（环境科学专业论文）五氯硝基苯对小鼠的神经毒性和抗氧化防御系统损伤研究.pdf

a b s t r a c t t h i sp a p e rs e l e c t e dd i s i n f e c t a n tp e n t a c h l o r o n i t r o b e n z e n e ( p c n b ) a sr e s e a r c ho b j e c t ， s t u d i e di t sn e r v e t o x i c i t y a n dt h e d a m a g e o no x i d i z ed e f e n d s y s t e m o nm i c ew i t h a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ( a c h e ) ，c a t a l a s e ( c a t ) ，a c e t y l c h o l i n e ( a c h ) a n dl i p i dp e r o x i d a t i o n ( l p o ) a tt h em o l e c u l a rl e v e lo ft o x i c i t y m o r e o v e r , t h i s p a p e r t r i e dt o p r o b e i n t ot h ee f f e c t m e c h a n i s m so fi t sn e r v et o x i c i t ya n do x i d a t i o n d a m a g e ，w h i c hp r o v i d e dt h e b a s i sf o rt h e f u l l y e s t i m a t eo f e c o l c l 西c a lt o x i c o l o g yo nm a r n m a l s t h et o x i c a n td o s ew a s2 0 0 m g k g ，4 0 0 m g k g a n d 6 0 0 m g k g ，a n df e dm i c e 4 、8 、1 2a n d1 6d a y s r e s p e c t i v e l ye a c hd o s e t h e r e s u l t ss h o w e d t h a tw i t ht h ec o n c e n t r a t i o ni n c r e a s i n g ，t h ea c t i v i t i e so fc a ti nb r a i nd e s c e n d e d ，t h el e v e lo f a c hi nl i v e rh a da t e n d e n c y t oi n c r e a s e ，a n ds h o w e da l le v i d e n t d e p e n d e n c eo n d o s ea n dt i m e ， i n d i c a t e dt h a tp c n bh a dn e r v et o x i c i t y f o l l o w i n gt h ed o s ei n c r e a s i n g ，t h ea c t i v i t i e so fc a t o fb r a i na n ds e r u mi n c r e a s e di ng r o u p so f4a n d8d a y s ，w h i l ed e c r e a s e di ng r o u p so f1 2a n d 1 6d a y s ；i nl i v e r , t h ea c t i v i t i e so f c a tw e r e d e s c e n d i n ge v i d e n t l y a tt h eb e g i n n i n go f t o x i c o s i s ； i n k i d n e y , t h ea c t i v i t i e s o fc a tw e r ei n c r e a s i n ga l l t h r o u g ht h et o x i c o s i st i m ew i t ht h e c o n c e n t r a t i o ni n c r e a s i n ga n dt i m ee x t e n d i n g t ot h el e v e lo fl p o ，t h el e v e lo fm d a o fb r a i n h a dat e n d e n c yt od e c r e a s ew i t hp c n bc o n c e n t r a t i o ai n c r e a s i n ga l lt h et i m e ，s h o w e dn o o x i d a t i