（材料学专业论文）壳聚糖基生物材料与巨噬细胞相互作用研究.pdf

中文摘要 宿主的炎症反应是组织对损伤和异物的正常应答，炎症的强度和持久性影响 生物材料在体内的生物相容性和稳定性。巨噬细胞是调控宿主免疫和炎症反应的 重要细胞，因此它对生物材料的响应性对认知材料宿主反应有重要作用。 为了研究可降解生物材料表面化学对巨噬细胞黏附、铺展、激活和凋亡等行 为的影响，本文制备了壳聚糖明胶膜、聚乳酸及其改性膜、壳聚糖衍生物膜， 对它们的力学性能、亲疏水性、溶胀特性等进行了表征：同时考察了膜材表面化 学性质对蛋白质吸附的影响；并通过提取小鼠腹腔巨噬细胞，利用m t t 实验、 扫描电镜、e l i s a 法、电泳法等实验手段定性或定量分析材料的不同组成、亲疏 水性、表面电荷性质对巨噬细胞行为的影响，并考察巨噬细胞对膜材表面降解的 影响。 性能测试表明：壳聚糖、明胶都是亲水性很好的材料，壳聚糖的加入有利于 增强明胶膜的力学性能，改善其溶胀性能，同时减缓明胶膜的降解速率；聚乳酸 是强疏水性材料，壳聚糖的引入改善了聚乳酸膜的亲水性；向壳聚糖分子链引入 磷酸基团提高了膜材的亲水性，改善其溶胀性能，而引入烷基基团提高了膜材的 疏水性，但对膜材溶胀性能影响不大。蛋白吸附实验表明：壳聚糖明胶膜材表 面吸附_ 定量的蛋白质，蛋白质的吸附量与膜材表面亲疏水性、表面电荷、溶胀 状态下的膜材表面水的结构有关。细胞实验表明：生物材料表面化学性质影响巨 噬细胞的黏附，铺展、激活和凋亡等行为；亲水性和阳离子表面有利于巨噬细胞 的黏附和铺展，但是过于亲水或表面正电荷密度过高却不利于巨噬细胞的黏附和 铺展。巨噬细胞在所有膜材的表面分泌t n f q 的水平都较低，表明膜材对巨噬 细胞的激活程度较低；所有膜材都不会引起巨噬细胞发生凋亡，表明具有良好的 生物相容性。在所观察的时间内，巨噬细胞在一定程度上促进壳聚糖一明胶膜材 的降解，通过设计物料配比可以调控膜材的降解速率，但对聚乳酸膜及其改性膜、 壳聚糖衍生物膜的降解影响甚微。 关键词：巨噬细胞；壳聚糖；表面化学；黏附；t n f a ：凋亡 a b s t r a c t t h eh o s ti n f l a m m a t o r yr e a c t i o ni san o r m a lr e s p o n s et oi l l i u r ya n dt h ep r e s e n e e o ff o r e i g ns u b s t a n c e s t h em a g n i t u d ea n dd u r a t i o no ft h ei n f l a m m a t o r yp r o c e s sh a sa d i r e c ti m p a c to nm a t e r i a l b i o s t a b i l i t ya n db i o c o m p a t i b i l i t y , h e n c ea f f e c t i n gt h e e f f i c a c yo fb i o m e d i c a ld e v i c e s m a e r o p h a g ei sac e n t r a lc e l lt y p ei nd i r e c t i n gh o s t i n f l a m m a t o r ya n di m m u n ep r o c e s s e s ；t h u s ，i t sr e s p o n s et ob i o m a t e r i a l si se x t r e m e l y i m p o r t a n ti nu n d e r s t a n d i n gm a t e r i a l - m e d i a t e dh o s tr e s p o n s e i nt h i sp a p e r , t od e t e r m i n et h ee f f e c to fb i o d e g r a d a b l eb i o m a t e r i a l s u r f a c e c h e m i s t r yo nm a c r o p h a g eb e h a v i o r ss u c ha s a d h e s i o n ，s p r e a d , a c t i v a t i o na n d a p o p t o s i s ，t h er a t sc e l i a cm a c r o p h a g e sw e r ec u l t u r e do nas e r i e so fc h i t o s a n g e l a t i n m e m b r a n e s ，p o l y ( 1 a c t i ca c i d ) ，e h i t o s a n - g ( 1 a c t i ca c i d ) a n dc h i t o s a nd e r i v a t i v e s m e m b r a n e s p r o t e i n a d s o r p t i o nb e h a v i o