（遗传学专业论文）交链孢菌基因p42a的原核表达、纯化及生物信息学分析.pdf

摘要 本文以c d n a 文库筛选到的p 4 2 a 基因为材料，构建原核表达载体，并进行目的蛋 白的表达和纯化，同时对p 4 ：a 基因及其编码的蛋白质进行生物信息学分析，为从结构 和分子水平进一步研究激活蛋白及其作用机理奠定基础。结论如下： 1 利用分子生物学方法，采用通用i t s 引物成功地克隆了一株真菌的i t s 区段， 经与g e n eb a n k 所有序列进行b l a s t ，结果与链格孢属a l t e r n a r i as p p 的i t s 区段完全相 同。 2 通过聚合酶链式反应( p c r ) ，扩增出含酶切位点的p 4 2 a 基因片段，并将该 基因按正确阅读框分别克隆到融合表达载体p g e x k g 及非融合表达载体p b v 2 2 1 上，经鉴定证明，融合及非融合表达载体均构建成功且获得表达。对融合表达和非融 合表达情况进行比较发现，前者表达量较高，而后者表达量很低。 3 对融合表达的质粒进行培养，建立菌液生长曲线，通过菌液密度、诱导剂浓 度、诱导时间和温度等条件的摸索，获得融合蛋白的最佳表达条件。结果表明，最佳 诱导时间为培养后4 h ；诱导剂i p t g 的最佳浓度为1 0 m m o l l ；3 7 下诱导培养4 h 时产物表达量最高。通过超声波破碎菌体细胞，离心及电泳发现，表达产物为可溶性 蛋白。 4 对表达的融合蛋白进行“两步法”纯化：先通过亲和层析柱纯化获得融合蛋 白，利用凝血酶切割除去g s t 标签，再通过亲和层析柱纯化获得目的蛋白。对融合 蛋白利用w e s t e r nb l o t 进行特异性鉴定，进一步确定了杂交带即为连接了g s t 标签 的融合蛋白带。 5 采用p 4 2 a 蛋白液浸泡小麦种子后，对小麦生长初期体内抗氧化酶活性和丙 二醛含量进行测定。结果处理的小麦s o d 活性和p o d 活性高于对照；小麦体内m d a 含量基本上均低于对照。说明作为激活蛋白的辅助蛋白p 4 2 a 蛋白液浸泡小麦种子 后，可以增强小麦体内抗氧化能力，并能显著提高小麦幼苗的抗性。 6 采用多种方法进行生物信息学分析，p 4 2 a 基因编码蛋白质的搜索结果显示， 该蛋白与t c t p 蛋白家族序列相似性程度很高，达6 1 o 。二级结构预测结果表明， 该蛋白质随机卷曲含量丰富，达4 6 1 5 。对p 4 2 a 蛋白进行模体搜索表明为单结构 域蛋白，通过同源模建获得了p 4 2 a 蛋白的三级结构。 关键词：链格孢属，原核表达，纯化，生物活性，生物信息学分析 p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ，p u r i f i c a t i o na n d b i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i so f p 4 2 ag e n e i na l t e r n a r i as p p a b s t r a c t t h ep 4 2 ag e n ef r a g m e n tw h i c hw a ss c r e e n e do u tf r o me d n al i b r a r yw a su s e di n t h i s e x p e r i m e n t t h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r sc o n t a i n i n gp 4 2 ag e n ew e r ec o n s t r u c t e d ， i n d u c e d ，a n dt h e nt h ee x p r e s s i o np r o t e i n w e r ep u r i f i e d a tt h es a m et i m e ，s o m e b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i so fp 4 2 ag e n ea n di t sc o d i n gp r o t e i nw e r ec a r r i e do u t t h i s e x p e r i m e n th a dp r o v i d e da ni m p o r t a n te v i d e n c et h a tt h ea c t i v a t o rp r o t e i na n di t sf u n c t i o n m e c h a n i s ma tm o l e c u l a rb i o l o g i c a ll e v e l 1 t h ei t sr e g i o nw a sc l o n e db yp c ra m p l i f i c a t i o nf r o mo n ef u n g i a f t e rs e q u e n c i n g a n db l a s tw i t ho t h