（材料学专业论文）新型no电化学传感器的制备及其性能研究.pdf

童 覆l ，t 肇硬士掌位论文 新型n o 电化学传感嚣的制各及其性能研究 摘要 自上世纪八十年代后期，人们已知道n o 在生命生理过程中发挥着非常重要 作用，为了研究它在生理及病理学方面的功能，近年来对n o 分析检测方法已开 展了大量研究。在这些方法中，电化学分析法由于它可实现在位即使检测，已成 为所有n o 检测方法中最具有发展前途的一种分析方法。 本文在总结前人研究的基础上，开展了将镍( i i ) 四磺酸基酞菁( n i t s p c ) 、 n a t i o n o 及纳米s o d a l i t c 沸石分子筛对玻碳电极( g c e ) 进行修饰改性制备新型 高灵敏度、高选择性n o 传感器的研究，并对三种不同的n i t s p c 修饰膜制备方 法：电沉积法、滴液法、浸蘸法进行了比较，结果表明，使用电沉积法将n i t s p c 组装到电极表面获得的传感器性能最佳，滴液法和浸蘸法等其他组装方法获得的 性能相对较差。n i t s p c 对n o 在电极表面的氧化行为具有催化作用，氧化电势 为0 7 2v ，同时n i t s p c 修饰膜也能显著提高电极对n o 的灵敏度( 由7 7n a p m 上升到3 9 0n a # m ) 。n a t i o n 对n o r 具有阻挡作用，它能在保持灵敏度的条件下， 使电极对抗n o r 干扰的能力提高5 0 ，但它对抗坏血酸、多巴胺、肾上腺素基 本不具抵抗能力。 由层叠式( l a y e r - b y l a y e r ) 组装方法修饰到g c e n i t s p c n a f i o n o 电极表面 的纳米s o c i a l i t e 分子筛修饰膜不仅可提高电极对n o 的灵敏度，而且还可提高电 极抵抗各种干扰的能力，由它制备的传感器 g c e n i t s p c n a f i o n o ( p d d a z e o l i t e ) 5 其检测n o 的灵敏度由2 5 7 n a u m 升至了 2 9 1n a 1 m ，对抗坏血酸( a a ) 、多巴胺( d o p a m i n e ) 、肾上腺素( e p i n e p h r i n e ) 及k n 0 2 的响应分别降低了8 2 3 ，5 0 8 ，4 6 6 和1 6 5 。这种高灵敏度、高 选择性的n o 传感器可望用于n o 在位实时检测。 关键词：电化学分析，一氧化氮传感器，玻碳电极( g c e ) ，镍酞菁( n i t s p c ) ， 纳米s o d a l i t e 沸石分子筛，n a t i o n k 中图分类号：t p 2 1 2 3 覆! ，t 擎硪士掌位论文 新型n o 电化学传感器的制各及其性能研究 a b s t r a c t n i t r i co x i d e 0 ) p l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei nt h er e g u l a t i o no fp h y s i o l o g i c a la n d p a t h o p h y s i o l o g i c a lm e c h a n i s m si nm a m m a l s , a n dq u i t cal o to fi n v e s t i g a t i o n sh a v e b e e nf o c u s e do nt h em e a s u r e m e n t so ft h i sk i n do fs p e c i a lm o l e c u l et oa i d u n d e r s t a n d i n gi t sc r u c i a lr o l e o fa l lt h ee x i s t i n gm e t h o d s ，e l e c t r o c h e m i c a lt e c h n i q u e s h a v e b e e nb e c o m i n gt h em o s tp r o m i s i n go n ew h i c hc a np r o v i d ei nv i v oa n dr e a lt i m e d e t e c t i o n i ti sd i f f i c u l tt oa c h i e v er e l i a b l ei nv i v on om e a s u r e m e n t sw i t ht h ee x i s t i n g a n a l y t i c a lm e t h o d s i nt h i sp a p e r , w eh a v ed e v e l o p e dan o v e le l e c t r o c h e m i c a ls e n s o ro fg l a s s yc a r b o n e l e c t r o d ew i t hh i g hs e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t y , m o d i f i e db yn i c k e lt e t r a s u l f o n a t e d p h t h a l o c y a n i n e ( n i t s p c ) , n a t i o n 。