（材料学专业论文）弹性蛋白的层层自组装改性研究.pdf

摘要 基于弹性蛋白良好的性能和层层自组装技术的在生物材料表面改性中的一 系列优点，本课题首先以弹性蛋白膜为基底材料，分别以细胞外基质成分透明质 酸、i 型胶原和透明质酸、天然多糖壳聚糖为组装材料通过层层自组装成功的对 弹性蛋白膜进行了表面改性；其次，将弹性蛋白部分降解后应用冷冻干燥法制各 了弹性蛋白三维支架，并对支架进行了自组装改性探索。 1 成功在弹性蛋白膜表面构筑了透明质酸胶原多层膜，扫描电镜测试显示， 随组装层数增加弹性蛋白膜表面粗糙程度逐渐降低，组装1 4 层后弹性蛋白膜表 平整，缺陷基本消失，组装1 4 层的弹性蛋白膜纵切面照片直观证明了基材表面 多层膜结构的存在：x 光电子能谱测试证实了组装膜为透明质酸胶原；紫外可 见光谱测试证实了透明质酸胶原多层膜的线性增长；动态接触角测试表明，组 装后弹性蛋白膜表面呈现良好的亲水性，组装1 4 层样品的前进接触角由组装前 的1 2 1 7 6 0 降低到6 9 3 3 0 ；拉伸测试显示弹性蛋白拉伸强度在8 4 0 8 7 0k p a 范围内， 断裂伸长率在1 4 0 1 6 0 范围内，改性对其力学性能影响不大。 2 成功在弹性蛋白膜表面组装了层透明质酸壳聚糖多层膜，扫描电镜照片 显示，随组装层数增加弹性蛋白膜表面粗糙程度逐渐降低，组装1 4 层的弹性蛋 白膜的表面平整，表面缺陷显著减少；x 光电子能谱测试表明组装膜为透明质酸 壳聚糖；动态接触角测试显示，组装后弹性蛋白膜表面呈现良好的亲水性，组 装1 4 层样品的前进接触角由组装前的1 2 1 7 6 0 降低到8 0 1 3 0 ；拉伸测试显示弹性 蛋白拉伸强度在8 4 0 8 7 0k p a 范围内，断裂伸长率在1 3 0 1 6 0 范围内，改性对 其力学性能几乎没有影响。 3 成功制备了性能较好的弹性蛋白三维支架，0 1 5m o l ln a o h 溶液降解 2 5h 后制备的支架的孔径可达1 0 0 岬且较均匀，孔隙间贯通性较好，孔隙率为 7 6 2 ，吸水率为1 2 6 3 ，拉伸强度可达1 1 2 6k p a ，0 3m o l l 草酸溶液降解4h 后制备的支架平均孔径在8 0 1 0 0 岬左右，孔隙间贯通性较好，孔隙率为8 3 7 ， 吸水率为1 5 6 5 ，拉伸强度为8 1 5k p a 。并初步利用l 、2 中的方法对性能较好 的弹性蛋白支架进行了表面改性，改性后支架的表面形貌没有明显的变化、孔径 基本不变、孔隙率有所降低、吸水能力明显提高、拉伸强度有所提高。 关键词：弹性蛋白；层层自组装；透明质酸；胶原；壳聚糖；表面改性；组织 工程支架 a b s t r a c t b a s e do nt h eg o o dp r o p e r t i e so fe l a s t i na n dt h es e r i e sa d v a n t a g e so fl a y e r b y l a y e r s e l f a s s e m b l yt e c h n o l o g yi nt h es u r f h c em o d i 6 c a t i o no fb i o m a t e r i a l s ，i nt h i sp a p e r ， n r s to fa 1 1 ，e l a s t i nw e r em o d i 行e dv i al a y e r - b y - l a y e rs e l f a s s e m b l yo fh y a l u r o n i c a c i d ( h a ) c o l l a g e n ( t y p ei ) a n dt h eh y a l u r o n i ca c i d ( h a ) c h i t o s a n ( c s ) r e s p e c t i v e l y s e c o n d l y ，e l a s t i nw a sd e g r a d e dp a r t l ya n dp r e p a r e di n t o3 ds c a f f o l d s ，a n dt h em o d i n - c a t i o no ft h ee l a s t i ns c a 何b l d sw a sa l s oe x p l o r e d 。 1 h a c o l l a g e nm u l t i l a y e r6 1 m sw e r es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e do nt h ee l a s t i n m e m b r a n e s s e mi m a g e ss h o w e di tw a sc l e a rs a n d w i c hs t r t j c t u r e so na ne d g eo ft h e e l a s t i nm e m b r a n e sc o n t a i n i n g14l a y e r so fh aa n dc o u a g e n