（环境科学专业论文）cd对超富集植物圆锥南芥（arabis+paniculata+f）抗氧化系统的影响.pdf

中山大学硕士学位论文 生物量仅增加了7 。高浓度的c a ( 2 0 m 9 1 ) 开始抑制ap a n i c u l a t a 的生长，但 其影响并不显著。 3 中，低浓度的c d ( 2 5 一l o n l g ，1 ) 添加导致ap a n i c u l a t a 根部丙二醛 ( m y d r o a s c o r b a t e ，m d a ) ，0 2 d 和h 2 0 2 含量降低；超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ，s o d ) ，愈创木酚过氧化物酶( g u a i a c o lp e r o x i d a s e ，g p x ) ，抗坏血 酸过氧化物酶( a s c o r b a t ep c r o x i d a s e ，a p x ) ，谷胱甘肽还原酶( g l u t a t h i o n e r c d u c t a s e ，g r ) 活性下降；半胱氨酸，非蛋白巯基( n o n p r o t e i n t h i o l s ，n p s h ) 和还原型谷胱甘肽( g l u t a t h i o n e ，g s h ) 含量降低。叶片部分2 5 l o m g nc d 添 加对m d a ，0 2 d 和h 2 0 2 的影响不显著，2 0 m g nc a 使得m d a 含量显著上升， 比对照提高了约6 9 5 。叶片s o d ，c a t ，g p x ，a p x 和g r 活性基本呈现上 升趋势。 总体来看，ap a n i c u l a t a 对c d 有较强的耐受能力和富集c d 的能力。中、 低浓度的c d 添加( 2 5 ，5 ，l o m g 1 ) 缓解了根部的氧化胁迫，高浓度c d 处理对 a p a n i c u l a t a 产生了氧化胁迫，此时ap a n i c u l a t a 的抗氧化系统发挥了积极的作 用清除r o s 。 关键词：c d a p a n i c u l a t a 抗氧化系统r o s 中山大学硕士学位论文 a n t i o x i d a t i v ed e f e n s ea g a i n s tc di nan e w l y d i s c o v e r e dc a d m i u mh y p e r a c c n m u l a t o r , a r a b i s p a n i c u l a t ae m a j o r e n v i r o n m e n t a ls c i e n c e n a m e ：z h a ox u a l m s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rq i ur o n # a n g a b s t r a c t p h y t o r e m e d i a t i o nh a sb e c n gan e w l yd e v e l o p e d g r e e nt e c h n o l o g y , i nw h i c h h y p e r a c x ：u m u l a t o r sw e r eu s e dt oi c i b o v ce x c e s sh e a v ym e t a l si ns o i l c di so n oo ft h e m o s tp o t e n t i a l l yh a z a r d o u sh e a v ym e t a l sw i t hg r e a tt o x i c i t y , a n dh a sc a u s e dd i f f e r e n t s o i lc o n t a m i n a t i o ni nm a n ya r e a s i tw i l lb eo fg r e a te c o l o g i c a la n de c o n o m i cb e n i f i t t or e m e d i a t ec d p o l l u t e ds o i lu s i n gh y p e r a c c u m u l a t o r s a n t i o x i d a t i v es y s t e mi n p l a n t i so n eo ft h ei m p o r t a n ts y s t e m sa g a i n s ta d v e r s e e n v i r o n m e n t i tc a ne f f e c t i v e l ys c a v e n g ee x c e 潞r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( s o s ) i n d u c e db yh e a v ym e t a l s , t h u