a n dn a n o s i z e ds o d a l i mz e o l i t e t h en i t s p c m e m b e r a n ee l e c t r e d e p o s i t e do ng c es u r f a c ee x h i b i t st h eb e s te l e c t r o c a t a l y t i ea c t i v i t y a n ds e n s i t i v i t yt ot h en oo x i d i z n gp r o c e a s , a tt h ep o t e n t i a lo f0 7 2vw i t ht h e s e n s i t i v i t yu pt o3 9 0n a m ，c o m p a r e dw i t hd i p m o d i f i e do rd r o p m o d i f i e dm e t h o d s n a t i o nm e m b r a n ep r o v i d e sg o o dr e s i s h a n c ea g a i n s tn o ib u tp o o ra g a i n s to t h e r b i o l o g i c a ls p e c i e s t h en os e n s o ro fg c e d n i t s p c n a f i o n ( p d d a z e o l i t e ) 5w a sa c h i e v e db a s e d o nt h em o d i f i c a t i o no fn 订s p ca n dn a n o s i z c dm o l e c u l a rs i e v e s o d a l i r ez e o l i t ew h i c h w a sa s s e m b l e d b yl a y - b y - l a y e rt e c h n i q u e t h i sn o v e ls e n s o r e x h i b i t s h i g h e r s e n s i t i v i t yo f2 9 1n a p mf o rn od e t e c t i o n , a n db e t t e rs e l e c t i v i t ya st h em e m b r a n eo f m o l e c u l a rs i e v ep r o v i d e sn o to n l yt h ec a t a l y t i cf u n c t i o nb u ta l s ot h es e l e c t i v i t ya g a i n s t n i t r i t e ，a s c o r b i ca c i d ，d o p a m i n e ，e p i n e p h r i n e f e wr e p o r t sh a v er e f e r r e dt ou t i l i z i n g s o d a l i t ez e o l i t ei nn od e t e r m i n a t i o n t h i sn o v e le l e c t r o c h e m i c a ln os e l l s o rw c p r e p a r e dp r o v i d e sa l li n s p i r i n ga p p r o a c hf o rn o r e a l - t i m ea n di nv i v om e a s u r e m e n t k e yw o r d s ：e l e c t r o c h e m i c a lt e c h n i q u e ，n i t r i co x i d e 0 ) 驼n r ，g l a s s yc a r b o n d e c t m d e , n i c k e lt e t r a s u l f o n a t e dp h t h a l o c y a n i n e , n a n o s i z e dm o l e c u l a rs i e v e ，s o d a l i t e z e o l i t e ，n a t i o n 中图分类号：t p 2 1 2 3 _ 棋! j t 肇礓_ 士掌位论文 新型n o 电化学传j 骞器的制备及其性能研究 1 1 简介 前言 一氧化氮( n o ) 是目前生命科学领域研究的热点之一，1 9 9 2 年n o 被 s c i e n c e 杂志评为年度“明星分子”f l 】，1 9 9 8 年美国纽约州立大学的f u r c h g o t t ， 德克萨斯大学医学院的m u r a d 和加州大学洛杉矶分校的i g n a r r o 因发现n o 在心 血管体系中的重要作用而获得诺贝尔生理学奖和医学奖【2 l 。