（材料学专业论文）弹性蛋白的改性研究.pdf

中文摘要 弹性蛋白( e l a s t i n ) 是细胞外基质中不溶、疏水、高交联的蛋白质和血管组织 中重要的化学成分，主要功能是被动伸缩、赋予所在组织以伸缩性和可逆的变形 能力。然而，弹性蛋白的功能仅限于弹性且难以加工成新的生物材料。本论文描 述了两种弹性蛋白表面改性的方法：原子转移自由基聚合( a t r p ) 和硫代引发转 移终止剂( t h i o i n i f c r t c r s ) ，并对其性能进行了研究。进一步，探索了种明胶功能 化弹性蛋白接枝共聚物的方法。 1 弹性蛋白经洳溴异丁酰溴化制备了大分子a t r p 引发剂溴代异丁酰化弹 性蛋白( e b r ) ，再以e b r 为引发剂，在c u c l 2 ，2 联吡啶催化体系下，用a t r p 方法合成了聚甲基丙烯酸b 羟乙酯( e g p h e m a ) 改性的弹性蛋白聚合物。用红外 ( f t i r ) 、x 射线光电子能谱( x p s ) 、热重分析( t g a ) 、扫描电镜( s e m ) 、离子色谱 和动态接触角对接枝聚合物进行了表征。结果表明：p h e m a 键接到了弹性蛋白 上；s e m 显示改性后弹性蛋白的表面比未改性前变得光滑，但改性后样品的热 性能均低于未改性样品，起始热分解温度由改性前的3 0 7o c 变为2 6 5o c ，最大 失重速率温度由3 4 7o c 降到3 1 6 7 6o c ；动态接触角实验表明改性后样品具有良 好的亲水性，反应7 2h 后前进角由接枝前的1 3 0 4 5o 下降到2 9 8 0o ，接触角滞后 由7 0 4 2o 变为2 9 8 0o 。 2 弹性蛋白经对氯甲基苯甲酰氯氯化、二乙基二硫代氨基甲酸钠( n a s d ) 硫 化制备了大分子i n i f c r t c r 剂( e s ) ，再以e s 为引发剂，在紫外光( o r 3 照射下引发 甲基丙烯酸p 羟乙酯( h e m a ) 聚合，合成了聚甲基丙烯酸肛羟乙酯( e g p h e m a ) 改性的弹性蛋白聚合物。用红# b ( f t i r ) 和x 射线光电子能谱( x p s ) 、热重分析 ( t g a ) 、扫描电镜( s e m ) 、离子色谱和动态接触角对改性弹性蛋白进行了表征。 结果表明：p h e m a 键接到了弹性蛋白上；s e m 显示改性后弹性蛋白的表面比未 改性前变得光滑，但改性后样品的热性能均低于未改性样品，起始热分解温度由 改性前的3 0 7 0o c 变为2 6 0 2 。c ，最大失重速率温度由3 4 7o c 降到3 1 6 3o c ；动 态接触角实验表明改性后样品具有良好的亲水性，反应7 2h 后前进角由改性前 的1 3 0 4 5o 下降到3 5 4 0o ，接触角滞后由7 0 4 2o 变为3 5 4 0o 。 3 本文首先用对硝基苯甲酰氯将原子转移自由基聚合方法得到的弹性蛋白 接枝共聚物的甲基丙烯酸p 羟乙酯的羟基活化，然后再利用明胶对其进行了功 能化。用红外( f t 和x 射线光电子能谱( x p s ) 和扫描电镜( s e m ) 对明胶功能化 的弹性蛋白接枝共聚物进行了表征。结果表明：明胶己键接到了弹性蛋白上；但 s e m 显示明胶功能化后弹性蛋白接枝共聚物的表面与未功能化的样品表面形态 没有太大变化。 关键词：弹性蛋白：原子转移自由基聚合：硫代引发转移- 终止剂；甲基丙烯 酸b 羟乙酯；光聚合；改性；明胶 a bs t r a c t e l a s t i ni st h ee x t r a c e l l u l a rm a t r i xp r o t e i nr e s p o n s i b l ef o rt h er e s i l i e n c eo ft i s s u e s a n di sac r i t i c a lb i o c h e m i c a lc o m p o n e n to fv a s c u l a rt i s s u e 。i ti sa ni n s o l u b l e ， h y d r o p h o b i ca n de x t e n s i v e l yc r o s s - l i n k e dp r o t e i n h o w e v e r , e l a s t i n sf u n c t i o n i s r e s t r i c t e dt oe l a s t i c i t ya n dd i f f i c u l tt ob ep r o c e s s e di n t on e wb i o m a t e r i a l s i nt h i s t h e s i s ，s y n t h e s i sa n dp r o p e r t i e so fe l a s t i ng r a f tc o p o l y m e rv i aa t o mt r a n s f e rr a d i