（环境科学专业论文）几种有机氯污染物对原生动物四膜虫的生物毒性和富集研究.pdf

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 ii abstract the persistent organic pollutants (pops) are harmful to humanbeings and ecosystem. in the recent years, more and more funds from the national and provinces supports indicate the lack of the studies on pops issue. the environmental beheavior of pops, as well as their biotoxicity and controlling, is the key projects in this research area. in this dissertation, the biotoxicity and bioaccumulation of hcb, 2,4-dcp, 2,4,6-tcp to the protozoan tetrahymena thermophila bf5 were studied. the main conclusions were as follows: 1. in ppys culture medium, low concentration (50 g/l) of hcb slightly promoted the growth of the protozoan, while with 250 g/l and 1000 g/l hcb, the number of protozoan decreased, and showed a short and acute biotoxicity to tetrahymena thermophila bf5. in inorganic salt culture medium, with 50g/l, 250 g/l and 1000 g/l of hcb, the number of protozoan decreased, which revealed an inhibition to the growth and an acute and short toxicity.so the presence of the nutrition could slow down the biotoxicity. by making use of dose-effect equation, the ec50 of hcb at 24, 48, 72 and 96h exposed were 364, 514, 296 and 117 g/l, respectively. the results showed that the concentration diffusion played an important role in the bioaccumulation of hcb by tetrahymena thermophila bf5. tetrahymena thermophila bf5 had a certainin bioaccumulation ability to hcb. in ppys culture medium, the bcf varied from 36 to 493. and in inorganic culture medium, bcf varied from 147 to 1328. 2. in ppys and inorganic salt culture medium with 800 g/l and 1000 g/l of 2,4- dcp, 2,4,6-tcp, they displayed an inhibition to the numbers of the protozoan. by making use of dose-effect equation, the ec50 of 2,4-dcp at 24, 48, 72 and 96h exposed were 693, 1849, 1122 and 955 g/l, respectively. the ec50 of 2,4,6-tcp at 24, 48, 72 and 96h were 347, 916, 18661 and 1262 g/l, respectively. tetrahymena thermophila bf5 had a certainin bioaccumulation ability to 2,4-dcp and 2,4,6-tcp. in ppys culture 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 iii medium, bcf varied from 32 to 67. and in inorganic culture medium, bcf varied from 42 to 85. 