经过长期不懈研究， 人们逐渐发现n o 在生理过程的许多方面起着非常广泛和重要的作用，从药物、 生理到生化，n o 与大量生理过程和病理密切相关，许多国家投入了大量的人力 物力研究n o 的生理作用。 1 i i 一氧化氮研究历史 对n o 的研究很早就已开始，硝酸甘油可以有效地缓解心绞痛，但它的作用机 理困扰了医学家、药理学家百余年，直到2 0 世纪8 0 年代才因为f u r c h g o t t ，i g n a r r o 及m u r a d 这三位美国药理学家的出色工作而得以解决。1 9 7 7 年，f e t i dm u r a d 发 现硝酸甘油等有机硝酸酯必须代谢为一氧化氮后才能发挥扩张血管的药理作用， 由此他认为一氧化氮可能是一种对血流具有调节作用的信使分子，但当时这一 推测缺乏直接的实验证据。到1 9 8 0 年，纽约州立大学的药理学家f u r c h g o t t 在进行 药物对血管作用的研究中发现，内皮细胞可产生一种信使分子，这种分子可引起 血管平滑肌细胞的舒张，从而使血管舒张【3 j ，他称这种信使分子为内皮衍生舒张 因子( e n d o t h e l i u m d e r i v e dr c l a x m gf a c t o r , e d r f ) 。这一发现引起了人们对该因子 进行鉴定的兴趣。i g n a r r o 教授与f u r c h g o t t 教授在1 9 8 6 年作出了大胆的推测： e d r f 是一氧化氮或与一氧化氮密切相关的某种( 某类) 化合物n o1 4 1 。1 9 8 7 年，英 国科学家p a l m e r 研究小组和i g n a r r o 各自实验证实了这一理论1 5 。他们的观点引 发了世界上科学家进行相关研究的热潮。这是人类首次发现一种气体小分子在生 物体中发挥信使作用。此后，一氧化氮在生物体内的生理及病理作用引起了广泛 的关注和进一步的深入研究。 近年来，对n o 的研究主要集中在医学、药理学、毒理学、生物化学等领域。 每年发表的文献数以万计( 见图1 1 ) ，其中专门研究n o 检测的文献约占1 0 。 覆l 上茅硬掌位惦支新型n o 电化学传感器的制各及其性能研究 赫 r “ i i ： l ； r 图i 1 近年来有关n o 研究的文献数量，由美国化学文摘检索 f i g i 1t h er e p o r t e dp a p e r so nn o a r c ks e a r c h e di nc a 1 1 2 一氧化氮实时( r e a lt i m e ) 原位( i nv i v o i ns l t u ) 检测的意义 n o 在生理、药理、病理和临床等方面的都发挥着极其重要的作用，因此准 确地分析n o 在生物体系中的浓度变化，就成为进一步揭示n o 功能的必要手段。 但是准确测定生物体系中n o 含量是非常困难的，简要概述如下： ( 1 ) n o 半衰期很短，只有2 6 秒川，这意味着n o 在有机体中的稳定状态浓 度很低，据报道浓度在纳摩尔( n m ) 级别，这使得很难精确监测体内的n o 浓度。 到目前为止还没有一种成熟而完美的检测方法研发出来。而为了研究n o 在有机 体中的不同功能，必须得至l j n o 浓度变化的准确动态数据。 ( 2 ) n o 是一种小分子活性自由基，很容易受到其他物质分子的影响，提高 或湮灭n o 的功能。( a ) 氢氧自由基( o h ) 和过氧根阴离子( 0 2 一) 嗣。这两种 自由基在有机体中大量存在，很容易跟n o 反应生成其它活性化合物。( b ) 一些 氧化物如0 2 、h 2 0 2 ，及抗氧化物如抗坏血酸，半胱氨酸、n a d p h 、n a d h 和谷 胱甘肽等。( c ) 一些蛋白质或酶如过氧歧化酶( s o d ) 、血红蛋白等。( d ) 一些 金属离子如f c 2 + 、f c 3 + 、o p 和c a 2 + 等。 ( 3 ) 作为二级信使分子，n o 会受到其他神经递质的干扰1 9 1 ，如乙酰胆碱 ( a c e t y l c h o l i n e ) ，多巴胺( d o p a m i n e ) 等，因此就较难区分n o 和其他物质各自 的功能贡献。 n o 在生物体系中扮演着重要角色，人们已经获得了广泛的认识和重大的进 展，但同时也应注意到在该领域我们的认识及研究工作还远远不够，因此开发出 一种可靠的n o 检测方法仍然是一项紧迫而严峻的任务，许多综述已经总结了已 有的n o 体内，体外实时分析技术，提出了有意义的展望i 悱1 3 1 。 1 1 3 一氧化氮基本性质 研究探讨n o 的性质功能可以为开发n o 检测技术提供非常有价值的信息。 