t h ex p sa n a l y s i s d e m o n s t r a t e dt h a tt h e a s s e m b l yn l m sw e r eh aa n dc o l l a g e n t h eu v v i s i b l e s p e c t r o s c o p yr e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h el i n e a r 时o ft h em u l t i l a y e r b u i l d u p t h e a d v a n c i n gc o n t a c ta n 9 1 ed a t ar e v e a l e dt h eh y d r o p h i l i c i 妙o ft h ee l a s t i nm e m b r a n e s w a sg r e a t l yi m p r o v e da r e ra s s e m b l y t h et e n s i l et e s td a t as h o w e dt h em e c h a n i c a l p r o p e r t i e so fe l a s t i nm e m b r a n e sh a dn o tc h a n g e da 1 f t e rt h em o d m c a t i o n 2 e l a s t i nm e m b r a n e sw e r es u c c e s s f u l i ym o d i n e dv i al a y e r - b y l a y e rs e l f - a s s e m b l y o fh aa n dc s s e mi m a g e ss h o w e dt h es u r f a c er o u 曲n e s so fe l a s t i nm e m b r a n e s g r a d u a l l yd e c r e a s e dw i t ht h en u m b e ro ft h em u l t i l a y e r si n c r e a s i n g t h ex p sa n a l y s i s d e m o n s t r a t e dt h a tt h ea s s e m b l yf i l m sw e r eh aa n dc s t h ea d v a n c i n gc o n t a c ta n g l e d a t ar e v e a l e dt h eh y d r o p h i l i c i 够o ft h ee l a s t i nm e m b r a n e sw a sg r e a t l yi m p r o v e da r e r a s s e m b l y t h et e n s i l et e s td a t as h o w e dt h em e c h a n i c a l p r o p e r t i e s o fe j a s t i n m e m b r a n e sh a dn o tc h a n g e da f t e rt h em o d i 行c a t i o n 3 e l a s t i n3 ds c a 妇f o k l sw i t hg o o dp r o p e r t i e sw e r es u c c e s s f u l l yp r e p a r e d t h ep o r e d i a m e t e ro ft h es c a 行o l d s p r e p a r e da r e r2 5 hd e g r a d e di nt h e0 15 m o l ln a o h s o l u t i o nr e a c h e dl0 0 岬a n dt h ep o r e sa r ea b s o l u t e l yo p e n t h ep o r o s i t ya r e7 6 2 a n dt h et e n s i l es t r e n 鲈ha r e1 12 6k p a t h ep o r ed j a m e t e ro ft h es c a f r o l d sp r e p a r e d a r e r4 hd e g r a d e di nt h e0 3m o l 】lo x a l i ca c i ds o l u t i o na r ei nt h er a n g eo f8 0 一1 0 0 i 蚰 a n dt h ep o r e sa r ea b s o l u t e l yo p e n t h ep o r o s i t ya r e8 3 7 a n dt h et e n s 订es 仃e n 矿ha r e 81 5k p a f u r t h e r n l o r e ，t h ee l a s t i ns c a f f o l d sw e r em o d i n e dv i al a y e 卜b y - l a y e r s e l f a s s e m b l y o fh a c o l l a g e na n dh a c s ，a n dt h em o d i n c a t i o ni m p r o v e dt h e b i b u l o u si a t i oo ft h es c a f o l d s 。 