3.according to the average ec50 of hcb, 2,4-dcp and 2,4,6-tcp, the order of single biotoxicity was hcb 2,4,6-tcp 2,4-dcp. the results showed the more substituent cl, the higher toxicity. with the mixture of hcb and 2,4-dcp, hcb and 2,4,6-tcp, hcb and 2,4-dcp and 2,4,6-tcp at 24,48,72,96h, ai was negative.so an antagonistic effect was obtained to explain the joint toxicity. the antagonistic effect could be explained by the competitive site theory, which still needed a further reaserch. keywords: persistent organic pollutants; protozoan; biotoxicity; bioaccumulation ;dose-effect equation 独创性声明独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 ，在_ _年解密后适用本授权书。 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 本论文属于 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 1.绪绪 言言 近年来，有机污染物及其对人体健康和生态系统的危害越来越被人们所认识。 其中持久性有机污染物（persistent organic pollutants,以下简称 pops） ，由于大多具 有“三致”效应和遗传毒性，能干扰人体内分泌系统引起 “雌性化”现象，并且在全 球范围的各种环境介质大气、江河、海洋、底泥、土壤等以及动植物组织器官和 人体中广泛存在，已经引起了各国政府、学术界、工业界和公众的广泛关注，成 为一个新的全球性环境问题。我国将有关 pops 的研究内容列入各种科技攻关、自 然科学基金等优先资助项目，这也是我国在该领域的前期研究基础相对薄弱的表 现。其中有关 pops 的环境行为、生态毒理、控制等方面的研究更是热点。 1.1 水生生物毒性实验的一般简介 1.1.1 毒性分类 1.1 水生生物毒性实验的一般简介 1.1.1 毒性分类 毒性主要根据化合物对机体的损害性质和持续时间进行分类，一般可分为急 性毒性、慢性毒性、亚急性毒性、致畸性、致癌性和致突变性等1,2。 1.1 .1 .1 毒性常用指标的一般性描述 急性毒性试验：lc10（安全致死浓度） 、lc50（半数致死浓度） 、lc100（绝对致 死浓度）等。 蓄积毒性试验：生物富集因子（bcf）等。 慢性毒性试验：无可见效应浓度（noael） 、最低可见效应浓度（loael） 、 最大允许毒物浓度（matc）等。 三致毒性试验：试验结果阴性或阳性等。 1.1 .1 .2 描述毒性的方法 剂量-效应关系：毒理学研究的一个基本问题，它从量的角度阐明毒物作用的 规律性，不论是评价化学品的毒作用，还是以无作用剂量为依据，去制定各类环 境质量标准，都要以剂量-效应为基础。它是毒理学研究中的一个关键问题。 剂量-效应关系：表示某种效应的发生率与作用剂量之间的关系。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 剂量-效应曲线：在毒理学研究中，通常将剂量-反应关系用曲线表示，主要有 三种类型。 1直线关系：剂量改变与效应强度或反应率的改变成正比。 2对数曲线关系：对数曲线亦为抛物线，通常见于剂量-效应关系中。因为引 起效应的剂量是按对数关系而增长，所以如将剂量换算成对数剂量，就可换算为 一直线。 3. s 状曲线关系：当群体中的全部个体对一种化学品敏感性的变异呈对称性的 正态频数分布时，剂量与反应率的关系呈 s 状曲线。这类曲线较易出现在剂量-效 应中。 1.1.2 影响生物毒性的因素1.1.2 影响生物毒性的因素 化合物对生物的毒性是由自身的性质（化合物的结构与性质）决定的，并与 生物的种类有关，同时也受到多种环境因子的影响，如佐剂、营养物、温度、染 毒条件等。 有机污染物因其结构不同，而具有不同的毒性。对化合物构效关系的研究尚 处在发展阶段，目前仅找到一些相对有限的规律，如卤素元素有强烈的吸电子效 应，结构中增加卤素使分子极性增加，更易与酶系统结合，使毒性增高。例如氯 化甲烷对肝脏的毒性依次为：ccl4chcl3ch2cl2ch3clch43。另外芳香族化合 物中引入羟基，分子极性增强，毒性增加。如苯引入羟基而成苯酚，后者具有弱 酸性，易与蛋白质中碱性基团结合，与酶蛋白有较强的亲和力，毒性增大。多羟 基的芳香族化合物毒性更高。此外化合物的正辛醇/水分配系数也对毒性有影响， 一般脂溶性高的毒物易于被吸收且不易被排泄，在体内停留时间长，毒性更大。 