c a l p o l y m e r i z a t i o n ( a t r p ) a n d t h i o - i n i f e r t e r sw e r ed e s c r i b e d f u r t h e r , an e w s t r a t e g yf o r t h ep r e p a r a t i o no f g l u t i n - f u n c t i o n a l i z e de l a s t i ng r a f tc o p o l y m e rw a se x p l o r e d 1 e l a s t i nw a sm o d i f i e dw i t h 2 - b r o m o i s o b u t y r y l b r o m i d et o p r e p a r e m a c r o - i n i t i a t o ra n ds u b s e q u e n t l ya t o mt r a n s f e rr a d i c a lp o l y m e r i z a t i o n ( a t r p ) m o d i f i e dt oa t t a c hp o l y ( 2 - h y d r o x y e t h y lm e t h a c r y l a t e ) ( p r m m a ) t h e s em o d i f i e d e l a s t i nw e r ee x a m i n e du s i n gf r m , x p s ，t g a ，s e m ，i o nc h r o m a t o g r a p h ya n d d y n a m i cc o n t a c ta n g l et e s t r e s u l t ss h o w e dt h a tp h e m ah a db e e nc o v a l e n t l yb o u n d t ot h ee l a s t i n a l t h o u g hs e me x a m i n a t i o ns u g g e s t e dt h es u r f a c eo fa t r p - m o d i f i e d e l a s t i nw a s m u c hs m o o t h e rt h a nt h a to fu n m o d i f i e ds a m p l e s ，t h et h e r m a ls t a b i l i t yo f m o d i f i e ds a m p l e sw a ss l i g h t l yl o w e rt h a nt h a to fu n m o d i f i e ds a m p l e s ，t h a ti st os a y ， t h ei n i t i a lt e m p e r a t u r eo fp y r o l y t i cd e c o m p o s i t i o nr e d u c e df r o m3 0 7 。ct o2 6 5o ca n d a n dt h em a x i m u m w e i g h t l e s s n e s sr a t et e m p e r a t u r ec h a n g e df r o m3 4 7o ct o3 16 7 6o c t h ed y n a m i cc o n t a c ta n g l et e s ts h o w e dt h a tt h em o d i f i e de l a s t i nw a sh y d r o p h i l i c c o m p a r e dw i 也t h eh i 曲h y d r o p h o b i c i t yo fe l a s t i ni t s e l fa n da f t e rp o l y m e r i z a t i o nf o r 7 2h t h ea d v a n c i n ga n g l eo fe l a s t i nd e c r e a s e df r o m1 3 0 4 5 0t o2 9 8 0 0 a n dc o n t a c t a n g l eh y s t e r e s i sr e d u c e df r o m7 0 4 2 o t o2 9 8 0o 2 e l a s t i nw a sf i r s t l ym o d i f i e db yr e a c t i n gt h ea m i n o - g r o u p so nt h ee l a s t i nw i t h p a r ac h l o r o m e t h y l b e n z o y lc h l o r i d ea n ds o d i u md i e