si t p l a y e d a ni m p o r t a n tm l ei n h e a v ym e t a l d e t o x i f i c a t i o n h y d r o p o n i cc u l t u r ea n de n z y m a t i ca c t i v i t ya s s a yw e r eu s e di nt h i s p r o j e c tt os t u d yt h ea c c u m u l a t i o no fc di nan e w l yd i s c o v e r e dh y p e r a c c a m u l a t o r ( a r a b i sp a n i c u l a t af ) a n dt h ee f f e c t so fc ao ni t sa n t i o x i d a t i v es y s t e m t h em a i n l y r 酷- t l i t sa r ea sf o i l o w s ： 1 ap a n i c u l a t ah a sg r e a t 曲i l i t yo fc aa c c u m u l a t i o n c ac o n c e n t r a t i o ni nb o t h l e a v e sa n dr o o t so f p a n 缸- u a t ai n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n gl e v e lo fc a a p p l i c a t i o ni nt h en u t r i e n ts o l u t i o nf r o m0 - 2 0 r a g 1 t h eh i g h e s ta c c u m u l a t i o ni n l e a v e sa n dr o o t so f a 尸缸摊妇f 4 细a p p e a r e d 砒2 0 m 鲫c at r e a t m e n t , w h i c hw c t e 1 6 6 2a n d8 6 7 0 m g k gd wr e s p e c t i v e l y c dm a i n l ya l l o c a t e di nr o o t so fa m 中山大学硕士学位论文 p a n i c u l a t a ，w i t hap r o p o r t i o no fm o r et h a n5 0 2 m o d e r a t ea n dl o wl e v e lo fc dt r e a t m e n t ( 2 5 5 ，1 0 t u f a ) p r o f o u n d l yp r o m o t e d t h eg r o w t ho fa p a n i c u l a t a ，a n dt h e i rb i o m a s si n c r e a s e da b o u t2 0 8 ，2 4 o ， a n d2 6 9 ，r e s p e c t i v e l y t h eb i o m a s so fc o n t r o l l e ds e e d l i n g sw r h o u ta n yc a t r e a t m e n to n l yi n c r e a s e d7 t i i g hl e v e lo fc dt r e a t m e n t ( 2 0 m g a ) r e d u c e dt h e g r o w t h , b u tt h ee f f e c tw a sn o ts i g n i f i c a n tc o m p a r e dt ot h eg r o w t ho fc o n t r o l l e d o n e s 3 m o d e r a t ea n dl o wl e v e lo fc dt r e a t m e n t ( 2 5 1 0 m g n ) r e d u c e dt h ec o n t e n to f m d a , 0 2 1a n dh 2 0 2i nr o o t so f a p a n i c u l a t a d e c r e a s e da c t i v i t yo fs o d ，g p x , a p xa n dg ra n dc o n c e n t r a t i o no fc y s t e i n e ，h p s h ，a n dg s hw e r ea l s oo b s e r v e d i nr o o t so ft h e s et r e a t m e n t s i nl e a v e s 。2 。