董玉瑛4等研究了苯环上不同取代基毒性大小顺序为苯酚间硝基苯胺硝基苯 邻苯二酚nh2oh.。高为5研究发现影响毒物毒性的因素很多，如毒 物分子的偶极性分子间与分子内氢键的形成、给出和接受质子的能力、分子体积 和溶解度等。黄国兰等6研究了 16 种不同形态有机锡化合物对斜生栅藻及扁藻生 长的影响，证明了有机锡的毒性强弱与形态有关，三取代有机锡二取代有机锡 一取代有机锡，同一取代系列中，烷基 r 越大，其毒性越大。 另外机体对化合物的感受性，与其种属、年龄、性别、营养和健康状况等有 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3 关。营养物影响生物毒性主要可能由于改变生物的生长而引起的。营养不足或失 调将影响化学物的毒性作用。蛋白质缺乏将引起酶蛋白合成减少及酶活性降低， 使毒物代谢减慢，机体对多数毒物的解毒能力降低，毒物毒性增加。如喂以低蛋 白饲料的大鼠对各种农药的敏感性增高 226 倍7。 由于很多有机物难溶于水，在毒性实验中常使用佐剂，即要将毒物用溶剂溶 解或稀释，有的溶剂和助溶剂可改变化合物的理化性质和生物活性，常表现为加 和、协同或拮抗效应。因此，选用的溶剂和助溶剂应是无毒的、与受试毒物无反 应，且制成的溶液应稳定。溶剂选择不当，可加速、减缓毒物的吸收、排泄而影 响其毒性。 例如 ddt8的油溶液对大鼠的 ld50为 150mg/kg， 这是因为油能促进 ddt 的吸收。但用油量过大会导致腹泻而影响吸收。ei jay9研究了有机溶剂对普通小 球藻和羊角月牙藻生长的影响，发现 dmso 浓度为 1时对上述二种藻无毒性， 甲醇浓度大于 1时即产生毒性，乙醇对藻的毒性与藻的种类有关。 1.1.3 毒性的评价方法1.1.3 毒性的评价方法 1.1.3.1 单一毒性的评价方法 在环境化合物对水生生物毒性试验结果的统计过程中，oecd 和 epa 中提到 的统计方法测定 ec50总结为三大类：1绘制生长曲线法（面积法） ；2生长速率 法；3相对数量法。但用不同的统计方法，所得出的 ec50值存在一定差异10。 记录细胞数生长情况通常有细胞计数法、干重、光密度法、叶绿素荧光法和 co211的吸收。需要指出的是，使用不同的指标测得的 ec50是不同的。由于毒物 常引起细胞产生形态改变，因此细胞计数和测干重有较大差异。光密度法一般是 测叶绿素的含量，叶绿素含量也受毒物的影响，与细胞计数和干重也有差异，由 于藻类、原生动物的生理毒性发生在种群水平毒性前，采用生理毒性指标更为敏 感，如采用光合作用（碳固定或氧释放）作为毒性指标，1h 可得到毒性值，但这 样测的 ec50比测定藻类、原生动物生长水平毒性所得的 ec50大的多，而用叶绿素 荧光分析和测 co2吸收测得的相似，并无较大区别。最简单的就是细胞计数法， 缺点是费时繁琐。 1.1.3.2 联合毒性的评价方法 化合物的联合毒性作用方式可分为相加、协同、拮抗和独立作用。对于多化 学物联合毒性的评价始于本世纪 70 年代，由于不同混合物的作用机理可能不同， 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 4 导致联合作用类型也可能不同，而且混合物所含组分越多，其相互作用越复杂， 这就决定了评价方法的多样性，下面介绍几种常见的评价方法。 1. 毒性单位法（ut）12 简单易行，得到了广泛的应用。 2. 相加指数法（ai）13 这种方法在研究多组分混合物联合作用时的应用最 多。刘静玲14等采用 oecd 藻类生长抑制实验的国际标准方法，研究了 2,4-二硝 基甲苯与其它 6 种硝基芳烃化合物共存时，对斜生栅列藻的联合毒性和联合效应 相加指数。2,4-二硝基甲苯加对硝基苯胺；2,4-二硝基甲苯加对二硝基苯；2,4-二硝 基甲苯加对硝基苯甲醚均表现为协同作用。2,4-二硝基甲苯加对硝基苯酚；2,4-二 硝基甲苯加对硝基甲苯；2,4-二硝基甲苯加对硝基氯苯均表现为拮抗作用。谢荣15 等以三角褐指藻、盐藻和青岛大扁藻为实验材料，采用联合指数相加法，研究了 有机磷农药和重金属对这三种海洋微藻的急性毒性和联合毒性效应，联合毒性配 比在 1：1 情况下，72h ai 分别为-0.462、-0.557 和-0.702，均为拮抗作用。 3. 等效线图模型16 等效线图的优点是比较直观，缺点是需要详细的实验资 料，如一系列混合物地准确剂量及其引起地特定反应地数据，采用这种模型进行 外推时，只能根据似乎合理的假设而不是根据生物统计学的讨论，而且只能用来 评价二元混合物的联合作用，并对混合比例有一定的限制，因此需要进一步完善。 4. 相似性参数法17 这种方法避免了由于实验误差所引起的不准确性，评价 结果能更真实地反映实际情况，是一种非常好的方法，但目前还没有得到广泛的 应用。 5. qsar 方法17 已普遍用于预测化合物的毒性，是一个比较简单的方法， 但是由于混合物之间相互作用的复杂性，联合效应不完全是相加的，而且毒性受 实验条件、受试生物等多种条件的影响，仅仅根据 qsar 模型预测是不完全正确 的，因此这一方法用于联合效应研究的合理性与可靠性仍有待于进一步证明。 此外还有混合毒性指数18（mti） 、剂量-反应曲线法19、v 值法20、共毒性系 数法20。