o no c c u r r e di ni t ；w h i l ei ti sj u s tc o n t r a r yi nl i v e ra n dk i d n e yw h i c hi n d i c a t e dt h a t o x i d a t i o nw a ss e r i o u si nt h i st w o o r g a n s ；t h el e v e lo fm d a o f s p l e e ni n c r e a s e dd i s t i n c t l yo n l y a tt h ee n do f t o x i c o s i st i m ea n dh a dn o g r e a tc h a n g ei ns e r u n l t h r o u g he x p e r i m e n tr e s u l t sw e c o u l dt a k eac o n c l u s i o nt h a tp c n b d a m a g e d l i v e ra n dk i d n e yo f m i c e b a d l ya n dt h eb r a i na n d s p l e e nw e r ea l s oi n j u r e da ta c e r t a i ne x t e n t t h r o u g ho b s e r v e db y e y e sa n dv i s c e r ac o e f f i c i e n t c h a n g i n g w ec o n c l u d e dt h a tt h el i v e r t u m e s c e n t e d ，a n dt h es p l e e na t r o p h i e d k e yw o r d s ：p e n t a c h l o r o n i t r o b e n z e n e ； n e r v e t o x i c i t y ；a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ；c a t a l a s e ； l i p i dp e r o x i d a t i o n ；o x i d a t i o nd a m a g e i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致 谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：逊日期 ) ，啊r d z i o 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位 论文的规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机 构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：逝 指导教师签名 学位论文作者毕业后去向 工作单位 通讯地址 耋 j 蟹! ! 正矿 电话： 邮编： 引言 近年来，由于农药的广泛使用导致的环境污染和生态破坏问题越来越引起各国环境 化学家和生态学家的重视，这主要是因为农药包括杀虫剂和杀菌剂等已成为生物体内 ( 人类未统计在内) 普遍存在的污染物，其中高残留的有机氯农药通过食物链进入生物 体内以后，会随着食物链的逐级升高而不断富集，其它低残留的农药也可能在体内代 谢转化成对生物体有害的物质，这些残留和有害物质在哺乳动物体内是如何代谢转化以 及对生物体有哪些持续影响目前还不十分清晰。 农药对哺乳动物的毒理学研究可以从分子、细胞、器官、个体、种群、群落和生态 系统水平来进行。从种群、群落和生态系统这些宏观角度进行的研究比较接近自然状况， 可较好地反映污染物对生态系统整体水平的影响，但这样的研究耗时长、花费大，而且 生物死亡、生长或繁殖受阻都会对最终的实验结果产生影响。而分子毒理学水平上的研 究是采用现代分子生物学方法与技术，研究污染物及其代谢产物与细胞内大分子( 包括 蛋白、核酸、酶) 的相互作用，找出作用的靶位或靶分子，揭示其作用机理，从而对个 体、种群或生态系统水平上的影响作出预报。分子毒理水平上的研究能揭示污染物作用 本质，反映污染物对生物体的早期影响，具有指标测定灵敏、周期短等特点。并且有一 点已经形成共识，那就是无论污染物对生态系统的影响多复杂或最终的影响多严重，最 早的作用必然是从对个体的分子水平上的作用开始的，然后逐步在细胞一器官一个体一 种群一群落一生态系统各个水平上反映出来，因此这种最早期的作用在保护种群和生态 系统上具有最大的预测价值【2 _ ”。 第一章农药对哺乳动物分子毒理学研究概述 一、研究概况 农药分子毒理学的研究目前主要体现在三个方面： ( 1 ) 利用有关酶的活性作为机体功能和器官损伤的标志 根据酶活性的改变及酶基因表达的变化揭示化学物质对生物体的损害是分子毒理 学研究领域公认且应用前景十分广阔的指标。