摸! 上擎壤学位论文 新型n o 电化学传感器的制各及其性能研究 n o 是无色气体，固液态呈淡蓝色。常温常压下水溶液中饱和浓度约为 2 m m l l 4 1 。据报道n o 在生物体中单向扩散速率为5 0 m m s 。n o 溶解性和传输性 能与氧分子类似。n o 分子在n p 反健轨道上带有未成对电子而具有顺磁性，是 一种能稳定存在的自由基。其共振结构式可表示为： + 一 一 + n 0 i 呻n = o 呻n 2o 呻n 兰o n o 活性较高，可以快速与氧分子、过氧化物和氧自由基等迅速反应，与其 他一些生物体分子反应相对略慢。由于n o 在体内半衰期不到十秒，因此检测方 法必须具备较短的响应时间【阍。 在水溶液中n o 与氧气的反应是三级反应，速率常数在p h = i - 1 3 内保持稳 定，可由下式表述： n o - i - 1 2 0 2 专n 0 2 2 n 0 2 = n 2 0 4 n 2 0 4 + h 2 0 = n o z + n 0 3 - + 2 i - g n o4 - n 0 2 = n 2 0 3 n 2 0 3 + h 2 0 - - ) 2 n o z - 4 - 2 i 一 但当体系中存在生物类分子时，如亚铁血红蛋白、半胱氨酸、抗坏血酸、多 巴胺和芳香胺等，n o 与生物类分子的化学反应速率常数是其水解为亚硝酸根离 子速率常数的1 0 0 0 倍以上【埘。 1 2n o 检测技术发展综述 鉴于n o 在生物体内存在特性，n o 的快速准确检测依然是n o 研究领域的 难题，并且在数以万计有关n o 生物合成和机理研究文献中，只有很少的文献涉 及n o 检测。常规的n o 检测技术一般是在体外( e xs i t u ，i nv i t r o ) 环境基于反 应二级产物或n o 络合物的测定，并且往往无法排除严重的干扰化学发光，如紫 外可见光谱法，荧光法，电子顺次共振( e p r ) 等。后来发展出来的检测技术实 现了实时和体内直接检测，如电化学法等。每种方法都由其自身的优点或缺陷， 应用范围受到一定的限制，检测方法的选择一般依赖于实验条件研究的需要。 对于开发制备生物传感器，其难点在于获得优良的性能而足以把被检测物的 发生信号与其他神经递质等干扰物信号区别开来。传感器的性能评估一般从灵敏 度，检测限( i d d ) ，选择性，稳定性，响应时间等方面加以考察。但众多优异 性能往往不能兼顾，例如选择性渗透膜可以提升传感器的抗干扰性能即选择性， 但同时却会延长响应时间。特定的修饰材料可以在一定条件下提高传感器的灵敏 度，但当其厚度过大时，又会降低传感器的灵敏度。 皤 握! 上乎；曩士掌t 馋文新型n o 电化学传感器的制备及其性能研究 ( 1 ) 化学发光法( c h e m i l u m i n e s c e n c e ) 化学发光法被认为是被认为是测定n o 的最有效方法，因为该方法灵敏度极 高，并且能够实时检测。该反应一般是气态检测，故称为气相化学发光法。经典 的测定n o 的化学发光法1 9 v o 年首次应用于环境中n o 监测1 1 6 1 ，是根据n o 与臭氧 ( t h ) 反应生成激发态二氧化氮( n 0 2 ) ，n o z 在返回基态的过程中释放能量而 发光。 n o + 0 3 - 9 n o z ( e x c i t e d s t a t o + 0 2 n 0 2 + 专n o z ( g r o u n ds t a t e ) + h v ( - 6 0 0 n m ) 激发出的光子由红光敏感光电倍增管检测，光电倍增管带有滤光镜滤除 6 0 0 r i m 以下的光波。检测时n o 和臭氧需在低压下混合注入反应室，低压是为了 防止激发态n 0 2 被钝化。由于在混合气体注入反应室之前，其它干扰类自由基会 被分解，故该技术可以排除被检测物中n 0 2 的干扰信号，n 0 2 是n o 气体中最主要 的干扰物质。 此方法灵敏度较高，快速准确，据报道检出限可达0 1 m m 。该法一般应用于 研究肺炎或其他疾病时检测呼出气体中n o 含量【1 7 1 但此方法的缺点是：n o 与0 3 的反应必须在气态进行，溶液中的一氧化氮必须用惰性气体将其吹析出来，然后 将混合气体注入反应室【堋。所以该法不适合n o 动力学研究的实时检测，并且操 作复杂，且该反应还存在易受氨气、硫化氢，烯类、二甲亚砜( d m s 0 ) 等的干扰， 以及反应条件不容易控制等。 后来对氧化剂进行改进，用过氧化氢代替臭氧，即鲁米诺( l u m i n 0 1 ) 法， 主要d q k i k u c m 及其合作者在1 9 9 0 s 开发研究【1 9 1 而出，他们用这种方法检测小自鼠 肝脏中的n o 。n o 可被h 2 0 2 氧化生成o n 0 0 ，这是比h 2 0 2 更强的氧化剂，可使 鲁米诺氧化并在溶液中发出很强的光。因为只有n o 可以激发这一光化学反应， 而n o r 和n 0 3 则不能，所以该方法是可对溶液中的n o 进行实时测定且检测灵敏 度最高的方法，其检出限可达1 0 1 3m i 刎 ( 2 ) 比色法( c o l o r i m c t r y ) 该法是通过检测n o 在生物体内代谢物n o r 和n 0 3 。