t h y l d i t h i o c a r b a m a t et op r e p a r et h e m a c r o - i n i f e r t e r sa n ds u b s e q u e n t l ym o d i f i e db yu v - i n d u c e dp o l y m e r i z a t i o nt oa t t a c h p o l y ( 2 一h y r o x y e t h y l m e t h a c r y l a t e ) ( p h e m a ) t h e s em o d i f i e de l a s t i nw e r ee x a m i n e d u s i n gf t i rx p s ，t g a ，s e m ，i o nc h r o m a t o g r a p h ya n dd y n a m i cc o n t a c ta n g l et e s t r e s u l t ss h o w e dt h a tp h e m ah a db e e nc o v a l e n t l yb o u n dt ot h ee l a s t i n a l t h o u g h s e me x a m i n a t i o ns u g g e s t e dt h es u r f a c eo ft h i o - i n i f e r t e r s m o d i f i e de l a s t i nw a sm u c h s m o o t h e rt h a nt h a to fu n m o d i f i e ds a m p l e s ，t h et h e r m a ls t a b i l i t yo fm o d i f i e ds a m p l e s w a ss l i g h t l yl o w e r ，t h a ti st os a y ，t h ei n i t i a lt e m p e r a t u r eo ft h e r m a ld e c o m p o s i t i o n r e d u c e df r o m3 0 7o ct o2 6 0 2o ca n dt h em a x i m u mw e i g h t l e s s n e s sr a t et e m p e r a t u r e c h a n g e df r o m3 4 7o ct o3 16 3o c t h ed y n a m i cc o n t a c ta n g l et e s ts h o w e dt h a tt h e m o d i f i e de l a s t i nw a sh y d r o p h i l i cc o m p a r e dw i t ht h eh i 曲h y d r o p h o b i c i t yo fe l a s t i n i t s e l fa n da f t e rp h o t o p o l y m e r i z a t i o nf o r7 2h ，t h ea d v a n c i n ga n g l eo fe l a s t i nd e c r e a s e d f r o m1 3 0 4 5 o t o3 5 4 0oa n dc o n t a c ta n g l eh y s t e r e s i sr e d u c e df r o m7 0 4 2ot o3 5 4 0o 3 an e ws t r a t e g yf o rt h ep r e p a r a t i o no fg l u t i n - f u n c t i o n a l i z e de l a s t i ng r a f t c o p o l y m e rw a se x p l o r e d , w h i c hi sb a s e do nac o m b i n a t i o no fs u r f a c e i n i t i a t e da t o m t r a n s f e rr a d i c a lp o l y m e r i z a t i o n ( a r r p ) o f2 - h y d r o x y e t h y lm e t h a e r y l a t e0 1 1t h ee l a s t i n ， p - n i t r o p h e n y l c h l o r o f o r m a t ea c t i v a t i o no ft h es u r f a c e h y d r o x y lg r o u p s ，a n d s u b s e q u e n tg l u t i n f u n c t i o n a l i z a t i o n t h