5 t o m g nc da p p l i c a t i o nd i dn o te f f e c t m d a , 0 2 4a n dh 2 0 2s i g n i f i c a n t 堍h i g h e rc o n c e n t r a t i o no fc ai nn u t r i e n t s o l u t i o nl e a d e dap r o f o u n di n c r e a s eo fm d ac o n t e n t a b o u t6 9 5 h i g h e rt h a n t h a to ft h ec o n t r o l l e do n e s a c t i v i t yo fs o d ，c a t , g p xa n da p xb a s i c a l l y s h o w e da ni n c r e a s i n gp a t t e r nw i t hi n c r e a s i n gl e v e lo fc dt r e a t m e m o nt h ew h o l e ，ap a n i c u l a t ap r e s e n t e dg r e a ta b i l i t yo fc dt o l e r a n c ea n dc d a c c u m u l a t i o n m o d e r a t ea n dl o wl e v e lo fc at r e a t m e n t ( 2 5 ，5 ，l o m g n ) a l l e v i a t e dt h e o x i d a t 押es t r e s si nr o o t s ；h i g h e rl e v e lo fc aa d d i t i o n ( 2 0 m 帅c a u s e do x i d a t i v es t r e s s , w h i c hw a sf o u g h ta g a i n s tb ya n t i o x i d a t i v es y s t e mb ys c a v e n g i n gr o s e f f e c t i v e l y k e yw o r d s ：c a , a p a n i c u l a t a , a n t i o x i d a t i v es y s t e m , r o s 中山大学硕士学位论文 第1 章前言 1 1 土壤重金属污染状况 土壤是人类赖以生存的重要自然资源，是人类生态环境的主要组成部分之 一，并且是人类社会的生存基础。土壤作为开放的缓冲动力学体系，在与周围环 境进行物质和能量的交换过程中，不可避免地会有外援重金属进入其中。重金属 对土壤的污染主要来源于工业废渣、废气中重金属的扩散，沉降、累积，矿山的 开采和冶炼，含重金属废水灌溉农田，以及含重金属农药、化肥的大量施用，导 致土壤污染的重金属主要包括a s ，c a 、c o 、c r 、c u 、h g 、m n 、n i 、p b 、z n 等。 目前我国受踟，c d ，舡等重金属污染的耕地面积近2 0 0 0 万h m 2 ，约占总耕地面积 的五分之一，其中工业“三废”污染耕地1 0 0 0 万h m 2 ，污水灌溉农田面积3 3 0 万h m 2 ( 祖艳群和李元，2 0 0 3 ) 土壤重金属污染具有隐蔽性、长期性和不可逆性等特 点。土壤环境一旦受到污染，治理和恢复的难度比大气，水体要大得多土壤中 的有害重金属能进入到地表和地下水体，并可能通过直接接触、食物链等途径危 及人类的生命健康。因此如何消除土壤环境中的重金属污染已成为国际性难题 1 2 土壤c d 污染 镉( c d ) 是毒性最强的重金属之一1 8 1 7 年，德国的s t r o m e y e r 茸先在不纯 的氧化锌中发现了c d 。上个世纪二十年代以来，随着电解锌生产的发展，c d 的 产量开始明显增加，同时由c d 产生的环境污染也随之出现。植物中积累的q i 还 可通过食物链进入人体，并且在体内不易被排出，容易积累到毒害水平，其半衰 期在人体内约有2 0 3 0 年( b i s h o p ，2 0 0 0 ) 1 9 7 2 年联合国粮农组织( f a o ) 与 世界卫生组织( w t o ) 联合专家委员会在关于食品污染的毒性报告中指出，c d 中毒是仅次于黄曲霉毒素和砷的食品污染物。在联合国环境规划署a 9 8 4 年提出的 具有全球意义的1 2 种危害物质中，c d 被列为首位( 张妮娅和齐德生，2 0 0 2 ) ， 并于1 9 9 3 年被正式确定为致癌物质( m i c h a e l ，2 0 0 0 ；b e r y l l i m ，1 9 9 3 ) 。c d 污染 已成为危害生态环境和人畜健康最严重的公害之一 1 中山大学硕士学位论文 1 2 1 土壤中c d 的背景值 c d 在地壳中的含量较少，平均为0 1 5 m g k g 。一般来说，在世界范围内，正 常土壤含c d 为0 0 1 0 2 m g k g ，因土壤类型及区域的不同而有所差异。中国地域 广阔，土壤类型较多，土壤中c a 的背景值也呈现一定的分布规律。不同的区域、 土类中c d 的背景值有一定的规律性。 