e rs e q u e n c e si ng e n e b a n k ，t h er e s u l ts h o w e dt h a ti tw a sc o m p l e t e l y i d e n t i c a lw i t ht h ei t sr e g i o ni na l t e r n a r i as p p 2 t h ep 4 2 ag e n ef r a g m e n tc o n t a i n i n ge n z y m ed i g e s t i o ns i t e sw a so b t a i n e db yp c r a m p l i f i c a t i o n ，t h e ns e p a r a t e l y c l o n e di n t of u s i o ne x p r e s s i o nv e c t o rp g e x - k ga n d u n f u s i o ne x p r e s s i o nv e c t o rp b v 2 21i nc o r r e c to r f t h er e s u l t ss h o w e dt h a te x p r e s s i o n v e c t o r sw a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d t h e ye x p r e s s e dt w op r o t e i n sw i t hs i z eo f4 4 k da n d 18 k dd e t e c t e db ys d s - p a g e ，r e s p e c t i v e l y m o r e o v e r , t h ey i e l do ff u s i o np r o t e i nw a s m a r k e d l yh i g h e rt h a nt h a to f u n f u s i o np r o t e i n 3 t h eb e s tf u s i o ne x p r e s s i o nc o n d i t i o n sw e r eo b t a i n e db ye s t a b l i s h i n gb a c t e r i a lg r o w i n g c u r v ea n db yo p t i m i z i n gi n d u c i n gc o n d i t i o n ss u c ha st h a l l id e n s i t y , t h ec o n c e n t r a t i o no f i p t g , g r o w i n gt i m ea n dt e m p e r a t u r e t h er e s u l t si n d i c a t e dw h e ni n d u c e da t4h o u r s a f t e r c u l t u r ea n da f t e rt h ei n d u c t i o no f1 0 m m o l li p t ga t3 7 。cf o r4h o u r s ，t h ey i e l do f f u s i o n p r o t e i nr e a c h e dt i p t o p o v e r5 6 o f t o t a lb a c t e r i a lp r o t e i n s e x p r e s s i o nf u s i o np r o t e i nw a s s o l u b l ed e t e c t e db ys d s ，p a g ea f t e rb r e a k i n gu pw i t hu l t r a s o n i ca n dc e n t r i f u g a t i o n 4 t h ee x p r e s s i o nf u s i o np r o t e i nw a sp u r i f i e db yt w os t e p s ：f i r s t l y , t h ep 4 2 a g s t f u s i o np r o t e i nw a sp u r i f i e db ya f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h i cc o l u m n ，t h e nt h eg s tt a gw a sc u t o f fb yt h r o m b i n f i n a l l y , t h ep 4 2 ap r o t e i nc o u l db eg a i n e db ya f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h i c c o l u m na g a i n w e s t e r nb l o ti n d i c a t e