e s e g l u t i n f u n c t i o n a l i z e d e l a s t i n g r a f t c o p o l y m e r sw e r ee x a m i n e dl l s 啦f t i r , x p sa n ds e m r e s u l t so ff t i ra n dx p s s h o w e dt h a tg l u t i nh a db e e nc o v a l e n t l yb o u n dt ot h ee l a s t i ng r a f tc o p o l y m e r h o w e v e r , s e me x a m i n a t i o ns u g g e s t e dt h a ta n yc h a n g e sc o u l dh a r d l yb es e e nc o m p a r i n gt h e s u r f a c eo fg l u t i n f u n c t i o n a l i z e de l a s t i ng r a f tc o p o l y m c rw i t ht h a to fu n f u n c t i o n a l i z e d s a m p l e s k e yw o r d s ：e l a s t i n ；a t o mt r a n s f e rr a d i c a lp o l y m e r i z a t i o n ( a t r p ) ；i n i f e r t e r s ； 2 - h y d r o x y e t h y lm e t h a c r y l a t e ( h e m a ) ；p h o t o p o l y m e r i z a t i o n ；m o d i f i c a t i o n ；g l u t i n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得叁叠盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 剃一躲王觑俪黼瓤砷年月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：王踮器币奄 签字吼川年m c 7 日 导师签名7 袤位 婵e ? 飙腑朋7 目 天津大学硕士学位论文第一章前言 1 1 引言 第一章前言 弹性蛋白是一种细胞外基质蛋白，极难溶于水，主要由成纤维细胞、大动脉 平滑肌细胞和弹性软骨的软骨细胞等产生，在体内可与微原纤维结合形成弹性纤 维，其主要功能是被动伸缩，赋予所在组织和器官以伸缩性和可逆的变形能力 1 1 - 7 。因而，在经常受力而变形的器官，如肺、大动脉及皮肤中都有大量弹性蛋 白，对维持这些器官的功能起重要作用，但是弹性蛋白在这些组织、器官中的含 量却不相同，韧带中含量最高，约占8 0 ，其后依次为主动脉( 3 0 5 0 ) ，肺 ( 1 0 2 5 ) 和皮肤( 2 3 ) ；在机体的不同部分，产生弹性蛋白的细胞也有差别【8 】。 此外，弹性蛋白作为细胞外基质的主要成分，还起着细胞间黏附和支持作用，它 与胶原蛋白等其他细胞外基质一起维持组织结构的稳定性。最近又发现：弹性蛋 白具有调控平滑肌细胞增生和稳定动脉构筑的功能【9 】。 近年来，弹性蛋白以其良好的弹性和延展性受到国内外的普遍重视。因此， 研究弹性蛋白的结构、性质、功能以及改性j 一方面有助于更深入地理解弹性蛋 白的功能作用，另一方面对研究弹性蛋白在组织工程和其他生物医用材料领域的 应用也不无裨益。 1 2 弹性蛋白的生物学特性 1 2 1 弹性蛋白的结构和氨基酸组成 成熟的弹性蛋白虽然高度不溶、高度交联，但是弹性蛋白却是由水溶性的单 体形成的。弹性蛋白前体是在细胞内合成的前弹性蛋( p r o e l a s t i n ) ，编码前弹性 蛋白的基因为单拷贝基因，位于7 q 1 5 2 1 1 位点，含有4 5k b 个碱基对，m r n a 长3 5k b 。每个前弹性蛋白分子由一条肽链构成，分子量为1 2 0 k d 1 3 0 k d 。前 弹性蛋白合成后被蛋白水解酶脱去其羧基端的部分氨基酸残基，成为原弹性蛋白 ( t r o p o e l a s t i n ) ，分子量为7 0k d ，可溶于水，含有7 0 0 - - 7 6 0 左右个氨基酸残基， 其中9 5 的氨基酸为非极性氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸等。 天津大学硕士学位论文 第一章前言 原弹性蛋白从细胞中分泌出来后进入在细胞表面( 一般是在细胞表面的皱摺中) 先期形成的f m f 簇的中央部位，每4 个分子交联聚合为一个不可溶于水的弹性 蛋白大分子。