全国4 1 个土类c d 的背景值变化范围在0 0 1 7 0 3 3 2 m g k g 石灰土的c d 的背 景值最高，达到0 3 3 2 m g k g ：绿洲土、水稻土和高山漠土的c d 背景值次之；其次 为灰褐土和黑垆土等，其背景值均大于0 1 m g k g ；c a 背景值较低的土类主要是栗 钙土、灰色森林土、砖红壤、赤红壤和红壤，均在0 0 6 m g k g 以下；其他各类土 类的c d 背景值接近于全国土壤c d 的平均背景值，为0 0 7 0 0 8 m g k g ( 陈怀满， 1 9 9 6 ；中国环境监测总站，1 9 9 0 ) 。中国不同生物气候带内的土壤，由于在其成 土过程中水热条件存在差异( 吴燕玉等，1 9 8 6 ) ，导致各区域问土壤的c a 的背景 值呈现了一定的区域分异的规律性：西部地区 中部地区 东部地区；北方地区 南方地区。从行政区域来看，土壤中c d 的背景值以贵州省最高，为0 3 3 2 m g k g ， 而浙江、江苏、内蒙古、福建和广东等省区的c a 土壤背景值较低，均在0 0 6 m g k g 以下( 陈怀满，1 9 9 6 ) 。 1 2 2 土壤c d 污染现状 c d 对土壤的主要污染途径是工业废渣、废气中c a 的扩散、沉降、累积，含 c d 废水灌溉农田，以及含c d 农药、磷肥的大量施用。外来c d 多富集在土壤的 表层。在沈阳张士灌区土壤中，经污灌进入土壤中的c d 的5 6 3 3 累积于土壤的 表层，去表土1 5 3 0 c m ，可使稻米中的c d 下降5 0 ( 吴燕玉等，1 9 8 4 ) 。 我国有关农田c a 污染的调查工作是2 0 世纪7 0 年代中、后期开始的，但至今未 见c d 污染总体状况的资料报道。何电源等在1 9 8 7 1 9 9 0 年间对湖南省的农田 污染状况进行了调查( 何电源等，1 9 9 1 ) ，结果发现，农田c a 污染主要来源于 2 中山大学硕士学位论文 工矿企业捧放的废气和废水，在各类c d 污染农田中5 1 0 的面积减产严重。 目前，我国污灌农田已扩大到1 4 x 1 0 7 h m 2 ，由于污灌不当对6 3 x 1 0 e h m 2 农田 造成不同程度的污染，其中o d 污染耕地1 3 xl o h m 2 ，涉及1 1 个省市的2 5 个 地区，每年生产“镉米”5 0 x1 0 7k g 。如江西大余县污灌引起的c d 污染面积为 5 5 0 0 h m 2 ，其中严重污染面积占1 2 ( 王凯荣，1 9 9 7 ) 。另外，土壤中的作物受 c a 污染导致“镉米”的地区还有：上海的沙川灌区、广东的广州和韶关地区、 广西的阳朔、湖南的衡阳等。在日本，受c d 污染的农田有4 7 2 1 2 5 h m 2 ，占重金 属污染总面积的8 2 ( 廖自基，1 9 9 3 ) 。由于土壤镉污染的严重性，世界各国根 据本国的实际情况制定了相应的土壤镉的环境标准和最大允许浓度( 见表1 - 1 ) 。 表1 1 世界各国土壤镉的环境标准和最大允许浓度( m g k g ) ( 孟凡桥等，2 0 0 0 ) n b k l - 1 t h ee n v i r o n m e n t a ls t a n d a r d a a d m 钔d m 嘲a l l o w e d c o n c e n t r a t i o n o f s o i l c d 址 国家和地区c o u n t r i e sa n da l c a s镉c a d m i u m 德国g e r m a n y 英国u k 欧洲功l r o p e 美国u s a 中国c h i n a 前苏联u s s r 加拿大c a n a d a 1 5 1 7 5 l - 3 3 - 5 6 0 3 - 1 o 5 1 6 l 一3 c d 污染的植物修复 同治理土壤其它重金属污染一样，传统的c d 污染土壤修复方法主要有客土 法、化学淋洗法、电化学法等。但这些方法不仅成本昂贵，容易造成二次污染和 营养元素的流失，而且对大面积的污染无可奈何，更不能从根本上解决问题。因 此，人们不得不寻找成本低廉，方便可行的新方法，在这种形势下，植物修复应 中山大学硕士学位论文 运而生。植物修复是一种新兴的绿色生物技术，是指在不破坏土壤生态环境，保 持土壤结构和微生物活性的条件下，利用自然生长的植物根系从土壤中提取有害 物质并大部分转移至地上部的一种修复方法。同时，该方法还具有成本低，安全 和易为群众接受的优点( m c g f a l h 等，2 0 0 2 ) ，目前已成为研究开发的热点。 1 3 1 超富集植物 l 。3 1 1 超富集植物的发现 1 5 8 3 年意大利植物学家c e s a l p i n o 首次发现在意大利托斯卡绑黑色的岩石” 上生长的特殊植物，这是有关超富集植物( h y p e r a c c u m u l a t o r ) 的最早报道。1 8 1 4 年d e s v a u x 将其命名为a l y s s u mb e r t o l o n i i ( 庭荠属) ，1 8 4 8 年m i n g u z z i 和v e r g n a n o 首次测定该植物叶片中( 干重) 富含n i 达7 9 0 0 z g g ( 0 7 9 ) ( b r o o k s ，1 9 8 9 ) 。 