dt h a tt h es p e c i f i cb a n dw a st h ep 4 2 a - g s tf u s i o n p r o t e i n 5 w i t ht h es e e d sd i p p i n gi np 4 2 ap r o t e i ns o l u t i o nf o r8h o u r s ，t h ea c t i v i t i e so f a n t i o x i d a n te n z y m e sa n dm d ac o n t e n tw e r ed e t e r m i n e di ne a r l yw h e a tg r o w t hp e r i o d t h e r e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ：t h ea c t i v i t yo fs o da n dp o di n c r e a s e da f t e rb e i n gt r e a t e d t h e i i m d ac o n t e u td e s c e n d e da f t e rb e i n gt r e a t e d a l lt h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a ta st h ea s s i s t a n t o fa c t i v a t o rp r o t e i n p 4 2 ap r o t e i nc o u l de n h a n c et h ea b i l 埘o fa n f i o x i d a n ta n dr e s i s t a n c et o w h e a t 6 b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i sw e r ec a r r i e do u tb ys o m ed i f f e r e n tm e t h o d s f o r e c a s t c o n t e n ti n c l u d e ：t h ep 4 2 ac o d i n gp r o t e i nh a da6 1 o d e g r e es i m i l a rt ot c t pf a m i l y a s t os e c o n d a r ys t r u c t u r e ，r a n d o mc o i lc o n t e u tw a sa b u n d a n t m o t i fs e a r c hs h o w e di tw a s s i n g l ed o m m np r o t e i n i t ss t e r e o s t r u c t u r ew a so b t a i n e db yh o m o l o g o u sm o d e l i n g k e yw o r d ：a l t e r n a r i as p p ，p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ，p u r i f i c a t i o n ，b i o a c f i v i t y , b i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s i i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名 显弛 时间： y 。年6 月矽日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：显鑫垒时间：矽年6 月如 导师签名时间：y 口# 年月，日 1 文献综述 1 1 原核表达系统中表达外源基因的研究进展 在各种表达系统中，最早被采用的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的 表达系统。该项技术主要是将已克隆入目的基因片断的载体转化细菌( 一般是大肠杆 菌) ，通过诱导表达、纯化获得所需的目的蛋白【l 翻。其优点是能够在较短时间内获得 基因表达产物，且所需的成本相对较低。大肠杆菌的遗传背景清楚，又由于其具有周 期短、高效率、易操作、使用安全等特点，成为外源基因的首选表达系统。 1 1 1 大肠杆菌表达载体的类型 表达系统的核心是表达载体。目前已知的大肠杆菌表达载体至少有以下几种【3 ： 非融合型表达、融合型表达、分泌型表达。若按启动子类型分，目前广泛使用的大多 数质粒表达载体，主要是由九噬菌体的p l 启动子，大肠杆菌乳糖操纵子的l a c 启动子， 色氨酸操纵子的t m 启动子，以及p b r 3 2 2 质粒的d 。内酰胺酶启动子等一批强启动子 构成的。 不同类型的表达载体各有其优缺点。非融合型表达优点主要在于，非融合蛋白 与天然状态下存在的蛋白在结构、功能以及免疫原性等方面基本一致，从而可以进行 后续研究。