k e yw o r d s ：e l a s t i n ，l a y e 卜b y l a y e rs e l f a s s e m b l y ，h y a l u r o n i ca c i d ， c o l l a g e n ，c h i t o s a n ，s u r f a c em o d i n c a t i o n ，t i s s u ee n g i n e e r i n gs c a f f o l d 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得叁洼盘堂或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在 论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学雠文作者虢锨、才签字啉劢汐乡年夕月朋 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解基洼盘堂有关保留、使用学位论文的规 定。特授权丞盗盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同 意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 常德才 导师签名： 玖j ，乏 签字日期：7 彻孑年莎月p 日 签字日期：删年多月口 日 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 弹性蛋白是一种重要的细胞外基质蛋白，主要由成纤维细胞、大动脉平滑肌 细胞和软骨细胞等产生，在体内可与微原纤维结合形成弹性纤维，其主要功能是 被动伸缩，赋予所在组织和器官以伸缩性和可逆的变形能力1 14 1 ，因而，弹性蛋 白大量存在于经常受力而变形的器官，如韧带、肺、大动脉及皮肤中，来维持这 些器官的功能，弹性蛋白在组织中的含量因弹性功能对组织的重要程度的不同而 不同，韧带中含量最高约占8 0 ，其后依次为主动脉3 0 5 0 ，肺1 0 2 5 和 皮肤2 3 ；在机体的不同部分，产生弹性蛋白的细胞也有差别【5 j 。此外，弹性 蛋白作为细胞外基质的主要成分，还起着细胞间黏附和支持作用，它与胶原蛋白 等其他细胞外基质一起维持组织结构的稳定性；最近又发现弹性蛋白具有调控平 滑肌细胞增生和稳定动脉构筑的功能1 6 j 。 近年来，弹性蛋白以其良好的弹性、延展性和生物相容性受到国内外学者的 普遍关注。研究弹性蛋白材料的结构、功能和改性，一方面有助于更深入地理解 弹性蛋白的功能作用，另一方面对研究弹性蛋白在组织工程和其他生物医用材料 领域的应用具有重要意义。 1 2 弹性蛋白的研究现状 1 2 1 弹性蛋白结构和组成 成熟的弹性蛋白虽然高度不溶、高度交联，但弹性蛋白却是由水溶性的单体 形成的。每个前弹性蛋白分子由一条肽链构成，分子量为1 2 0l 1 3 0k d 。前 弹性蛋白合成后被蛋白水解酶脱去其羧基端的部分氨基酸残基，成为原弹性蛋白 ( t r o p o e l a s t i n ) ，分子量为7 0l ( d ，可溶于水，含有7 0 0 7 6 0 左右个氨基酸残基， 其中9 5 的氨基酸为非极性氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸等。 原弹性蛋白从细胞中分泌出来后聚集在细胞表面( 一般是在细胞表面的皱摺中) 先期形成的f m f 簇的中央部位，每4 个分子交联聚合为个不可溶于水的弹性蛋 第一窜绪论 白大分子。4 条多肽链中3 条的赖氨酰残基被结台在f m f 上的赖氨酰氧化酶氧化 脱去啦的氨基形成醛基，这3 条多肽链上的醛萋和另一条肚链上未被氧化脱氨 的赖氨酰残基发生缩合反应，形成其特有的交联键，锁链素( d e s r n o 对n ) 或异锁链 素( i s o d e s r n o s i n ) 而成为弹性蛋白【 】。弹性蛋白与微原纤维共同组成弹性纤维。在 透射电镜下，弹性蛋白表现为单条状纤维，直径l 1 0 姗1 ，长短不一，微纤维则 是直径为l o 1 2 n m 的细纤维【帷。由于高度的变联使得弹性蛋白具有十分稳定 的化学和机械稳定性，呈现“橡胶”的性质。由于弹性蛋白的姑睫核交鞋结构， 使弹性蛋白显示荧光，其水介质呈黄色。 