以上几种方法，都是比较常用的方法，但其评价结果稍有不同。在实际 工作中，往往是几种方法联合使用。 1.1.4.毒物的作用机理1.1.4.毒物的作用机理 1.1.4.1 单一毒物的作用机理 根据毒性机理不同，可将有机物大致分成三类21： （1）非极性麻醉型有机物； 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 5 （2）极性麻醉型有机物； （3）反应性有机物。前两类统称为非反应性有机物。其 中，非极性麻醉型有机物为疏水性物质，其急性毒性为麻醉作用，仅与正辛醇/水 分配系数 kow 有关。 knemann22把这种由疏水性大小决定的毒性定义为化合物 的本底毒性。极性麻醉型有机物的急性毒性作用为极性麻醉作用，其毒性稍大于 本底毒性，这类化合物的分子结构特征是具有与其他分子形成氢键的能力。反应 性有机物与生物体之间发生特殊的毒性作用，如共价结合，因此其毒性远远大于 本底毒性23。 1.1.4.2 联合毒性作用机理 目前关于这方面的研究还处于起步阶段，缺乏深入的研究，化合物相互作用 的复杂性，制约联合效应因素的多样性，决定了作用机理也比较复杂。比较成熟 的机理有： 1. 竞争活性位点：物理化学性质相似的污染物由于作用方式和途径相似，因 而在细胞表面及代谢系统的活性部位存在竞争作用，从而影响污染物的相互作用。 这种竞争结果在很大程度上取决于参与竞争的各污染物的种类、浓度比和各自的 吸附特性24。 2 干扰生物生理活动与功能：化合物之间的联合作用会干扰生物体正常生 理活动，影响生物体对特定化合物的转移、转化、代谢等生理过程。如 nirmala25 等研究三丁基锡（tbt）和多氯联苯（pcbs）对鱼体繁殖率表现出的拮抗作用与 毒物在鱼体中的蓄积和卵有关。 3 影响生物细胞结构与功能：污染物的联合作用可使生物体或有关内含物 与外界环境隔离开，从而改变其透性及主动、被动转运能力，也会改变细胞的结 构与功能。如 ensenbech26等发现暴露于 3，4-二氯苯胺的鱼体的肝细胞中粗面内 质网穿孔，线粒体膨胀，活酶数量增多，加入林丹后，肝细胞会变得更加肥大。 4 影响酶的活性：污染物的联合作用会改变与代谢污染物有关的酶的活性， 影响污染物在生物体内的扩散、转化和代谢方式，从而影响污染物在生物体内的 行为和毒性。有些化合物可阻止生物体内自由基的产生，从而减低过氧化物胁迫， 使其它共存的毒物的毒性降低。 5 干扰生物大分子的结构与功能：污染物通过抑制生物大分子的合成与代 谢， 干扰基因的扩散和表达， 对 dna 造成损失或使之断裂并影响其修复， 或与 dna 生成化学加和物。如 donnelly27等研究发现，随着 tnt（三硝基甲苯）加入量的 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 6 增大，苯并芘的毒性逐渐降低，原因在于前者干扰了后者与 dna 的结合。 6 络合或螯合作用：自然环境中存在许多络合剂如-oh，-nh2，-cooh 等， 他们会改变污染物的形态分布和其生物有效性。有机螯合剂和被螯合物可形成不 能吸收、蓄积的螯合物形式，同时污染物还可形成沉淀，从而降低污染物的溶解 性和可利用性。 1.2 有机污染物在食物链中的生物富集研究 1.2.1 研究生物富集的意义和影响因素 1.2 有机污染物在食物链中的生物富集研究 1.2.1 研究生物富集的意义和影响因素 生物富集是指生物从周围环境蓄积有机物，使其在生物体内的浓度超过在环 境中浓度的现象。持久性有机物一般具有稳定的化学性质，不易降解，能够长期 存在于环境中，可对生态环境产生持久性危害。 研究有机污染物，尤其是 pops 的生物富集，对于了解 pops 的毒性以及水生 系统中的迁移对其它生物的作用很重要。水生生物对 pops 的富集系数高达 105 106，具有很高的富集能力，富集有三个意义：1富集程度决定作用位点的浓度， 而浓度是影响毒性的重要指标；2pops 的富集可避免或减少对其它生物的影响； 3不同水生生物富集 pops 是物理转移的一个重要途径，可通过食物链在高营养 级水平转移毒物。 影响生物富集的因素很多28，污染物的性质、污染物的浓度、作用时间、生 物种的特性以及环境特点是主要的、决定性的因素。 许多资料表明，生物富集的基本机制是有机化合物在类脂物水体系中的分 配过程，进入生物体的有机化合物主要积累在类脂物组织中，生物体中有机化合 物的浓度与类脂物的含量有显著的正相关。例如，hanch29，30等人证实，多氯联苯 （pcbs）在鱼体内脏中的浓度差别很大，一般以肝脏中 pcbs 浓度最大，其次为 腮，鱼体，心脏，脑，肌肉，这种差异是由于脂肪含量不同而引起的。 其次是污染物的性质，包括污染物的价态、形态、物理化学稳定性、生物稳 定性、在溶液中的扩散能力和在生物体内的迁移能力等。化学稳定性和高脂溶性 是生物富集的重要条件。例如 ddt 具有很高的理化和生物稳定性，其理化性质能 在环境中和在生物体内的迁移过程中长时间保持稳定。在水中的溶解度很低，仅 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 7 为 0.02mg/kg，在脂类浓度可达 105mg/kg，比在水中的溶解度大 500 万倍。