为了提高翻译效率，人们在设计表达载体时采用了许多办法：优化翻译起 始区以达到高效表达 4 】；构建一套s d a u g 间隔不等的表达盒，以供选择利用【5 】；在 构建表达载体时，使用“原核翻译增强子”序列，以提高翻译效率 6 】；鉴于野生型大 肠杆菌基因多以多顺反子形式来组织，故采用双顺反子表达载体来获得目的基因的表 达1 7 j ；将“原核翻译增强子”和双顺反子结合到一起，从而提高表达效率【8 。 对于融合表达来说，其表达载体通常s d a u g 已固定，翻译起始信号组织合理， 利于翻译起始；简化蛋白分离纯化工艺；可增强m r n a 及表达产物的稳定性；有些 蛋白质经过融合表达产生可溶性蛋白。目前成功的融合表达系统主要有：g s t 系 统：融合蛋白通过谷胱甘肽一亲和层析柱进行亲和纯化后，用凝血酶或x a 因子切除 融合蛋白的g s t 部分，获得目的蛋白。但是并非所有g s t 融合蛋白都是可溶的，切 割后目的蛋白n 端一般残留两个氨基酸，且切割效率不高【9 】。b 半乳糖苷酶系统： 通过蓝自斑筛选得到目的克隆，融合蛋白用氨基苯硫代半乳糖苷酶( t p e g ) s e p h a r o s e 进行亲和纯化【l 们。麦芽糖结合蛋白( m b p ) 系统：某些目的蛋白与m b p 融合后可 分泌到外周质中，通过直链淀粉交联纤维素亲和层析分离纯化口”。金黄色葡萄球菌 蛋白a 系统：通过i g g s e p h a r o s e 亲和层析分离纯化，融合蛋白由h i v - 1 蛋白酶切割 ”“。陈燕等将胰岛素原基因融合到金黄色葡萄球菌蛋白a 的基因上，构建成大肠杆 菌的融合外分泌表达载体，结果高效分泌表达，能方便地从培养基中分离得到具天然 结构的胰岛素原 1 3 】。纯化标签融合：如f l a g t a g 和h i s - t a g ，甚至将g s t 、h i s 置 于同一个表达载体中，进行双标签表达，检测、纯化更容易。其它融合系统，如硫 氧还蛋白等。 1 1 2 外源基因在大肠杆菌细胞中的表达状态 真核基因在大肠杆菌中的表达形式一般可分为3 类：细胞内不溶性表达，即以 包涵体形式存在；细胞内可溶性表达；蛋白分泌型表达。 包涵体的形成是细胞内表达最大的问题，它是细菌表达的蛋白在胞内相互凝集 而形成的无活性固体颗粒，具很强的折光性【i ”。包涵体的形成是由于肽链折叠过程中 部分折叠的中间态之间的特异性错误聚合，而不形成成熟的天然或完全解链的蛋白 【” 。包涵体虽然利于分离纯化，但是对表达产物的活性不利。涉及包涵体形成的主要 理化因素有：电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基的组分、半胱氨酸和脯氨酸的组 分、亲水性和氨基酸残基的总数等。 为了克服包涵体的形成，常在表达外源基因的同时，共表达分子伴侣和折叠酶。 分子伴侣是细胞内催化及维持其它蛋白质正确构象的一类蛋白质分子【l “1 。”，能识别、 结合并稳定部分折叠的蛋白中间体，避免不适当的分子间及分子内作用，而它本身却 不是最终形成的功能蛋白质的组成部分【1 8 】。大肠杆菌细胞中存在三种具有广泛特异性 的伴侣复合物：一是由1 0k d 的g r o e s 与6 0k d 的g r o e l 两种热休克蛋白( h s p ) 组成的g r o e s e l ；二是由d n a k ( h s p 7 0 ) 与d n a j 、g r p e 组成的伴侣复合物，新生 肽链通过与d n a j 作用被d n a k 识别，再与g r p e 结合；第三种是c i v 系统( c i p a 与 c i p x ) ，它的作用可能是识别易被降解的未折叠肽【1 9 _ 2 0 1 。折叠酶是指那些催化蛋白质 特定异构反应的酶，限制蛋白质折叠的速率。大量表达这些酶可以促进重组蛋白在大 肠杆菌中的正确折叠。大肠杆菌中研究最多的折叠酶是二硫键异构酶d s b a ( d i s u l f a t e b i n d i n gp r o t e i na ) ，其功能依赖于膜蛋白d s b b 。共表达有两种方法：一是采用双顺 反子或多顺反子系统，将不同基因连同各自的s d 序列串连在一起，克隆在同一启动 子下游；或将不同亚基的表达单元，包括各自的启动子、s d 序列和结构基因串连起 来。另一种方法是将不同基因克隆到两个相容表达载体中，通过共转化实现不同亚基 在同一宿主中的共表达【2 1 】。c a s p e r s 等人将酪氨酸激酶c s k 、f y n 或l c k 等与d n a k 、 d n a j 、g r o e s 等共表达，得到了可溶蛋白 2 2 j 。此外，还可通过改变发酵条件，如降 低发酵温度、加入不能代谢的糖、降低培养基的p h 值等来改善蛋白的溶解性【2 3 】。 蛋白分泌型表达又可根据表达场所的不同分为周质分泌表达和胞外分泌表达。 所谓周质是指在大肠杆菌一类革兰氏阴性细菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部 分。