这里的酶包括组织酶、胞内酶、血清同工 酶以及解毒系统的各种酶或蛋白【2 】。目前研究最多的是细胞色素p 4 5 0 ( c y p s ) 酶系，它广 泛参与内源与外源化合物的合成与代谢，与人类癌症的关系十分密切，如多环芳烃、黄 曲霉素，亚硝胺等都需要经c y p s 代谢活化才能发挥致癌作用1 4 】。近年来对有机磷农药 和拟除虫菊酯类农药的神经毒性进行了较为深入的研究，涉及到谷氨酸、磷脂酶c 、蛋 白激酶，乙酰胆碱酯酶( a c l l e ) 等多方面。何凤生等深入研究了农药等化学物质分子 水平的神经毒性【5 4 】；夏春胜等进行了丙硫磷对乙酰胆碱酯酶的抑制能力及其毒力与药 效研究 8 l ；易宗春等也研究了有机磷农药抗虫灵对大鼠全血和人红细胞膜乙酰胆碱酯酶 的抑制作用一1 ； 在污染物致毒机理研究中，许多外源性化合物是通过产生大量活性氧中间体，诱导 生物体内抗氧化作用的酶，从而对机体诱发多种损害的。因此毒理学家一般应用抗氧化 防御酶系来检测污染物对机体的早期影响。抗氧化防御酶系包括谷胱甘肽过氧化物酶 ( g p x ) 、超氧化物歧化酶( s o d ) 和过氧化氢酶( c a t ) ，以及细胞氧化损伤、脂质过 氧化等。李厚勇等进行了杀菌剂y f 1 对小鼠血液m d a 、s o d 、g s h p x 的影响实验u0 j ； 孟紫强等研究了二氧化硫对小鼠肝、肺、肾、脑、脾、肠等多种器官的过氧化氢酶和脂 质过氧化的影响，结果c a t 有显著变化，证实s 0 2 有促进脂质过氧化引起氧化损伤的 毒理作用 1 1 - 1 2 1 。 ( 2 ) 从d n a 、r n a 的水平来研究化学物质的损伤作用 化学物质进入生物体后，经体内的酶系统活化，产生具有强亲电性的中间代谢物， 这些代谢物可与脂类、蛋白、d n a 或r n a 的亲核中心发生反应，形成稳定或不稳定的 加合物，从而导致d n a 损伤或断裂。d n a 加合物的形成可以引起细胞毒性、诱变作用、 活化癌基因，引发细胞癌变等生物学效应，d n a 加合物是生物体暴露于致癌物的有效 剂量及致癌物在体内产生的有效作用的综合表现，反映了化合物与d n a 的作用，与致 癌物作用直接相关，因此可以用来评价和预测化学物的潜在致癌性。生物体都有强大的 d n a 修复机制，损伤在d n a 复制前就能被修复，但很多环境物质攻击修复d n a 断裂 的酶，从而降低其修复能力，使基因突变增多。目前，通过d n a 损伤、基因突变、加 合物形成以及癌基因和抑癌基因的检测来反映杀虫剂、杀菌剂及其它外源性化合物对哺 乳动物是否具有细胞毒性和致癌性、致突变性已经成为分子毒理学研究的重要内容。刘 淑芬于1 9 9 7 年进行了灭幼脲光解产物d n a 加合物的研究i l 驯；孔志明等也做了烷基酚类 化合物诱发小鼠睾丸细胞d n a 损伤的研究【l ”。 ( 3 ) 环境毒物对细胞信息传递过程的影响1 4 j 细胞内信息传递系统的基本结构主要有特异性膜受体、g 蛋白、第二信使、蛋白激 酶等。各种环境毒物可在细胞信息传递途径的各个环节起作用，如人们普遍关注的“环 境激素”多氯联苯、d d t 等可通过模拟内源性激素而与这些激素的受体结合，造成内 分泌失调，影响机体生长发育和生殖机能，甚至诱发肿瘤。许多重金属和农药可通过与 第二信使c a 2 + 、c a m p 等作用进而影响细胞信息传递。 二、酶学指标及其意义 酶是由细胞产生的具有催化能力的蛋白质，大部分位于细胞体内，部分分泌到体外。 生物体新陈代谢中的各种化学反应都是在酶的作用下进行的，没有酶，代谢就会停止， 生命也即停止 15 1 。因此，从酶分子水平去探讨酶与生命活动、代谢调节、疾病、生长发 育的关系，无疑具有重大的科学意义。 酶的种类大致分为6 大类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂台酶、异构酶、连接 酶( 或合成酶) 0 6 1 。其中前3 种在体内的作用尤为重要，研究也较为深入。 ( 一) 乙酰胆碱醑酶( a c h e ) 与乙酰胆碱( a c h ) 乙酰胆碱酯酶属于水解酶类，主要分布于神经系统、肌肉、红细胞等，哺乳动物脑 中乙酰胆碱酯酶的含量占全部a c h e 的8 0 9 0 。它是膜结合蛋白质，至少有三分之二 的酶结合于细胞膜上 1 7 】，在中枢及外周神经系统与乙酰胆碱( a c h ) 受体一起参与完成神 经一神经及神经肌肉突触之间动作电位的传递，其主要生理功能是催化水解阳离子性神 经递质a c h ，使之水解成为胆碱和乙酸：乙酰胆碱+ h 2 0 一乙酸+ 胆碱，从而维持神经冲 动的正常进行【i 犯。】。a c h e 活性中心由丝氨酸、组氨酸、谷氨酸、丙氨酸、色氨酸和两 个甘氨酸共7 个残基组成，直接作用于a c h 的催化三元体可能是丝氨酸、组氨酸和色 氨酸3 个残基组成的【2 lj 。如果乙酰胆碱酯酶活性降低或失活，则引起乙酰胆碱在中枢胆 碱能突触、神经肌肉接头等处的积累，神经传递受到阻碍，动物会表现出各种病状，如 惊厥、麻痹等弘u j 。 