4 条多肽链中的3 条，其赖氨酰残基被结合在原纤维蛋白微原纤维 ( f i b r i l l i nm i c r o f i b r i l ，f m f ) 上的赖氨酰氧化酶氧化脱去位的氨基形成醛基，这3 条多肽链上的醛基和另一条原弹性蛋白肽链上末被氧化脱氨的赖氨酰残基发生 缩合反应，形成其特有的交联键，称为锁链素( d e s m o s i n ) 或异锁链素( i s o d e s m o s i n ) ( 图1 1 ) ，成为弹性蛋白。并与微原纤维共同组成弹性纤维 1 0 - 1 3 】。组织中的弹性 纤维可用地衣红( o r e e l n ) 或间苯二酚复红染色后，在光学显微镜下可观察到。在 透射电镜下，弹性蛋白表现为单条状纤维，直径l 1 0g m ，长短不一，微纤维 则是直径为1 0 - - 一1 2 n m 的细纤维【1 4 1 。 鼍：莲no ：_ 毒一。啭挚 ，人：器、奠健：茹中) 图1 - 1 锁链素 f i g 1 - 1d e s m o s i n 弹性蛋白中疏水氨基酸残基1 国( 甘、丙、缬、亮及异亮氨酸) 约占9 0 以上， 其与胶原类似之处在于约l 3 氨基酸残基为甘基酸，但与胶原不同处为弹性蛋白 含羟脯氨酸很少，不含羟赖脯氨酸、蛋氨酸、无或极少半胱氨酸( 表1 1 ) 。由于弹 性蛋白中的主要成分是甘、脯等氨基酸，因此可形成p 转角，组成较宽的p 螺 旋，大量的疏水性氨基酸侧链都在螺旋内部，而亲水性的甘氨酸则在螺旋外部， 这一螺旋具有亲水、亲脂性、弹性和坚韧性，是弹性蛋白赋有弹性的物质基础。 表1 - 1 弹性蛋白和胶原蛋白的氨基酸组成 t a b l e1 - 1a m i n oa c i dc o m p o s i t i o no f e l a s t i na n dc o l l a g e n 胶厚和雌性蛋白的氰幕暖组戚 一囊摹魄曼苎：! ! 翌窒尘星堕苎 甘瞳3 ，oa ： _ l w1 2 一o 甜t1 0 t q 曩艘1 i 口2 2 灭* ls1 谷瓤n7 j _ n3 t 蓐l 幔j i 一e 衄 名1 j i 瓤啦oc ”* 蕾-j o2 0 ，e 曩姐霉5 讳l “ 2 7 5 争相-o h l h5 _ 曩n5 5 i l t l t _ 瓤， 堡星e j 一一一 天津大学硕士学位论文第章前言 1 2 2 弹性蛋白的提取与纯化 由于弹性蛋白和微原纤维的紧密缠绕、弹性蛋白在各种溶剂中的难溶性和在 制各过程中由于钙键联微原纤维的影响使得弹性蛋白极易钙化，因此，从组织中 分离和纯化弹性蛋白是困难的。通常，弹性蛋白的提取与纯化使用加热的氢氧化 钠碱溶液【1 7 】水解的方法，待其他各种细胞外基质被溶解之后，最后剩下的即为弹 性蛋白。 最近w f d a a m e n 等分别用5 种方法0 s - 2 0 对马颈部韧带中的弹性蛋白进行 了分离和纯化( 图1 2 ) ，通过凝胶电泳，氨基酸分析，荧光免疫检测法和透射 电镜等分析认为，用萃取酶解方法与较早运用2 巯基乙醇和氰溴化物的方法可 以得到高纯度的，近乎没有微原纤维的弹性蛋白【2 l 】。 12345 n | a 萃取胍盐忸c l + 2 巯基乙醇萃职n t c ! 萃取n l 萃职a 萃职 ljili 丙酮萃取 5 h 高压釜中处理有机溶弃障取有机溶剂举取有机溶剂萃取 iliil n a o h 处理c m f 处理胍盐咀c l 萃取胍盏也c l 萃职q 昭r 处理 jii 胶原酶处理胶原酶处理p j t + h c i + 2 - 巯基乙酵萃取 iil 胰岛泵处理旗岛泵处理胶原酶处理 lli n a c i 萃职c n k 处理胰岛紊处理 ii 2 巯基乙目口鞫职n 妇萃职 i n a c l 泰取 图1 2 弹性蛋白的制备 f i g ，p r e p a r a t i o no fe l a s t i n 1 2 3 弹性蛋白的性质及功能 弹性蛋白特有的高交联的结构( 图l - 3 ) ，赋予它许多优良性质，基于这些性 质又产生了许多特殊的功能。目前已经知道，在脑动脉瘤、脑动脉粥样硬化等多 种疾病中都伴有弹性蛋白的变化，提示弹性蛋白在这些疾病的治疗过程中可能具 天津大学硕士学位论文 第一章前言 有重要作用。因此，研究弹性蛋白的性质、功能是研究弹性蛋白的生理功能的一 个重要组成部分【2 2 捌。弹性蛋白的主要性质及功能有以下几方面。 舔 耵一卜 图l 一3 弹性蛋白的结构 f i g 1 3t h es t r u c t u r eo fe l a s t i n 1 2 3 1 溶解性能 弹性蛋白是一种极难溶解的硬蛋白，不溶于稀酸、碱、醇和盐溶液，仅在一 些极性溶剂中出现溶胀现象。m a l i l l i e 等通过对比纯净弹性蛋白在溶剂中的线 性膨胀和体积膨胀研究来弹性蛋白特殊的溶胀性能【2 4 1 。他们测定三种情况下即固 定水分含量、脱水消溶胀中和十二烷基硫酸钠( s d s ) 中的弹性蛋白样品的长度和 体积的变化。结果发现：与通常的立方体网络的各个方向长度的变化与体积的立 方根成比例不同，弹性蛋白网络的长度变化均直接与体积变化成比例，而且长度 变化比预想的要大。