大肠杆菌中，已成功使用了各种不同类型的信号肽，将细胞质中表达的蛋白质转 运到周质，如p h o a 、o m p a 、o m p t 、l a m b 、b 呐酰胺酶、肠毒素s t - i i 、l t 诅、l t - b 、 金黄色葡萄球菌蛋白a 、人生长激素信号肽等。氧化性的周质间隙可以模拟真核细胞 的内质网环境，便于新生肽链折叠成天然结构，获得具完全生物活性的重组蛋白。一 些可被细胞内蛋白酶降解的蛋白质在周质中稳定性提高 2 4 1 ，但周质空间小，有时会发 生二硫键的错配【2 5 】。胞外表达使熏组蛋白分泌到胞外培养基中进行分离纯化，便于大 规模培养【2 “。目前使外源蛋白分泌到培养基的系统主要有a 一溶血素( h a e m o l y s i n a ， h l y a ) 系统圈和大肠杆菌素释放蛋白( b a c t e r i o c i nr e l e a s ep r o t e i n ，b r p ) 系统。 郭斯若等还报道了一种l 一型细菌蛋白表达系统。l 一型细菌缺乏细胞壁，通过连接合 适的信号肽，可以用于许多外源蛋白的可溶性、功能活性形式的分泌表达，表达产物 直接分泌到培养基中。 1 1 3 影响克隆基因在大肠杆菌细胞中表达效率的因素 主要影响因素有：密码子的使用、增强子的使用、m r n a 的稳定性及翻译起始 效率、启动子的选择、载体选择、蛋白酶的影响等。 原核生物中，由于不同t r n a 含量上的差异产生了对密码子的偏爱性。经统计发 现：a g a 、a c j c 、a u a 、c c g 、c c t 、c t c 、c g a 、g t c8 种密码子是大肠杆菌的 稀有密码子【2 9 】。蛋白翻译过程中，如果稀少密码子连续出现，会抑制蛋白质合成，发 生密码子错配【3 0 。因此对含较高比例稀有密码子的外源基因进行表达时，应针对密码 子的偏爱性采取措施，如用非连续性多核苷酸定点突变方法对c d n a 中稀有密码子进 行同义突变，或提高某种氨基酸的t r n a 浓度。s r i m i v a s a ng 等报道m e t h a n o s a r c i n a b a r k e r i 甲胺转甲基酶基因中u a g 密码子编码了一个赖氨酸衍生物【3 l j 。故在重组蛋白 表达时应避免使用u a g 作终止密码子，防止转录过程的通读。已知大肠杆菌格外偏 爱终止密码子u a a ，尤其当在其下游连上一个u 而形成u a a u 四联核苷酸的情况下， 转译终止的效率会进一步加强p a 。 增强子是基因表达的重要调控元件，在原核细胞中也发现类似增强子序列，在一 定程度上能提高大肠杆菌系统的表达效率【3 3 】。罗文新等用t 7 启动子和q 序列对 p e t 2 4 ( + ) 载体的转录调控区进行改造，并通过增强型绿色荧光蛋白( e g f p ) 来 检测表达效率，结构表明q 序列能显著增强p e t 2 4 ( + ) 载体的表达效率 3 ”。 m r n a 的稳定性与外源蛋白的合成有很大关系，也是影响表达效率的重要因素 之一【35 1 。转录出的m r n a 5 上游的s d 序列与a t g 问的碱基数和碱基组成对目的基 因的翻译效率很重要。有报道认为，间距以6 1 1 个碱基最好，碱基组成以c + g 比例 不超过5 0 为好，说明s d 序列与a t g 间的距离适当，能更有效地促进翻译的效率 【3 郇。一般认为，降低翻译起始区( t i r ) 二级结构的稳定性可以提高m r n a 的稳定性， 利于外源基因的表达【3 ”。沈芸等通过改变原有载体的t i r 区的序列，成功构建出了 一个高效表达的载体 3 8 】。 在大肠杆菌的表达系统中，通过采用可诱导的强启动子，多数情况下真核基因可 得到有效的转录。目前构建的表达载体一般都采用较强且易于诱导的启动子，如p l 、 l a c 、t a c 和t 7 启动子等。 由于大肠杆菌防御系统的自身保护作用，细胞内的重组基因和蛋白可能会被其核 酸酶和蛋白酶降解，这种降解作用具有一定的专一性和选择性。因此，阐明大肠杆菌 中核酸酶和蛋白酶的作用规律，对m r n a 和基因产物采取一定的保护措施，可以使 一些原先不能在原核生物中表达的真核基因获得表达。目前已发现了一些促进m r n a 稳定性的序列，如o m p a 基因m r n a 5 端非翻译区末端的一段序列。有研究表明，大 肠杆菌的重复性基因外回文序列能防止37 5 夕h 切酶的作用，进而能稳定m l l n a 并提 高表达水平 3 9 】。 1 2 翻译控制肿瘤蛋白( t c t p ) 研究进展 通过生物信息学分析，发现p 4 2 a 蛋白与翻译控制肿瘤蛋白( t c t p ) 家族同源 性高达6 1 ，初步认为该蛋白属于t c t p 蛋白家族成员之一。现对t c t p 蛋白研究 情况做一综述，为进一步研究p 4 2 a 蛋自提供参考。 翻译控制肿瘤蛋白( t c t p ) ，又称p 2 1 ( 小鼠t c t p ) 、p 2 3 ( 人t c t p p ) 、0 2 3 ， 是一类广泛存在于动物、植物及酵母中在序列上高度保守且有很高同源性的蛋白家 族，是由三个不同的研究小组分别从人类乳腺癌组织、小鼠肉瘤细胞系和红白血病细 胞、s w i s s3 t 3 细胞中发现的 4 0 4 “。