有机氯 农药由于难以被化学降解和生物降解，极易通过食物链而大量累积，目前已被禁 用。 许多疏水性有机物在不同的生物体内显示不同的富集性能。例如 hcb 在虹蹲 鱼和呆头鱼中的 bcf 分别为 5500 和 16200。由于同一种生物，在不同的生长期体 内的类脂物含量和酶的代谢活力不同，导致富集能力的不同。 1.2.2 有机污染物在不同生物体内生物富集研究现状1.2.2 有机污染物在不同生物体内生物富集研究现状 1.2.2.1 藻类对有机物的生物富集 目前，国内国外关于不同藻类对有机物富集的报道很多，如迟杰31等研究普 通小球藻对 dehp 的富集和降解动力学。结果表明，普通小球藻对 dehp 有较明 显的富集与生物降解作用，富集系数在 6h 时达到最大 3.67105，降解符合一级动 力学过程。藻类富集有机物的作用机制相当复杂，随所富集的物质种类不同而异， 目前尚无定论。藻类的细胞壁主要由肽聚糖、磷脂和蛋白质组成，具有粘性，带 有一定的负电荷，并可提供许多能与离子结合的官能团。不同藻类的细胞结构和 被富集物质的性质，决定了生物富集的效率和选择性。富集过程一般分为胞外结 合与沉积、胞内吸收与转化两个步骤。具体的富集途径有物理吸附、生物吸附、 表面沉积、主动运输和被动扩散等。其中生物吸附和主动运输是最主要的富集途 径，约占总富集量的 80，而生物吸附又比主动运输占有更大的比重。生物吸附 过程快速与代谢无关，受 ph、富集时间等影响；主动运输过程缓慢且依靠能量， 与代谢过程有关，主要受微生物的活性、培养温度、培养条件、代谢抑制物等因 素的影响。 1.2.2.2 浮游植物对有机物的富集 目前，国内国外关于浮游植物对有机物富集的报道也较多。如江玉32等用改 进的比较完善的生物富集动力学模型研究了海洋浮游植物对 2-甲基萘的生物富 集，结果表明，6 种浮游植物对 2-甲基萘的 bcf 与浮游植物细胞比表面积之间有 较好的 log-log 相关性，验证了浮游植物对有机污染物的生物富集与浮游植物的比 表面积存在定量关系。 一般认为33，浮游植物对有机物的生物富集主要是通过浮游植物细胞表面到 细胞壁的快速吸附（即表面吸附） ，然后缓慢向细胞内部迁移和吸收的过程（即基 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 8 质吸附） 。因此，生物富集不仅决定于有机物的物理化学性质，也与浮游植物细胞 生物性质相关。实际上，对于结构和物理化学性质相近的系列有机物，bcf 与 kow 之间存在普遍的 log-log 相关性。rice34实验观察到，粒径愈小（即比表面积愈大） 的浮游植物，对 pcbs 的生物富集能力愈强。swackhamer35实验也证明，浮游植 物对 pcbs 的 bcf 与浮游植物表面积等密切相关。 尽管认识到 bcf 与 hoc 的 kow 值以及浮游植物表面积和类脂含量相关，并根据实验分别得到了 bcf 与 kow 和类 脂含量的经验关系，但是至今无法对上述结果作出简单定量解释，也没有建立有 关生物富集的理论模型，并且由于缺乏精确测定浮游植物细胞表面积的方法，也 无法定量研究 bcf 与细胞表面积间的关系。 1.2.2.3 原生动物、细菌等微生物对有机物的富集研究 目前国内关于原生动物、细菌等微生物对有机物富集研究报道没有发现，国 外的报道也不多见。roland lindqvist36研究了细菌对地表水中 hcb 和 ddt 的富 集，结论是在土壤作用下，细菌对 hcb 和 ddt 的迁移决定两个因素，即细菌和 污染物的相互作用和细菌内的迁移率。petra37通过对海水用 4 种滤膜选择过滤， 在两种营养条件下定性研究了颗粒物、细菌、藻类、浮游植物和原生动物对 pcbs 的富集，结果表明营养物质有影响。在实验室模拟研究单一微生物对有机物的富 集报道没有发现。基于相关的研究报道较少，本文以原生动物四膜虫为代表研究 其对 hcb、2,4-dcp、2,4,6-tcp 的生物富集。 1.2.3 生物富集机理和模型1.2.3 生物富集机理和模型 生物富集有机污染物是环境中迁移转化主要过程之一，曾做了大量机理研究 工作。常用的模型有：1疏水模型；2鱼体富集动力学模型；3生物膜的透过 机理；4生物组织中化合物的富集机理。 迄今38，已有多种用来描述水生生物富集水体中污染物的数学模型，但多用 于疏水性有机物的生物富集。如比较经典的鱼类实验或者甲壳类生物，如片脚类 生物。有关重金属的生物积累模型及各种修正模型也已有过报道，其中双箱动力 学模型是在近几年发展起来的一类重要的数学模型。国内也有许多有关贝类对一 些污染物质的生物富集动力学过程的研究，其内容局限于单一条件下生物体内金 属含量及积累速率的研究方面，缺乏富集动力学模型方面的研究。赵元慧等39以 双箱动力学模型为理论基础，提出一种生物富集系数快速测定方法。王修林等33 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 9 修正和发展了这一模型，并将之应用于一些海洋生物对疏水性污染有机质富集动 力学研究中。由于该模型是建立在生物富集时对水体中污染物质的检测结果之上， 其与贝类中污染物质含量的相关性受许多不确定因素的影响，故该模型还需进一 步的验证和比较研究。 