ro n c h i t o s a n g e l a t i n m e m b r a n e sw a s m e a s u r e db ye l i s a m a c o p h a g e sb e h a v i o r sw e r em e a s u r e db yt h em e t h o d so fm t t t e s t ，s c a ne l e c t r o n i cm i c r o s c o p e ，e l i s aa n de l e c t r o p h o r e s i s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tc h i t o s a na n dg e l a t i nh a dg o o dh y d r o p h i l i c i t y m a n y p r o p e r t i e so fg e l a t i nm e m b r a n e sw e r ei m p r o v e db yt h ei n t r o d u c t i o no fc h i t o s a n ，s u c h a st h em e c h a n i c a lp r o p e r t i e s ，t h es w e l l i n gp r o p e r t i e sa n db i o d e g r a d a t i o n p o l y ( 1 a c t i c a c i d ) w a sh y d r o p h o b i ca n di t sh y d r o p h i l i c i t yw a se n h a n c e db yt h ei n t r o d u c t i o no f c h i t o s a n t h eh y d r o p h i l i c i t yo fc h i t o s a nm e m b r a n ew a sm o r ee n h a n c e db yt h e i n t r o d u c t i o no fp h o s p h o n i cg r o u pb u tr e d u c e db yt h ei n t r o d u c t i o no fa l k y lg r o u p p r o t e i na d s o r p t i o nb e h a v i o rw a si n f l u e n c e db yt h ef a c t o r so f h y d r o p h i l i c i t y ，c h a r g e d c h a r a c t e r i s t i ca n ds t r u c t u r eo fw a t e ro fc h i t o s a n g e l a t i nm e m b r a n e si ns w o l l e ns t a t e t l l ec e l le x p e r i m e n t sd e m o n s t r a t e dt h a tb i o m a t e r i a ls u f a c ec h e m i s t r yh a da no b v i o u s i m p a c to nt h eb e h a v i o r so fm a c r o p h a g e s h y d r o p h i l i ca n dc a t i o n i cs u r f a c e sp r o m o t e d m a c r o p h a g e sa d h e s i o na n ds p r e a d ，b u ts u r f a c e sw h i c hw e r et o oh y d r o p h i l i co rh a dt o o h i 曲d e n s i t yo fp o s i t i v ec h a r g e sw e r en o tb e n e f i c i a lt om a e r o p h a g e sa d h e s i o na n d s p r e a d a l lm e m b r a n e ss h o w nl o wr e l e a s eo fn 虾q ，i n d i c a t i n gn os i g n i f i c a n t a c t i v a t i o na n di n f l a m m a t i o n m a c r o p h a g e s a p o p t o s i sw a sn o ti n d u c e db ya l l m e m b r a n e s ，w h i c hd e m o n s t r a t e dt h a ta l lm e m b r a n e sh a dg o o db i o c o m p a t i b i l i t y m a c r o p h a g e sa c