其编码基因为t p t l ( t u m o rp r o t e i n t r a n s l a t i o n a l l y c o n t r o l l e d1 1 。随后，又从过敏性疾病中发现一种能促使i g e + 的嗜碱性 粒细胞释放组胺的物质 4 6 - 4 s ，与t c t p 序列高度同源，故t c t p 又称为 h i s t a m i n e - r e l e a s i n gf a c t o r ( h r f ) 。人类t c t p 基因编码的蛋白称f o r t i l i n ，是一类新的 抗凋亡蛋白质【4 9 1 。 r u p e cr a 等人于1 9 9 8 年从1 3 号染色体上分离出了t c t p 基因【5 “，1 9 9 9 年， m a c d o n a l ds m 等人又迸一步将该基因基序定位于1 3 q 1 2 一q 1 4 之间【5 ”。t h i e l eh 等分析出t c t p 基因由5 个外显予和6 个内含子构成，全长3 8 1 9 个核苷酸，所有 的内含子夕 显子区域均符合g t a g 规律。启动子区域位于3 0 b p 处的t a t a 盒和 转录因子结合位点，如s p l 、n f l 、a p l 、c p 2 、m z f l 等1 5 2 1 。t h i e l eh 等通过研 究证明，t c t p 基因转录后产生二个核苷酸长度分别为8 4 3 和1 1 6 3 的m r n a ： t c t p m r n a l 和t c t p m r n a 2 ，差异在于3 端非翻译区( 3 - u n t r a n s l a t e dr e g i o n s ， u r t ) 不同1 ”j 。 t c t p 预测的分子量约为1 9 k d a ，等电点为4 7 5 。t h a wp 等人用异核核糖核 酸n m r 光谱法对酵母t c t p 的三维结构进行分析，结果除高度可变且呈无序状 态的g l y 4 0 o l y 6 0 区外的空间结构都较明确。p 2 3 卯是由a 、b 、c 、d 四个b 折 叠片和h i 、h 2 、h 3 三个主要螺旋组成【5 4 】。 研究者利用d a i l 和p o s s u m 程序寻找发现，p 2 ，船与人蛋白m s s 4 d s s 4 的结 构类似，不同的是t c t p 除了具有高度保守的核区外，还有另外两个保守基序。 4 一个为变动的t c t p l 基序，紧邻g t p 酶结台表面，环的中心是磷酸化位点的s e r 残基；另一基序包含h 1 和h 2 螺旋，该区被认为是鼠t c t p 的微管结合区怿”】。 已有研究表明，t c t p 并不像其名字所言，仅局限于肿瘤细胞；在正常细胞 中也有表达。s a n c h e zj c 等利用双向凝胶电泳发现，t c t p 在红细胞、肝细胞、 巨噬细胞、红白血病细胞等中均有表达，但在肾细胞和肾癌细胞中未检测到，表 明该蛋白虽广泛表达但还是受一定的组织特异性调节【5 ”。l if 等分析了f o n i l i n 在 人类组织中的表达，结果在肾组织中，虽然f o n i l i n m r n a 表达丰富，却检测不到 t c t p 蛋白质，说明t c t p 基因的转录与翻译受到不同的控制【4 9 j 。 x u a 等用差异蛋白作图法检测c o s 7 细胞在钙失去平衡时蛋白合成的变化， 结果当细胞内钙储存耗竭时，t c t p 表达上调，同时m r n a 水平也上升。此时若 降低内质网钙浓度，则导致t c t p 蛋白表达增加，且蛋白的增加先于相应的m r n a 的增加，这提示了t c t p t p t l 表达在转录和翻译两个不同的水平受到调节口”。 y a r m 研究了极体样激酶( p l k ) 对t c t p 微管稳定性的调节作用，通过缺失t c t p 的两个s e r 残基使之失去p l k 的磷酸化位点，这导致多核细胞和具致密球样核的 圆形细胞增加，并使细胞死亡。提示p l k 的磷酸化能调节t c t p 的微管稳定性， 在细胞周期中发挥重要作用唧】。 2 0 0 1 年，m a c d o n a l ds m 等人从恶性疟原虫感染的重症病人体内分离出 t c t p ，经重组的疟疾t c t p 在体外可像h r f 一样引起恶性疟疾病人的嗜碱性粒 细胞释放组胺，同时也可引起嗜碱性粒细胞分泌i l 8 ，且t c t p 与h r f 在序列上 高度同源。该结果表明，在疟疾发作时，t c t p 对宿主的免疫反应具一定的影响， 提示恶性疟原虫的t c t p 是哺乳动物h r f 的一个同源类似物【6 1 】。t c t p 的组胺释 放功能可能在过敏性炎症中起重要作用。 1 9 9 9 年，g a c h e t y 等研究证明t c t p 的同源类似物p 2 3 蛋白具有微管结合蛋 白的特性，并以细胞周期依赖的方式与微管结合。免疫共沉淀实验表明，p 2 3 被 微管蛋白抗体共沉淀，但此法获得的p 2 3 量很低，说明仅有部分p 2 3 与微管蛋白 发生结合f5 7 1 。 