超富集植物的概念是在1 9 7 7 年由b r o o k s 提出来的( b r o o k 等，1 9 7 7 ) ，1 9 8 3 年 c h a n e y 提出了利用超富集植物清除土壤重金属污染的思想( c h a n e y ，1 9 8 3 ) 。 1 3 。l 。2 超富集植物镌特点及速理分衣 超富集植物是能超量吸收重金属并将其运移到地上部的植物。这种植物通常 有以下几个重要特征：( 1 ) 其体内某一金属元素浓度大于一定临界值；( 2 ) 植物 吸收的重金属大部分分布在地上部，即有较高的地上部根浓度比率；( 3 ) 在重 金属污染的土壤上这类植物能良好地生长，一般不会发生重金属毒害现象。由于 各种重金属在地壳中的丰度及在土壤和植物中的背景值存在较大差异，因此对于 不同重金属，其超富集植物富集浓度界限也有不同。目前采用较多的是b a k e r 和 b r o o k s1 9 8 3 年提出的参考值( b a k e r 等，1 9 8 3 ) ，即把植物叶片或地上部( 干重) 中含c d 达到1 0 0 m g ，c o ，c u ，n i ，p b ，达到1 0 0 0 # g g ，m n ，z n 达到1 0 0 0 0 t g g 以上的植物称为超富集植物。 目前，全世界已经发现4 0 0 多种超富集植物。其中大部分为n i 的超富集植 物，约有3 0 0 种( b a k e r 等，1 9 9 4 ) 它们分布在世界少数几个地区( 表1 2 ) 并 且可能存在更多的超富集植物尚待发现。表1 - 3 展示的是已经发现的部分c a 的 超富集植物，其中有4 种是最近5 年在中国境内新发现的，包括本文的研究植物， a r a b i s p a n i c u l a t af 一 4 中山大学硕士学位论文 表1 - 2 已发现的九种重金属超富集植物数量分布( 陈同斌和韦朝阳，2 0 0 2 ) l h b l e1 - 2 d j s c o v e g e d h y p e r _ c c u m u l a t o r s o f l o h e a v y m e t a l s a n d t h e i r 钿n i l i y d i s t r i b u t i o n 重垒星! 里【竺翌竺塑! 苎2登墼! 塑坐竖垡! 堕!銎墼! 坠婴丝! ! ! 垒型! ! 1 2 砷a s2 2 钴g o 1 2 铜o u 2 41 1 铅p b 53 锰m n 1 15 镍n i 2 7 7 锌办 1 85 硒s e 1 9一 钛币 2一 表1 - 3 部分c d 的超富集植物及其产地 a b k1 - 3s o m ed i s c o v e r e dc a d m i u mh y p e r a c c u m u l a t o r sa n dt h e i r g e o g r a p h i c d t s t r i b u t i o n 塾垒亡垫 丝占叠蔓垒星宣量! 拦垒盘2 s e d m n 神话棚 中国 1 4 2 4 a r a b i s p a n i c u l a t a 中国457 w 口如b a o s h a n e n s i s中国 1 1 鹋 s o l a r i u mn i g r u m 中国 2 2 8 a 强蛔i c a e r u l e s c e n s 德国 3 7 0 孺细积c a e r u l e s c e n s 欧洲中西部 2 1 3 0 t h l a s p ic a e r u l e s c e n s 英国 2 5 8 a r a b i sg e m m i f e r a日本 1 8 1 0 ( 参考自汤叶涛等，2 0 0 5 ；魏树和等，2 0 0 4 ；刘威等，2 0 0 3 ；k u b o t a 和t a k e n a k a ，2 0 0 3 ；韦 朝阳和陈同斌，2 0 0 1 ) 1 3 2 植物修复的类型和机理 1 3 0 玉重金弱植物修复技术的类型 根据其作用过程和机理，重金属污染土壤的植物修复技术可归成4 种类型 ( c h a n e y 等，1 9 9 7 ；s a l t 等，1 9 9 5 ；a l e x a n d e r 和d a n i e l ，2 0 0 0 ) ：( 1 ) 植物提取 5 中山大学硕士学位论文 ( p h y t o e x t r a c t i o n ) ，即利用重金属超富集植物吸取土壤金属污染物进入植物体，通 过收获植物体以去除污染物。( 2 ) 植物稳定( p h y t o s t a b i l i z a t i o n ) ，是利用耐重金属植 物降低重金属活性，从而减少金属被淋滤到地下水或通过空气扩散进一步污染环 境的可能性。( 3 ) 根滤作用( r h i z o f i l t r a t i o n ) ，是指借助植物羽状根系所具有的强烈 吸持作用，从污水中吸收、浓集、沉淀去除金属或有机污染物。( 4 ) 植物挥发 ( p h y t o v o l a t i l i z a t i o n ) ，是利用植物的吸收、富集和挥发而减少土壤中一些挥发性 污染物，然后释放到大气中。