c e l e r a t e dt h eb i o d e g r a d a t i o no fc h i t o s a n g e l a t i nm e m b r a n e s ，b u th a d n on o t a b l ei n f l u e n c eo np o l y ( 1 a c t i ca c i d ) a n d 10d a y sc u l t u r ep e r i o d c h i t o s a nd e r i v a t i v e sm e m b r a n e sd u r i n g k e y w o r d s ：m a c r o p h a g e ；c h i t o s a n ；s u r f a c ec h e m i s t r y ；a d h e s i o n ；t n f c t ；a p o p t o s i s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得鑫洼盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：压相 t签字日期：x 9 年 ：月号f 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权苤鲞盘堂：可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：疹舶忙 导师签名：秘孵 签字日期：丸。夕年：，月乡7 日签字日期：1 。b 7 年1 月弓f 日 第一章绪论 1 1 生物材料与组织工程 第一章绪论 生物材料又称生物医用材料，它是指对生物体进行诊断、治疗和置换损伤组 织、器官或增进其功能的材料。2 0 世纪中后期，随着材料科学的迅猛发展和现 代医学、免疫学、分子生物学等相关学科的发展，生物材料进入了一个高速发展 的新阶段。特别是自2 0 世纪8 0 年代开始，组织工程概念的提出，更是加速了生 物材料的迅猛发展。 组织工程学是利用生命科学与工程科学的原理和方法，研究和开发具有修复 或改善人体组织或器官功能的新一代临床应用的取代物，用于替代组织或器官的 一部分或全部功能，达到修复重建的目的。它的出现标志着医学将走出器官移植 的范畴，步入制造组织和器官的新时代j 。组织工程的基本原理和方法是，将体 外培养的组织细胞吸附扩增于一种生物相容性良好并可被人体逐步降解吸收的 生物材料上，形成细胞一生物材料复合物。该生物材料为细胞提供一个生存的三 维空间，有利于细胞获得足够的营养物质，进行营养物的交换，使细胞能在按照 预制设计的三维形状支架上生长。然后，将此细胞一生物材料复合体植入机体组 织病损部位。种植的细胞在生物支架逐步降解吸收过程中，继续增殖并分泌基质， 形成新的具有与自身功能和形态相应的组织和器官。这种具有生命力的活体组织 能对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代m j 。因此，生物材 料是组织工程研究的桥梁和纽带。它是种子细胞在形成组织之前赖以生存和依附 的三维支架，为细胞的增殖、分化、营养交换、新陈代谢以及细胞外基质分泌等 生理活动提供空间场所。 组织工程一般采用以下三种策略：( 1 ) 细胞和生物材料的杂化体系：如从小 块活组织分离组织特异细胞，经过体外扩增，将其种植在生物相容性可降解聚合 物构建的多孔支架内，将细胞支架结构物回植在患者体内，随聚合物降解，可 重建新组织。( 2 ) 细胞体系：通过生物过程发展微结构，如造血于细胞移植。( 3 ) 只有生物材料的体系：通过生物过程使细胞整合，如由珊瑚骨架制备羟基磷灰石， 其孔隙结构与人体网状骨结构极为相似。三种策略中以杂化方法应用最广。 在短短不到2 0 年中，组织工程已取得了突飞猛进的发展，不仅在免疫缺陷 的小动物体内构建出各种组织工程化组织，而且成功地修复了免疫功能完全的大 型哺乳类动物的各种组织缺损。组织工程学科的发展，对传统生物材料提出了新 第一章绪论 的挑战。 首先，生物材料应符合生物安全性的要求，即对人体无毒性、无刺激性、无 遗传性和无致癌性。其次，生物材料应具有良好的生物相容性，即对人体组织、 血液、免疫等系统无不良反应。此外，更希望植入的生物材料和装置不被免疫系 统所排斥，并能产生所期望的宿主反应。生物材料植入体内后，其表面诱发的一 系列宿主反应，包括蛋白质的优先吸附、补体激活、细胞的征集或粘连等，而这 些过程是更广意义上的炎症和纤维化反应的一部分。从材料表面所发生的蛋白质 吸附、免疫反应、细胞因子和生长因子的释放、目标细胞的反应着手，诱发期望 的愈合途径，使组织重建，是第三代生物材料所要达到的目标p j 。 为了实现这一目标，这就需要了解宿主的免疫防御系统与植入物之间的相互 作用，只有这样才能诱发所期望的愈合途径，以利于缺损组织的重建。 1 2 生物材料与免疫系统 1 2 1 免疫系统概述 免疫系统是机体执行免疫应答及免疫功能的一个重要的和结构复杂的防御 体系，它相当于生命的卫士，保护机体免受外来入侵物的危害。 