l i f 等对t c t p 的同源类似物f o a i l i n 转染h e l a 细胞和u 2 0 s 细胞的情况进行 研究，结果f b m l i n 以量一效依赖关系阻止依托泊苷所诱导的细胞凋亡，用反义封闭 法消耗乳腺癌细胞系m c f 一7 的f b 币i i n 后，则出现大量的细胞凋亡。说明f j m l i n 具抗凋亡作用【4 9 。l i uh 等通过研究也发现，t c t p 在细胞水平上与m c l l 相互影 响并调节m c l l 的稳定性。进一步研究表明t c t p 通过干扰m c l l 的泛素依赖的 降解途径来使其稳定【6 2 。以上研究从正反两方面说明f o r t i l i n 是与细胞凋亡密切相 关的抗凋亡蛋白质。 生物学特性研究表明t c t p 具有钙结合特性和热稳定性。x ua 等人用可特异 性地与内质网膜上的c a + 一a t p 结合进而引起内质网储存钙耗竭的离子载体a 2 3 1 8 7 和 t h a p s i g a r g i n 来消耗内质网钙离子，结果t c t p 表达上调，t c t p m _ r n a 亦上调；相反， 增加胞浆钙离子浓度时，t c t p 蛋白合成增加，而t c t p m f 廿诅无变化，说明t c t p 具钙结合蛋白的特性，通过与钙结合并受转录和翻译水平的调节，从而对体内钙平衡 做出反趔5 9 1 。 另外，有研究发现t c t p 上有两个m 红素结合位点，当有血红素存在时，t c t p 可与双氢青蒿素发生共价结合，故认为t c t p 可能作为青蒿素类药物的作用靶点或受 体蛋白之一【6 3 。6 6 ，在抗疟疾方面有重要作用。从t c t p 最初的发现来看，这是一个与 肿瘤发生发展密切相关的蛋白。大量研究表明，t p t l 在癌组织中的表达远高于正常 组织，t c t p 在细胞生长和分化及精子发生中也有重要作用【6 7 - 6 9 。 2 引言 微生物蛋白农药是一种新型的生物农药，它是对多种农作物具有较强生物活性的 一类蛋白质药物。主要包括b t 杀虫晶体蛋白( i c p ) 、蛋白激发子类农药、过敏蛋白 ( h a r p i n ) 、隐地蛋白( e l i c i t i n ) 、激活蛋白( a c t i v a t o r ) 等。激活蛋白是从一些真菌 中筛选、分离、纯化出的一种新型蛋白，主要有交链孢菌、稻瘟菌、纹枯病菌、黄益 霉、葡萄孢菌、青霉、木霉、镰刀菌等，氨基酸和核苷酸序列分析表明这种蛋白不同 于过敏蛋白和隐地蛋白，根据其作用机理将此蛋白命名为真菌源激活蛋( a c t i v a t o r p r o t e i n ) 。该蛋白不诱导烟草植株的过敏反应，这与h a r p i n 和e l i e i t i n 均对烟草植物产 生过敏反应不同7 0 1 。本室的生理生化测定结果表明 7 1 - 7 3 i ，其对烟草花叶病毒病、黄瓜 花叶病毒病等多种病毒病和蚜虫都有较好控制效果，并能提高作物的抗旱能力和产 量。激活蛋白处理种子能够加快黄瓜、豌豆等种子的萌发，促进幼根的生长。开发新 型蛋白质激发子农药将是今后生物农药发展的一个重要方向【”j 。 现代生物技术的快速发展，特别是基因工程的广泛应用，给微生物蛋白农药的研 究注入了新的活力。利用现代分子生物学技术，研究其编码基因的克隆和表达，为蛋 白农药生物合成和提高蛋白农药的生物活性提供分子生物学的理论依据，从而从分子 水平研究具有药性功能的微生物基因及抗病虫害蛋白与宿主受体的相互作用及其机 理。同时，此类蛋白质激发子的深入研究，对揭示植物抗病信号传导过程也很有价值。 本实验室以交链孢菌为材料，应用g a t e w a y 技术构建高质量的e d n a 文库，并用免 疫方法筛选文库，得到编码激活蛋白的基因口”。初步认为此基因编码产物作为激活蛋 白的辅助蛋白发挥作用。 本文先利用分子生物学方法对交链孢菌进行鉴定，然后以e d n a 文库筛选到的编 码激活蛋白辅助蛋白的基因v 4 2 a 为材料，构建原核表达载体，并进行目的蛋白的表 达和纯化，通过优化获得该蛋白的最佳表达条件，为下一步发酵和放大生产奠定基础， 获得p 4 2 a 表达蛋白可用于晶体培养及结构解析；同时对p 4 2 a 基因及其编码的蛋白 质进行生物信息学分析，获得大量的结构信息，为进一步研究结构与功能关系提供具 有指导意义的结论。 3 材料与方法 3 1 实验材料 3 1 1 实验菌株与材料 交链孢菌j h 5 0 5 菌株( a l t e r n a r i as p p js t r a i nj h 5 0 5 ) 由中国农业科学院农业环境 与可持续发展研究所药物工程实验室保存。含有目的片段的p d e s t - 1 7 4 2 a 质粒，化 学诱导型表达载体p g e x k g ，温度诱导型表达载体p b v 2 2 1 均为本室保存。大肠杆菌 d h 5 a ，b l 2 1 f d e 3 ) 购于原北京天为时代科技有限公司。c a 0 0 4 5 中抗小麦种子为中 国农科院作物所陈新民老师惠赠。 