（分析化学专业论文）鼠李糖脂在微乳毛细管电动色谱中的应用.pdf

摘要 摘要 微乳毛细管电动色谱( m e e k c ) 是在胶束毛细管电动色谱( m e k c ) 基础上发展起来的 一种电泳新技术。鼠李糖脂是近年来应用较为广泛的生物表面活性剂，表面活性很高。 本论文首次将鼠李糖脂应用于m e e k c ，旨在解决经典微乳体系中离子型表面活性剂用 量过多造成的焦耳热过大、柱效下降、分析时间过长等问题。论文分四个部分： 1 通过发酵法制备鼠李糖脂，经过分离纯化得到鼠李糖脂提取物，通过高效液相色 谱电喷雾质谱法( h p l c e s i m s ) 确定了提取物中鼠李糖脂同系物的组成及相对质量分 数。通过临界胶束浓度( c i v i c ) 的测定对鼠李糖脂的表面活性做了初步探讨。结果表明， 该鼠李糖脂提取物至少由九种同系物组成。在弱碱性条件下( p h7 5 9 0 ) ，p h 的变化对 鼠李糖脂的表面活性有显著影响。p n 小于9 0 时，c m c 随着p h 的升高而降低，在p h 9 0 处达到最低值；p h 大于9 0 时，c m c 随着p h 值的升高而逐渐升高。这是氢键和极 性头基间的静电排斥力共同作用的结果。 2 以该鼠李糖脂提取物为表面活性剂制备了微乳液，并探讨了该微乳体系稳定性的 影响因素。通过微乳液滴粒径和 电位的测定考察了p h 值及添加物对该微乳体系微结 构的影响。结果显示，该微乳体系稳定性受温度、p h 值、表面活性剂浓度和助表面活 性剂影响较大。微乳液滴的粒径及 3 的情况下，其内表面硅羟基发生解离而 带负电，和缓冲液接触时形成双电层。在高压电场作用下，形成双电层一侧的缓冲液由 于带正电荷而向负极移动，形成电渗流。而缓冲液中带负电的微乳液滴在电场作用下向 正极泳动。由于电渗速度大于电泳速度，因此微乳液滴仍向负极移动。各种被分析的组 分，由于在微乳相与水相中的分配差异，加上它们的荷电与尺寸差异性，表现出不同的 表观淌度。因此m e e k c 可同时分离离子和中性化合物。由于微乳的增溶作用，一些难 溶于水的有机化合物也可以用m e e k c 来分离分析，而分离时间窗口的增大，使电泳峰 容量增大许多，因此m e e k c 更加适用于多组分复杂体系的分析。 1 1 3m e e k c 的应用与发展 近几年来，m e e k c 在药物，手性分离，生物分子，环境分析以及疏水性评价等各 个领域的应用都有了长足进步，呈现出强势的发展。 江南大学硕士学位论文 1 1 3 1 疏水性测定 m e e l 最重要的用途之一就是测定化合物的疏水性。化合物在微乳液中的微观两 相中的分配性质，可模拟化合物在本体溶液中的分配行为。国外学者认为，可根据化合 物在微乳两相中的分配而引起其电泳迁移行为的差异进行油水分配系数之一的正辛醇 水分配系数的对数值( 1 9 p e w ) 的测定。用m e e k c 技术测定化合物l g p e w ，比其它一些方 法简单、快速，测量精确度也更高1 1 2 1 3 1 。 1 1 3 2 药物分析 研究表明m e e k c 可同时对脂溶性和水溶性的维生素进行分离，且比m e k c 具有 更大分离度【1 4 1 。b e l l i n im s 等运用m e e k c 同时分离了七种脂溶性和水溶性维生素【1 5 1 。 合成药物方面，到目前为止，m e e k c 已被用于分析强心剂、止痛药、感冒药、镇 静剂、药物的代谢产物等【1 6 - 2 0 。 中药方面，国内已有报道用m e e k c 测定蟾酥及其制剂中蟾毒内酯类成分的含量 2 1 l ，以及测定消炎利胆片中的穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯瞄】。 1 1 3 3 手性拆分 到目前为止，利用m e e k c 进行手性拆分的报道不多，主要用于分离麻黄碱和假麻 黄碱。z h a n g 等】用微乳毛细管电动色谱激光诱导荧光检测法 正e k c l i f ) 在8m i n 内 成功分离了麻黄碱和假麻黄碱。z h e n g 等瞰】则通过使用手性表面活性剂的m e e k c 对麻 黄碱、甲基麻黄碱和去甲麻黄碱进行了手性分离。赵海波等【2 5 】首次用p 环糊精添加的 m e e k c ，在1 2m i n 内完成了顺式、反式氯氰菊酯对映体的手性拆分。 1 1 3 4 生物分子分析 m e e k c 最初的应用集中在中性小分子的分离研究上，很少用于生物大分子的分离 分析。周国华等人瞄】首次将m e e k c 应用到生物大分子的分离上，发现m e e k c 可有效 分离蛋白质类生物大分子。分离度受温度、电压和十二烷基硫酸钠( s d s ) 浓度影响较大， 受p h 值和离子强度的影响较小。用该方法对重组人粒细胞集落刺激因子( r h u g m c s f ) 和重组人肿瘤坏死因子( r h u t n f ) 半成品的纯度进行了测定。 1 1 3 5 其他物质分析 m e e k c 在环境分析中的应用相对较少。已有报道用m e e k c 分析环境中的中性的 多环芳烃、杂环化合物 2 7 1 。 