的浓度而间接得到n o 的浓度最普遍的方法是使用格氏( g f i c s s ) 试剂，g d e s s s 试剂是对氨基苯磺酰 胺和n - ( 1 萘) 乙二胺，测定方法是稀磷酸介质中，n o r 与对氨基苯磺酰胺反应生 成重氮盐，再与n - 0 萘) - l - - 胺偶联成红色染料，该反应生成的重氮化合物的浓 度与n c h 浓度具有线性关系。然后在九。= 5 4 3 n m 进行定量测定。该方法其操 作简便，是测定生物样品中n o 的代谢产物亚硝酸盐常用方法，一般用于环境 和食品中n o r 的测定，不适合实体检测。如l a u m 2 1 l 等人用g r i e s s 试剂法检测 血浆和牛奶中的n 0 2 和n 0 3 。分光光度法使用常见的紫外可见光谱仪，测试步 摸! 土肇稚掌位诗走 新塑n o 电化学传感器的制各及其性能研究 骤规范统一，检出限为t m 水平，线性区间为1 5 0 口m 。但该方法可能因为n o 不充分氧化或者成为气相挥发以及由非l 鲫跏o s 代谢路径产生的n 0 2 n 0 3 而影 响测定结果的准确度。 另外还有许多其它分光光度法，如基于n o 与氧合血红蛋白( h b 0 2 ) 的反 应生。还原型的亚铁氧合血红蛋白【h b ( 】f c 2 + ) 0 2 1 可被n o 快速氧化为高铁血红蛋 白，高铁血红蛋白的s o r e t 吸收峰位置从4 3 3n m 迁移到4 0 6n m ，利用时间分辨 双光束仪，可测出n o 的含量。这种方法可以避免样品酸度和高铁血红蛋白稳定 性的影响。k o s t i c 等人1 2 2 1 用这种方法证明由于n o 产量的增加，局部心肌缺血运 动力增强。有人吲也用此方法证明了在小白鼠的心脏中因注入了亚硝基血管扩张 剂，可使血液中h b n o 的含量增加。 ( 3 ) 荧光法( f l u o r i m e t r y ) 2 ，3 氨基萘( 2 ，3 - d i a m i n o n a p h t h a l e n e , d a n ) 是早期常用的指示剂 2 4 1 ，测 定n o 的原理是n 0 2 在酸性条件下与d a n 发生反应，生成2 ，3 【h 】1 ，萘三唑( n a t ) ，d a n 本身可激发的荧光信号较弱，而n a t ( x e x l e m = 3 7 5 4 1 5r i m ) 在碱性条 件下( o h l o ) 具有很高的荧光效率，荧光量子产率比d a n 高，该法灵敏度高( 较 g r i e s s 法高5 m 1 0 0 倍) ，检出限可达5 0 r i m 。另外，在酸性条件下n 0 2 也能与d a n 反 应，生成n a t ，反应机理与n o 的反应机理相同。w a d a 等使用液相色谱与荧光 检测法联用，p a d a n 为荧光指示剂来测定细胞释放出的n o 浓度瞄】。 该方法的主要缺点在于d a n 试剂预备复杂耗时，以及低p h 值时易受亚硝酸 盐的影响。 ( 4 ) 电子自旋共振( e l e c t r o ns p i nr e s o n a n c e ，e s r ) n o 是一种气体自由基，具有未成对电子，是顺磁性物质，所以理论上n o 可 以直接用e p r 法测定，但是由于n o 的单电子弛豫时间太短，不易检测，必须与 另外一种化合物相结合，产生一个比较稳定的配合物才能用e p r 检测到n o 。 亚铁血红蛋白( 1 i b ) 与n o 作用生成亚硝酰血红蛋白( i b n o ) 和高铁血红 蛋白( m e t h b ) ，在温度7 7k 下h b n o 光谱具有特征三线态结构，而在其他的亚硝 基化合物存在下i i b 并没有这种超细结构1 2 6 1 。g e n b e r g 等人网用e p r 技术研究了 e d r f 雕j 活性和n o 在大腿骨动脉中的含量，检出限为l n m 。w e n n m a l m 等人闭 用这种技术测定了人体臂n nq b n 0 2 的含量，先用连二硫酸盐把n 0 2 还原成n o 再利用e p r 技术测定测定范围为0 0 6m m 。 另一种n o 自旋捕获剂是二硫代氨基甲酸盐，该物质本身不能与n o 直接作 用。它们首先与f e 2 + 形成二元配合物( 如i r o nd i t m o c a r b a m a t e ) 。二元配合物再与 n o 形成三元配合物，由于n o 具有未成对电子，所以这种三元配合物也可用 e p r 技术检测。y o s h i m u r a 等 2 9 1 报道t n n 二乙基二硫代氨基甲酸盐( d e t c ) 、 棋l 上肇_ 掌位论文 新型n o 电化学传感器的制各及其性能研究 n 甲基d 葡糖胺氨基甲酸盐( m g d ) 和n - 一- - 硫代羧酸肌氨酸( r y r c s ) 等。