免疫系统由免疫器官( 胸腺、骨髓、脾、淋巴结等) 、免疫组织( 黏膜相关 淋巴组织) 、免疫细胞( 吞噬细胞、自然杀伤细胞、t 及b 淋巴细胞) 及免疫分子 ( 细胞表面分子、抗体、细胞因子、补体等) 组成，担任着对“自己”和“非己” 抗原的识别应答功能。免疫系统是在个体发育过程中逐渐形成并完善的，该过程 中任何环节的障碍均可引起机体的免疫功能紊乱，并引起相应的疾病p j 。 机体免疫反应的方式可分为两类，即非特异性免疫和特异性免疫。非特异性 免疫是机体在长期的进化过程中逐渐建立的，具有相对稳定性并能遗传给下一代 的防御能力( 也称先天性免疫) 。特异性免疫是在抗原刺激下产生的，指专门对 某一种病菌有识别和杀灭作用的免疫。它们依赖于白细胞、t 淋巴细胞和b 淋巴 细胞而执行免疫作用，其特点是：有特异性：是后天获得的，故又称获得性 免疫，医学上预防注射疫苗就是此原理。 非特异性免疫和特异性免疫结合而形成的免疫防御系统具有如下性质【o j ： ( 1 )专一性，系统可以辨别并对大量的刺激物产生反应； ( 2 )记忆性，一经暴露于刺激物后，随后与刺激物的相遇将激起较起初 更强更快的反应； ( 3 ) “自知功能”，迅速辨认和攻击外来侵入物，包括其他物种生物分子、 2 第一章绪论 细胞和组织( 或有时是来自同种类的其他个体) ，而不会对自身的生物分子、细 胞和组织进行攻击。 免疫系统顽强的抗击“非我 的功能，一方面有效地保护了机体免受外来侵 入物的危害，而另一方面，生物植入体也将被视作异物而引发宿主反应，包括局 部反应、全身毒性反应、过敏反应、致畸致癌突变及免疫反应，从而影响植入体 功能的发挥。其中，对于宿主而言，生物材料植入体内后最普遍的反应就是炎症 反应【7 】o 1 2 2 生物材料植入体内后的炎症与免疫反应 生物材料植入体内通常在开始时引起强烈的炎症反应，然后导致慢性炎症反 应、肉芽组织的形成、异物反应和纤维包囊的形成。生物材料植入体内后在不同 的时间内产生不同的事件序芦j ( 图1 - 1 ) 。在不同创伤期，应答反应的主要细胞 各异。一般来说，嗜中性白细胞是创伤后数天后的主要炎症细胞；几天至几个星 期代之以单核细胞；单核细胞可分化为巨噬细胞，可存活几个星期，其时间长短 取决于损伤程度及生物材料和趋化因子的激活情况。生物材料的植入对血管组织 造成的创伤会在植入部位立刻形成暂时性基质，这种基质由凝血、血栓形成激活 的补体系统、- 激活的血小板、炎症细胞和内皮细胞释放的炎症产物生成的血纤蛋 白组成，在材料植入后几小时内产生。组织工程通过将细胞支架结构物植入体 内达到治疗缺损的目的，这就需要了解宿主的防御系统与植入物之间的相互作 用，只有这样才能诱发所期望的愈合途径，以利于缺损组织的重建。 生物材料植入体内后，会刺激巨噬细胞释放细胞因子和黏附因子作用于血管 壁，改变血管壁的通透性，使白细胞和炎症细胞( 中性粒细胞和单核细胞) 越过血 管壁内皮细胞向炎症部位集中，从而引发炎症反应。另外，对于植入材料，机体 会启动一系列伤口愈合机制，而炎症就是这一复杂过程中重要的一项内容，通过 愈合创伤及消灭病原茵，从而恢复周围组织；同时由于多种细胞因子及氧自由基 的释放，炎症细胞的迁移聚集也会破坏血管内皮单分子层，最终导致材料植入失 败。因此炎症反应的程度及持续时间直接影响到生物材料的稳定性和组织相容 性，从而影响生物医用材料的有效性。 另外，生物材料植入体内可能引起的许多临床症状，包括组织反应和血液反 应都与人体免疫反应和补体系统激活密切相关。快速的非特异性( 固有性) 免疫 可防止感染扩散。非特异性免疫反应经遗传获得，无需事先与抗原接触、致敏就 能对入侵的病原体进行吞噬和消除。非特异性免疫中包括皮肤、粘膜等组织屏障， 中性粒细胞、单核巨噬细胞等固有免疫细胞，补体系统、细胞因子、防御素等 固有免疫分子。如果感染持续存在或扩散，则特异性免疫反应被激活，它们依赖 第一章绪论 于白细胞、t 淋巴细胞和b 淋巴细胞的作用，防止进一步的感染【10 1 。 可见，在生物材料植入体内后引发的炎症及免疫反应中，巨噬细胞作为一种 炎症细胞和固有免疫细胞，都起到了重要的作用。巨噬细胞是调控宿主免疫和炎 症反应的一个主要细胞类型，因而它对生物材料的响应性在认知材料与宿主相互 作用中十分重要。 一急性一 慢性一肉芽鳃织- 时间 ( 分钟、小时、天、周) 图1 - 1 生物材料植入体内后诱发的急性炎症反应、慢性炎症反应、肉芽组织 形成和异物反应的时间序【8 ，9 】 f i g 1 1t h et e m p o r a lv a r i a t i o ni nt h ea c u t ei n f l a m m a t o r yr e s p o n s e ，c h r o n i ci n f l a m m a t o r y r e s p o n s e ，g r a n u l a t i o nt i s s u ed e v e l o p m e n t ，a n df o r e i g nb o d yr e a c t i o nt oi m p l a n t e db i o m a t e r i a l s 1 3 生物材料与巨噬细胞双重相互作用 1 3 1 巨噬细胞概述、 巨噬细胞是免疫系统中固有免疫细胞的一种，是由血液中的单核细胞进入组 织器官后发育分化而成，是一类重要的抗原提呈细胞，是体内执行非特异性免疫 作用的效应细胞，同时在特异性免疫应答的各个过程中起重要作用。 