近来食品及化妆品中的防腐剂类，防晒霜中的防晒剂，利尿药等各种强极性化合物， 电中性芳香族化合物等都能用m e e k c 进行分离分析【2 8 】。 1 1 4m e e k c 分离影响因素 由于微乳体系比胶束溶液的组分更复杂，通过组成的变化可控制速率、相比、表面 电荷密度等重要参数，因此比m e k c 有更多的操作变量，从而扩大了毛细管电动色谱 的应用范围。 2 第一章绪论 1 1 4 1 表面活性剂种类和浓度 表面活性剂的种类及浓度对微乳液滴的大小、表面电荷、电荷相互作用以及电渗流 的方向与大小都有显著影响。随着表面活性剂浓度的增加，微乳体系稳定性增强，对脂 溶性成分的增溶作用增强，分离的选择性也会发生改变；同时高浓度的表面活性剂会增 大电泳电流，导致分析时间延长，较高的离子强度也会限制高电压的使用。表面活性剂 浓度过低则会导致微乳液分层。常用的阴离子表面活性剂为s d s ，阳离子表面活性剂为 十六烷基三甲基溴化铵( c t a b ) ，十四烷基三甲基溴化铵) 【2 9 】。此外，b r i j 7 6 t 3 0 l 、 b r i j 3 5 1 3 1 1 、2 丁基酒石酸( a o t ) p 2 】等非离子型表面活性剂也可以用来形成微乳液。非离 子型表面活性剂由于不带电荷，脂溶性成分的迁移速率较快，但分离的选择性也交差。 1 1 4 2 缓冲液的p h 值 被分析物在带电和中性情况下的迁移性质不一样，改变缓冲液的p h 值将影响被分 析物的离子化程度和电渗流的大小，从而改变m e e k c 分离的选择性。p h 越大，毛细 管内表面硅羟基的解离程度越大，电荷密度越大，电渗流淌度就越大。 1 1 4 3 缓冲浪种类和浓度 高浓度的缓冲液可以减小电渗流，但是其高离子强度限制了高电压的使用。低浓度 的硼酸盐或磷酸盐的缓冲液具有较小的分析电流和较大的电渗流，应用比较广泛。其常 用的浓度范围为5 1 0 0m m o l l 。 1 1 三4 4 助表面活性剂的类型与浓度 ， 助表面活性剂对分离的选择性有很大影响。正丁醇是最常用的助表面活性剂，此外， 异丙醇、异戊醇、丙二醇等也常被用来改善分离选择性【3 3 1 。洪利娅等【2 2 1 发现用异丙醇代 替正丁醇作为助表面活性剂，对吉他霉素各组分的分离度有较大改善。 1 1 4 5 有机改性剂的类型与浓度 加入一定量的有机溶剂有利于提高脂溶性成分的溶解度，改善峰形，减小拖尾，但 过多的有机添加剂会导致微乳液分层。甲醇和乙腈是常用的有机添加剂瞰】。 1 1 4 6 油相的类型和浓度 常用油相有正辛烷、正庚烷、正己烷。三种正构烷烃中，正庚烷毒性较小，而正辛 烷重现性较好【3 5 1 。 1 1 4 7 温度 温度对m e e k c 的分离也有一定的影响。它主要通过改变分析物的溶解度而影响它 的分配系数。其次，温度的改变会使微乳液粘度发生改变，导致电渗流的变化【3 6 1 。 1 1 5m e e k c 的优缺点 与高效液相( h p l c ) 、气相( g c ) 等方法相比，m e e k c 具有易于实现自动化、样品进 样量少、分析时间短、重现性好、样品前处理简单等优势。与m e k c 相比，微乳由于 3 江南大学硕士学位论文 其大尺寸和相对不太紧密的结构，比胶束具有更大的增溶量。将它用于分离疏水性化合 物时，效果更佳。而分离时间窗口的增大，使电泳峰容量增大许多，更适用于多组分复 杂体系的分析。 但m e e k c 也有不足之处：在m e k c 中，可根据需要选用不同类型的表面活性剂， 但在m e e k c 中，由于微乳体系稳定性的要求，许多表面活性剂的使用受到了限制，至 今仍以s d s 的使用最为广泛；由于微乳液中含有高浓度的表面活性剂，会产生大量的 质谱吸收背景，而使m s 与m e e k c 的联用较为困难；此外，m e e k c 在理论认识和技 术上还不尽完善，微乳液的稳定性和分析的重现性还有待于提高，m e e k c 的新体系和 新方法还有待进一步研究，以完善和发展m e e k c 自身的理论基础。 1 2 鼠李糖脂 1 2 1 生物表面活性剂简介 生物表面活性剂( b i o s u r f a c t a n t ) 是由微生物在好氧或厌氧条件下在碳源培养基中生 长时产生的具有高表面活性的生物分子【3 7 】。生物表面活性剂大多为非离子型和阴离子 型，由一个或多个亲水性和疏水性基团组成。根据其亲水基的类别，分为以下五种类型： ( 1 ) 以糖为亲水基的糖脂系生物表面活性剂；( 2 ) 以低缩氨酸为亲水基的酰基缩氨酸系生 物表面活性剂；( 3 ) 以磷酸基为亲水基的磷脂系生物表面活性剂；( 4 ) 以羧酸基为亲水基 的脂肪酸系生物表面活性剂：( 5 ) 结合多糖、蛋白质及脂的高分子生物表面活性剂( 生物 聚合体) 。 和传统的化学表面活性剂相比，生物表面活性剂不但具有降低表面张力、分散和增 溶作用，而且还具有以下优点：( 1 ) 可生物降解，不会造成二次污染；( 2 ) 无毒或低毒， 对生态环境影响小；( 3 ) 对生物的刺激性较低；( 4 ) 可利用工业废物为原料进行生产，并 用于生物环境治理；( 5 ) 具有更好的环境相容性和更高的起泡性；( 6 ) 稳定性好，在极端 温度、p h 、盐浓度下具有更好的选择性和专一性；( 7 ) 结构多样，可适用于特殊的领域。 