乙酰胆碱酯酶较早用于评价水体中有机磷农药的毒性【2 0 】，后发展成为研究有机磷农 药毒性的最普遍和权威的方法，如夏春胜等研究了丙硫磷对乙酰胆碱酯酶的抑制作用8 1 。 乙酰胆碱酯酶活性的降低可作为脑萎缩过程中中枢胆碱能神经异常的指征，其活性的强 弱是神经细胞性质和功能的重要参考指标 1 6 - 1 7 。 ( 二) 过氧化氨酶( c a t ) 过氧化氢酶属于抗氧化防御酶系，主要存在于哺乳动物的肝、肾的过氧酶体中，担 负h 2 0 2 和过氧化物的分解与转化任务：2h 2 0 2 2h 2 0 + 0 2 。在机体中过氧化氢是一种 有害产物，它可以通过l 氨基酸、d 氨基酸、黄嘌呤、尿酸等作为底物，在l 一氨基酸 氧化酶、d 氨基酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、尿酸氧化酶等催化下，以氧分子为直接受氢 体而生成：r h 2 + 0 2 一r + h 2 0 2 ；r + h 2 0 + 0 2 一r o + h 2 0 2 。生成的过氧化氢可通过氧化细 胞膜磷脂分子中高度不饱和脂肪酸，生成大量过氧化物，造成磷脂功能障碍，严重损伤 生物膜，引起d n a 断裂等。例如红细胞膜被损伤，则易发生溶血；线粒体损伤后，氧 化磷酸化不能正常进行，严重时可导致细胞死亡。过氧化氢酶具有强大的催化效能，一 分子过氧化氢酶0 c 下每分钟可使2 6 4 0 0 0 0 个过氧化氢分子分解，因此机体内过氧化氢 不会蓄积中毒，起到保护机体的作用【l 6 ，”】。 目前的研究认为哺乳动物对外源性化合物( 如重金属、农药、化学物品) 进行生物 转化的结果，可能生成危害性更大的活性氧中间代谢物，且往往有大量的活性氧自由基 如o 、0 2 。、o h 、h 2 0 2 、和r o o h 产生，这些自由基若不及时清除，就会对机体造成 氧化胁迫，导致d n a 损伤、酶失活、脂质过氧化以至细胞死亡，引发癌症等疾病 2 。 因此机体内抗氧化防御系统成分的改变可以作为机体受到氧化胁迫的指示 2 4 1 。 三、脂质过氧化( l p o ) 脂质过氧化是指活性氧自由基攻击生物膜中多烯不饱和脂肪酸( p u f ) 而引起的一 系列氧化过程 1 0 1 。在生理状态下，生物体内的自由基不断地产生，也不断地被消除，处 予平衡状态的自由基浓度是极低的。在病理情况下，环境物理因素或外源性化学物质直 接或间接诱导产生的自由基得不到及时清除，或者内源性自由基的产生和消除失去了正 常平衡，常常会造成自由基对机体的损伤【2 研。自由基主要攻击机体内的脂质使之发生过 氧化，过氧化脂质在人体内积累可以逐渐消弱甚至破坏细胞的正常生理功能，使蛋白质 变性，使激素、酶和维生素失活，引起溶酶体颗粒破裂，造成细胞死亡，导致某些疾病 的发生和恶化，并可促使人体衰老 2 6 1 。脂质过氧化反应可以形成丙二醛、乙烷、共轭二 烯、荧光产物及能产生化学发光的产物。如果这些产物在体液和组织中的含量增多，则 表明体内脂质过氧化反应增科z 7 1 。 脂质过氧化在自由基损伤研究中处于十分重要的地位，目前认为，构成生物膜成分 的多不饱和脂肪酸的过氧化反应是许多中毒过程的起点【2 8 】。但是由于脂质过氧化是一个 复杂的过程，尤其在生物体系中使得该反应变得更加多样化，因此，目前人们对脂质过 氧化机理的了解还不十分透彻。吴萍等指出l p o 可引起蛋白质分子内和分子间交联， 影响细胞的正常生理生化功能，造成机体的损伤1 2 9 】。 4 四、五氯硝基苯( p c n b ) 的环境行为及研究现状 五氯硝基苯属于有机氯杀菌剂。有机氯农药挥发性低，不易分解，残留期长，不溶 于水，易溶于有机溶剂和脂肪等，侵入机体后，很容易蓄积在脂肪含量较高的组织和脏 器中，造成慢性中毒，引起各种特异性疾病。五氯硝基苯作为一种土壤杀菌剂和拌种剂 广泛应用于大棚蔬菜的病菌防治和大田种子病虫害的预防。国家安全生产监督管理局对 p c n b 有如下报道：五氯硝基苯对环境有严重危害，应特别注意对水体的污染。对人体 的危害：有毒，侵入人体途径主要为吸入、食入和经皮吸收，主要损害心血管系统、中 枢神经系统、肝、肾和造血系统。 目前对五氯硝基苯的研究国内外都有开展，国内主要集中在它的残留性研究方面， 比如研究它在人参中的残留浓度以及由此涉及到的检测技术如气相、液相色谱分析等， 还有一些是研究它对昆虫的药效作用【3 0 3 3 1 。 国外对五氯硝基苯的研究开展得较为深入1 3 4 - 3 6 。除一般的毒性研究外【3 刀，n a t i o n a l t o x i c o l o g yp r o g r a m 早在1 9 7 8 年就进行了p c n b 的致癌性研究，他们将农药拌在饲料中 配成两种不同浓度喂食两种小鼠，其中雄r a t s 的饲料中毒物浓度为1 0 0 6 4 p p m 和 5 4 1 7 p p m ，雌r a t s 的饲料中毒物浓度为1 4 6 3 5 p p m 和7 8 7 5 p p m ；雄m i c e 染毒浓度为 5 2 1 3 p p m 和2 6 0 6 p p m ，雌m i c e 染毒浓度为8 1 8 7 p p m 和4 0 9 3 p p m 。