巨噬细胞分为定居的巨噬细胞和游走的巨噬细胞两大类。定居的巨噬细胞广 泛分布在宿主全身，可因所处部位的不同而有不同的形态和名称，如存肝中称库 普弗细胞、脑中称小胶质细胞、骨中称破骨细胞；它们的主要作用是清除体内衰 老损伤或凋亡的细胞，以及免疫复合物和病原体等抗原性异物。游走的巨噬细胞 由血液中的单核细胞衍生而来，体积数倍于单核细胞，寿命较长，在组织中可存 活数月。该种巨噬细胞胞质内含有溶酶体及线粒体，具有强大的吞噬杀菌和吞噬 4 第一章绪论 清除体内凋亡及其他异物的能力。 一般情况下，体内的巨噬细胞一般处于静止状态。病原体或细胞因子等异物 可激活巨噬细胞，并使巨噬细胞功能明显增强。巨噬细胞的主要生物学功能为1 ： ( 1 ) 识别、清除病原体等抗原性异物：巨噬细胞可通过表面模式识别受体， 直接识别结合某些病原体共同表达的和宿主衰老损伤和凋亡细胞表面呈现的特 定的分子结构；还可以通过表面i g gf c 受体( f cyr ) 和补体受体( c r ) ，识别 摄取抗体或补体结合的病原体等抗原性物质。巨噬细胞与病原体等抗原性异物结 合后，经吞噬或吞饮作用将病原体等摄入胞内形成吞噬体。在吞噬体内，可通过 氧依赖和氧非依赖杀菌系统杀伤病原体。 ( 2 ) 参与和促进炎症反应：巨噬细胞表面具有单核一巨噬细胞趋化性细胞 因子蛋白一i ( m c p - 1 ) 、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子( g m c s f ) 、巨噬细胞集落 刺激因子( m - c s f ) 和y 干扰素( y i f n ) 等细胞因子的受体，借此巨噬细胞能 与感染部位组织细胞产生的m c p l 、g m - c s f 、m - c s f 和y i f n 等细胞因子结合， 而被募集到感染部位并被活化，使其吞噬能力显著加强。与此同时，巨噬细胞通 过分泌趋化性细胞因子、促炎细胞因子、低分子量炎性介质和胞外酶等物质参与 和促进炎症反应。 ( 3 ) 加工提呈抗原，启动适应性免疫应答：巨噬细胞是专职抗原处理及提 呈细胞，可将摄入的外源性抗原和内源性抗原加工处理为具有免疫原性小分子肽 段，并以抗原肽一心ci i i 类分子复合物的形式表达于巨噬细胞表面，供c d 4 + c d 8 t 十细胞识别。 ( 4 ) 免疫调节：巨噬细胞通过提呈抗原、产生和分泌各种细胞因子、某些 神经肽及激素等，参与免疫应答和免疫调节。 此外，巨噬细胞还具有杀伤肿瘤和病毒感染等靶细胞、调节止血以及组织修 复和再生等生理作用。 1 3 2 生物材料对巨噬细胞行为的影响 1 3 。2 1 生物材料对单核细胞分化成巨噬细胞的影响 细胞分化是指细胞后代在形态结构和功能上发生差异的过程，通过细胞分 化，使具有相同遗传组成的细胞，选择性地表达不同的基因，产生不同的结构蛋 白、执行不同的功能，共同参与构成一个复杂的细胞社会，所以细胞分化的实质 是基因的差别表达( d i f f e r e n t i a le x p r e s s i o n ) 。细胞分化与形态发生 ( m o r p h o g e n e s i s ) 是相互联系在一起的，后者是指通过细胞的增殖、分化和行 为( 如粘附、迁移、凋亡) 塑造组织、器官和个体形态的过程。 5 第一章绪论 单核细胞由骨髓单核系干细胞发育分化而成，约占血液中白细胞总数的 3 8 。其胞质中富含溶酶体颗粒，其内含过氧化物酶、酸性磷酸酶、溶菌酶等 多种酶。单核细胞在血液中仅停留1 2 - - - 2 4 小时，然后进入组织器官或表皮层， 相应地分别发育分化成朗格汉斯细胞或巨噬细胞“”。 胶原是哺乳动物皮肤、骨、腱、血管、牙齿和细胞骨架的主要纤维成分，构 成人体约3 0 的蛋白质。为考察依赖于细胞外基质的细胞形态是否对单核细胞 分化成巨噬细胞产生影响，s u d h a k a r a n 等纠将人外周血单核细胞种植于三维胶 原支架中，研究巨噬细胞对白蛋白的吞噬能力以及特定表面抗原和基质金属蛋白 酶的表达。结果表明，在三维胶原支架上生长的巨噬细胞对白蛋白的吞噬能力比 胶原修饰的组织培养板( t c p s ) 强，并且在三维支架中单核细胞向巨噬细胞分化 速率高于二维胶原膜。这种结果说明三维支架结构更符合细胞外的微环境引， 通过信号转导调控单核巨噬细胞的行为有别于二维体系。这种研究模型有助于 考察正常生理条件以及某些病理条件如动脉硬化症、糖尿病和老化过程产生的信 号转导。随后，他们还报道了血管中非酶化糖修饰胶原( n o n - e n z y m a t i c a l l y g l y c a t e dc o l l a g e n ) 的细胞外基质蛋白会加快单核细胞向巨噬细胞分化，从而 导致泡沫细胞( f o a mc e l1 ) 的形成，进而引发动脉硬化症i i 川。j a c o b 等l i 刊体外 研究了细胞外基质蛋白对单核巨噬细胞分化的影响。他们研究了在单核细胞分化 过程中巨噬细胞表面特异标记的表达情况：( a ) 对改性蛋白质的吞噬：( b ) 巨噬 细胞基质金属蛋白酶( m m p s ) 的表达；( c ) 髓过氧物酶和1 3 - d - 葡萄糖苷酸酶的 活性；( d ) 细胞表面抗原表达的变化。