弹性蛋白这种不同寻常的溶胀性能归因于在亚纤维态下其特 殊的结构，但是目前在弹性蛋白的分子结构方面还没有详细的资料能解释这个现 象的发生，因为假设弹性蛋白溶胀时均相膨胀，用这两种模型可以很好去预示弹 性蛋白的溶胀性能，但是这些模型与通常的弹性网络结构中自由链的运动规律相 背离；假设弹性蛋白异相膨胀，那么实验中观察到的弹性蛋白网络的长度变化直 接与体积变化成比例就无法解释。因此，到目前为止，人们还在寻找适合弹性蛋 白结构的模型以研究弹性蛋白的溶胀性能及其与黏弹性能之间的关系【2 5 1 。 4 天津大学硕士学位论文 第一章前言 n 献r b t h e i b e i m k - m l h b 警h 岫 w 妯l 硼目瞰d 时【州m _ 斜r a t i o sp r 酬d “叶t k m w 柚i - 呻嘛k i 2 州m i 叩嘲c l p 4 噼h n j n 警仉l mh r 喃 馓岫啤a n d - 州响删m 哺玎岫h - 睁f ，酊f i g u r e ， _ r 1y - 1 - 一 ”1 期v 1 ”1 i - 一1 2 v ，1 5 0 k _ 1 1 即 k _ 。 t 4v ，”lk 。t l 即1 _ i 1 8 7v , ，1 3 8 k _ 1l i 州l _ 。_ _ _ - 1 a h 棚r 脚咄k d d h h q 哪h 蜜( 1 1 0 u i 1 日嚼衲w - - 以b i d i 蜘m c p 捌“叽l i 呻吣k 瑚c 、k i h k 且坤n 伸n i m o 如lf 、p 舯k mr w w tj a f # ej vh n 研j f 唯o r l c n m “o n 村蹦c 邮蜘o f 岫n c r w o d c 【i l t 如p r 玳r a y a l t k i 警l w o d t b “q 加譬d o i jm 叫nb o d yo fd i 柚n 硼t he i ；h i nb d p 皓e x c e e i l n g 协叶k 卅i - 幢mu 州k t ki 似f 吐 i i h m 忡c d l 舅i 雕r r 斜如9 h c i 唧出o rb c 岫b o d - 酣h n | i c a = l1 4 【蛔td y u 弛? 耐k 钟c - 砒km 咖訾oi i ro fi 舯t h c 他备w 删辅吖岫) 州i t hl n m 科 i o 一= 1 5 k a 附“c h 瞎h 9 t h e d fo r 证m m a i m 玎m 电6 a h u , e x k n d 删i 可t r , k l n c 州妇f , a p c r g l e - m ew o u l d “芦础阶p k 址略虹咐 _ 嘻岫s a m p kw 蝴胱k 劬i j 【rj 翔i nt i r e i - l e 婶删 , s w e l h n pm 删 h eb d 一d o 啊c h 呲c 吨m h 嘶i _ 竹眦n ni 目e - l d t l 瑚i m 瞻c 蚺岫h l km ) d y ： 忡2 1 1 7 i c t 帅严山 附，= 1 1 2 m h ，i h _ l k 拥m t h e h r “l l e e sr m k e p 玢o t 岫i n l a je j 蕾- l f i l er l e p e ( j r k 佃b 船 i k 佃i 觚i z i l r ，o 铝+ i8 ，、0 , 0 2 ) t k 鞠州i 螂啊础- c 嘲幻i j i i 1 2 + 1 4 7 讪i + i d - - q 妇￥棚k 3 冀 图1 - 4 弹性蛋白的长度变化和体积变化率之间的关系( 左) 及其所用模型( 右) f i g i - 4r e l a t i o nb e t w e e ni n c r e a s ei nl e n g t hr a t i ow i t hi n c r e a s e dn e t w o r km a s sr a t i oa n dt h em o d e l 1 2 3 2 热性能【2 6 2 7 】 vs a m o u i l l a n 等从猪的大动脉组织中提取出弹性蛋白、胶原蛋白等非细胞基 体，利用热重分析法( t g a ) 和示差量热扫描法( d s c ) 对加热过程对于这些细 胞外基质纤维蛋白可能造成的损坏和它们的结构转变进行了研究。其中，t g a 用来研究蛋白质水的相互作用和蛋白质的分解温度：d s c 从蛋白质热转变的角 度( 玻璃化转变和蛋白质变性) 提供动脉组织的动态结构信息。 1 2 321 热重分析 5 面。回一回一。回 天津大学硕士学位论文 第一章前言 图l 一5 弹性蛋白的热重曲线图 f i g 1 - 5t g at h e r m o g r a m sf o re l a s t i n 图1 5 是弹性蛋白和胶原蛋白的热重曲线图，从中也可得到大动脉壁和瓣膜 小叶的热分解信息。图中四条曲线呈现相似的变化：第一个失重阶段发生在4 0 1 2 0 ，最大失重速率温度为7 0 ，归因于水分的蒸发，对在空气中干燥的蛋白 质来说，这是常见的。