菏 已如 图卜1 曲弹性蛋白分子模型，协弹性虽白的形成过程示意图 h gi ja j 仆e m o k c i l h r m o d e lo f c 衄hb ) t k 胁州c r e 障e n 谢b n o f 恤e 自珊m i o n o f e l a m 弹性蛋白中疏水氨基酸残基【1 2 吲( 甘、丙、缬、亮及异亮氢酸) 约占9 0 以上， 其与胶原类似之处在于约l 胆氪基酸残基为甘基酸，但与胶原不同魁为弹性蛋白 含羟脯氨酸很少，不含羟赖脯氨酸、蛋氨酸、无或极少半胱氨酸。由于弹性蛋白 中的主要成分是甘、脯等氨基酸，因此可形成- b - 转角，组成较宽的b 螵旋，大 量的疏水性氪基酸侧链都在螺旋内部，而亲水性的甘氨酸则在螺旋外部，这一螺 旋具有亲水、亲脂性、弹性和坚韧性，是弹性蛋白赋有弹性的物质基础。 12 2 弹性蛋白的性质及功能 弹性蛋白特有的茼芟睫的结构，赋予它许多优良性质，基于这些性质又产生 了许多特殊的功能。因此，研究弹性蛋白的性质、功能是研究弹性蛋白一个重要 组成部分”。 第一章绪论 1 2 2 1 弹性蛋白的溶解性能 弹性蛋白是一种极难溶解的硬蛋白，不溶于稀酸、碱、醇和盐溶液，仅在一 些极性溶剂中出现溶胀现象。m a l i l i i e 等通过对比纯净弹性蛋白在溶剂中的线 性膨胀和体积膨胀研究了弹性蛋白特殊的溶胀性能i l6 i 。他们测定三种情况下即 固定水分含量、脱水溶胀中和十二烷基硫酸钠( s d s ) 中的弹性蛋白样品的长度和 体积的变化。结果发现：与通常的立方体网络的各个方向长度的变化与体积的立 方根成比例不同，弹性蛋白网络的长度变化均直接与体积变化成比例，而且长度 变化比预想的要大。弹性蛋白这种不同寻常的溶胀性能归因于在亚纤维态下其特 殊的结构，但是目前在弹性蛋白的分子结构方面还没有详细的资料能解释这个现 象的发生，因为假设弹性蛋白溶胀时均相膨胀，用这两种模型可以很好去预示弹 性蛋白的溶胀性能，但是这些模型与通常的弹性网络结构中自由链的运动规律相 背离；假设弹性蛋白异相膨胀，那么实验中观察到的弹性蛋白网络的长度变化直 接与体积变化成比例就无法解释。因此，到目前为止，人们还在寻找适合弹性蛋 白结构的模型以研究弹性蛋白的溶胀性能及其与黏弹性能之间的关系【l7 | 。 1 2 2 2 弹性蛋白的弹性与延展性能 弹性蛋白仅在水合的条件下才具有弹性性能【1 8 之0 1 。在弹性蛋白的疏水区域存 在两种相互交替出现的结构域：1 ) 内在氢键形成p 转角和p 螺旋，成为有序构象 区域；2 ) 无规结构形成的无规构象区域。在弹性蛋白稳定结构的形成过程中， 结合水起着关键作用【2 1 】，与其他蛋白质相比，弹性蛋白的稳定结构更容易发生 变化。在松弛状态下，弹性蛋白偏向于无规的构象，大量的溶剂水( b ) 增加了水 合水( w ) 和弹性蛋白分子的相互作用力，增加了多肽链的活动性，因此，水溶胀 弹性蛋白处于高熵值状态，它的分子链具有高度的活动能力。当水溶胀的弹性蛋 白被拉伸时，卷曲的原弹性蛋白分子被打开，溶剂水从分子链孔隙中挤出，从而 导致结合水与弹性蛋白分子间的相互作用力大大降低，在这种状态下，多肽链被 强迫沿预定方向排列，分子链间的作用力加强，因此，就可能会形成p 转角和p - 螺旋，呈现有序构象。拉伸力使得弹性蛋白分子链由无序态变为有序态，伴随着 分子链的重排，体系的熵值也出现明显的下降。然而，当去掉外力后，由于原弹 性蛋白分子的折叠和弹性网络的再次膨胀，弹性无规结构又会出现。因此，弹性 蛋白特有的交联结构是其具有弹性性能的基础。 1 2 2 3 弹性蛋白的降解性能 弹性蛋白的代谢率( t u m o v e r ) 相当低，经放射性同位素测定，其半衰期约为 第一章绪论 7 0 年，而且这种纤维状蛋白分子对物理、化学、甚至某些酶的攻击有很强的耐 受和抵抗能力。在体内弹性蛋白只能被弹性蛋白酶降解1 22 | 。弹性蛋白酶是一种 内肽酶，能水解多种蛋白基质。弹性蛋白酶可以分成两类：金属离子蛋白水解酶 和丝氨酸蛋白水解酶。其中，除了巨噬细胞和成纤维细胞弹性蛋自酶是金属离子 蛋白水解酶外( 即需锌离子作为辅酶) ，其余的均为丝氨酸蛋白水解酶。中性粒细 胞中的弹性蛋白酶是体内最主要的丝氨酸蛋白水解酶，它的分子量为3 0 0 0 0 ，除 了对弹性蛋白有很强的降解能力外，还对胶原、粘蛋白和免疫球蛋白等有很强的 降解作用。在局部充血炎症时，中性粒细胞聚集，其溶酶体释放，造成周围组织 中的各种基质降解。在生理情况下，机体存在着在数量上占绝对优势的弹性蛋白 酶的天然抑制剂。对丝氨酸类型弹性蛋白酶的抑制剂主要是伍1 蛋白酶抑制剂和 a 2 巨球蛋白抑制剂；但对金属离子型弹性蛋白酶的抑制剂为组织金属内肽酶抑 制剂( t i s s u ei n h i b i t o r so f m e t a l l o p r o t a e s e ，t i m p ) 。弹性蛋白酶和弹性蛋白酶抑制 剂之问维持着一个动态平衡，只有在机体衰老或者遗传缺陷、长期紫外辐射、炎 症等病理情况下，抑制剂浓度下降或弹性蛋白酶活性升高，弹性蛋白与弹性蛋白 酶之间的动态平衡破坏，弹性蛋白才会被降解，造成相应组织器官的病理变化。 在体外，最常用的降解弹性蛋白的方法是用草酸和k o h 处删2 3 j 。有时弹性蛋白 也可以用胃蛋白酶溶于3 7 下的0 5m 醋酸中和8 0 下的盐酸中降解【24 | ，这些 方法都是基于不溶性弹性蛋白中的一些肽键的水解的。 