随着细胞培养时间的增加，分化速率不断 加快，表现为巨噬细胞对标记牛血清白蛋白( b s a ) 的吞噬能力的增强和胶原酶a 和b 的表达。与型胶原修饰的材料表面相比，单核一巨噬细胞的吞噬速率和m m p s 的生成速率在纤连蛋白( f n ) 和i 型胶原修饰的材料表面呈显著增强趋势，说明 细胞在后一种表面的分化速率较快。这种结果表明，由细胞外基质蛋白提供的微 环境特别是f n 修饰表面可以调节单核一巨噬细胞的分化速率。 1 3 2 2 生物材料表面蛋白吸附对巨噬细胞黏附的影响 生物材料植入体内后，如图1 2 所示，体液或血液中的多种蛋白将吸附到 材料表面，然后引起单核巨噬细胞的黏附和活化。巨噬细胞可识别黏附于生物 材料表面的蛋白质，如纤连蛋白( f i b r o n e c t i n ，f n ) 、玻连蛋白( v i t r o n e c t i n ， v n ) 、免疫球蛋白一g ( i m m u n o g l o b u li ng ，i g c ) 、补体c 3 ( c o m p l e m e n tc o m p o n e n t 3 ) 等。巨噬细胞黏附到生物材料表面后可被激活融合而形成异物巨细胞( f o r e i g n b o d yg i a n tc e l l ，f b g c ) ，在巨噬细胞独特表型f b g c 的作用下，材料的降解速率 明显加快。被活化的巨噬细胞会进一步释放细胞因子以及胞外酶和其他炎性介 6 第一章绪论 质，从而影响炎性环境中的其他类型细胞的功能【l0 j 。 k a o 等o 1 采用体外和体内技术，研究了生物材料和巨噬细胞相互作用的复 杂的分子机制。研究结果显示，在巨噬细胞黏附过程中，补体c 3 起着重要作用。 c 3 通过形成c 3 b 被吸附到材料表面，补体蛋白被材料激活通过两种途径导致补体 的级联反应，从而介导巨噬细胞的黏附。a n d e r s o n 等【l 副比较了多种血浆蛋白对 巨噬细胞黏附水平的影响，发现f n 、v n 、威勒布兰德因子( y o nw i l l e b r a n df a c t o r ， v w f ) 和i g g 具有介导巨噬细胞黏附的功能；v w f 抑制巨噬细胞黏附，i g g 促进巨噬 细胞长期黏附。s h e n 等u 刿考察了表面化学性质和蛋白吸附对单核巨噬细胞黏 附、激活和促凝血反应的影响。采用组织培养板、未处理的聚苯乙烯和p r i m a r i a 制备得到具有不同表面化学和亲疏水性的材料表面，预先吸附i g g 、b s a 、纤连蛋 白和纤维蛋白原，用于观察单核巨噬细胞行为。研究结果显示，f b g c 的形成、 t n f q 的分泌和促凝血效果在i g g 修饰的表面达到最佳。吸附纤维蛋白原和纤连 蛋白的表面比未修饰表面，f b g c 的形成水平更低。t n f q 的分泌水平在纤维蛋白 原、纤连蛋白和白蛋白表面相差不大。同时，单核一巨噬细胞的激活也受化学性 质的影响，因为f b g c 的生成水平在未处理的聚苯乙烯表面最高，而在组织培养板 表面最低；单核一巨噬细胞的促凝血效果在p r i m a r i a 最佳。因此，吸附的蛋白质 和材料表面化学对f b g c 的形成、t n f a 的分泌和促凝血反应有重要影响，这将为 设计新型的生物材料提供有益的思路。 图l 一2 生物材料一蛋白质一巨噬细胞相互作用模式图 f i g 1 - 2b i o m a t e r i a l p r o t e i n m a c r o p h a g ei n t e f f a c i a li n t e r a c t i o n sl e a d i n gt oc e l l u l a ra c t i v a t i o n ， p r o l i f e r a t i o na n ds y n t h e s i s 第一章绪论 1 3 2 3 生物材料对巨噬细胞融合的影响 细胞融合是两个或两个以上细胞合并形成一个细胞的过程。在自然情况下， 体内外发生细胞融合的现象称为自然融合；体外培养的细胞可用人工方法促使相 同或不同细胞间发生融合，称为人工诱导融合。细胞融合是研究细胞间遗传信息 转移、基因在染色体上的定位、以及创造新细胞株的有效途径。 生物材料植入体内，黏附在表面的单核巨噬细胞试图吞噬材料，融合形成 具有更强吞噬能力的f b g c ，进而加速材料的降解。某些细胞因子如白介素一4 ( i l - 4 ) 和白介素一1 3 ( i l - 1 3 ) 通过巨噬细胞表面甘露糖受体介导作用会促进这种 融合作用，而且甘露糖受体被认为介导巨噬细胞对糖蛋白和微生物的吞噬瞄。 a n d e r s o n 等l 2 1 , 2 2 1 分别采用碳氟化合物、聚氧化乙烯、聚二甲基硅氧烷本体或表 面改性聚氨酯，体外研究它们对巨噬细胞黏附、融合、凋亡及细胞骨架变化的影 响。结果表明，碳氟化合物和聚氧化乙烯表面改性聚氨酯不会影响巨噬细胞的黏 附、融合和凋亡；聚硅氧烷改性聚氨酯不会影响巨噬细胞的黏附，但会促进巨噬 细胞的融合；加入i l - 4 后，黏附细胞的形态发生急剧变化，巨噬细胞膜表面甘 露糖受体表达增加。