目前这方面研究较多的是类金属元素h g 和非金属 元素s e 。这些方法中，植物提取是一种集永久性和广域性于一体的植物修复途 径，已成为众人瞩目、风靡全球的一种植物去除环境污染元素( 特别是重金属) 的 方法。 1 3 2 2 重金羁超富集的生理枫锄 有关重金属超富集的生理机制主要涉及植物根部金属离子延迟的跨膜吸收、 对重金属在植物体内的迁移、以及金属离子的区室化分布等方面。 ( 1 ) 根系延迟的c d 跨膜吸收 n e d e l k o s k a 和d o r a n ( n e d e l k o s k a 和d o r a n ，2 0 0 0 ) 对zc a e r u l e s c e n s 与烟草( n t a b a c u m ) 的根毛研究发现：在2 0 m g gc a 处理时，对根部及其细胞壁的c d 水 平分析发现，烟草根毛吸收的c a 大多数在3d 内就直接进入共质体，而z c a e r u l e s c e n s 在开始的7 1 0 d 内则是几乎把所有吸收的c d 先贮存在细胞壁内， 然后再释放到共质体中向茎叶部运输。表明c a 延迟的跨膜吸收是zc a e r u l e s c e n s 抗c a 毒害的一重要机制，使其获得充裕时间来启动细胞内重金属的解毒机制。 对于其它重金属是否存在类似机制目前还未见相关报道。 ( 2 ) 重金属在植物体内的迁移 植物茎部重金属的浓集是植物提取的关键。金属离子从根向茎迁移主要是受 两个过程制约的：( 1 ) 进入根部木质部的运动；( 2 ) 通过叶部叶肉细胞随蒸腾流 吸收重金属。研究资料表明，金属进入木质部所需的能量来自木质部薄壁细胞膜 上的i - i - a t f a s e 产生的负性跨膜电势。在超积累植物中，可能存在更多的离子运输 体或蛋白通道，从而促进重金属向木质部的运输，但这一点还没有得到证实。植物 茎部是金属从根部到叶部运输的管道，相对来说，叶部茎部的蒸腾速率是最高的， 所以最高的木质部流被认为是到达茎部组织和部分叶部的。 6 中山大学硕士学位论文 ( 3 ) 区室化分布 重金属区室化是植物重金属抗性的重要机制之一研究表明，在组织和细胞 水平，重金属在超积累植物叶片中都存在区室化分布。在组织水平，重金属主要 分布在表皮细胞、亚表皮细胞和表皮毛中；在细胞水平，重金属主要分布在质外 体和液泡中k u p p e r 等( 勋p p e r 等，2 0 0 0 ) 发现在水培条件下，z n 和c d 在根部 主要以z n c d 磷酸盐形式累积在表皮细胞的细胞壁中，而在叶部主要贮存在叶肉 细胞的液泡内。重金属在细胞壁中被果胶和半纤维素所束缚，阻止了其渗透到原 生质体中产生毒害作用。k r m e r 等( k r c t m e r 等，2 0 0 0 ) 研究也发现，n i 超富集 植物zg o e s i n g e n s e 叶片中大多数n i 贮存在细胞壁中，而其余部分主要以n i 有 机酸复合物形式贮存在液泡内，小部分以h i 组氨酸复合物形式存在于细胞质中。 1 4 c d 与植物抗氧化系统 1 4 1c d 对植物的影响 l a l 。ic d 对植物的毒蛙 土壤中过量c d 存在会对植物造成许多负面影响。c a 对植物的毒性主要包括 三个方面：( 1 ) c d 能够破坏光合作用这一过程主要通过影响一些与光合作用 相关的酶，尤其是包含在开尔文循环中的酶活性，以及影响叶绿素的合成来进行 ( c h e g h 和s a w h n e y ，1 9 9 9 ；k r u p a 等，1 9 9 3 ) ( 2 ) e d 对营养物质的吸收，氮 代谢以及呼吸作用产生影响( p r a s a d ，1 9 9 5 ；t o p p i 和g a b b r i e l l i ，1 9 9 9 ) ( 3 ) c d 能够引发活性氧( r o s ) ，包括h 2 0 2 ，0 f 1 ，o h 的产生，而且扰乱植物抗氧 化系统，使植物遭受氧化胁迫( s a n d a l i o 等，2 0 0 1 ) 。受到c a 毒害的植物的症状 包括有：叶片失绿、卷曲，根呈褐色，以及叶片和根部生长的减少( o u z o u n i d o u 等，1 9 9 7 ) 。 1 4 1 。2c d 对植物的毒物瓤激作用 毒物刺激效应( h o r m e s i s ) 是毒理学中的一种现象( c a l a b r e s e 和l i n d a ，2 0 0 1 ) ， 表现在受体遭受毒物刺激时，在毒物浓度较低的情况下产生刺激反应，浓度较高 时则受到抑制。若用x 轴表示毒物施加浓度，y 轴表示受该毒物影响的某个指 标，则产生毒物刺激效应时，曲线的形状为u 型或倒u 型。 7 中山大学硕士学位论文 毒物刺激效应是一种普遍存在的现象，除了重金属和植物，一些抗菌素，酒 精，咖啡因，射线等等，都会对其目标对象产生这种作用。例如许多低水平的杀 虫剂能够促进牡蛎幼虫的生长( d a v i s 和h i d u ，1 9 6 9 ) ，低剂量x 射线可延长小 鼠和豚鼠的寿命，低剂量乙醇和乙醛可延长果蝇的寿命( r e n n e r ，2 0 0 3 ) 。 