1 2 3 弹性蛋白的作为生物材料的来源与制备 弹性蛋白可以以不同的形式用作生物材料，这包括脱细胞细胞外基质、不溶 性弹性蛋白、弹性蛋白的水解产物和重复的类弹性蛋白序列等等，重组的弹性蛋 白原或弹性蛋白原片段也可以被应用在生物材料中。 1 2 3 1 含弹性蛋白的脱细胞组织 脱细胞组织是指通过除去细胞但保持组织的三维构筑结构而提纯的组织碎 片。脱细胞结构保留了天然组织的结构，细胞的除去避免了免疫学响应。其应用 主要限于原组织上，例如，脱细胞膀胱用于膀胱的修补，脱细胞食道用于食道组 织工程以及脱细胞心脏瓣膜和脉管系统应用于心脏瓣膜的代替和血管的嫁接等 【2 5 】。然而有时也可以用作其它方面，例如脱细胞的牛心包膜用来增强骨修复。 脱细胞组织缺点是很难得到高纯度的产品，且存在批次间差异。含弹性蛋白的脱 细胞组织可以通过多种方法得到，这包括清洁剂( t r i t o n ，s d s ) 和酶消化( 例如 胰蛋白酶) 。通过t r i t o n 和胰蛋白酶来进行脱细胞处理也会改变细胞外基质的组成 第一章绪论 【2 6 1 ，由不同实验室得到的产物很难比较好坏，因为每一种制备方案将会得到独 特的一种细胞外基质组分。 1 2 3 2 纯弹性蛋白的制备 由于弹性蛋白中分子间的交联，它是高度不溶的，通常被用来从组织中分离 而制备。一般的，牛和马颈韧带是不溶性弹性蛋白的主要来源，因为弹性蛋白占 它们干重的很大百分比。w f d a a m e n 等分别用5 种方法【2 7 j 对马颈部韧带中的 弹性蛋白进行了分离和纯化( 图1 2 ) ，通过凝胶电泳，氨基酸分析，荧光免疫 检测法和透射电镜等分析认为，用萃取酶解方法与较早运用2 巯基乙醇和氰溴 化物的方法可以得到高纯度的，近乎没有微原纤维的弹性蛋白。 图1 2 纯弹性蛋白的制备 f i g 1 - 2t h ep r e p a r a t i o no fp u r ee l a s t i i l 另外r a s m u s s e n 等设计了一种通过1 2 0 高压灭菌5 h 来提纯弹性蛋白的方 法。j o h n 和1 1 1 0 m a s 在一个更加温和的条件下从大动脉和肺部组织中提取了弹 性蛋白通过n a c l ，盐酸胍，有机溶剂和胶原酶胰蛋白酶消化。弹性蛋白也能够 从其它组织如动脉、肺和皮肤得到。 1 2 3 3 弹性蛋白水解产物的制备 弹性蛋白水解产物( 也被称做可溶性弹性蛋白或弹性蛋白多肽) 也被应用在 生物材料中。最常用的制备可溶性弹性蛋白的方法是用0 2 5 m 草酸在10 0 【3 0 1 和 1 mk o h 在8 0 乙醇中在3 7 下处理。也可通过弹性蛋白分解酶对弹性纤维降 解，而得到可溶性的弹性蛋白。有时也可以用胃蛋白酶溶于3 7 下的0 5m 醋 第一章绪论 酸中和8 0 下的盐酸中得到1 2 4 1 。所有这些方法都是基于不溶性弹性蛋白中的一 些肽键的水解的。通过草酸水解得到的弹性蛋白多肽在悬浮于1 0 m m 醋酸钠 1 0 n l nn a c l 由醋酸调节p h 值5 5 ，然后加热在3 7 下离心得到能够凝聚而得到两 种片段：粘性的凝聚层a 弹性蛋白和上清液d 弹性蛋白。如果用k o h ，则将会形 成1 c 弹性蛋白，它是一种溶于水溶液的平均分子量大约为7 0k d a 弹性蛋白多肽的 非均相混合物。这些制备方法的最大的好处是他们的可溶性使得对这种材料的分 析和处理更加直接。加之，弹性蛋白多肽通过弹性蛋白受体来影响信息传输、化 学向性、增殖和蛋白酶的释放，包含可溶性弹性蛋白的生物材料可以在广范围的 细胞类型上发挥它的生物效应( 如增加弹性蛋白的合成) ，而且当他们能够长时 间来完成这种效应的时候是尤其有益的。 1 2 3 4 合成弹性蛋的制备 应用基因蛋白工程，可以制备多种参数被控制合成类弹性蛋白分子，这包括 氨基酸序列、肽链长度和嵌段共聚物中链段的长度和数量等。合成弹性蛋白其另 一优势是可以结合具有细胞生物效应的特定的序列，如a 唱g l y a s p ( r g d ) 序列 【”】。用这一方法能够得到特制的蛋白质，例如结合了两种蛋白质性质的蛋白。 与缩氨酸合成制备的分子相比重组表达系统能够制得具有高度均一性质的蛋白 质( 组分、序列、分子质量) 。而另一方面，应用缩氨酸合成则易于结合非天然 氨基酸，这些氨基酸在修饰和交联反应中是非常有意义的。 1 2 4 弹性蛋白在生物医用材料中的应用 弹性蛋白作为天然的生物材料，具有合成高分子材料无法比拟的生物相容 性、弹性和延展性，故而在生物医用材料领域中受到了广泛的重视和研究。 1 2 4 1 纯弹性蛋白材料 鉴于弹性蛋白的独特性质，d a nt s i m i o n e s c u 等l 卫，3 3 j 将猪的大动脉或者心脏 先经溴化氰( c n b r ) ( 5 0 m g m lc n b r 的7 0 的甲酸溶液) 常温搅拌处理l9 h 除掉 细胞及胶原蛋白等细胞外基质成分，升温至6 0 ，保温1 h 后再煮沸5 m i n 使c n b r 充分失活，最终得到弹性蛋白支架材料。扫描电镜照片显示：弹性蛋白支架材料 呈现有序的三维结构。细胞培养实验和生物毒性实验的结果表明：弹性蛋白支架 材料具有无毒、生物相容性良好的优点，并能有效的调节和重塑宿主( 成年兔颈 动脉) 细胞的增殖、分化。