另外，激光共聚焦显微镜下观察到巨噬细胞膜表面微丝的分 化( p o l a r i z a t i o n ) 引起t d e f i f e 等m 刊的兴趣，他们研究了甘露糖受体介导的 巨噬细胞融合是否依赖细丝状肌动蛋白路径。研究结果表明，细胞松弛素b 和d 分裂微丝干扰巨噬细胞融合具有浓度依赖性。细胞松弛素b 和d 虽然抑制巨噬细胞 融合，但对巨噬细胞的黏附、迁移和运动没有显著影响。这些结果说明，细胞因 子诱导的、甘露糖受体介导的巨噬细胞凋亡需要完整的f 一肌动蛋白骨架，而且融 合机理与噬菌机理相类似。 1 3 2 4 生物材料对巨噬细胞凋亡的影响 在多细胞生物中，细胞的死亡有两种形式。一种是细胞坏死( n e c r o s i s ) ，另 一种是细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 。细胞凋亡是指由体内外因素促发细胞内预存的死 亡程序诱导的细胞死亡过程。细胞凋亡不同于细胞死亡，是细胞为了维持集体内 环境的稳定，由一系列生理性特定基因编码和控制的自主、有序的死亡，是一个 主动的过程，涉及一系列基因的激活、表达和调控等。细胞坏死是由于某些外界 环境( 局部缺血、高热、物理化学损伤及微生物的侵袭等) 的作用使细胞受到侵 害性损伤，引起细胞肿大、胀裂、胞内物质溢出，并由此引起周围组织发生炎症 等一系列崩溃现象。细胞坏死会引起炎症反应，而细胞凋亡不会引起炎症反应 2 4 2 a 0 s h i v e 等弘q j 的研究表明聚氨酯表面化学性质和动态剪切速率影响巨噬细胞 8 第一章绪论 的凋亡。由于黏附在生物材料表面的巨噬细胞易融合生成f b g c ，会加速材料在体 内的降解，导致植入失效。因而控制材料一组织界面的巨噬细胞和异物巨细胞的 功能可以提高材料在体内的稳定性，其中诱导巨噬细胞凋亡是提高材料稳定性的 一种重要方式。b r o d b e c k 等弘v o j 的体内外研究确认，亲水性和阴离子修饰的聚 氨酯表面比疏水性和阳离子修饰的表面更能抑制单核巨噬细胞的黏附和融合， 并促进其凋亡，从而提高植入材料的稳定性。g r e t z e r 等弘u 考察了表面形貌相同 的不同材料如可降解聚氨酯、聚苯乙烯和钛对单核细胞黏附、凋亡和分泌细胞因 子的影响。研究结果表明，在聚氨酯膜表面黏附数量比其他二者多，脂多糖的加 入促进细胞的黏附，但减少单核细胞的凋亡和坏死数量，其中在聚氨酯膜表面细 胞凋亡和细胞坏死的数量最少；但细胞未受脂多糖刺激时，t n f q 的分泌量较少， 而且与钛表面相比，t n f a 和i l - i o 的分泌量明显较少：这些说明，细胞黏附、 凋亡和细胞因子的分泌与材料性质有关，而且与钛和聚苯乙烯表面相比，聚氨酯 表面的细胞激活能力较低。 1 3 2 5 生物材料对巨噬细胞分泌细胞因子的影响 生物材料植入体内后，黏附在其表面的单核巨噬细胞受激活会分泌细胞因 子，从而影响其他细胞功能。例如，它会调控成纤维细胞生长，诱导淋巴细胞增 殖、合成蛋白质和分泌细胞因子，进而激活巨噬细胞，引起炎症反应弘引。细胞 因子根据所起的作用分为促进炎症反应或者促进创伤愈合反应两大类型。肿瘤坏 死因子一q ( t n f ：q ) 、i l - 8 、i l - 6 、i l - 2 促进炎症反应抑制创伤愈合；i l 一1 r a 、 i l - 4 、i l - 1 3 抑制炎症反应促进创伤愈合：i l - 1b 既促进炎症反应又促进创伤愈 合；i l - i o 既抑制炎症反应又抑制创伤愈合反应。因此，控制细胞因子的环境对 促进期望的反应有重要意义弘u ，d j 。 一 生物材料的表面性质如材料组成、亲疏水性、表面电荷、表面形貌等会影响 蛋白吸附，进而影响巨噬细胞行为。b r o d b e c k 等t z o , 3 0 j 考察了聚氨酯表面化学性 质对单核巨噬细胞分泌细胞因子的影响。体外研究结果显示弘，i l 1 0 在亲水 性和阴离子修饰表面的表达水平显著高于疏水性和阳离子修饰表面，i l - 8 则相 反。体内研究结果表明弘w ，亲水性修饰表面抑制炎性细胞分泌促炎细胞因子和 促创伤愈合细胞因子，与体外研究结果相似。此外，y o u n g 等弘训报道不同表面形 貌和亲疏水性的结晶聚合物会影响单核巨噬细胞的黏附和激活。r i c h a r d 等p u j 体外考察了硅酸盐基和磷酸锌基生物活性玻璃对激活的巨噬细胞分泌细胞因子 的影响。研究结果表明，在硅酸盐玻璃条件下t n f q 和i l - 6 的分泌量明显低于 磷酸锌玻璃，预示着硅酸盐玻璃具有较低的炎症反应，将有可能应用到治疗风湿 性关节炎等临床研究。 9 第一章绪论 高分子量的壳聚糖生物相容性好，有很多生物学功能，广泛用于生物医学 领域如创伤愈合、软组织和硬组织的重建、药物释放等，但在中性条件下的不溶 解性限制了它在体内的应用。因而，z h a o 等t j l i 采用酶水解的方法得到寡壳聚糖 ( 3 - - 一1 0 个糖单元) ，评价了寡壳聚糖糖对巨噬细胞的影响。研究表明，壳聚糖 具有刺激巨噬细胞释放相关因子( 如肿瘤坏死因子t n f a 和白介素- 1b 等) 的作 用，从而诱导宿主愈合。