在经过1 1 1 1 1 3 周的 观察以后，将鼠处死，结果没有肿瘤形成，d n a 也没有明显的受损情况，结论是p c n b 无致癌性口引。在19 8 7 年他们又进行了p c n b 的n t p 毒性和致癌性实验，将染毒剂量增 大，雄鼠染毒浓度2 0 0 0 0 p p m ，雌鼠染毒浓度4 0 0 0 0 p p m ，2 年后存活的鼠高剂量组较对 照组有轻微的体重下降，结论同样是没有致癌性【3 9 j 。 国外在p c n b 的环境效应和代谢转化方面研究的也较为深入。c h o u d h u r yh 于1 9 8 7 年发表了一篇关于p c n b 的健康和环境效应的综述，文中指出已经从水体和鱼体中检测 到了p c n b ，而且没有一种有效的物质能降解它【4 州。s u z u k it 等于1 9 9 7 年进行了p c n b 对游离肝细胞的毒性实验，实验结果为低毒，这是从细胞水平上进行的研究【4 ”。a n d om 等在1 9 8 5 年研究了p c n b 的主要积累部位和代谢产物，指出动物进食p c n b 以后，p c n b 中所含的约0 7 的六氯苯( h c b ) 会在富含脂质的组织尤其是动物脂肪中积累，同时 p c n b 会代谢成亚甲基五氯苯和亚甲基四氯苯【4 2 1 。r e n n e r g 也进行了p c n b 在鼠体内代 谢产物的研究，他从鼠的排泄物中检测到了1 7 种物质，其中包括n 乙酰基s 半胱氨酸、 五氯硫酚、五氯硫代苯甲醚、2 ，3 ，4 ，5 四氯硫酚、2 ，3 ，4 ，5 四硫代苯甲醚、2 ，3 ，4 ，6 或2 ，3 ，5 ，6 四氯苯硫酚、1 ，4 二亚甲基四氯苯、五氯酚和四氯酚等 4 3 - 4 4 。 此外，美国于1 9 8 3 年开始进行p c n b 的研究，并定量地研究了它在水体中的转运 及半衰期等。 目前对p c n b 的神经毒性和氧化损伤作用的研究尚未见报道。本论文拟从分子毒理 学水平揭示不同剂量的p c n b 对小鼠各脏器的损伤程度；同一剂量的p c n b 对小鼠各指 标的动态影响并初步确定损伤靶器官，为全面评价五氯硝基苯对哺乳动物的影响提供科 学依据。 e 五、本项研究的意义 ( 一) 国内外目前对五氯硝基苯的研究多集中于短期生长植物的药效、药害和残留性； 对哺乳动物的一般毒性以及p c n b 在哺乳动物体内的代谢转化和致癌性方面，对其神经 毒性和机体氧化损伤方面的研究至今尚未见报道。因此，从酶学水平研究p c n b 对小鼠 的神经毒性和氧化损伤作用并初步探讨其毒作用机理对全面了解p c n b 的毒性和危害 具有重要意义。 ( 二) 为更全面地研究五氯硝基苯对哺乳动物的神经毒性和其它部位氧化损伤奠定了基 础，为进一步开展脏器病理研究提供了依据。 6 一、实验试剂与仪器 ( 一) 主要试剂 无水乙醇 三氯乙酸 碘化钾 结晶醋酸钠 氢氧化钠 三氯化铁 盐酸羟胺 钼酸铵 磷酸 盐酸 3 0 过氧化氢 9 5 乙醇 磷酸氢二钠 磷酸二氢钾 氯化乙酰腮碱 硫代巴比妥酸 考马斯亮蓝g 2 5 0 ( 二) 主要仪器 双杰牌系列电子天平 赛多利斯电子分析天平 l d 5 1 0 型离心机 8 0 0 型离心沉淀器 7 2 1 型分光光度计 第二章实验材料与方法 a r a r a r a r a r a r a r a r a r a r a r a r a r a r 生化试剂 生化试剂 生化试剂 北京化工厂 上海三爱思世纪有限公司 天津市耀华化工厂 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 北京化工厂 上海金山化工厂 北京化工厂 吉林市龙潭试剂厂 北京市红星化工厂 北京化学试剂二厂 北京化工厂 北京化工厂 天津市化学试剂六厂 北京红星化工厂 北京市东环联合化工厂 上海试剂二厂 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 常熟市双杰测试仪器厂 赛多利斯广州分公司 北京医用离心机厂 上海手术器械十厂 上海第三分析仪器厂 7 5 2 型紫外光栅分光光度计 微量移液器 电热三用水箱 j j 1 型定时电动搅拌器 j o u a n 低温高速离心机 二、五氯硝基苯的提纯 上海第三分析仪器厂 上海荣泰生化工程有限公司 北京医疗设备厂 江苏省金坛医疗仪器厂 法国j o u a n 公司 由山西临汾化工厂购得4 0 五氯硝基苯粉剂，采用减压蒸馏法提纯后，经液相色谱 法测得其纯度为9 7 3 ，可以用于哺乳动物毒性实验。 三、实验动物的选择 实验动物选择昆明种小白鼠，鼠龄4 周，体重( 2 0 4 - 2 ) g ，由吉林大学实验动物中 b 提供。 四、实验方法 ( 一) 染毒方法 本实验以昆明种小白鼠为研究对象，采用灌胃法染毒。依据相关文献报道将染毒剂 量设置为2 0 0 m g k g 、4 0 0 m g k g 、6 0 0 m g k 9 1 4 5 1 ，另设油对照。每天染毒一次，染毒时间 段分别设定为4 天、8 天、1 2 天、1 6 天【4 6 】。 ( 二) 相应脏器蛋白含量的涌定 采用考马斯亮蓝法t 4 7 1 n 定脑、血清、肝、肾的蛋白含量。 ( 三) 脑乙酰胆碱醋酶活性的测定 脑乙酰胆碱酯酶采用碱性羟胺比色法【2 8 1 。其原理是a c h e 分解乙酰胆碱为胆碱和乙 酸，未被分解的乙酰胆碱与三氯化铁生成一种棕褐色络合物，用7 2 1 型分光光度计在 5 2 5 n m 比色测定。 ( 四) 肝乙酰胆碱的测定 肝乙酰胆碱含量的测定也采用碱性羟胺比色法 4 8 1 。其原理是a c h 和盐酸羟胺的碱性 溶液反应生成乙酰羟胺酸，后者在p h l 2 o 2 下和氯化铁形成棕色化合物，其色泽深浅 8 与a c h 浓度成正比。待显色后用7 2 1 型分光光度计在5 4 0 n m 处比色测定。 ( 五) 脑、血清、肝、肾过氧化氢酶活性的测定 采用钼酸铵显色法1 4 9 书】。测定过程中加入过氧化氢基质液，c a t 将基质液中的h 2 0 2 分解，剩余的h 2 0 2 与铝酸铵反应生成一种黄色产物，用7 2 1 型分光光度计在4 0 5 n m 比 色测定。 ( 六) 脑、肝、肾、脾、血清脂质过氧化的测定1 5 4 5 5 i 采用t b a 比色法拥。依据硫代巴比妥酸( t b a ) 与脂质过氧化终产物丙二醛( m d a ) 反应生成一种粉红色的生色团来进行比色测定。应用7 5 2 紫外光栅分光光度计，波长 5 3 5 n m 。 五、数据分析 ( 一) 标准曲线的制作 依据考马斯亮蓝法中的相关操作制作蛋白质标准曲线。以l m g m l 牛血清白蛋白作 为蛋白标准液，做线性回归得到标准曲线方程：y = 7 5 3 0 3 x - i - 0 0 2 3 7 ，r e = 0 9 8 9 ；依据 碱性羟胺比色法的相应步骤制作乙酰胆碱标准曲线，得到回归方程为：y = o 8 2 5 2 x + o 0 0 9 1 ，r 2 = 0 9 9 4 7 。 ( 二) 实验鼓据的处理 将阴性对照和油对照作折线图，比较溶剂对实验的影响；依据标准曲线方程和实验 方法的相关公式，将实验所得数据( 吸光值) 进行转化计算，得到最终的实验结果，采 用s p s s 数据分析软件对实验结果进行t 检验，比较实验组与油对照组之间的差异显著 性。 9 第三章结果与讨论 一、溶剂对实验结果的影响 本实验采用纯花生油作为溶剂，和阴性对照组相比较，溶剂对实验结果产生的影响 如图3 - 1 所示。由图可以看出，采用花生油作溶剂对小鼠脑a c h e 活性；脑、肝、肾、 血清c a t 活性；脑、肝、肾m d a 含量的实验结果影响甚微，油对照组与阴性对照组数 值变化趋势相符，对应点数值基本持平，可忽略不计：花生油对肝a c h 含量有一些影 响，使其数值变化幅度减小，但从实验组肝a c h 含量不断升高的结果可知，并未对染 毒组产生大的影响：此外，脾m d a 含量在1 6 d 时油对照组较阴性对照组数值显著降低， 但染毒组中数值却显著升高，间接表明毒物对脾的过氧化损伤比实验结果体现出来的更 强烈，说明溶剂对实验结果影响不大：油对照组血清m d a 含量出现不规则的变化，但 变化趋势与染毒组的实验结果基本相符，说明溶剂的影响不大。总体来说，采用花生油 作溶剂对整个实验结果的影响不大，表明溶剂是可行的。 茔 皿 啪 ，： 16 血1 4 鬯1 ： 0 8 量嚣 o2 4 d8 d1 2 d1 6 d 脑a c h e 活性 - - 4 b - 油对照一空自 4 d8 d1 2 d1 6 d 肝c a t 活性 一油对照空白 1 0 1 5 , i z 咖1 0 鼍5 j 0 ： 遥。4 喜z 。1 4 d8 d1 2 d1 6 d 肝a c h 含量 一油对照空白 4 db d1 2 d1 6 d 脑c a t 活性 一油对照空自 4 , i x3 嚷z 1 0 2 品l s 毒 ， 1 0 5 0 1 4 蜒1 2 _ 1 0 名8 j6 星 4 童2 o 皿 跚 b o o g 01 0 0 8 00 6 0 0 4 0 0 2 0 4 d8 d1 2 d1 6 d 血清c a t 活性 一油对照空白 4 d8 d1 2 d1 6 d 脑m d a 含量 一油对照空白 4 d8 d1 2 d1 6 d 脾m d a # 量 一油对照空白 4 d8 d1 2 d1 6 d 血清m d a 含量 一油对照空白 4 0 0 皿3 0 0 鬯2 0 0 g 1 0 0 0 皿。篡 鬯呲 o 1 5 名o 1 p 嚅 。o , b 9 舞。0 7 逞嚣 豁 “： 8 d 1 2 d1 6 d 肾c a t 活性 一油对照空白 4 d8 d1 2 d1 6 d 肝m d a 苣 量 一油对照空白 4 d8 d2 d 肾m d a 台 量 一油对照空白 图3 1 溶剂对实验各指标影响图( 与阴性对照相比) 二、p c n b 对小鼠的神经毒性 ( 一) 小鼠神经毒性的行为表现 小鼠神经毒性一般表现为行为障碍、惊厥及情绪异常如兴奋、激惹、不停跳跃等。 在本实验染毒期间，试验组小鼠不同程度地表现出行动迟缓、呆滞、不爱进食，一些小 鼠表现极度兴奋，不停窜动、跳跃，并且染毒剂量越高，时间越长，症状越明显。 ( 二) p c n b 对小鼠脑乙酰胆碱酗酶活性的影畴 表3 1 和图3 - 2 为p c n b 对小鼠脑乙酰胆碱酯酶活性影响的数据和柱状图。可以看 出， 4 d 时随着染毒剂量的加大，酶活性值先是降低，当浓度为6 0 0 m g k g 时，活性值 又有所回升；8 d 、1 2 d 和1 6 d 时，随着染毒剂量的加大，酶活性值不断降低，与对照组 相比均有显著差异，表明p c n b 对小鼠脑乙酰胆碱酯酶活性有明显的抑制作用，并表现 为明显的剂量和时间依赖性。 表3 - l p c n b 对小鼠脑乙酰胆碱酯酶活性的影响( m g m g 蛋白小时) ( 注：+ p 0 0 5 ：”p 0 0 1 ；+ ”p 0 0 0 1 ) 瓣 鞭 眦： 对照组射塞( q k s ) 4 0 0 6 0 0 图3 2p c n b 对小鼠脑乙酰胆碱酯酶活性 的影响 ( 三) p c n b 对小鼠肝乙酰腱碱的影响 作为脑乙酰胆碱酯酶的辅助性指标，本实验测定了肝脏中乙酰胆碱含量的变化。从 表3 2 的数据和图3 3 中可以看出，8 d 和1 6 d 时随着染毒剂量的增加乙酰胆碱含量不断 升高，说明酶活性是不断降低的，这与脑乙酰胆碱酯酶活性的变化规律一致；1 2 d 的数 值变化不大；而4 d 的数值表现出的变化与脑a c h e 不相符。由于肝中乙酰胆碱含量很 低，极易受多种因素的影响而发生较大的变化，因此从整体实验结果来看，肝乙酰胆碱 酯酶呈抑制作用，但没有脑乙酰胆碱酯酶变化明显。 表3 2p c n b 对小鼠肝乙酰胆碱含量的影响( u g m g 蛋白) ( 注：+ p 0 0 5 ) - 一z 2 0 强1 5 喜1 0 舞s 耍。 对照组2 0 0 4 0 06 0 0 剂量( m g k g ) 图3 3p c n b 对小鼠肝乙酰胆碱含量的影响 三、p c n b 对小的氯化损伤作用 ( - - ) p c n b 对小鼠多器官和血清过氧化氢酶活性的影响 从表3 3 和图3 _ 4 可见，脑c a t 活性在4 d 、8 d 时随染毒浓度增加活性逐渐升高， 1 2 d 和1 6 d 时活性逐渐降低，但无统计学差异：对血清c a t 活性的影响与脑类似，在 4 d 和8 d 时活性不断增高，在1 2 d 和1 6 d 时又显著下降，并且具有显著性差异；肝c a t 活性在染毒初期表现出了明显的抑制作用，随染毒剂量的升高活性显著降低，较对照组 有显著差异；p c n b 对肾c a t 活性的影响在4 个时间段内均很显著，总体上呈增高趋势， 三个剂量组与对照组相比均具有显著差异。 表3 - 3 不同剂量p c n b 在不同时间段对小鼠多器官和血清c a t 活性的影响( u m g 蛋白) 时n ( d 1 器官 对照组 2 0 0 m g k g4 0 0 m g k g6 0 0 m g k g 4 7 8 0 5 8 0 8 8 0 2 2 3 6 8 3 2 7 0 1 2 4 o 2 5 5 6 8 2 1 l6 7 1 2 0 86 7 8 1 2 6 * 0 6 1 0 0 7 + + 0 5 8 0 1 8 + 0 2 6 0 1 2 + + 8 57 7 1 3 1 9 + + + 8 7 0 0 9 8 6 + 9 0 6 9 1 2 7 7 + 十+ 1 4 6 1 0 42 1 4 1 9 92 9 9 0 8 1 + + 8脑5 1 2 0 3 65 4 5 l ，2 86 7 8 1 6 5 脑肝肾嘴 4 肝 肾 血清 1 2脑 肝 肾 血清 0 3 7 0 0 70 ，3 4 0 1 0 0 3 0 _ - - 4 - 0 1 10 2 3 0 1 1 2 6 5 7 6 3 9 5 43 8 21 0 4 6 5 9 + 4 4 8 1 5 8 2 5 9 + + 6 9 9 3 4 7 6 8 4 十 + 2 2 5 0 7 74 3 8 2 1 2 4 6 4 1 6 15 1 6 2 1 9 4 1 2 1 3 0 0 2 4 0 0 6 5 9 4 9 2 3 5 7 1 0 8 0 3 1 2 7 8 1 1 8 + 0 2 1 0 0 6 9 3 6 3 1 5 1 7 0 7 3 0 1 5 + + 2 7 2 1 2 5 * 0 2 3 0 ，0 6 1 0 2 6 9 1 0 9 9 * + 0 6 0 0 1 0 + 1 8 7 0 7 7 + + 0 1 8 0 0 5 7 8 5 3 1 4 5 5 0 4 5 0 1 9 + 1 6脑5 3 3 2 4 83 3 1 1 4 l + + 2 3 8 1 7 9 1 4 9 0 1 3 + 肝0 7 5 0 2 1o ，6 9 0 1 5 o 7 4 0 2 0o 7 6 0 2 6 。肾7 2 6 5 1 4 5 81 5 1 9 9 - 4 - 1 4 3 3 0 1 7 2 0 7 9 0 9 81 7 2 3 3 - - + 6 89 1 血清o 5 4 + 0 0 8 0 4 8 - - - - - 0 0 2 *0 4 7 0 0 4 + 0 3 1 o 0 6 + ( 注：+ p o 0 5 ；”p o 0 1 ；”p o 0 0 1 ) 一8 _ 嘲6 旨 喜4 掣 蜒2 尝 uo 舞。 