体外研究证实：弹性蛋白支架可实现完全内皮化，有 效防止血栓的形成。因此，弹性蛋白是制备脉管、血管类支架材料强有力的候选。 第一章绪论 k u r a n e 等 3 4 】应用d a nt s i m i o n e s c u 的方法制备了管状弹性蛋白支架，他们将含有 碱性成纤维细胞生长因子的琼脂糖凝胶填充到管状弹性蛋白支架中，并将该支架 植入到成年鼠的真皮囊中，经过2 8 天后观察发现含有生长因子的管状弹性蛋白 支架比不含生长因子的纤维原细胞的渗入显著增加了，免疫组织化学着色显示这 些细胞中一部分是活性纤维原细胞，并且在支架中观察到了微脉管系统，这充分 显示了弹性蛋白管状支架在血管嫁接上应用的可能性。 1 2 4 2 弹性蛋白复合材料 1 2 4 2 1 弹性蛋白一胶原材料 胶原蛋白弹性蛋白支架材料具有优良的拉伸强度和弹性强度，因而也是很 有价值的生物材料。b 0 1 a n de d 【3 5 】、l b u t t a f o c o 【3 6 】、w f d a a m e n 【3 7 j 等分别用电 纺( 图1 3 a ) 、冷冻干燥( 图1 3 b ) 、预先用d a nt s i m i o n e s c u 的方法制备弹性蛋白支 架再将胶原蛋白混合到弹性蛋白支架材料中，均得到了胶原蛋白弹性蛋白多孔 支架材料。与单纯的胶原蛋白和弹性蛋白支架材料相比较，这种混合两种细胞外 基质蛋白的支架材料具有更加优异的机械性能和弹性性能。同时，通过改变弹性 蛋白和胶原蛋白的比例来调节支架材料的性能，能获得满足血管、脉管、心脏血 管组织等不同性能要求的材料。在此基础上，s t i t z e l 等p 8 j 继续用电纺的方法得到 了i 型胶原、弹性蛋白和聚乳酸聚羟基乙酸共聚物( p l g a ) 支架，研究显示这 种支架提高了细胞外生物相容性，拥有类似于天然血管的组织成分和力学性能， 植入人体后不会引起局部或系统中毒，可降解。w f d a u a m e n 等p 刈继续用冷冻干 燥的方法得到了胶原蛋白弹性蛋白粘多糖多孔支架材料，将具有调节细胞外基 质水合作用和受体细胞识别能力的多糖引入到胶原蛋白弹性蛋白支架材料中， 使材料在物理和化学性能可调控的前提下，又获得生物学性能的可控性。 b u t t a f o c o 等 4 0 】用冷冻干燥法将i 型胶原和弹性蛋白按1 ：1 ( 质量比) 通过碳二 亚胺琥珀酰亚胺( e d c n h s ) 或碳二亚胺琥珀酰亚胺j 2 3 0 ( e d c n h s j 2 3 0 ) 交联 制各了多孔支架，支架具有9 0 的孔隙率和1 3 1 1 5 l p m 的平均孔尺寸。通过平滑 肌细胞( s m c ) 在波动流体中的支架上动态培养，研究弹性蛋白支架的各种性能， 结果显示：所有支架都能经受住循环机械应力而不开裂或发生永久变形。 e n 曲e r s - b u i i t e n h u i i s 等【4 1 用b u t t a f o c o 方法将i 型胶原和弹性蛋白( 1 ：1 ) ( 质量比) 悬 浮液在1 8 下冷冻干燥得到了内直径为3m m ，外直径为6m m ，长度为4c m 的多 孔管状支架，支架用碳二亚胺与琥珀酰亚胺( e d c n h s ) 或j 2 3 0 在e d c n h s 存在 条件下交联。s m c 同样在波动流体中的支架上动态培养，发现支架的平均壁剪 切率、收缩和舒张压和压力的波动与人的颈动脉血管相当。该条件下支架中培养 的s m c 与静态条件下的相比提高了组织构成：高s m c 数目、更加均匀的s m c 分 第一章绪论 布和高的胶原m r n a 表达水平。与静态下培养相比较支架材料的力学性能明显 的与体内环境更加匹配，细胞间的排列也更加紧密。 凰 电纺支架 ( b ) 冷冻干燥支架 圈1 3 胶原蛋白- 弹性蛋白支架的扫描电镜照片 f j gl 一3 s c a 舶i 玎ge i e a h 0 n m i 舯胛p h s 。f l h 。p 0 l l a g e n 卅t i l ls c a 肺( a ) s e m h 4 9 船o f 儿a g 酬e i a s 【ms 咖胁鹳o b 诅i n e db ye i e m s p i 衄i i l g 嘞s e m 肺雄o fc 0 】l a g e 毗1 a g 血 s 叽c t o b 值i r l e db y h od r y m g h 惦j i k 等用可吸收的胶原弹性蛋白真皮基质来修补真皮。他们在一系列平 均年龄4 3 岁，平均烧伤总面积为2 28 的病人中做了实验，在清理伤口后在伤处 植入基质后并立即进行皮肤移植，发现术后覆盖率9 7 与传统的皮肤移植相比 较，移植前几天的皮肤有点苍白，两周后没有区别，三个月后移植区域具有良好 的柔韧性( m e 粕v s s32 士1 2 ) ，手掌可以全方位的活动，没有水泡或不稳定的伤 疤出现。h a 传m 蛐等m 铡用猪真皮中得到的胶原、弹性蛋白构建了真皮基质膜。 