因此，近年来生物表面活性剂越来越受到人们的关注，被广泛应用在食品工业、精细化 工、医疗卫生等行业。 1 2 2 鼠李糖脂结构与性质 鼠李糖脂晶体为无色方形片状，易溶于甲醇、氯仿、乙酸乙酯和乙醚等有机溶剂， 在碱性水溶液中也表现出良好的溶解性。由图1 1 鼠李糖脂结构通式可以看出，其亲水 基团一般由1 2 分子鼠李糖构成，疏水基团则由1 2 分子具有不同碳链长度的饱和或不 饱和脂肪酸构成，在碱性条件下是一种羧酸盐型表面活性剂。在生物合成过程中，不同 的亲水和疏水基团之间可能相互链接而生成多种化学结构相近的鼠李糖脂同系物，同系 物的组成、比例、不饱和键的多少、烷基链的长度以及亲水基团的大小都能影响它们的 表面活性【3 刀。 鼠李糖脂的分子量通常介于4 7 6 7 7 6g m o l 之间。临界胶束浓度为2 0 2 0 0m g l 3 s 】， 能使水的表面张力从7 2m n m 降至3 0m n m 左右，使油水界面张力从4 3m n m 1 降低 4 第一章绪论 至1m n m 。1 左右。 o h o o - - - - c h c h 2 m c - - - o 一 i ( c h l ) i c h ， h oo i 氏 图1 1 鼠李糖脂分子结构通式 f i g u e ll lb a s i cc h e m i c a ls ：仃u c t u r eo f r h a n m o l i p i d 1 2 3 鼠李糖脂的应用 鼠李糖脂具有良好的乳化、增溶、发泡、润湿、吸附、絮凝、渗透等性能，经改性 后有望替代传统表面活性剂广泛应用于石油开采、环境治理、化妆品、食品、医药等领 域。作为天然产品，鼠李糖脂具有更好的生物相容性和微生物可降解性，因此它的潜在 应用价值和广阔的开发前景是不容忽视的。 1 2 3 1 鼠李糖脂提高原油采收率的应用 鼠李糖脂等生物表面活性剂能溶于地层水和注入水中，在油水界面有较高的界面活 性f 在含油岩石表面润湿性好，能剥落油膜，分散原油，具有很强的乳化原油的能力； 在固体表面吸附量小，具有岩石润湿能力及降低重原油粘度的能力，因此被广泛应用于 三次采油，提高石油采收率【3 9 4 5 1 。 1 2 3 2 鼠李糖脂在治理环境污染上的应用 近年来，工业废水、聚芳香族烃类、原油、杀虫剂以及重金属等造成的土壤污染问 题日益严重。鼠李糖脂可用来修复被烃类和原油污染的土壤i 妊5 1 】，亦可用于土壤中有毒 物质的富集和清除【5 2 弓3 1 。与其他污染治理方法相比，可避免二次污染的发生，是一种更 有效、更彻底的技术方法。此外，鼠李糖脂还可用于油罐的洗涤【5 4 1 。 1 2 3 3 其他方面的应用 鼠李糖脂有较强表面活性和乳化性能，可作为润湿剂、乳化剂等应用于食品、制药、 日化行业【5 5 】，由于其较强的抗菌性能和抗病毒活性，还能作为抗植物病原体的试剂【5 6 1 。 1 2 4 鼠李糖脂微乳体系研究现状 目前国内外对于鼠李糖脂微乳体系的研究有少量报道，基本都围绕在相行为方面。 谢颖玮等用鼠李糖脂成功制各了微乳液，并通过鼠李糖脂正丁醇正庚烷水体系相行为 的研究，分析了n a o h 5 7 】及助表面活性剂【5 8 】对微乳体系相转变的影响。在另一篇报道中， 谢颖玮等【5 9 1 还考察了在o w 和w o 两种鼠李糖脂微乳体系中微结构的变化，发现液滴 江南大学硕士学位论文 尺寸、扩散系数及聚合度分布性都有所不同，w o 微乳液滴更均一，尺寸也较小。 1 3 糖皮质激素的分析 1 3 1 糖皮质激素简介 激素( h o r m o n e ) 是人体内分泌腺分泌出的一种调节机体正常活动的重要物质，影响人 体的新陈代谢，使组织、器官生长发育，使人体的生理功能发生变化。把人体天然激素 的化学结构进行改造，人工合成后并制成药物，使激素成了治病救命的利器。糖皮质激 素( g l u e o c o r t i e o i d ) 是临床使用最广泛的三类激素之一，包括氢化可的松( h y d r o c o r t i s o n e ) 、 可的松( c o r t i s o n e ) 、泼尼松( p r e d n i s o n e ) 、泼尼松龙( p r e d n i s o l o n e ) 等等。其制剂有口服片剂、 注射液以及外用的软膏、滴眼液、喷雾剂等。糖皮质激素对蛋白质、糖、脂肪、水、电 解质代谢及多种组织器官的功能有重要影响，具有抗炎、抗过敏和抑制免疫等多种药理 作用。 糖皮质激素的基本结构为见图1 2 ，其维持生理功能必需基团基本结构为甾核、c 3 的酮基，c 4 5 的双键、c 2 0 的羰基。 图1 2 糖皮质激素结构式 f i g1 - 2b a s i cc h e m i c a ls 臼1 l c n l r eo f g l u c o c o r t i c o i d s 1 3 2 糖皮质激素的滥用与危害 糖皮质激素对蛋白质、糖、脂肪、水、电解质代谢及多种组织器官的功能有重要影 响，临床可利用糖皮质激素及其衍生物的抗炎、抗风湿和免疫抑制作用治疗多种疾病。 