这个现象可以从水吸附实验中得到证实：在2 5 、8 5 相对湿度下，为研究蛋白质水之间的相互作用的而进行的水吸附实验得到，纯 净的胶原蛋白吸水量为2 9 4 ，而弹性蛋白则为1 9 7 ，这一结果与t g a 曲线 的水分蒸发损失基本一致；这个阶段之后，所研究的材料均出现一个准平台区 温度变化范围非常小，但是相应物质的失重速率却明显不同，在1 5 0 时，弹性 蛋白和胶原蛋白分别失重达9 6 和1 4 8 。第二个失重阶段即热分解过程在 2 2 0 3 8 0 范围内展开，不同物质的最大失重速率温度不同，但均在2 8 5 3 0 0 内，据y a n n a s 讲，这一阶段是一个非常复杂的过程，伴随着解聚过程和氧化分 解过程的同时发生。3 5 0 c 以后是失重的最后阶段，是主要成分的真正的燃烧过 程，所以t g a 曲线出现急剧的变化。表1 2 是上述几种大动脉基质的t g a 参数。 表1 - 2 弹性蛋白的热重曲线参数 仉出l e1 2p a r a m e t e r sf r o mt g ac u r v e sf o re l a s t i n 天津大学硕士学位论文第一章前言 1 2 3 2 2 示差量热扫描分析 图1 - 6 弹性蛋白的d s c 曲线图 f i g1 - 6d s ct h e r m o g r a m so fe l a s t i n d s c 的第一副图表示的是水分的变化，而第二、三副图是蛋白质的变化。 可以看出：第一副中，在1 0 0 附近有一个很强的吸热峰，出现一阶转变，根据 以前的结论，其归因于结合水的释放、蒸发和气化。但是弹性蛋白的热转变参数 ( 最大峰值温度) 明显低于胶原蛋白的相应值。 在弹性蛋白d s c 第二、三副图中，没有第一副图中吸热峰的出现，仅在2 0 0 附近出现一个特殊的吸热峰，即伪二阶玻璃化转变。有研究发现：3 0 的结合水 足以使固态的弹性蛋白的玻璃化转变温度从2 0 0 降到室温。因此，弹性蛋白与 水的结合程度对其玻璃化转变温度有极其深刻的影响。 1 2 3 3 弹性与延展性能 弹性蛋白仅在水合的条件下才具有弹性性能【2 8 圳】。在弹性蛋白的疏水区域存 在两种相互交替出现的结构域：1 ) 内在氢键形成p 转角和p 螺旋，成为有序构 象区域；2 ) 无规结构形成的无序构象区域。在弹性蛋白稳定结构的形成过程中， 结合水起着关键作用【3 2 。3 6 】，与其他蛋白质相比，弹性蛋白的稳定结构更容易发生 变化。弹性蛋白的结构弹性能能之间的关系可概括为图1 7 。 7 天津大学硕士学位论文 第一章前言 r e l a x e d o r d e r e d r e s t r a i n e d 圉 图1 7 水调节溶胀弹性蛋白的结构平衡 f i g 1 - 7w a t e rm e d i a t e ds t r u c t u r a le q u i l i b r i ap r o p o s e df o rs w o l l e ne l a s t i n 在松弛状态下，弹性蛋白偏向于无规的构象，大量的溶剂水( b ) 增加了水合 的水( w 0 和弹性蛋白分子的相互作用力，增强了多肽链的活动性，因此，水溶胀 的弹性蛋白处于高熵值状态，它的分子链具有高度的活动能力。当水溶胀的弹性 蛋白被拉伸时，卷曲的原弹性蛋白分子被打开，溶剂水从分子链孔隙中挤出，从 而导致结合水与弹性蛋白分子间的相互作用力大大降低，在这种状态下，多肽链 被强迫沿预定方向排列，分子链间的作用力加强，因此，就可能会形成b 转角 和p 一螺旋，呈现有序构象。拉伸力使得弹性蛋白分子链由无序态变为有序态， 而且伴随着分子链的重排，体系的熵值也出现明显的下降。然而，当去掉外力后， 由于原弹性蛋白分子的折叠和弹性网络的再次膨胀，弹性无规结构又会出现。因 此，弹性蛋白特有的交联结构是其具有弹性性能的基础。 1 2 3 4 降解性能 弹性蛋白的代谢率( t u r n o v e r ) 相当低，经放射性同位素测定，其半衰期约为 7 0 年，而且这种纤维状蛋白分子对物理、化学、甚至某些酶的攻击有很强的耐 受和抵抗能力，因此，长期以来一直被认为是一个情性的、无代谢的蛋白质。l9 5 0 年，匈牙利学者第一次在动物的胰脏中分离出一种酶，在中性溶液中能降解弹性 蛋白，被命名为弹性蛋白酶。以后，有人使用放射免疫测定方法，检测到了弹性 蛋白的降解产物弹性蛋白多肽在人血清中的存在，证实了弹性蛋白在体内的降 掣 ；jf ，圉 天津大学硕士学位论文 第一章前言 解。 弹性蛋白酶是一种内肽酶，它并非对弹性蛋白专一，能水解多种蛋白基质。 在机体中，除了胰脏来源的弹性蛋白酶外，还有多核中性粒细胞、血小板、巨噬 细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞来源的弹性蛋白酶。这些弹性蛋白酶 可以分成两类：金属离子蛋白水解酶和丝氨酸蛋白水解酶。其中，除了巨噬细胞 和成纤维细胞弹性蛋白酶是金属离子蛋白水解酶外( 即需锌离子作为辅酶) ，其余 的均为丝氨酸蛋白水解酶。例如，与皮肤衰老有关的主要是成纤维细胞和中性粒 细胞来源的弹性蛋白酶。