侯玲40等用改进的双膜理论预测了 7 种硝基芳烃的挥发速率常数，快速测定 了它们在鱼体内的富集与释放速率常数，用获得的参数及二室模型预测了 7 种化 合物在鱼体中的迁移过程，并与模拟实验测定的结果进行比较，得到了比较满意 的结果。陆光华41等测定了硝基苯、2,4-二硝基甲苯、2,6-二硝基甲苯及硝基氯苯 (邻、间、对)在绿藻体内富集及释放趋势，其生物富集因子大小顺序是硝基苯2,6- 二硝基甲苯七氯环氧艾氏剂林丹，与有机氯 化合物的脂/水分配系数成正相关。 1.3 有机氯农药、氯酚的毒性和生物富集研究进展 1.3.1 有机氯农药的毒性作用 1.3 有机氯农药、氯酚的毒性和生物富集研究进展 1.3.1 有机氯农药的毒性作用28 28 1.3.1.1 急性毒性作用 有机氯农药急性中毒主要表现为对中枢神经系统的作用，症状可有肌肉震颤、 阵发性及强直性抽搐，最后可由于全身麻痹而死亡。急性中毒的动物可见有肝脏 肿大、肝细胞脂肪变性及坏死。 1.3.1.2 慢性毒性作用 有机氯农药的慢性毒性作用主要表现为对肝、肾的损害。ddt 及六六六毒性 试验中，供试动物可见有肝肿大，肝细胞变性及坏死等。慢性中毒的动物常见有 不同程度的贫血、白细胞增高和中枢神经性病变。长期小剂量饲养动物，有体重 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 10 下降、发育停滞、全身状况不良及实质脏器的退行性病变等。 1.3.1.3 毒作用机理 有机氯农药的毒作用机理尚不十分清楚，有人认为有机氯杀虫剂的作用机理 在于它的脱氯反应，当有机氯进入血循环后，即与基质中氧活性原子作用，发生 脱氯的链式反应，产生不稳定的氧化产物，分解缓慢，于是成为新的活性中心。 这种链式反应很慢，因此未起作用的杀虫剂即被血液带到脂肪组织中长期贮存。 有机氯农药的主要靶器官是神经系统，ddt 对神经系统的作用可能是由于其作用 于神经类脂膜上的胆固醇，降低了膜对钙离子的渗透性，干扰了轴突膜去极化后 恢复正常电位所需的表面重新钙化。目前认为 ddt 分子与神经膜上受体结构互补 是毒作用的基础。有人认为 ddt 的靶子是一种 atp 酶。有机氯农药的潜在危害主 要在于其在人体内可长期蓄积。 1.3.1.4 几种典型有机物的生物富集 生物富集因子（bcf）能够反映该种物质在生物体内的富集程度。显然，bcf 的值越大，这种物质就越容易在生物体内富集。由于 pops 在环境中很难发生化学 分解和生物降解，所以才会在食物链中传递进而在更高营养级的生物体内富集。 这样一来，顶级消费者可能就会成为 pops 传递的终点，其体内的 pops 浓度比环 境中高出几个数量级，这在水生生态系统中表现的尤为明显。 表 1-1 北冰洋海水中水生食物链中有机氯代物的生物富集与扩大43 水浮游生 物 水鱼鱼海豹鱼鲸鱼鸟海豹熊 八氯次莃6.71042.61060.384.6 hch9.31033.01041.51.40.79.3 氯丹2.61065.31077.39.40.336.6 ddt4.31051.410720.29.88.50.3 pcbs1.91064.81078.88.05.97.4 hcb1.21059.61060.23.07.515.6 1.3.2 氯酚(1.3.2 氯酚(cps)的性质)的性质 氯酚是一类毒性强、性质稳定、生物降解困难的致癌性化合物，主要来源于 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 11 石油化工、炼焦及造纸等工业，广泛用作木材防腐剂、除草剂和杀虫剂，对公众 健康造成严重威胁。我国水体优先控制污染物名单中含有 2,4-二氯苯酚(2,4-dcp)， 2,4,6-三氯苯酚(2,4,6-tcp)，五氯酚(pcp)44。 1.3.2.1 酚对人类健康的影响 酚类化合物是一种细胞原浆毒物，其毒性作用是与细胞原浆中蛋白质发生化 学反应，形成变形蛋白质，使细胞失去活性。它所引起的病理变化主要取决于毒 物的浓度，低浓度时可使细胞变性，高浓度可使蛋白质凝固，低浓度对局部损害 虽不如高浓度严重，但低浓度时由于其渗透力强，可向深部组织渗透，因而后果 更加严重。酚类化合物侵犯神经中枢，刺激脊髓，进而导致全身中毒症状。酚类 化合物可经皮肤的接触，呼吸道吸入和经口进入消化道等多种途径进入体内。 酚类化合物，特别是氯代酚，即使低浓度时也会对人体产生危害。世界卫生 组织（wto）规定了饮用水中一些有毒酚类化合物的最高允许浓度（mac） ： 2,4,6-tcp 为 200 g/l，pcp 为 9 g/l，2-cp 为 10 g/l，2,4-dcp 为 40 g/l，美 国环保署（us-epa）也在联邦登记目录中规定了 11 种对人体健康有害的取代苯酚 的最大允许浓度范围为 60400 g/l。 