一些制假者利用中成药所含成分复杂、质量标准不完善的缺点，在纯中药制剂中非法添 加微量的糖皮质激素，对消费者健康造成危害。为了保证群众的用药安全，有必要建立 灵敏、可靠的分析方法快速测定中成药中违禁添加的糖皮质激素。 糖皮质激素具有增加体重，产生脂肪再分配作用，因此这类药物被一些养殖户超标 超量使用和滥用。动物生长过程中过量使用这些激素会导致其在动物源性食品中的残 留，影响人类健康。 外用糖皮质激素可降低毛细血管的通透性，短时间使用含有糖皮质激素的化妆品可 使皮肤光滑细腻、红润白嫩，有较好的美容效果。但长期使用皮肤会对激素产生依赖， 发生皮肤变薄、毛细血管扩张、毛囊萎缩，一旦停用，皮肤就会发红、发痒，出现红斑、 丘疹、脱屑等。因此我国：化妆品卫生规范规定此类物质为禁用成分。 6 第一章绪论 1 3 3 糖皮质激素残留的分析现状 由于激素种类繁多、结构相似，且在食品动物中的用量小、代谢快、残留低，因此 动物性食品和生物样品中激素残留分析的技术难度大，对方法的灵敏度、确证能力和分 析速度的要求很高。 目前测定食品中甾体类合成类固醇激素和糖皮质激素残留的方法有h p l c 【6 嘶1 1 、气 质联用( g c m s ) 【6 2 】和l c m s 6 3 侧。h p l c 方法的灵敏度较低，选择性差，已经不适合用 于痕量兽药残留分析的要求。g c - m s 方法虽然灵敏度和特异性都很高，可以满足残留 分析的要求，但衍生过程繁琐。l c m s 是分析糖皮质激素残留的一种重要方法，该方 法灵敏度高，选择性和特异性好，能够对低浓度的样品进行很好的确认，已用于测定不 同基质中的糖皮质激素，但这种方法对样品纯度要求较高，前处理较繁琐。 1 4 本课题的目的和意义 m e e k c 经典微乳体系组成为3 3 ( w w ) s d s 6 6 ( w w ) i e 丁醇0 8 ( w 厂w ) 正己 烷- 8 9 3 ( w w ) 硼砂缓冲液。3 3 的s d s 浓度过高，使电泳电流过大而产生焦耳热，柱 效下降，并导致样品分析时间拉长；而减小s d s 浓度则会引起微乳体系不稳定，实验 无法进行。因此，需要寻找一种表面活性更高的表面活性剂，应用于m e e k c ，以减小 表面活性剂用量，抑制焦耳热的产生。 鼠李糖脂是目前研究最为深入和广泛的生物表面活性剂，它的表面活性远高于 s d s ，在较低浓度时无需加入助表面活性剂就能形成稳定的微乳体系，在m e e k c 中具 有非常大的应用潜力。 到目前为止，国内外关于鼠李糖脂表面活性的研究大多集中在电解质及分子结构的 影响方面【6 7 删，关于它的的应用则以驱油和环境修复较多。以鼠李糖脂为表面活性剂制 备微乳液的研究已有少量报道，主要围绕在相行为方面。至今从未有过将鼠李糖脂微乳 体系应用于m e e k c 中。 本论文基于鼠李糖脂的高表面活性，首次将其应用于m e e k c ，旨在解决经典微乳 体系中离子型表面活性剂用量过多造成的焦耳热过大、柱效下降、分析时间过长等问题。 首先通过发酵法制备鼠李糖脂，并从发酵液中进行提取和纯化。为了提高回收率， 得到纯度较高的鼠李糖脂，对分离提纯方法和步骤进行优化。由于发酵所得的鼠李糖脂 通常由多种同系物组成，因此利用h p l c e s i m s 法来分离和鉴定提取物中的各种同系 物组成。 以该鼠李糖脂提取物为表面活性剂制备微乳液，并探讨该微乳体系的稳定性影响因 素。微乳液微结构的研究在m e e k c 中具有极其重要的意义。微乳液滴的粒径大小和表 面所带电荷会影响分析物在微乳相和水相中的分配比及迁移速度，从而影响分离度，峰 容量等分离参数。因此，通过微乳液滴粒径和 电位的测定，考察了p h 值的变化以及 助表面活性剂和十二烷基硫酸钠( s d s ) 的添加对于鼠李糖脂微乳体系微结构的影响。 将鼠李糖脂微乳液应用于m e e k c ，建立了新型微乳体系。以乙腈为标记物测定电 渗流时间，以强疏水性化合物菲为标记物测定微乳液滴的迁移时间，考察时间窗1 2 1 的变 7 江南大学硕士学位论文 化。系统地研究了鼠李糖脂微乳体系中的表面活性剂、助表面活性剂、油相缓冲液等微 乳组成以及电泳条件对时间窗口的影响。 利用鼠李糖脂微乳体系来分离三种结构相近的糖皮质激素( 泼尼松、泼尼松龙、氢 化可的松) ，优化微乳体系组成和电泳条件，在相同分离条件下与m e e k c 经典体系分 离效果作比较。 8 第二章鼠李糖脂的制各与性质 2 1 引言 第二章鼠李糖脂的制备与性质 生物表面活性剂的来源广泛，生产方法也很多。根据原料来源，生产方式可以分为： 从动植物材料中提取法，微生物发酵法和酶法合成等。从技术和经济角度考虑，微生物 发酵法较为可行，且适合大量生产【协7 2 。鼠李糖脂的生产一般采用发酵法，得到的同系 物组成、质量和数量主要受到碳源、氮源、离子浓度、培养条件( 如p h 、温度、通风量、 发酵方式) 以及所选择的菌种影响。因此，在鼠李糖脂的生产过程中必须考虑以上因素 的影响。 鼠李糖脂通常采用萃取、沉淀等方法进行提取，然后用硅胶柱色谱法，纸层析法、 薄层色谱法等方法分离各种组分，再通过各种质谱如快原子轰击质谱来鉴定m 7 4 】。由于 这些同系物性质十分相似，传统的分离方法很难将各个组分完全分开，而且繁杂的操作 可能会导致某些组分的流失。