寡壳聚糖中的n 一乙酰基葡糖胺( n a g a ) 可与巨噬细胞表 面的甘露糖受体相结合，从而促进巨噬细胞吞噬寡壳聚糖。 为了研究甲壳素衍生物激活巨噬细胞的机理，日本学者m o r i 等l j 纠用甲壳素、 壳聚糖、低分子量壳聚糖刺激腹腔巨噬细胞。研究表明，壳聚糖会促使巨噬细胞 的凋亡，但甲壳素和低分子量壳聚糖不会；壳聚糖刺激后的巨噬细胞产生活化标 记物，如主要组织相容性复合体i 类和i i 类分子( ci 和m n ci i ) ，f c 受体、转 铁蛋白受体、甘露糖受体、f a s 和巨噬细胞炎性蛋白( m i p 一2 ) ，然而甲壳素和低 分子量壳聚糖刺激巨噬细胞后，只产生m h ci 和m h c1 1 分子；壳聚糖诱导巨噬细 胞凋亡的途径是由甘露糖受体介导的通过f a s 信号转导的吞噬作用。从以上可得 出结论，壳聚糖通过甘露糖受体活化巨噬细胞并促使它凋亡的方式促进创伤愈 合，但需要进一步考察壳聚糖相对分子质量的大小是否对巨噬细胞细胞激活有影 响。 1 3 2 6 生物材料对巨噬细胞产生反应性氧中间物的影响 巨噬细胞与病原体等抗原性异物结合后，经吞噬或吞饮作用将病原体等摄入 胞内形成吞噬体。在吞噬体内，可通过氧依赖和氧非依赖杀菌系统杀伤病原体。 当溶酶体与吞噬体融合形成吞噬溶酶体后，在多种水解酶的作用下，可进一步使 细菌消化降解，同时产生一些具有免疫原性的小分子抗原肽段。氧依赖杀菌系统 包括反应性氧中间物系统和反应性氮中间物系统。其中反应性氧中间物系统是指 在吞噬作用激发下，通过呼吸爆发，激活细胞膜上还原性辅酶i 和还原性辅酶i i ， 使分子氧活化，生成超氧阴离子( 0 2 一) 、游离羟基( o h 一) 、过氧化氢( h 2 0 ：) 和 单态氧( 1 0 。) 产生杀菌作用的系统。这些活性氧化物质具有很强的氧化作用和细 胞毒作用，可有效杀死病源微生物，同时对机体组织细胞也有一定的损伤作用 【1 1 】 o 许多学者对培养在材料表面的细胞的氧代谢的研究表明，吞噬细胞反应性氧 中间物的形成和对外源刺激物的应答取决于细胞类型( 悬浮或黏附) 、基质和刺 激物的类型等【j 川。单核细胞向成熟巨噬细胞的分化伴随着细胞内髓过氧物酶、 过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶清道夫的减少和0 2 - 、h 。0 。和0 h 一的产生。i l 一4 促进单核细胞的分化和抑制细胞内可溶性和颗粒刺激的0 2 一产生，而且抑制i f n l o 第一章绪论 y 介导的h 。0 ：的产生。g r e t z e rc 等的l 1 研究表明，h 。0 2 随着材料颗粒量的增加在 短期内会增加，但在长期培养下这种反应被打破，而且伴随着表型的改变。关于 这方面的体内研究较少。k a l l t o r p 等【 1 将不同亲疏水性表面的材料植入鼠体内 研究材料表面理化性质对中性粒细胞和单核细胞分泌反应性氧中间物的影响。结 果表明，在亲水性材料表面( 一o h ) 比疏水性材料表面( 一c h 。) 产生较多的反应 性氧中间物。 1 3 2 7 生物材料一巨噬细胞相互作用对其他细胞的影响 生物材料植入生物体内，将会引起一系列的异物排斥反应。体内的早期反应 是急性和慢性炎症，主要由多形核白细胞、单核巨噬细胞、淋巴细胞参与。这 三种细胞主导植入前两周的体内反应，因而在正常条件下，单核巨噬细胞与淋 巴细胞会相互作用从而影响彼此的行为。b r o d b e c k 等p 叫的研究表明，材料的表 面化学性质会影响巨噬细胞和淋巴细胞的相互作用，从而影响到材料在体内的生 物相容性。淋巴细胞促进巨噬细胞的粘附和融合，巨噬细胞则促进淋巴细胞的增 殖；亲水性表面抑制单核细胞的粘附，同时抑制淋巴细胞的增殖p 。此外，被 活化的巨噬细胞会释放细胞因子以及胞外酶和其它炎性介质，从而影响炎性环境 中的其他类型细胞的功能，因而全面考察巨噬细胞在植入部位炎症和创伤愈合的 作用，需要包括对其他细胞类型如靶细胞的影响。r o d r i g o 等人l j 州采用巨噬细胞 和造骨细胞共培养技术，考察了在骨吸收过程中氧化铝颗粒对几种细胞因子的影 响。结果表明，在与造骨细胞共培养条件下，巨噬细胞会降低t n f q 的表达；当 巨噬细胞用氧化铝颗粒处理后，t n f q 的表达增加，但与造骨细胞共培养，t n f a 表达水平有所下降；与t n f a 不同的是，巨噬细胞单独培养时，i l - 6 的表达水 平很低，但与造骨细胞共培养时工l 6 的表达水平却增强。另一方面，巨噬细胞促 进造骨细胞表达i l - 6 和g m - c s f ，用氧化铝颗粒处理后，两种细胞因子的表达水平 有所增强。根据这些体外实验结果可以推测，氧化铝颗粒在体内可以引发炎症反 应，但需要进一步研究。c u r r a nj m 等人p 刈采用造骨细胞与巨噬细胞共培养技术， 研究双相磷酸钙颗粒的潜在炎症情况。研究结果表明，颗粒中磷酸三钙的比率比 颗粒的大小在对细胞黏附和细胞因子表达方面起到更重要的影响。 1 3 3 巨噬细胞对生物材料降解的影响 1 3 3 1 生物降解概述 所谓生物降解一般指因生物环境而造成的降解。人体是一个非常复杂的环 第一章绪论 境，植入体内的材料长期处于物理、化学、