1.3.2.2 酚对水生植物和无脊椎动物的毒性 表 1-2 酚对水生藻类、无脊椎动物和鱼的急性毒性（96h lc50）单位 mg/l 化合物藻 类无脊椎动物鱼 淡水绿藻水 蚤虾翻车鱼小鲤鱼 苯酚103036.416.436 2-氯酚5004.48.212.3 4-氯酚4.84.429.73.8 2,4-二氯酚2.62.08.2 2,4,5-三氯酚1.22.73.80.4 2,4,6-三氯酚5.96.00.39.0 2,3,5,6-四氯酚2.70.621.90.2 2,3,4,6-四氯酚0.60.30.1 五氯酚1.02.70.70.80.15.10.10.2 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 12 邻甲苯酚16.02113 对甲苯酚13.51219 2,4-二甲基酚5002.17.816.8 4-硝基酚4.2227.28.360.5 2,4-二硝基酚9.24.14.90.616.7 2,4,6-三硝基酚41.78519.7170 一般来说，酚对无脊椎动物的毒性，简单酚的毒性小，随着取代程度增加，特 别是氯原子数的增加，其毒性增加。但氯甲基酚和一些烷基酚之类化合物对无脊 椎动物毒性比较小。酚类化合物对无脊椎动物还具有一些不致命的毒性，包括降 低产卵能力和卵成活率。在自然环境里，由于无脊椎动物对不同酚的敏感性不同， 导致无脊椎动物群体的繁殖和结构发生变化。 1.4 原生动物在生态系统中的地位及作用水质毒理评价方面的研究 1.4.1 原生动物在水质毒理评价方面的研究现状 1.4 原生动物在生态系统中的地位及作用水质毒理评价方面的研究 1.4.1 原生动物在水质毒理评价方面的研究现状 原生动物是最原始、最简单、最低等的单细胞动物。从形态上看，原生动物 是单一的细胞个体，然而从生理上看，它是很复杂的。它具有维持生命和持续后 代必需的一切功能：如行动、营养、呼吸、排泄、生殖等，这些功能由细胞内特 化的各种胞器来承担。也就是说它是一个复杂的、高等集中的生命单位，是一个 完整的有机体。 绝大多数原生动物都要用显微镜才能观察到， 其大小范围一般在 2 200 m 之间。 作为水生食物网的一个重要环节，原生动物在其中所发挥的作用是十分大的。 许多研究表明原生动物对水体中的细菌和藻类具有很强的牧食作用。原生动物具 有很高的牧食效率，并且具有被牧食对象相似的世代时间。从数量上讲，原生动 物是水生态系统中最重要的牧食者，它控制着水环境中细菌的丰度。一方面原生 动物在水体中将超微型生物转化为个体较大的自身，以利于高营养级生物利用。 另一方面，又通过牧食水体中的细菌、细菌产物及藻类使水质得到改善，起到水 质净化器的作用。 最早应用原生动物判断水质污染状况是要数 100 多年前英国人在研究泰晤士 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 13 河和伦敦的饮水卫生时，就断定某些纤毛虫与水中有机物质浓度有密切的关系。 在应用原生动物进行水质评价的初期，某些种类被选择来作为指示生物。通过观 察指示生物的有无、种群数量大小等指标，来判断水质状况。应用原生动物单个 物种进行化学物质的毒性评价工作也开展的比较广泛。其中以四膜虫为受试生物 的为最多。schultz(1997)45用梨形四膜虫作为对象来研究醌类的构效关系。实验结 果表明：醌类物质的毒性大小与醌的结构有很大的关系：正醌的毒形为最大，如 果在醌环两边加上苯环的话，那么毒性将大大降低，即是其浓度达到饱和也不对 四膜虫产生毒性作用。另外研究还表明，在醌环上的取代基不同其毒性大小也不 同；如果取代基上的取代基是供电子基、甲氧基、羟基的话，将大大降低该物质 的毒性。huber(1991)46用梨形四膜虫来做 cd，pb，hg，ddt，六六六等的毒性 试验，主要检测梨形四膜虫的死亡率与上述物质的关系，测定的上述污染物质的 ec50依次为 3.0，5.62，1.58，12.82，35.48mg/l。jorgan larsen47等试图用梨形四 膜虫作为受试生物来建立一种简单有效的毒性检测方法。 也有学者尝试用多种原生动物来同时评价水质或化学物质的毒性。在这方面， vadoni48用六种纤毛虫来评价镉、铜、汞、锌的 24h 急性毒性效应。abrnham49等 在两年时间通过检测一家污水处理厂曝气池中的纤毛虫种群及其变化，来反应池 中铁、锌、铬的浓度变化。moropuehla50用纤毛虫的组成变化来指示重金属浓度的 变化。研究都表明纤毛虫种类的增减、种群密度变化与重金属的浓度大小有正的 和负的相关性。poremba51用鞭毛虫对重金属、酚、表面活性剂来做毒性试验。 poremba52用食菌性鞭毛虫种群达到生长顶峰的时间变化来评价化学物质的毒性强 度。 现在的研究热点是利用原生动物群落来进行淡水生态毒理学的研究。 1.4.2 四膜虫在生物毒性方面研究现状1.4.2 四膜虫在生物毒性方面研究现状 其中，四膜虫(etrahymena)是第一种进行实验室无菌纯培养并且实现细胞同 步化的纤毛虫。关于四膜虫的各种培养条件及不同条件下其相应的生理生化指标 在过去的数十年里已有详细的报道。同时，作为一种先进的分子遗传学工具，四 膜虫在基础研究中一直处于前沿地位，尤其是在其他模式生物具有一定困难的某 些体内试验的研究领域，如调节分泌、细胞动力学、噬菌作用、端粒酶、组蛋白 和微管蛋白翻译后修饰功能以及发育中的 dna 重整等。正是基于以上特点，其越 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 14 来越受到毒理学与生态毒理学家的关注和重视。迄今为止，已对四膜虫中的 t.pyriformis、tthermophila、tvoraxtshanghaiensis 等诸多物种进行了多方面的研究。 