l c m s 技术集h p l c 的高分辨能力和m s 的高灵敏鉴定 能力于一体，已广泛应用于结构相近的复杂混合物各组分的分离和鉴定。 到目前为止，通过发酵法得到的鼠李糖脂发酵液中最多有二十多种同系物。本实验 以甘油为碳源，用铜绿假单胞菌发酵生产鼠李糖脂，对萃取剂及提取步骤进行优化，提 高鼠李糖脂的纯度和回收率。通过调节h p l c e s i m s 条件，对鼠李糖脂提取物进行各 种同系物的分离和鉴定，获得更为全面的化学结构信息。 2 2 实验仪器与试剂 2 2 1 试剂 甘油，h c l ，硫酸，乙酸乙酯，三氯甲烷，三氟乙酸，甲酸：分析纯，上海国药集 团化学试剂有限公司； n a n o a ，f e s 0 4 7 h 2 0 ，z n s 0 4 7 h 2 0 ，c o c l 2 6 h 2 0 ，c u s 0 4 5 h 2 0 ，m n s 0 4 h 2 0 ， n a m 0 0 4 2 h 2 0 ，酵母浸膏：化学纯，上海国药集团化学试剂有限公司： n a 2 h p 0 4 12 h 2 0 ，k h 2 p 0 4 ，m g s 0 4 7 h 2 0 ，( n h 4 ) ：s 0 4 ，n a c l ，n a h c 0 3 ，无水n a 2 s 0 4 ， h 3 8 0 3 ，葸酮：分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司； c a c l 2 2 h 2 0 ：化学纯，宜兴市威特石油化工添加剂厂； 乙腈：色谱纯，上海国药集团化学试剂有限公司； 甲醇：色谱纯，江苏汉邦科技有限公司。 2 2 2 仪器 空气摇床：k y c 11 0 2 c ，南京菲奇工贸； 压力蒸汽消毒器：t d g c 1 ，南京电气控制设备厂； 液相色谱仪：w a t c r s l 5 2 5 ，美国w a t e r s 公司； 蒸发光散射检测器：w a t e r s 2 4 2 0 ，美国w a t e r s 公司； 高效液相色谱电喷雾质谱联用仪：w a t e r sp l a t f o r mz m d4 0 0 0 ，美国w a t e r s 公司； 9 江南大学硕士学位论文 台式高速离心机：r j t g l 1 6 g ，无锡市瑞江分析仪器有限公司； 旋转蒸发器：t r 5 2 l ，巩义市英峪高科仪器厂； 紫外可见分光光度计：t u 1 9 0 1 ，北京普析通用仪器有限公司； 电子天平：e l 2 0 4 ，梅特勒托利多仪器上海有限公司。 2 3 实验方法 2 3 1 鼠李糖脂的生产 本实验鼠李糖脂的生产采用微生物发酵法。 菌种来源：铜绿假单胞菌由江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心提供。 平板培养基：牛肉膏2 0 9 l ，蛋白胨5 0 9 l ，n a c l5 0 9 l ，琼脂1 5g l ，用0 1m o f l n a o h 溶液调节p h 至7 0 。用于菌种的活化和传代培养。 种子培养基：牛肉膏2 0g l ，蛋白胨5 0g l ，n a c i5 0g l ，用0 1m o f l n a o h 溶 液调节p n 至7 0 ；2 5 0m l 三角瓶装液量6 0m l ，将铜绿假单胞菌接种于种子培养基中， 接种量为每瓶2 接种环。3 7 ，2 0 0r p m 摇床上培养2 4h ，4 下保存备用。 发酵培养基：甘油3 ( v v ) ，n a n 0 32 0g l ，酵母浸膏1 0g l ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 01 5 g l ，k h 2 p 0 41 5g l ，c a c h - 2 h 2 0o 0 4 班，m g s 0 4 7 h 2 00 1g l ，微量元素溶液 0 1 们。用0 1m o f ln a o h 溶液调节p h 至6 5 。其中，微量元素溶液组成为： f e s 0 4 7 h 2 00 0 0 8g l ，z n s 0 4 7 h 2 00 7 5g l ，c o c l 2 6 h 2 00 0 8g l ，c u s 0 4 5 h 2 00 0 7 5 g l ，m n s 0 4 h 2 00 7 5 9 l ，n a m 0 0 4 2 h 2 00 0 5g l ，h 3 8 0 30 1 5 l 。培养条件为：2 5 0m l 三角瓶装6 0m l 培养基，将活化了2 4h 的铜绿假单胞菌种子液接种于培养基中，接种 量为1 0 ( v v ) 。3 0 3 4 ，2 0 0r p m 摇床上培养6d 。 2 3 2 鼠李糖脂的提纯 鼠李糖脂的提取有多种方法，常用的有萃取、沉淀、超滤、泡沫层系及柱色谱等。 本实验以甘油为碳源发酵制备鼠李糖脂，因此发酵液成分相对较为简单。综合考虑经济 性和简便性，采用以下几种方法对发酵液中的鼠李糖脂进行提纯。 2 3 。2 。1 离心 为了去除发酵液中的菌体，取发酵液5 0m l ，8 0 0 0r p m 离心1 0r a i n ，留上清液。 