在目前很多关于重金属对植物影响的研究中，均发现了一种有趣的现象，即 尽管高剂量的重金属会对植物造成危害，但微量或者少量重金属的添加，对植物 不仅没有毒害作用，反而在某种程度上改善了植物的生长，尤其是在超富集植物 中，这种情况更为显著。例如w 6 j c i k 等( w 6 j c i k 等2 0 0 6 ) 发现2 5 0 q u mz n 处 理和和mc d 处理对zc a e r u l e s c e n s 的生长有促进作用；c a o 等发现2 0 m g k g 土 的a s 添加明显的增进了p t e r i s v i t t a t a 的生物量( c a o 等2 0 0 4 ) ；h e 等( h c 等， 2 0 0 2 ) 发现 6 0 m g z p b 的添加，使得东南景天( s e d u ma l f r e d i ih a n c e ) 根部的干 重从1 3 9 m g 株( 对照) 增加至5 2 9 n 影株，并且发现2 0 0 肛m o l l c d 处理使得东 南景天的含水率和叶绿素含量均高于对照( z h o u 和q i u ，2 0 q 5 ) 。发生这种现象 的原因很可能就是重金属的添加对植物产生了类似毒物刺激效应的作用，但是具 体的原理还要通过更深入的研究才能证实。 1 4 2 植物抗氧化系统 l 一2 1 购s 豹产釜 在有氧代谢过程( 呼吸作用与光合作用) 中，植物细胞内线粒体，叶绿体及 过氧化物酶体等细胞器中不可避免的产生了一类活性氧类物质( r e a c t i v eo x y g e n s p e c i e sr o s ) ，包括0 2 1 ，1 0 2 ，h 2 0 2 ，o h ，r o s 具有极强的活性，可破坏分子， 导致细胞死亡，因此，这类物质的一个共同的特征是它们能对蛋白质，d n a ， 脂类产生氧化胁迫。在植物体内，r o s 作为各种代谢过程的副产物在不同的细 胞器中连续不断的产生( f o y e r 和h a r b i n s o n ，1 9 9 4 ) 。在稳定的生理状况下，r o s 可被存在于特定细胞器中不同的抗氧化物质清除( a l s c h e r 等，1 9 9 0 ，但在一些不 利的环境因素的影响下，这种产生一清除平衡就会遭到破坏，最终导致细胞内 r o s 含量的上升，从而破坏正常的细胞活动。导致植物细胞内产生r o s 的外界 因素包括生物性因素和非生物性因素。生物性因素主要包括其他生物对植物的侵 害；非生物因素包括干旱、盐渍、温度、紫外辐射、臭氧、重金属，生物毒素等。 8 中山大学硕士学位论文 1 4 2 2 抗氧纯系统砑r o s 的清除 植物通过体内一系列酶与非酶的抗氧化系统减轻r o s 带来的危害。酶类的 抗氧化剂包括s o d ( 超氧化物歧化酶) ，a p x ( 抗坏血酸过氧化物酶) ，c a t ( 过 氧化氢酶) ，g p x ( 愈创木酚过氧化物酶) ，g r ( 谷胱甘肽还原酶) 等；非酶的 抗氧化剂包括抗坏血酸，g s h ( 还原型谷胱甘肽) ，维生素e ，类黄酮，生物碱 以及类胡萝卜素等。 酶系统主要是在s o d 的作用下将0 2 歧化成h 2 0 2 和0 2 ，而a 蛆和g p x 则进一 步将h 2 0 2 催化生成h 2 0 ，从而减少0 2 - * 0 h 2 0 2 的积累( f o y e r 等，1 9 9 7 ；a l s c h e r 等， 1 9 9 7 ；n o c t o r 等，1 9 9 8 ) 抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) 、脱氢抗坏血酸还原酶 ( d r ) 和谷胱甘肽还原酶( g r ) 则主要存在于叶绿体中，是与a s a - g s h 循环有 关的酶，在这个循环中a p x 以a & a 为电子供体催化h 2 0 2 还原，同时抗坏血酸氧化 为d a s a , g r 和d r ，再将n a d p h 的电子传递给d a s a ，再生成a s a ( g a l l e g o 等， 1 9 9 6 ) 如果0 2 和h 2 0 2 不能被及时清除，在f c 的催化下就会通过f e n t o n 反应而 生成毒性更强的o h ，对蛋白质、膜脂及核酸产生伤害( g r a n t 和l o a k e ，2 0 0 0 ) 膜脂过氧化产物丙二醛( m o a ) ( l i n 和k a o ，2 0 0 0 ) 的水平经常被用作逆境条件 下膜脂过氧化的指标。 