四膜虫(tetrahymenapyri formis)是环境毒理学家最常用的生物模型之一，美国环境 保护署甚至建议将其作为水和废水标准参考实验系统。这一生物体之所以如此受 重视，是由其自身的一些特性决定的： (1) 在全世界广泛分布，是一种普遍易得的生物材料，并且其还是在限制性培 养基中进行纯培养的第一种原生动物； (2) 在食物链中处于重要的位置，是能量流和物质流的重要环节； (3) 当水体有机物负载过重或处于不利条件时，它的个体数目减少；反之，则 增加，因而被认为是理想的水体系统遭受破坏的早期警报指示器； (4) 个体小，繁殖周期短，操作方便，花费少； (5) 作为代表单细胞生物进化最高形式，纤毛虫的一种，不仅具有绝大多数在 真核细胞中可见的典型的亚细胞结构，而且同时具备完整生命体所有的诸如纤毛 口器，粘液泡等细胞器，这一点使得以四膜虫为模型的生物实验可以在短时间内 同时在细胞层次和生命独立个体层次展开研究。 大量研究已经证明四膜虫是进行药物，有机物，无机物毒理学评价的一个方 便模型。马正学等53用原生动物上海四膜虫(tetrahymenashanghaiensis)为材料，以 细胞生长和繁殖等生物学特征为指标，评价了黄河兰州段的水环境质量。结果表 明，四膜虫细胞对水环境质量的变化反映灵敏，可以用作监测和评价水质的细胞 模型。陈小娟、沈韫芬等 54利用微量热法研究 cd2+和 cu2+对嗜热四膜虫 bf5(tetrahymena thermophilabf5)生长代谢毒性效应，结果表明低浓度的 cd2+(0 0.4mg/l)和 cu2+(010mg/l)对四膜虫的生长有促进作用，而高浓度 cd2+(0.8 3.2mg/l)和 cu2+(20200mg/l)则产生抑制作用；cd2+和 cu2+联合毒性为协同作用。 王永兴等55应用 4 种方法(细胞直接计数法、中性红试验、蛋白质及核酸含量测定)， 研究不同浓度稀土金属离子 la3+、 sm3+、 y3+、 gd3+，处理 24h 后对梨形四膜虫 (tetrahymena pyriformis)的生长影响。结果表明，在低浓度时 la3+、 sm3+、 y3+、 gd3+，对四膜虫有刺激生长的作用。随着浓度的升高，4 种稀土金属离子均表现出 毒性效应；高浓度时，抑制生长作用特别明显。比较每一处理组的四膜虫细胞蛋 白质和核酸含量表明，稀土离子在刺激浓度时主要表现为促进四膜虫的分裂，而 抑制效应在相对较低浓度时仅表现为抑制生长，在较高浓度时生长分裂均受到抑 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 15 制。比较稀土金属离子不同处理浓度对四膜虫蛋白及核酸合成的影响，稀土金属 离子的作用主要是经过与膜结合，通过影响细胞的信号系统进而影响到细胞内部 的生理功能。bamadad 等56在研究多环芳烃(pahs)对四膜虫的毒性损伤时，发现 在一定时间内，pahs 对四膜虫的生长无显著影响。进一步利用流式细胞仪来探究 pahs 的胞内积累情况，结果显示这些化学毒物被迅速清除至胞外；而当添加 mdr 泵的两种抑制剂异搏定和环孢菌素时，pahs 浓度有不同程度的提高。因此推测四 膜虫上有类似于普遍存在于哺乳动物肿瘤细胞上、与肿瘤细胞耐药性有关的 mdr 泵。免疫细胞化学研究结果也进一步证实了这一点，并且还表明，苯并芘(bap)的 暴露可诱导 mdr 的表达。 1.4.3 有机物对原生动物生物毒性和富集的研究现状1.4.3 有机物对原生动物生物毒性和富集的研究现状 目前，有关原生动物生物毒性和富集的系统研究报道较少，这主要是因为原 生动物的生物量较小，直接测定生物体内有机物的浓度操作繁琐且难度较大。 1.5 研究的目的和意义1.5 研究的目的和意义 绝大多数有机物，尤其是 pops，因为它们一般很难或很缓慢降解，易在生物 体内富集，含量不仅是依次递增的，而且在有些动物中含量已相当高，远远超过 其周围环境中的含量。通过食物链传播、放大，一旦人类等一些高营养级生物食 用这些含有机物的生物，便会受到这类物质的危害，或有暴露于这类物质的危险 之中，对这类物质的研究也再次成为当今国际环境科学所关注的焦点之一。 原生动物对于生态系统的平衡和稳定起着极其重要的作用。在水生生态毒理 研究中，生物测试中的原生动物往往因为是单细胞、运动的、个体相对大的无细 胞壁的真核细胞，不仅生长周期短，而且对许多毒物比其他高等生物更为敏感、 直接，是较理想的试验材料。在食物链的初段，原生动物能通过包含蛋白质来吸 收物质。原生动物富含有机脂类物质，如梨形四膜虫中类脂含量约占细胞干重 8 25，有的原生动物体内还有油滴，就具备了富集有机污染物的条件57。有关 有机污染物对食物链高营养级水平如藻类58、尤其对鱼类59、鼠类60的毒性、富 集已经有许多研究报道，单个种类的原生动物对某些有机物61、重金属62,63的生物 毒性和富集有一定的报道，目前却明显缺乏有机污染物，特别是 pops，长期剂量 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 16 暴露下被水中原生动物富集的科学数据。 本文以嗜热四膜虫为原生动物代表，研究了