2 3 2 2 盐析 为了除去发酵液中的蛋白质，采用盐析法，即在发酵液中加入大量中性盐如 州4 ) 2 s 0 4 或n a 2 s 0 4 ，破坏蛋白质分子表面的水化膜使蛋白质发生凝聚，沉淀。 操作：将离心后的发酵液置于冰水浴中，边搅拌边向其中慢慢加) ( n h 4 ) 2 s 0 4 至饱 和。继续搅拌1 0 3 0m i n ，1 0 0 0 0r p m 离心1 0r a i n ，留上清液。 2 3 2 3 沉淀 由于鼠李糖脂在酸性条件下不溶于水，因此可调节p h 至酸性使其沉淀。 操作：用6m o l l 的盐酸将盐析后的上清液调p h 至2 0 ，溶液变成乳白色浑浊状， 1 0 第二章鼠李糖脂的制各与性质 于4 冰箱中静置过夜，使鼠李糖脂完全沉淀。 2 3 2 4 萃取 鼠李糖脂易溶于甲醇、氯仿、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂，因此可用这些溶剂对其 进行萃取。 操作：沉淀后的鼠李糖脂水溶液用等体积的萃取剂萃取两次，合并有机相。 2 3 2 5 战压蒸馏 于4 0 利用旋转蒸发仪蒸干有机溶剂，得到鼠李糖脂粗提取物。加入2 0m l0 0 5 m o l l 的n a h c 0 3 溶液溶解鼠李糖脂粗提取物，并滤掉不溶物。用6m o l l 盐酸调节溶 液p h 至2 0 ，在4 冰箱中静置2h 使其完全沉淀。1 0 0 0 0r p m 离心1 0l , n i n ，去除上清 液，余下沉淀即为精制的鼠李糖脂，用5m l 甲醇溶解，经0 4 5 岬微孔滤膜过滤后， 用于后续分析。 2 3 3 鼠李糖脂同系物的分离与鉴定 将提纯后的鼠李糖脂甲醇溶液稀释数倍后进行h p l c e s i m s 分析，由于提取物成 分较为复杂，需进行梯度洗脱，才有可能将各种成分有效分离。 i - i p l c e s i m s 条件：色谱柱为a l l t i m ac 1 8 反相键合色谱柱( 1 5 0m i n x 4 6m m x 0 5 l im ) ，流动相为乙腈0 0 5 甲酸水溶液，采用线性梯度洗脱，在o 5 5r a i n 内乙腈体积分 数由6 0 线性上升到8 0 ，并保持5m i l l ；流速：1m l m i m 迸样量：2 0 此。质谱条件： 雾化气和干燥气都为n 2 ；毛细管电压：3 0k v ；椎孔电压：4 0v ；碰撞电压：- - 7 0v ； 喷雾电压：3 8k v ；离子源温度：1 0 0 ；脱溶温度：2 5 0 ；柱后流出物导入离子源 速率：5t 刖l m i n ；质谱扫描质量数范围：2 0 0 1 1 0 0n g z ；检测方式为负离子检测。各组 分质量分数的确定采用面积归一化法。 2 3 4 鼠李糖脂的定量 鼠李糖脂的分子结构中，由于脂肪酸链的长度常有变化，因此在鼠李糖脂的定量分 析中，通常是测定鼠李糖脂水解液中鼠李糖的含量。本实验采用葸酮硫酸比色法对鼠 李糖脂进行定量。糖脂分子中所含的五碳糖，在热浓硫酸作用下脱水生成糖醛类化合物， 与蒽酮反应，缩合生成有色物质，在6 2 0n m 处有最大吸收。依据分子量关系，将测得 的鼠李糖浓度乘以系数3 4 后可得到相应鼠李糖脂的浓度。 操作：于试管中加入4m l 新鲜配制的0 2 葸酮一硫酸显色剂( 硫酸：水= 8 5 ：1 5 ) ， 沿着管壁缓慢滴加1m l 试样并不断振荡散热，冷却后置沸水浴中加热2 0r a i n ，取出冷 却，在6 2 0i l r n 进行吸光度测定，对照鼠李糖吸光度标准曲线并通过计算得到样品中鼠 李糖脂的质量浓度。 2 3 5 鼠李糖脂表面活性测定 在实验过程中发现所得鼠李糖脂提取物在酸性条件下水溶性较小，而在强碱性条件 下酯键易发生水解，会导致表面活性的降低。因此本实验在保持溶液总离子强度为0 0 1 5 江南大学硕士学位论文 m o l l 的情况下，分别考察p h 为7 5 ，8 0 ，8 4 ，9 0 ，9 2 时该鼠李糖脂提取物的c m c 。 操作方法：以2 0m m o l l 硼砂缓冲液配制不同浓度的鼠李糖脂溶液，采用吊环法于 2 5 测其表面张力。以鼠李糖脂浓度的对数值l o g c 为横坐标，以对应的表面张力值j ， 为纵坐标作图，得到表面张力达到最低点时的鼠李糖脂浓度，即为c m c 值。 2 4 结果与讨论 2 4 1 鼠李糖脂的生产 通过葸酮硫酸比色法测得，在接种量1 0 ( v v ) ，发酵温度3 0 3 4 ，摇床转速 2 0 0r p m ，发酵时间6d 的培养条件下，得到鼠李糖脂平均产量为1 1 7g t , 的发酵液。 2 4 2 鼠李糖脂的提纯 2 4 2 1 萃取剂的选择 比较了两种萃取剂：氯仿甲醇( 2 ：1v ) 与乙酸乙酯。发现以乙酸乙酯作为萃取 剂时，鼠李糖脂回收率略高于氯仿甲醇，且萃取过程中的乳化现象也较轻。可见2 ：l 的氯仿- 甲醇并不适用于本实验鼠李糖脂发酵液的提纯。因此选择乙酸乙酯作为本实验 萃取剂。 2 4 2 2 萃取过程中乳化现象的消除 在萃取过程中，水与萃取剂界面间形成乳白色的乳化层。乳化层的存在影响两相分 离，若不将其消除会造成鼠李糖脂损耗，降低回收率。采取以下几种方法来消除乳化层。 