逞0 三 誊0 萼o 0 对照组 2 紫量( m g k g ) 4 0 0 6 0 0 p c n b 对小鼠脑c a t 活性的影响 对照组 2 蹁量( m g k g ，0 0 p c n b 对小鼠肝c a t 活性的影响 1 4 金溜 醐6 0 0 | 黜 茸3 0 0 斡： 0 岔6 嘲5 等4 言3 刘2 鉴l 舌0 对照组 2 量( m g k 0 0 0 6 0 0 p c n b 对小鼠肾c a t 活性的影响 对照组 2 0 04 0 0 剂量( m g k g ) p c n b 对小鼠血清c a t 活性的影响 图3 - 4p c n b 对小鼠多器官和血清c a t 活性的影响 ( 二) p c n b 对小鼠多器官和血清脂质过氧化的影响 从表3 5 和图3 - 6 可见，脑m d a 的含量在4 个时间段随着染毒剂量的增加呈降低 趋势，未有过氧化现象发生；p c n b 对肝l p o 水平的影响在短时间( 4 d ) 最大，三个剂 量组和对照组相比均具有显著性差异，在较长时间段( s d 、1 2 d 和1 6 d ) ，随着染毒剂量 的增加，m d a 的含量不断升高，表明p c n b 对肝的氧化损伤有浓度依赖性，染毒剂量 越高，损伤程度越重；p c n b 对肾l p o 水平的影响在4 个时间段里均较为明显，总体上 随着剂量的增加m d a 的含量也随着升高，并且中、高剂量( 4 0 0 m g k g ，6 0 0 m g k g ) 组 与对照组相比有显著性差异，表明p c n b 对肾的氧化损伤也具有浓度依赖性；脾m d a 的含量只在1 6 天时显著增高；血清中m d a 的含量在整个染毒期间没有明显变化。 表3 5p c n b 对小鼠多器官和血清脂质过氧化的影响自a m o l m l 上清液) 时间( d ) 脏器对照组 2 0 0 m g k g4 0 0 m g k g6 0 0 m g k g 41 7 0 0 2 3 0 0 7 0 0 0 0 2 9 0 0 4 5 6 5 0 9 1 0 0 6 4 - 0 0 2 1 5 6 0 1 5 0 0 8 0 0 2 0 5 7 - 4 - 0 0 9 3 5 1 1 2 8 0 0 7 士0 0 3 1 3 2 0 1 9 0 1 0 0 0 4 0 6 l 0 1 0 1 2 3 1 4 - 1 4 3 0 0 9 4 - 0 0 3 1 0 0 4 - 0 1 3 0 2 7 4 - 0 0 5 0 4 3 0 0 4 4 4 2 4 - 0 5 0 0 0 4 0 0 2 1 3 3 01 9 + + 0 2 0 0 0 2 * + 0 3 0 0 0 8 5 6 9 1 6 3 0 0 8 4 - 0 0 3 1 4 5 0 2 l 0 1 1 0 0 4 0 5 8 4 - 0 0 6 4 2 3 4 - 0 7 2 0 0 6 0 0 1 1 1 4 0 1 6 0 1 2 0 ，0 6 0 6 14 - 0 0 7 1 0 8 5 2 1 0 0 0 9 4 - 0 0 2 0 7 3 4 - 0 1 3 0 5 0 4 - 0 1 8 0 4 9 4 - 0 0 8 7 6 5 1 4 0 + + 0 0 4 4 - 0 0 l ( 注：+ p 0 0 5 ：”p 0 0 1 ：“p 0 0 0 1 ) 占瘿 血f 叫 抽 1 4 3 4 - 0 1 9 + 0 1 2 4 - 0 0 4 * 0 3 3 4 - 0 0 3 * 5 9 5 1 5 9 0 0 8 0 0 2 1 1 8 0 1 6 + 0 1 5 4 - 0 0 5 * 0 8 8 0 1 4 + 4 3 3 4 - 0 6 4 * 0 0 6 4 - 0 0 1 0 9 3 4 - 0 0 8 + + 0 1 4 4 - 0 0 2 * 0 5 7 4 - 0 0 4 l o 0 34 - 1 4 6 * 0 0 9 4 - 0 0 2 0 6 54 - 0 0 6 * 0 5 2 0 0 8 * 0 4 6 0 0 1 6 9 4 1 1 9 0 0 4 0 0 1 1 2 0 0 2 0 * 0 0 5 4 - 0 0 2 * 0 6 3 4 - 0 1 1 + + 57 5 4 - 0 4 8 * 0 0 7 0 0 2 0 9 2 4 - 0 0 8 * + + 0 1 5 4 - 0 0 4 0 8 8 4 - 0 1 0 + 4 0 8 0 7 3 0 0 6 4 - 0 0 3 0 8 9 4 - 0 1 0 + + + 0 1 4 4 - 0 1 5 0 4 8 4 - 0 0 8 * 1 2 8 1 1 6 8 0 0 7 4 - 0 0 1 十 0 6 34 - 0 0 6 * 0 6 5 4 - 0 1 3 0 6 3 0 1 7 1 7 1 6 4 - 3 5 9 0 0 3 4 - 0 0 0 2 + 对照组：，：竺 6