t o t e r o n ij h 5 ，能同时降解4 - c p 和4 - m p 。对其降解中间产物及降 解酶的检测都证实了在该菌的作用下，4 - c p 是经问位开环降解的【5 。降解途径 如图1 2 。 hn d _ o o h 图1 2 4 氯酚的间位开环降解途径 氯代儿茶酚的问位开环的发现使得氯代芳烃和甲基芳烃这两种曾认为是生 物代谢不相容的两类化合物的同时降解成为可能，为代谢不相容化合物的生物降 解提供了新的思路。 ( - - ) 先脱氯再开环 沁 m 嘣八丫审 十叫八、a (n 洲海人学硕：毕业论文优势复台菌群降解氯酚类化台物的特性研究 丌环前脱氯有羟基取代氯和c c l 键氧化断裂两种途径。 j o h n s t o n 等首先提出了芳香环羟基化取代氯的证据【5 。他们发现假单胞菌具 有利用3 一氯苯甲酸作为唯一碳源和能源物质的能力，生长于苯甲酸或3 一氯苯甲 酸基质中的培养物能将3 氯苯甲酸氧化成3 羟基或2 ，5 二羟基苯甲酸，而无滞后 期。a p a i a l a h a t i 通过实验观察到氯酚红球菌p c p 1 ( r h o d o c o c c u sc h l o r o p h e n o l i c u s p c p i ) 对p c p 的羟基取代脱氯过程i s 5 】。1 8 0 标记试验表明p c p 的脱氯首先是 在水解酶催化下的氯水解取代而不是在加氧酶催化下进行的，但这个过程仍需要 分子态氧的存在，形成的四氯对羟基醌再经过三次还原性脱氯，先后形成三氯对 苯二酚、2 ，6 二氯对苯二酚和一氯对苯二酚，然后再开环进入下一步的降解过程。 如图1 3 。 吨卫q 一 图1 - 3 p c p 的好氧生物脱氯降解途径 c c 1 键氧化断裂由双加氧酶催化完成，它是从氯代芳烃上去除氯代基的一 个替补途径。洋葱假单胞菌矿化2 氯苯甲酸就是典型的例【5 6 1 。由双加氧酶催 化产生的顺二氢二酚( c i s d i h y d r o d i 0 1 ) 的氧化去除机理也可以解释假单胞菌 c b s 5 3 对4 一氯苯乙酸脱氯。 近年来，人们发现了另一种由双加氧酶催化的脱氯机理，生长于5 一氯香草酸 基质中的一种细菌能定量地释放出氯离子，形成代谢中间产物4 一氯儿茶酸，4 ，5 双加氧酶进一步将它转化为5 一氯儿茶酸，酰基氯被亲核取代后裂环，最后形成丙 酮酸和草酸乙酸【”。 第一章绪论 5 3 2 厌氧生物降解的脱氯机制 因氯原子强烈吸引电子云使苯环上电子云密度降低，在好氧条件下，氯代芳 香化合物，特别是多氯芳烃类化合物很难在氧化酶的作用下发生氧化反应而得到 降解；相反，在厌氧条件下，环境氧化还原电位较低，电子云密度较低的苯环在 酶的作用下易受到还原剂的亲核攻击，氯原子就很容易被亲核取代，形成氯代程 度较低、毒性较小、更易被好氧微生物氧化代谢的部分脱氯产物，甚至于在特定 的环境中，多氯芳烃类化合物也可以直接矿化为c 0 2 、c f i a 及h c l 58 1 。 j a m e s 等从河底淤泥中筛选出一株能在厌氧条件下利用2 - c p 生长的细菌， 经鉴定，属c y s t o b a c t e r i n c a e 。在厌氧条件下，该菌能以乙酸盐为电子供体，将 2 - c p 还原脱氯转化为苯酚【5 9 】。在多氯酚的微生物降解过程中，人们发现邻位氯 取代基较间、对位容易还原脱除。m a d s e n 等研究了t c p s 对微生物的毒性以及 产甲烷菌培养液对2 ，4 ，6 - t c p 的降解，结果表明，2 , 4 ，6 t c p 的转化途径是：依次 脱去邻位氯取代基生成2 , 4 一d c p 和4 - c p l 6 0 1 。 由于p c p 应用的广泛性和相对易于厌氧降解，在氯酚类化合物中p c p 的厌 氧降解研究最多。