经过长时间静置后乳化层厚度有所减小但无法完全消除，且该方法比较消耗时间。将乳 化层与水相合并，加大萃取剂的用量对其反复进行萃取，乳化现象有所改善但也无法彻 底消除。最后尝试将乳化层单独分出，并离心，成功消除乳化现象。 2 4 2 3 鼠李糖脂回收率的测定 综合对上述条件的优化，选择合适的步骤对发酵所得的鼠李糖脂进行分离提纯，同 时对其浓度与回收率进行测定。 表2 1 为各步提纯后所测得的鼠李糖回收率，可以看出，加入( n h 4 ) 2 s 0 4 盐析后鼠 李糖脂回收率很高，达到9 8 3 ，说明盐析步骤中鼠李糖脂损耗不大。而加入乙酸乙酯 萃取后，回收率降到了8 8 6 ，说明在萃取过程中鼠李糖脂仍有部分损耗，可能为沉淀 和萃取过程中产生。在除去有机溶剂的鼠李糖脂粗产品中加入n a h c 0 3 溶液溶解后，回 收率大幅度降低，分析损失来源可能为：蒸去溶剂后的鼠李糖脂粗产品量很少，且为粘 稠状物质，粘附于烧瓶壁上，未能用n a h c 0 3 溶液完全溶出。酸化沉淀离心并加入甲醇 溶解后回收率有少量减小，可能为沉淀和离心过程中的少量损耗。 经过以上提取纯化步骤，最终得到浓度为7 6 8 7g l 的鼠李糖脂甲醇溶液，回收率 达到6 5 7 。 1 2 第二章鼠李糖脂的制各与性质 表2 - 1 鼠李糖脂各纯化步骤的回收率 t a b l e2 - 1r e c o v e r yr a t e so f r h a m n o l i p i do b t a i n e db yd i f f e r e n tp r o c e d u r e so f p u r i f i c a t i o n 2 4 3 鼠李糖脂同系物的分离和鉴定 采用i - i p l c e s i m s 对提纯后的鼠李糖脂甲醇溶液进行分析，获得了样品的总离子 流图，见图2 1 。 图2 1 鼠李糖脂提取物的h p l c e s i m s 总离子流图 f i g2 - 1t o t a li o nc u r r e n tc h r o m a t o g r a mo f t h er h a m n o l i p i de x t r a c t i o nw i mh p l c e s i - m s 通过总离子流图可以看到，在5 0r a i n 内，鼠李糖脂提取物各组分已基本得到分离。 分别对保留时间为1 6 1 5m i n ，1 6 5 7r a i n ，2 2 7 8m i n ，2 5 0 5m i n ，3 1 7 6m i n ，3 4 0 5m i n ， 3 7 3 5m i n ，4 1 8 0r a i n ，4 8 0 3r a i n 的色谱峰进行相应质谱解析，质谱图见附录图a i 。 通过对相应质谱的解析，可确定提取物中至少存在9 种鼠李糖脂同系物。表2 2 给 出了各组分的保留时间，分子离子峰和离子碎片以及相应糖脂结构。该鼠李糖脂提取物 由1 2 分子的鼠李糖和1 2 分子含b 羟基的碳链长度为8 1 2 的饱和或不饱和脂肪酸组 成。其中，2 o 伽l 吡喃鼠李糖苷吨l 吡喃鼠李糖苷p 羟基癸酰p 羟基辛酸 ( r h a - r h a c 1 0 - c s ) ，2 o a l 吡喃鼠李糖苷a l 毗喃鼠李糖苷b 羟基辛酰d 羟基癸酸 ( g h a - r h a - c s - c 1 0 ) ，a l 吡喃鼠李糖苷- p - 羟基癸酰p 羟基辛酸( r h a - c 1 0 c 8 ) ，2 o 一- l - 吡 喃鼠李糖苷d 羟基癸酰p 羟基癸酸( r h a - r h a - c l o c l o ) 和a l 吡喃鼠李糖苷p 羟基癸酰 - p 一羟基癸酸( r h a - c 1 0 - c l o ) 这五种组分含量较高，大约占总量的7 8 ，其余四种组分约占 2 2 。 通过各组分质量分数的计算得到，该鼠李糖脂提取物的平均相对分子质量约为 江南大学硕士学位论文 5 7 9 2 2 。 表2 2 鼠李糖脂提取物中各同系物组分的结构及相对含量 t a b l e2 - 2c h e m i c a ls t r u c t u r e sa n dr e l a t i v ea b u n d a n c eo f t h er b a m n o l i p i d s c h e 删咖姗照e 器m l 沛一w 0 1 e 眇j 曲t 喇叮啤( m l ) 川o n s 黜协气挚妇 in l 细j 2 4 4 鼠李糖脂的含量测定 用葸酮。硫酸法测得不同浓度的鼠李糖标准溶液在6 2 0n m 处的吸光度值，以鼠李糖 质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线( 见图2 - 2 ) ，线性回归得鼠李糖吸 光度标准曲线方程y = 6 5 9 x 0 0 0 7 5 4 ，相关系数r = o 9 9 9 6 。在鼠李糖质量浓度0 0 0 5 0 1 g l 范围内，该测定方法线性关系良好。鼠李糖脂的质量浓度约为测得鼠李糖质量浓度 的三倍。 