它们与 f 色“的二元配合物( i c d e t c 、f e m g d 、f e - d t c s ) 再与n o 形成多元异配位的 配合物( n o f e d e t c 、n o f e - mg d 、n o f e d t c s ，) 水溶性好且很稳定。作为 e p r 时间分辨探针检测生物活体中n o 的含量，并用e p r 二维照相技术来研究 小白鼠心脏中n o 的产生，取得良好效果。n o f e d t c s 的e p r 光谱的信噪比( 大 于l o ) 比其它配合物好但n o f e m g d 和n o - f e - d e t c 的光谱信号的振幅比 n o f e d t c s 小。综合来看n o f e d t c s 具有最好的水溶性，故应用于生物活体中 n o 的检测时，结果良好。 k h r a m t s v 3 0 1 研究小组合成出一系列氮氧自由基类( n i t r o n y ln i t r o x y lr a d i c a l ， n n r ) ，它们与n o 反应生成稳定的亚氨基硝基氧化物( 1 m i n on i t r o x i d e ，i n o ) ， 然后用e p r 技术检删。他们合成的这一系列试剂与n o 的反应较快，是n o 的一种 高效的捕获剂。他们把这类试剂应用于测定小鼠的小脑中n o 合酶产生n o 的含 量，同时也证明了实时检测生物样品中n o 的可能性。但n n r 和i n o 在生物体内很 快被还原，为了克服这个缺点他们用硫甘油作为还原剂，硫甘油比其它的还原剂 如硝圣基- t e mp o 高。其他还已开发出多种n o 捕获剂，如环状化合物等在此不 作详述。 e p r 技术灵敏度较高速度较快，据报道已用于实时检测，但该方法缺点在于 难以制备高效的n o 捕获剂，操作复杂昂贵，而且易受多种氧化物的干扰。 ( 5 ) 电化学方法 尽管有各种测定n o 的方法，如化学发光法、分光光度法、荧光法等，但是 这些方法都只能间隔性的测量n o 的释放量或n o 产物中的酶含量，并需做样品的 化学预处理，所需仪器设备复杂昂贵，甚至在很多n o 机理研究中无法使用。但 是电化学方法可以实时原位连续测定n o 浓度，而不是测定整个时间n o 的积累 量，误差小，测定结果准确。现已有不少文献报道用电化学方法测定生物体中 n o 的含量。 电化学方法制备的n o 生物传感器被认为是最具实用价值，最有应用前景的 n o 检测技术。在下一小节将作详细介绍 ( 6 ) 商品化的n o 微传感器 已有部分n o 传感器商品化，这类传感器一般是微探针型传感器( 直径可小 至加1 ) ，也是以电化学为检测机理，向简单易用可重复性方向发展。根据s h i b u k i 和t s u k a h a r a 的研究，w o r l dp r e c i s i o ni n s t r u m e n t s ( w p i ，s a r a s o t a ，u s a ) 公司在1 9 9 3 年首次开发出第1 个商品化的n o 微传感器i s o n o 。在1 9 9 4 年，i n t e rm e d i c a l ( n a g o y a ，j a p a n ) 和e m k a t e c h n o l o g i e s ( p a r i s ，f r a n c e ) 公司也开发出1 种商品化n o 微传感器m o d e ln o - 5 0 1 。w i i 公司于1 9 9 5 年推出新一代直径从3 0 9 m 到2 m m 的传 覆! ，t 葶硬士学位论文 新型n o 电化学传感器的制各及其性能研究 感器。每一种传感器的工作电极和参比电极都被放在1 个高性能的法拉第罩内来 降低环境噪声。目前，应用较多的微传感器是w p i 公司出品的 # i s o n o p 0 0 7 ( 7 m m ) ，# 1 s o - n o p 3 0 2 0 ( 3 0 m m ) ，# i s o - n o p 2 0 0 ( 2 0 0 9 m ) 和微芯片n o 传感器0 s o n o p m c ) 。由于商业保密，上述传感器材料及化学修饰成分不清楚， 而且由于应用不多，缺乏充分的证据来证明他们的性能。据w p i 公司生产的 i s o - n o p m c 微传感器产品介绍，其检出限可达3 n m ，线性范围为1 0 0 1 0 0 0 n m ， 可直接、实时、实体测量p b s 溶液、水溶液( 包括海水) 、血液、组织、细胞培养 液中的n o ，测定灵敏度高，电极稳定性好，使用寿命长【3 “3 2 1 。 1 3n o 电化学检测( 电化学检测方法综述) 常规的n o 方法如前所述存在各种各样的缺陷而限制了其应用范围，电化学 方法是唯一能够同时实现实时( r e a lt i m e ) 和体内( i nv i v o i ns i t u ) 要求的n o 检 测技术。该方法一般以n o 在固体电极表面的电化学氧化为基本原理，少部分以 n o 电化学还原为基本原理，当n o 在工作电极上氧化( 或还原) 时产生的电流 与样品中n o 的浓度成线性比例关系时，即可将电流信号作为浓度分析信号。 