人皮肤成纤维弹性蛋白酶的分子量为6 00 0 0 ，存在于细 胞膜上，它能快速地降解真皮乳头层中垂直、纤细的弹性纤维( o x y t a l a n s 和 e l a u n i n sf i b r e s ) ，但对成熟的弹性纤维速度相对幔一些。中性粒细胞中的弹性蛋 白酶是体内最主要的丝氨酸蛋白水解酶，它的分子量为3 00 0 0 ，除了对弹性蛋白 有很强的降解能力外，还对胶原、粘蛋白和免疫球蛋白等有很强的降解作用。在 局部充血炎症时，中性粒细胞聚集，其溶酶体释放，造成周围组织中的各种基质 降解，该酶在皮肤遭紫外辐射时，会引起血管扩张或红斑，组织充血炎症，造成 弹性蛋白酶对弹性蛋白的降解，促进皮肤衰老最为重要。 弹性蛋白酶如此广泛地存在于机体之中，那么为什么在正常情况下，它不会 大量地降解弹性蛋白，造成病理性变化呢? 这是因为在生理情况下，机体存在着 在数量上占绝对优势的该酶的天然抑制剂。对丝氨酸类型弹性蛋白酶的抑制剂主 要是伐1 蛋白酶抑制剂和q 2 巨球蛋白抑制剂；但对金属离子型弹性蛋白酶的抑 制剂为组织金属内肽酶抑制齐 ( t i s s u ei n h i b i t o r so f m e t a l l o p r o t a e s e ，t i m p ) 。弹性 蛋白酶和弹性蛋白酶抑制剂之问维持着一个动态平衡，只有在机体衰老或者遗传 缺陷、长期紫外辐射、炎症等病理情况下，抑制剂浓度下降或弹性蛋白酶活性升 高，弹性蛋白与弹性蛋白酶之间的动态平衡破坏，弹性蛋白才会被降解，造成相 应组织器官的病理变化。 1 2 4 弹性蛋白在生物医用材料中的应用 弹性蛋白作为天然的生物资源，具有合成高分子材料无法比拟的生物相容 性、弹性和延展性，可广泛应用在医药、组织工程、化妆品等领域中。 1 2 4 1 弹性蛋白基生物医用材料 组织工程学是近来发展起来的一门新学科，是材料学、工程学和生命科学共 同发展并相互融合的产物，其最基本的思路是在体外分离、培养细胞，将一定量 的细胞接种到具有一定空间结构的支架上，通过细胞之间的相互黏附、生长繁殖、 分泌细胞外基质，从而形成具有一定结构和功能的组织或器官。因而，充足的种 9 天律大学硕士学位论文第一章前言 子细胞、合适的支架、及促进种子细胞在支架上增殖分化的园子便成为组织工程 的三大要素。一般来说，用于组织工程的材料可分为三太类人工合成的，天然 的，及经过修饰的天然高分子。 弹性蛋白的良好的弹性和特殊的交联结构形成的稳定性，使其成为组织工程 中令人期待的蛋白质材料旧。最近的体外研究进一步证实：弹性蛋白能够调节血 管平滑肌细胞的增殖、分化、迁移并能够有效降低因细胞增殖对动脉损伤处的 炎症反应口8 。这些都使得弹性蛋白在组织工程中越来越受到人们的青昧。但是， 不像胶原蛋白，弹性蛋白本身极少用于生物材料【3 叫”，一个原因是在弹性蛋白在 细胞培养过程中极易钙化，另一个原因是弹性蛋白的提取纯化过程及其复杂且 难以加工成新材料。因此，下面着重介绍几种弹性蛋白基的组织工程材料 1 , 2 4 1 1 纯弹性蛋白组织工程材料 4 3 刮 d a nts i m i o n c s e u 等将猪的大动脉或者心脏先经溴化氰( c n b d ( 5 0m g m l c n b r 的7 0 的甲酸溶液) 常温搅拌处理1 9 h 以去除掉细胞、胶原蛋白、其他除 弹性纤维之外的细胞外基质成分接着升温至6 0 保温1h 后再煮沸5m i n 使c n b r 充分失活，得到弹性蛋白支架材料。图卜8 的扫描电镜照片显示：弹性 蛋白支架材料呈现有序的三维结构。 图1 8 弹性蛋白立桨 f i g1 - 8d a s t i ns c a f f o l d 细胞培养实验和生物毒性实验的结果证明：弹性蛋白支架材料具有无毒、生 物相窖性良好的优点，并能有效的调节和重塑宿主( 成年兔颈动脉) 细胞的增殖、 分化。进一步的体外研究证实：可实现弹性蛋白支架完全内皮化，有效地防止血 栓的形成。因此弹性蛋白是制各脉管、血管类支架材料强有力的候选。 天津大学硕士学位论文第一章前言 1 2 4 1 2 弹性蛋白一胶原蛋白基组织工程材料 在组织工程中，胶原蛋白弹性蛋白支架材料是有价值的生物材料，因为这 种材料集优良的拉伸强度和弹性强度于一身。b o l a n d e d l 4 “、lb u t t a f o e o l 4 “、w f d 越m 印h 1 等分别用电纺、冷冻干燥( 图1 4 ( 曲卜预先用d a n ts i m i o n e s c u 的方法 制备弹性蛋白支架再将胶原蛋白混合到弹性蛋白支架材料中( 图】一9 ( o ) ) ，均得到 了胶原蛋白一弹性蛋白多孔支架材料。 田1 - 9 ( 0圈l 帅) 图1 - 9 胶原蛋白- 弹性蛋白支架 f i g i - 9e o l l a g e n - e l a s t ms c a f f o l d 与单纯的胶原蛋白和弹性蛋白支架材料相比较这种混合两种细胞外基质蛋 白的支架材料具有更加优异的机械性能和弹性性能。同时，我们也通过改变弹性 蛋白和胶原蛋白的比例调节支架材料的性能获得满足血管