将此膜移植入雄性d a 鼠的全层皮肤损伤面上，发现移植8 天后在膜的下层及边 缘出现毛细血管化，1 1 天后膜上层也有毛细血管出现3 周左右血管均匀地分布 在膜的全层，整个膜充分血管化；将d a 鼠上皮细胞在体外培养后接种于移植在 鼠创面6 1 2 天的胶原弹性蛋白膜上结果显示6 天后2 9 的膜上皮化，形成多层 化、部分分化的表皮细胞，同时可以观察到淋巴等细胞，并有不完整的基底膜形 成：l o 天左右，4 7 的膜上皮化形成了具有锚定纤维的基底膜成分。 1 工4 2 0 其它弹性蛋白复台材料 弹性蛋白不仅可以与胶原蛋白组成混合材料，近年来t 国内外不同的学者纷 纷利用电纺、冷冻干燥等技术将弹性蛋白与其它材料复合建构成为新型组织工程 支架材料。s c i l 等【“嫌用电纺技术制各了弹性蛋白一聚二恶烷酮( p o j y d i o x a n o n e ， p d 0 ) 支架，支架中p d o 增强了材料力学性能，弹性蛋白提高了弹性和生物相容 性使得其机械性能与天然动脉组织更加相近且有益于组织重建。m e 嘧r a n “ 第一章绪论 等【4 5 】将一定量的聚( 丙交酯一乙交酯) 、明胶、弹性蛋白混合，采用电纺的技术制 备出同时具备天然材料、合成材料优点的组织工程支架材料，其优异的性能使其 有望在软组织工程领域- 血管、心脏、肺部组织中获得广泛应用。t h o m a sc h a n d y 等f 4 6 】采用冷冻干燥的方法将海藻酸钠、弹性蛋白、聚乙二醇混合制得多孔复合 基体材料。这种基体材料的分级结构有利于受损伤的心肌细胞的修复。 m i c h i o 【4 7 】等用与小肠粘膜下层结合的弹性蛋白和氰基丙烯酸盐粘合剂用于 修补十二指肠的损伤，他们选取2 4 头猪进行实验，结果2 5 个月后2 2 头猪( 2 2 2 4 ， 9 1 7 ) 的十二指肠得到了完整的修复，其中1 头由于技术问题修补3 天后失败，l 头由于腹部脓肿2 0 天后失败。证实这种弹性蛋白补丁材料能够提供一个可靠的屏 障来修复十二指肠的损伤，氰基丙烯酸盐粘合剂使补丁快速紧密的组织融合。 h i n d s 等【4 8 】用脱细胞小肠黏膜下层( a s i s ) 与弹性蛋白结合增强了弹性蛋白支架， a s i s 的加入使弹性蛋白血管的力学性能有了综合性的提高。在活性培植中，此种 材料具有适当的机械性能和低的凝血酶原，而且具有细胞增殖和主动综合重建一 个适当的弹性动脉的潜力。 1 2 4 3 弹性蛋白水解产物材料 将不溶性的弹性蛋白用8 0 乙醇和1 mn a o h 处理得到k e l a s t i n ，用草酸处理 得到0 【e l a s t i n 。k e l a s t i n 和q e l a s t i n 是弹性蛋白的可溶形式，尽管与弹性蛋白本身 的结构不同，但其仍然保持了一些主要的物理化学性能，如可以凝聚到原纤维上、 调节动脉平滑肌细胞的迁移和增殖速率等1 4 9 1 。因此，与弹性蛋白相比，可溶性 的弹性蛋白则获得了较大的发展。 1 2 4 3 1a e l a s t i n 基材料。 鉴于弹性蛋白高度不溶、难以加工的缺点，j e n n i eb l e a c h 【5 0 】等利用水溶性 的a e l a s t i n 和环氧交联剂合成了可加工的弹性蛋白基材料，并通过改变溶液p h ， 有效地调节产物的交联度。实验结果证明：这种材料的溶胀率为1 0 2 5 ，解率 为1 0 2 5 1 1 ( o 1 u m 1 ) ，弹性模量为4 1 2 0 k p a 。在不同的实验条件下，产物的性 能也不同。其中，碱性和中性体系与酸性体系下相比较，得到的弹性蛋白基材料 具有高交联度，弹性模量高达1 2 0l ( p a ，但降解率和溶胀率( 】0 ) 却较低。进一 步的细胞培养实验证明，交联a e l a s t i n 材料能够支持血管平滑肌细胞的黏附、增 殖分化。这种可以“加工 的弹性蛋白基生物材料的合成为现有的组织工程中改 善材料的性能和多功能化能供了依据。 与j e n n i eb l e a c h 不同，m e n g y a nl i 等i 5 1j 贝0 将胶原蛋白、明胶、可溶的q e l a s t i n 用电纺的方法做成组织工程支架。与迄今为止报道的电纺聚合物的结构不同的 是，这种蛋白质支架材料随着溶液给料速率的增加，呈现出伪弹性波动型形态， 第一章绪论 细胞培养实验结果显示：此支架材料能够支持人体胚胎腭突间充质细胞的黏附和 增殖。 1 2 4 3 2k - e l a s t i n 基材料 众所周知，在有缺陷或者受损伤的软骨组织中植入独立的软骨细胞有利于这 些组织的修复，而现在组织工程学的发展也允许我们再生、构造大量的软骨组织， 例如外耳的外科整容手术。t r i s 伽1d ec h a l a i n 等【5 2 】将猪耳的弹性软骨细胞植入到 用海藻酸钠、i 型胶原蛋白、1 c e l a s t i n 制备出的可加工成型的凝胶中。培养1 2 周 后发现：新生的软骨细胞与本身组织的耳部软骨细胞在重量、微观结构、超分子 结构上都及其相像。免疫组织化学和电镜照片均显示新生的软骨细胞包含弹性软 骨组织的主要成分，如i i 型胶原蛋白、蛋白多糖和规整的弹性纤维。d u t o y a 等【5 j j 利用弹性蛋白可溶蛋白( e s p ) 能够与特定聚合物如弹性蛋白或涤纶( p e t ) 等 紧密结合的性质【5 4 ，将e l a s t i n e s p 复合体涂到p e t 表面，提高了聚合物容纳有机 基质的能力，涂层的厚度达3 m 。