这种方法自上世纪九十年代开发出来以后，获得了大量广泛深入的研究与应 用，按n o 氧化还原方式可分为直接电化学氧化型、还原型和电化学催化氧化型。 如今电化学传感器一般使用超微电极，超微电极设计和制备已达到很高的水准。 电化学检测技术一般具有以下优点： ( 1 ) 灵敏度很高，适合生物体检测要求； ( 2 ) 选择性很好，能够排除其他物质的干扰； ( 3 ) 响应时问短，检测迅速； ( 4 ) 稳定性保持时间较长； ( 5 ) 超微结构尺寸很小，检测时不会对被检测机体( 单细胞，其它生物组 织等) 造成破坏或侵害； ( 6 ) 操作简便。 1 3 1 直接电化学氧化 ( 1 ) 克拉克型( c l a r kt y p e ) n o 传感器 最早的一种n o 电化学传感器是在1 9 9 0 年s h m u k i 开发出来的c l a r k t y p e 传 感器【3 3 l 。该方法在毛细管中封装了铂丝电极为阳极，毛细管中注有3 0m mn a c i 和0 3m mh c i ( p l q = 3 5 ) ，以一种气体半透膜( 氯丁二烯橡胶) 封住端口，在 0 9v ( a g ) 处检测n o 在阳极的氧化电流。另外s h i b u k i 的研究数据表明传感器 直接检测的是n o 分子而无n o 衍生物的信号，因为只有n o 分子可以穿透渗透 膜。 梗l 上葶z l - t r 掌位佬文 新型n o 电化学传感器的制备及其性能研究 图1 2 克拉克型微传感器示意图( 见文献【3 3 】) f i g 1 2s c h e m a t i cd r a w i n go ft h ec l a l kt y p en o m i e r o s e n s o rd e v e l o p e db ys h i b u k i ( a d a p t e d f r o m 3 2 1 ) 该传感器灵敏度为1 0 6n a n m 检测限可达1 0n m ，但其线性区间太狭窄( 1 - 3 t m ) ，可重复性差，半透膜太脆弱而极大限制了其应用范围。 ( 2 ) 铂铱合金电极n o 传感器 i c h i m o r i i 蚓在1 9 9 4 年开发出一种覆盖有三层修饰膜的铂铱合金电极。工作电 极铂铱合金( p t9 0 ，h1 0 ) 电极直径2m m ，由内到外依次覆盖k c l ，硝酸 纤维树脂和硅树脂，辅助电极为石墨纤维电极。k c i 修饰膜是为了降低n o 氧化 电势，硝酸纤维是为了提高选择性。实验以s n a p 生成n o 采用极谱法检测n o 氧化电流，得到的线性区间为6 5n m 一1 t m 。但该电极的性能受到修饰膜厚度 的严重影响，结果可重复性差。 其他还有许多类似克拉克型的电化学传感器，在此不作详述。 1 3 2 电化学还原 m e u l e m a n s 曾报导通过n o 在经电化学处理的碳纤维微电极上发生直接电化 学还原，来测定n o 的含量。在p b s 缓冲溶液中，n o 的还原电位是1 2 v ( v s a g a g e l ) ，检出限为1 0 t m ，线性范m 1 0 t m 一5 0 m m 。此法检出限过高，而且由 于n o 还原电位为负值，许多金属离子及氧气等气体会干扰n o 的测定，故大多数 采用电化学氧化原理渊。 棋! 上肇硬女掌论文 新型n o 电化学传感器的制各及其性能研究 1 3 3 电化学催化氧化 第二种获得广泛研究和应用的是金属卟啉类n o 传感器( 1 o r p h y r i n i c s e n s o r ) ，这种传感器由m a l i n s k i 和t a h a 在1 9 9 2 年首次提出【3 习。他们将镍( ) 4 - ( 3 甲基- 4 苯羟基) 卟啉( n i t m h p p ) 修饰在碳纤维表面，以降低n o 的氧化电势， 催化n o 的氧化过程并提高了氧化电流强度。另外还将n a t i o n 修饰在卧啉修饰 层之外以提高对亚硝酸根离子和硝酸根离子的抗干扰性能。检测时n o 的氧化电 势为6 3 0 m v ( 参比电极饱和甘汞电极，s c e ) ，比未修饰的金属电极或玻碳电极 降低了2 7 0m v ，而且氧化电流强度很高。该电极在单细胞中检测n o 及其他许 多应用中均很成功，m a l i n s k i 发表了一系列的研究论文【蚓。 图1 3 镍卟啉n o 传感器示意图( r s r 献 3 4 1 ) f i g 1 3s c h e m a t i cd r a w i n go f t h en i c k e lp o r p h y r i na n dn a t i o n - b a s e dn om i c r o s e n s o r ( a d a p t e d f r o m 【3 4 】) m a l i n s k i 的研究成果吸引了大批科学家进入化学修饰电极的研制领域，随后 又有研究者使用锰卧啉、铁卟啉、钴卧啉等作为催化材料制备传感器。 对于n o 在该类电极表面的氧化机理存在一些异议。