n i s h i n o 等【6 1 】在对经p c p 驯化的产甲烷菌对p c p 还原脱氯进行 研究后，得出结论：在驯化1 0 d 的产甲烷菌作用下，p c p 的脱氯主要发生在羟基 邻位；当驯化时间为6 个月时，p c p 的脱氯可在邻、间、对同时发生。图1 - 4 是 产甲烷菌在经驯化后对p c p 的降解示意图。 i 口 壬大学硕 ：毕业论文 优势复合菌群降解氯酚类化合物的特性研究 图l - 4 产甲烷菌作用下p c p 的厌氧脱氯途径 在厌氧或缺氧条件下氯酚类化合物生物降解方面的研究表明，在适宜的条件 下，厌氧环境中存在多种的、大量的、潜在的微生物，这是因为大多数还原脱氯 需要多种微生物的参与，首先多种微生物共存易于创造厌氧环境；其次，一种微 生物要靠其他微生物作为电子供体和受体；另外，一种微生物可以借助其他微生 物消除抑制性的中间代谢产物，从而使降解进一步完成。 5 4 氯代芳烃化合物生物降解的影响因素 5 4 1 易降解有机物对氯代芳烃降解的影响 对于氯代芳烃类化合物，基于降解过程中，生长基质所起到的作用不同，可 将投加的生长基质分为两个类型： ( 1 ) 氯代芳烃单基质时抑制所处环境中微生物的呼吸作用，而当与易降解 的物质共基质后，微生物可以部分利用所投加基质作为碳源，一定程度上缓解了 所受的抑制作用。同时易降解基质的存在，也有利于菌种迅速繁殖，增强微生物 的活性，进而促进氯代芳烃的降解。在目前的研究以及应用中，一般选择葡萄糖、 蔗糖、甲醇、乙酸盐、淘米水、生活污水等作为该类生长基质。 第一章绪论 张晓健等研究了添加易降解物质时各种污染物，包括氯酚类化合物在内的降 解氧化率的变化情况。结果表明，这种方法可以有效提高污染物的降解氧化率， 添加了3 0 m g lb o d 5 的情况下，2 , 4 一d c p 的氧化率从未添加时的2 9 增加到了 4 1 【6 2 j 。 ( 2 ) 微生物对某些氯代芳烃之所以难降解，是因为很多目前造成环境污染 的氯代芳烃都是人工合成的，自然界并不存在，微生物也就不能分泌可以降解这 些氯代芳烃的酶。所以在这种情况下，可选择非生长基质的类似物或中间代谢产 物作为生长基质，使降解微生物在降解生长基质的同时，也能适应非生长基质的 化学特性。这也是利用了代谢酶的可诱导性。在目前针对氯酚的研究以及应用中， 可选择氯苯、苯酚、氯酚等作为该类生长基质1 6 3 1 。 5 4 2 生长基质的投加量 菌种对非生长基质的降解效果，除了和投加的生长基质的种类有关之外，和 生长基质的投加量也有着密切的关系，也就是说，非生长基质的降解效果必须通 过维持适当的生长基质浓度来达到最优。投加量太少，起不到促进的作用；投加 量过多，也会造成生长基质和非生长基质之间的交叉非竞争性抑制作用。 徐向阳等人在研究混合菌株对污染物的降解能力时，也研究了外加不同浓度 的葡萄糖和酵母膏对污染物降解的影响。研究结果表明，低浓度的葡萄糖和酵母 膏对水体中苯酚的降解有一定的强化作用，而高浓度的葡萄糖和酵母膏则无强化 作用【4 6 】。 5 4 3 营养物质 微生物的生长需要足够的营养来维持。微生物的营养物有六大要素，即碳源、 氮源、能源、生长因子、无机赫和水。因此，若要微生物能够健康快速的生长， 除了需要投加生长基质来保证足够的碳源之外，还需要投加一定量的生长基质无 法提供的物质，如氮、磷、铁、维生索以及一些微量元素等。这些物质虽然在共 代谢的过程当中，投加的量不是很多，但却能直接影响到最后的降解效果。 s a n d r a 6 4 1 等人在研究多氯联苯的生物降解性时，对添加了维生素b 1 2 。和未添 加了维生素b t 2 。的生物降解系统进行了比较。他们发现，3 6 d 之后，未添加维生 素b 。2 。的系统中，五氯苯依然占系统中存在的多氯联苯量的9 7 ，而添加了维生 河海人学硕士毕业论文优势复合苗群降解氯酚类化台物的特性研究 索b 。2 。的系