3 1 2 主要试剂、工具酶及载体 d n a m a r k e r 购自北京天为时代科技有限公司，低分子量标准蛋白质购自北京 江晨生物技术开发中心，i p t g 、丙烯酰胺、琼脂糖、凝血酶t h r o m b i n 购自s i g m a 公 司；酵母提取物、蛋白胨为o x f o r d 公司产品；还原型谷胱苷肽( r e d u c e dg l u t a t h i o n e ) 购自北京经科宏达生物技术有限公司；其余试剂为国产分析纯。 2 x t a qp c r m a s t e r m i x 、2 x p f up c rm a s t e r m i x 、大肠杆菌d h 5 c 和b l 2 1 感受态 细胞、p m d l 8 一t 载体、l i g a t i o ns o l u t i o n 、g s t 小鼠单克隆抗体、a p 碱性磷酸酶标记 的羊抗鼠i g g 购于北京天为时代科技有限公司，限制性内切酶e c o ri 、b a m h i 为上 海生工生物工程公司产品，t 4d n a 连接酶为p r o m e g a 公司产品。 3 1 _ 3 主要仪器 电泳仪、凝胶电泳装嚣、电转移槽和可调节恒压恒流电源为b i o r a d 公司产品； 高速离心机为s o r v a l l 公司产品；小型离心机为日本e p p e n d o r f 公司产品；分光光度计 ( 岛津u v - 2 5 5 0 双光束一紫外可见分光光度计) ；a k t ae x p l o r e r 高效蛋白纯化仪、 g s t r a pf f ( 5 m 1 ) 亲和柱为安玛西亚公司( a m e r s h a m ) 产品；h p g 一2 8 0 b 光照培养 箱为哈尔滨市东联电子技术开发有限公司产品；恒温水浴、真空干燥器均为国产。 3 1 4 培养基及有关溶液的配制 c t a b 抽提液：2 ( w v ) c t a b ( 十六烷基三乙基溴化铵) ，l o o m m o l lt r i s h c l ( p h 8 o ) ，2 0 m m o l le d t a ( p h 8 0 ) ，1 4 m o l f ln a c l ( 室温保存) 。 l b 培养基：蛋白胨1 0g 几，酵母提取物5 l ，氯化钠1 0g i g ，p h 7 2 。 溶液i ：5 0 m m o l l 葡萄糖，2 5 m m o l l i r i s h c i ( p h 8 o ) ，1 0 m m o l l e d t a 。 溶液： o 2m o i l n a o h ，l s d s ( 现配现用) 。 溶液i i i ：3m o l l 醋酸钾，5m o l l 醋酸( p h 4 8 ) 。 溶液： 2 5m m 0 1 lt r i s - h c l ( p h 7 5 ) ，0 5m m o f le d t a 。 溶液v ：1 0 m m o l l t r i s h c i ( p h 8 0 ) ，1 0 m m o l l e d t a ，4 0 m m o f l c u s 0 4 。 3 0 丙烯酰胺溶液：2 9 9 丙烯酰胺，l g n ，n 一亚甲叉丙烯酰胺，溶于1 0 0 m l 水。 1 0 过硫酸胺( w v ) ：取1 0 0 “g 过硫酸胺加入1m l 超纯水，使用前配制。 1 5 分离胶的配制( 5 m 1 ) ：水1 1 m l ，3 0 丙烯酰胺溶液2 5 m l ，1 5 m o l l t r i s c i ( p h 8 8 ) 1 3 m l ，1 0 s d s0 0 5 m l ，过硫酸胺0 0 5 m l ，t e m e d0 0 0 2 m l 。 1 2 分离胶的配制( 5 m 1 ) ：水1 6 m l ，3 0 丙烯酰胺溶液2 0 m l ，1 5 m o f lt r i s c 1 ( p h 8 8 ) 1 3 m l ，1 0 s d s0 0 5 m l ，过硫酸胺0 0 5 m l ，t e m e do 0 0 2 m l 。 浓缩胶的配匍j ( 2 m 1 ) ：水1 4 m l ，3 0 丙烯酰胺溶液o 3 3 m l ，1 0 m o l l t r i s c i ( p h 6 - 8 ) 0 2 5 m l ，1 0 s d so 0 2 m l ，过硫酸胺0 0 2 m l ，t e m e do 0 0 2 m l 。 考马斯亮蓝染液：o 2 4 9 考马斯亮蓝r 2 5 0 溶于9 0i n l 甲醇：水( 1 ：1 ，v v ) 和1 0 m l 冰乙酸中。 t a e ( 5 0 ) ：2 4 2 9 t r i s 碱，5 7 1 m l 冰乙酸，1 0 0 m lo 5 m o l le d t a ( p h 8 0 ) ，用无菌 水定容至1 0 0 0 m l 。 s d s p a g el o a d i n gb u f f e r ( 5 x ) ：6 0 m m o l lt r i s - h c l ( p h 6 8 ) 、1 4 4 m m o i l 二巯基 乙醇、2 s d s 、o 1 溴酚蓝、2 5 甘油。 b i n d i n gb u f f e r