如b e d i o u i 研究小组发 现没有金属离子配位的卟啉甚至碳纤维裸电极也可以检测n o ，且灵敏度很好印 3 8 l 。 卟啉类传感器的选择性和灵敏度受到诸多因素的影响，不同工作电极修饰不 同的金属卟啉往往具有不同n o 氧化电势，修饰处理步骤及其他实验条件也会明 显影响传感器性能。需要提及的是，电催化氧化类传感器采用的电化学分析技术 一般是微分脉冲电压法( d p v ) 和微分脉冲电流法( d p a ) ，也有文献报道采用 微分常规脉冲电压法( d n p v ) 而获得更好的检测效果 随研究深入，各种不同的电极( 玻碳电极，铂纤维电极，金圆盘电极等) 和 各种电极表面修饰材料相继被提出【3 9 l ，以提高传感器的灵敏度并获得一定程度的 - 摸! ，t 事礓士掌位论文 新型n o 电化学传噶器的制备及其性能研究 选择性。蔡沛祥和莫金垣【加】等使用一种杂环席夫碱( d a p b a ) 修饰在铂片电极 表面，对n o 氧化过程表现出良好的催化作用。该课题组还采用了溶胶凝胶钻 邻菲i 罗啉修饰玻碳电极和大环铜配合物修饰微铂盘电极等方法制备n o 传感器， 检测限达1 4n m 4 x 1 朱民、金利通1 4 2 1 等制备了一种纳米a u 和n a t i o n 修饰微铂传感器，并将该传 感器用于心肌细胞n o 水平的研究，微传感器对n o 表现出良好的催化性能，文 中认为催化效果是由纳米a u 的小尺寸效应及界面效应引起的。该课题组还采用 过四氨基铜( 锰、钴) 酞菁和金属铜铂微粒修饰电极制备n o 传感，检测限可至 1 0 nm 【4 3 1 。 1 3 4 其他方法 近年来陆续有报道提出使用光纤化学传感器和光纤物理传感器检测生物试 样中的n o ，其反应借助荧光法或化学发光法( 如鲁米诺法) 将光信号通过光纤 传导出来再检测光量子强度1 该技术还不够成熟，仍需进一步优化研究。 其他还有各种复合电极，组合电极等等不作详述。 1 4n o 传感器的标定( c a l i b r a t i o n ) 为保证实验结果的精确性，传感器性能表征必不可少的步骤之一是传感器标 定。由于n o 传感器对温度比较敏感，标定时的温度和其他条件必须与检测实验 条件尽量一致。一般由三种标定方法，简述如下【蜘： ( 1 ) 化学发生标定法 亚硝酸盐在酸性条件下与碘化物反应可生成确定浓度的n o ，反应式如下： 2 k n o b + 2 k i + 2 h 2 s 0 4 - - 2 n o + 1 2 + 2 h 2 0 + 2 k 2 s 0 4 由于n 0 2 和n o 是化学计量定比的，和h 2 s 0 4 过量的，因此溶液中n o 的浓度与k n 0 2 浓度一致，故n o 浓度可由稀释因子方便的推算出来，而且n o 可在溶液中保持足够长时间以完成标定程序。但该方法会使用到强酸，而强酸很 有可能会破坏n o 传感器的修饰膜，故该法一般只适用于惰性材料电极。 ( 2 ) n o 标准溶液标定法 该法先制备出n o 饱和溶液作为储备液，即n o 饱和纯水溶液。步骤一般为 常温常压下，先在密闭容器中注入去离子水，超声处理1 0 分钟左右，然后通入 高纯氮气，氯气鼓泡3 0 分钟左右( 高纯氮气通入之前须先经过碱溶液以除氧) 。 接着通入高纯n o 气体鼓泡3 0 分钟左右( 高纯n o 通入前一般也须先经过碱溶 液除氧) ，这样获得的溶液中n o 浓度约为2m m ( o i m p a ，2 5 ) 该n o 饱和 溶液可用分光光度法标定其浓度。然后通过无氧去离子水稀释得到各种不同已知 准确浓度的n o 标准溶液。该方法应用最多，但缺点在于n o 是有毒气体，整个 摸! 上肇硕士掌位论文新型n o 电化学传感器的制各及其性能研究 操作步骤必须在安全保护和密闭体系中进行。 ( 3 ) s n a p 分解标定法 s 亚硝基n - f 酰青霉胺( s n i t r o s o - n - a c c t y l p e n i c i l l a m i n e ，s n a p ) 在催化剂 存在下可迅速代谢释放出n o 分子，反应式如下： 2 r s n o 2 n o + r s s r 根据化学计量比，生成的n o 浓度与s n a p 浓度一致，由定量的s n a p 储备 液和稀释因子可方便推算出n o 浓度，与方法( 1 ) 类似。 1 5 本论文采用的方法 酞菁配合物是由具有大环电子共轭体系的酞菁环与中心原子( 离子) 形成的 一类配合物，由于其中心空位可以与7 0 多种金属相配位，在酞菁大环周边上有 1 6 个可取代位置，轴向上还有两个位置可引入取代基团，因此可以通过调整其 分子的组成与结构使其具有特定的光、电、声、热、磁、化学等性质，被认为是 二十一世纪最有发展前景的功能材料之一嗍 金属酞菁对很多物质的氧化还原反应具有很好的电催化活性，如氧分子、含 硫化合物、某些神经传递物质和亚硝酸盐等等 4 7 4 s l 。卟啉类化合物是人们使用 的用于n o 氧化的传统催化剂眇删，近年来的研究表明在相同条件下金属酞菁 具有更优异的催化性能，钴、锰、铜、镍、钌等各种金属与酞菁形成的配合物大 量应用于分析化学领域，其中镍酞菁类配合物被认为对n o 氧化过程有