s o d ( e c1 1 5 1 1 ) 可以将0 2 - 歧化成h 2 0 2 和0 2 ( b o w l e r 等，1 9 9 2 ) 植物中已 分离出三类s o d 它们是存在于细胞质、过氧化物体和叶绿体中的c u z n - s o d s ； 叶绿体中的f e - s o d ( 不是所有植物中都存在) ；线粒体及过氧化物体中的 m n - s o d 并且已经发现前两者受氧化胁迫的调节( k l i e b e n s t e 缸等，1 9 9 8 ) c a t ( e c1 1 1 1 回在特定的组织及发育阶段合成，并且清除在光呼吸及脂肪 酸b 氧化过程中产生的h 2 0 2 ( l i n 和k a o ，2 0 0 0 ) c a t 可以无需外加底物在过氧 化物体中将h 2 0 2 分解成h 2 0 和0 2 ，在其它细胞器中h 2 0 2 清除则依靠不同类型的过 氧化物酶，且需要还原性的底物 g p x ( e c1 1 1 1 7 ) ，定位于细胞质、液泡、细胞壁以及细胞外空问，利用 愈创木酚为电子供体在不同的有机和无机底物氧化过程中清除h 2 0 2 ( a s a d a 1 9 4 4 ) 由于叶绿体中缺少过氧化氢酶( c a t ) ，因此在叶绿体中，h 2 0 2 清除主要 依赖于抗坏血酸的a p x 及相应的抗坏血酸谷胱甘肽g s 哪循环系统完成 中山大学硕士学位论文 ( s c a n d a l i o s 等，1 9 9 7 ) 。 通常情况下，对寿命较长的0 2 d 和h 2 0 2 的清除，主要由s o d 、c a t 、g p x 及 a s a - g s h 循环参与反应。而对于1 0 2 等寿命短的r o s 主要由低分子化合物发挥作 用，如抗坏血酸、维生素e 、类胡萝卜素、黄酮类以及某些未知的物质。由于它 们寿命短，但反应性高，主要攻击其产生部位的结构成分，如蛋白质、d n a 的 损伤。而目前对损害最大的o h 尚未发现低分子抗氧化剂能特异地清除。可能是 以接近重要靶分子的次要成分受到可逆损害，从而发挥对o h 的消除和对靶分子 的保护作用。同时经常保持组织中过渡金属离子处在不促成o h 产生的状态也是 个重要的生理机制( 郑荣粱等，1 9 9 3 ) 。 1 5 研究思路 随着工业和农业的发展和现代化，土壤污染正成为日趋严重的环境问题，尤 其是土壤重金属污染，由于其具有隐蔽性、长期性和不可逆性等特点，治理难度 要比大气和水高的多。一些传统的治理方法，如物理、化学、电化学等不仅价格 昂贵，难以大规模使用，而且容易造成二次污染。现在国际上兴起的植物修复作 为一种绿色、低廉、有效的污染修复技术正受到世人瞩目，成为研究的热点。 超富集植物是进行植物修复的生物基础，本研究所采用的实验材料就是在中 国云南兰坪县金顶矿区新发现的一种十字花科植物：圆锥南芥( a r a b i sp a n i c u l a t a f ) 通过野外调查分析和实验室研究发现其是一种p b z n c d 的多金属超富集植 物( 汤叶涛等，2 0 0 5 ) 。超富集植物大量富集重金属的一个重要前提就是这些植 物必然能够首先耐受高剂量的重金属，对抗重金属可能产生的毒性，其中很重要 的一部分就是能够有效的避免或减轻r o s 带来的胁迫。植物抗氧化系统作为清除 r o s 的主要工具，对其的研究是国际的热点，但是目前大多数的研究集中于非超 累积植物，对于超累积植物这方面的报道较少，且大多数只针对其中的某几个指 标进行研究。因此本研究希望通过水溶液培养，以c d a 2 的形式添加一定浓度的 c d ，系统的研究c a 对圆锥南芥( a r a b i sp a n i c u l a t ae ) 抗氧化系统的影响，包 括酶与非酶的抗氧化剂，同时监测h 2 0 2 和0 2 d 这两种重要的r o s 在植物体内的 含量，以期探讨圆锥南芥抗氧化系统在清除活性氧物质过程中的作用，以及抗氧 中山大学硕士学位论文 化系统与c d 的耐受，富集之间存在的关系，为探讨超富集植物耐受，富集重金 属的机理提供基础研究数据。 本研究采用的技术路线如图1 - 1 所示。 图l - l 本研究采用的技术路线 t , m - e1 - 1 a d o p t e dm e t h e d e g ye f t h i ss t n d y 1 1 中山大学硕士学位论文 第2 章实验设计及分析方法 2 1 实验材料 本研究采用的实验材料是在中国云南新发现的一种p b z n c d 超富集植物圆锥 南芥( a r a b i sp a n i c u l a t af ) 。实验用种子采集自云南省兰坪县金顶镇的北场铅锌 矿区。 。 2 2 实验设计 a p a n i c u l a t a 种子经消毒后置于温室营养土中萌发。待3 个月后采集生长一 致的幼苗，用自来水和去离子水仔细清洗植物根系，移入h o a g l a n d ( 1 8s t r e n g t h ) 营养液( 配方见表2 - 1 ) 中进行预培养。水培器皿采用容积为7 5 0 m l 的正方形塑 料饭盒。盒身用黑色塑料纸包裹用以避光，盒盖用同样的塑料纸包裹，每个桶盖 穿5 个孔，分布于盒盖的四角及中心，中心的孔作为曝气管通道，2 4 小时通气， 其余4 孔种上植物，作为一个分析样。预培养3 0 天待植物适应水培环境后，按 设计的浓度梯度( 见表2 - 2 ) 以c c 1 2 的形式加入，每个处理设置三个重复。浓 度梯度的设置是根据之前对ap a n i c u l a t a 进行的预试验而定的，根据预实验的结 果，当c d 浓度在2 0 m e l 或以下时，a p a n i c u l a t a 不会受到明显的毒害影响，故 为