同时，内皮细胞培养显示1 0 0 p g c m 2e s p 浓度 时能够很好的促进细胞的生长。s a n g a l l i 等1 5 5 】弹性蛋白纤维生物降解材料 n e u r o p l a s t 制作了硬脑膜，该人工膜既能够紧紧绑定到损伤脑膜的边缘，移植3 个月后他们发现该材料完全降解被正常的结缔组织取代，不产生炎性反应，而且 应用于临床反应良好，但其远期的效果还需要长期的追踪和检验。 可溶性的弹性蛋白多肽( a e l a s t i na n dk e l a s t i n ) 也可成功的应用在合成基质材 料上，如l e f e b v r ef 等【5 6 】用弹性蛋白多肽纤维材料来合成出基质材料作为支架修 复来兔腹部动脉的裂口；b o n z o nn 等【5 7 】通过胶原和弹性蛋白多肽一纤维材料所制 备出的材料被应用在修复鼓膜上。因为弹性蛋白能够减少的血小板吸收和聚集， o o y a m at 等例和i t os h 等【5 9 1 分别将弹性蛋白多肽涂在其合成的人工血管上用来 抑制内膜增生和促进接枝材料的内皮化。 1 2 4 4 基因工程类弹性蛋白材料 类弹性蛋白高聚物( e l p s ) 主要用作融合蛋白以及被用来重组细胞外基质等。 融合蛋白是将两个或多个基因的编码区首尾连接，由同一调控序列控制构成的基 因表达产物。e l p s 是基于肽链重组的生物高聚物，它包含富含甘氨酸、缬氨酸、 脯氨酸和丙氨酸的重复序列。g a o 等【6 0 j 通过用p r o a ，p r o g 或p r o l 来创造功能e l p s 融合物来使抗体固定到疏水的表面上从而得到一个制作抗体阵列的普遍的平台。 抗体在构建时首先与融合蛋白区域内的p r o a ，p r o g 或p r o l 形成共轭结构，然后通 过e l p s 区域和疏水表面的由温度激起的疏水相互作用使共轭体的固化，这种方 法提供了在没有共价修饰受体的情况下把抗体固定到一个功能活性方向上的一 个普遍的平台。k o b a t a k e 等1 6 l j 以个刚性的e l p 单元和一个生物活性肽单元的结 第一章绪论 合为基础设计白合成了极高热稳定性生物活性蛋质。c h o w 等1 6 2 】在蛋白质表达过 程中它们通过监督细胞生长和大肠杆菌表达一个用绿荧光蛋白质标记的e l p 的 蛋白质时的表达动力学测试了培养状况和单个介质组分对蛋白质产率的影响，得 到了一种有用的提高其他蛋白质融合蛋白和重复多肽的产率的方法。 k u r i h a r a 等1 6 3 j 用重复性的弹性蛋白和类胶原功能基元重组了细胞外类基质 蛋白质。他们应用重叠延长p c r 技术，创造了重复性的基因库编码：弹性蛋白 v p g v g 和类胶原g e r g d r g d p 序列。从这些库编码中它们分离出了两种重复性 的d n a 序列c 0 1 5 和e l a 一16 其编码分别为 ( g e r g d r g d p ) 5 g e r 】和 【( v p g v g ) 1 6 v p g 】，这两种蛋白都被作为硫氧还蛋白融合蛋白表达出来。结果制 得的重组的细胞外类基质蛋白质拥有预期的功能性质( 细胞附着能力和热响应结 构变化) 。 合成类弹性蛋白多肽( e l p s ) 具有精确的分子量和低分散性而且降解可控 等特点，可用做药物控释材料。c h i l k o t i 等【删设计了一种e l p 使其t 。在人的体温与 4 2 之间，他们在鼠皮下植入人体肿瘤，当肿瘤处被加热到4 2 时热响应e l p 在 肿瘤处聚集的程度是其他未加热肿瘤处的两倍，从而可以提高渗透性和药物保持 力。h e r r e r o v a r r e l l 掣6 5 j 合成了微米级的v p a v g 重复序列聚集体，这种聚集体在 加热和冷却的时候表现出明显的1 2 8 的滞后现象。他们将地塞米松放入e l p 微 粒中，药物的介入影响了t l ，但聚集体的构成并没有被影响，这种聚集是不可逆 的它们在t 。以下将会保持其完整性，减少了在药物注射和释放时对温度的精确控 制。 此外，t i r r e l l 等1 6 6 j 使用高疏水性的弹性蛋白拟肽构成微阵列表面的固定域， 弹性蛋白拟肽利用一个光反应氨基酸与表面发生共价结合能紧紧地附着在疏水 的表面，而目标蛋白质与亮氨酸拉链螺旋的融合以及螺旋间强大的非共价连接形 成的二聚作用实现了对目标蛋白质的有效固定。这种方法中弹性蛋白拟肽能实现 将蛋白质更为有效更为灵活地固定在芯片上，以便于研究人员更好的从事蛋白质 功能的研究。 1 2 5 弹性蛋白材料的发展前景 弹性蛋白作为一种具有良好弹性和生物相容性的天然材料已引起了广泛的 关注和研究并在生物医用材料中已显示其出其优势，其应用范围涉及组织工程中 的人工血管、软骨、皮肤、心脏瓣膜、神经等等领域，而且在药物控释等领域也 有良好的应用前景，我们有理由相信在不久的将来，弹性蛋白将成为生物医用材 料中非常重要的一类材料。 第一章绪论 1 3 层层自组装技术 层层自组装技术的研究可追溯到2 0 世