图2 - 2 鼠李糖吸光度标准曲线 f i g2 - 2s t a n d a r dc u r v eo fr h a m n o s ec o n c e n t r a t i o na n da b s o r b e n c y 1 4 第二章鼠李糖脂的制备与性质 2 4 5 鼠李糖脂的表面活性 2 4 5 1p h 的影响 作为羧酸盐型表面活性剂，鼠李糖脂对p h 的变化很敏感。因为随着p h 增大，鼠 李糖脂上的羧酸基团电离度增大，改变了极性基头及其它分子间作用力，会对表面活性 造成较大的影响。 在实验过程中发现，该鼠李糖脂提取物在酸性条件下水溶性较小，而在强碱性条件 下酯键易发生水解。因此本实验在保持溶液总离子强度为0 0 1 5m o f l 的情况下，分别 考察了p h 为7 5 ，8 0 ，8 4 ，9 0 ，9 2 时该鼠李糖脂提取物c m c 的大小。 图2 - 32 9 8 0 k 时p h 对鼠李糖脂提取物c m c 的影响 f i g2 - 3e f f e c to f p ho nc i v i co f t h er h a n m o l i p i de x t r a c t i o na t2 9 8 0k 图2 - 4r h a - r h a - c l o - c l o 的折叠结构 f i g2 - 4t h ef o l d e ds l r u c t u r eo far h a - r h a - c 1 0 - c l om o l e c u l e 由图2 - 3 可知，在p h 值小于9 0 的时候，c m c 随p h 的增大而降低，并在p h9 0 时达到最小，此时c m c 为5 2x1 0 。2g l ，由此算得表面活性剂鼠李糖脂的浓度为8 9 7 江南大学硕士学位论文 x1 0 m o f l ；随后，在p h 大于9 0 时，c m c 随p h 的增大而增大。在少量电解质存在 下，随着p h 增加，羧基上的氧与鼠李糖元的羟基易形成氢键，双鼠李糖j n d i - r h a m n o l i p i d ) 呈折叠结构【删( 如图2 - 4 ) ，此时分子排列更为紧密，更易形成胶束，从而降低了c m c ； 但随着p h 继续升高，鼠李糖脂所带的负电荷继续增加，其极性头基之间的静电排斥力 增大，分子排列变得疏松，结果使得c m c 增加。虽然p h 增加会导致氢键和静电排斥 都增强，但两个作用力对分子排布的效果是相反的，p h 不同的情况下，占主导地位的 作用力也不同。在p h9 0 时，分子排列最为紧密，c m c 最小，因而此时鼠李糖脂的表 面活性最强。 2 4 5 2 温度的影响 为了考察鼠李糖脂对温度的稳定性，将o 1g l 的糖脂溶液加热至1 2 0 并保持4h ， 冷却至2 5 后测其表面张力，发现表面张力只略有升高，说明在1 2 0 下鼠李糖脂仍 可保持其表面活性。 2 4 5 3n a c l 的影响 为了考察鼠李糖脂对盐溶液的稳定性，在0 1g l 的糖脂溶液中加入1 0 0g l 的n a c i ， 2 5 时测其表面张力，发现表面张力变化不大，说明1 0 0g l 的n a c l 溶液对其表面活 性没有太大影响。 2 5 结论 本实验采用甘油为碳源，利用铜绿假单胞菌生产鼠李糖脂，其产量为1 1 7g l 。通 过萃取剂及各纯化步骤的优化，最终得到纯度较高的鼠李糖脂，回收率达到6 5 7 。采 用h p l c e s i m s 快速而有效地分离和鉴定了各种鼠李糖脂同系物组分，获得了更为全 面的化学结构信息。根据质谱图确定提取物中至少存在9 种鼠李糖脂同系物，由l - 2 分 子的鼠李糖和1 2 个含b 羟基的碳链长度为8 1 2 的饱和或不饱和脂肪酸组成，其中1 种组分含有不饱和脂肪酸。该鼠李糖脂提取物表面活性受p h 影响较大，随着p h 的增 大，c m c 先降低后升高，在p h 为9 0 处有最小值8 9 7 x1 0 一m o f l ，具有良好的耐温耐 盐性。这为后续工作中用鼠李糖脂制备微乳液提供了理论指导。 1 6 第三章鼠李糖脂微乳体系稳定性与微结构的研究 第三章鼠李糖脂微乳体系稳定性与微结构的研究 3 1 引言 微乳液的稳定性考察对m e e k c 应用有着重要意义。m e e k c 各参数的选择必须建 立在微乳液稳定不破乳的基础上，而体系稳定性对分离重现性也有较大影响。 微乳液微结构的研究在m e e k c 中也具有极其重要的意义。微乳液滴的粒径大小会 直接影响分析物在微乳相和水相中的分配比，进而影响分离效果。粒径改变，微乳液滴 表面所带的电荷也会随之发生改变，从而导致荷质比的变化。而随着荷质比的变化，微 乳液滴在m e e k c 中的电泳速度会受到很大影响，从而导致时间窗口的变化，影响分离 度、峰容量等分离参数。在分离荷电物质时，由于电荷间的相互作用，表面电荷密度的 改变也会使微乳液滴和分离物的结合程度发生变化，对分离产生影响。 目前国内外关于鼠李糖脂微乳体系的研究很少，主要围绕在相行为方面。而对于鼠 李糖脂微乳液滴的粒径和表面电荷等微结构的影响因素的考察，至今还未见报道。 鼠李糖脂作为一种羧酸盐型表面活性剂，对p h 变化较为敏感。p h 的变化会影响羧 酸基团的电离度，改变极性头基间的