（运动人体科学专业论文）灵芝孢子粉对小鼠抗氧化和抗运动性疲劳作用的研究.pdf

摘要 目的：观察灵芝孢子粉对小鼠血液中某些抗氧化酶的作用及对小鼠运动 能力的影响，探讨其对延缓运动性疲劳的作用，为灵芝孢子粉在运动领域中 的开发和应用提供一定的参考。 方法：将4 0 只雄性昆明小鼠随机分为5 组，每组8 只，分别为空白对照 组( 空白组) 、运动对照组( 运动组) 、运动低剂量组( 低量组) 、运动中剂量 组( 中量组) 和运动高剂量组( 高量组) 。空白组和运动组小鼠每日空腹灌胃 生理盐水( 剂量按体重的6 0 0 m g k g ) ，低量组每日灌胃孢子粉6 0 0m g k g ，中 量组每同灌胃1 2 0 0m g k g ，高量组每日灌胃1 8 0 0m g k g ，服用两周后，第十 五天将空白组小鼠处死，测抗氧化酶值，作为基础值；其余各组小鼠作一次 性力竭游泳实验( 2 j 竭标准是小鼠沉水1 0 秒不上浮) ，记录力竭时间，处死 取血测得b l a 、c k 值及抗氧化酶值，各组比较，得出结论。 抗氧化指标的测定：运动后即刻由专人取血( 眼球取血) 2 m l ，部分注入 试管中，用于测红细胞的s o d 、g s h p x 及m d a 值，按试剂盒说明进行操作后， 用7 2 2 可见光分光光度计进行比色处理。 实验结果：( 1 ) 力竭时间的比较：运动组和低量组的运动时间( p 0 0 5 ) 。 无差异性，中量组和高量组时间均长于运动组和低量组( p 0 0 5 ) ，但此两组 间无明显差异性；( 2 ) 血清中c k 的比较：运动组明显高于安静组，补剂组均 高于空白组( p o 0 5 ) ，但低于运动组( p 0 0 5 ) ，高量组最明显；血清中b l a 的比较：各实验组均高于空白组( p 0 0 1 ) ，组间无差异性；实验组间无差异 性；( 3 ) 各组抗氧化指标的比较：空白组最高，补剂组次之，运动组最低； m d a 值：运动组高于空白组，补剂组高于空白组但低于运动组( p 0 0 5 ) ； g s h p x ：实验组数值低于空白组( p 0 0 5 ) ，只有高量组值高于运动组，有 统计学意义，其他补剂组与运动组无差异性。 结论：灵芝孢子粉可以提高部分抗氧化酶( s o d 、g s h p x ) 的活性，降低 由运动引起机体自由基的堆积，增强运动中机体抗氧化作用，减少运动体内 m d a 含量，降低c k 的外溢，延长运动时间，延缓疲劳的产生。 关键词：灵芝孢子粉；力竭性运动；抗氧化酶；运动能力 a b s t r a c t o b j e c f i v e ：t oo b s e r v ee f f e c t so fg a n o d e r m as p o r e s ( g s ) o na n t i o x i d a n te n z y m e i nb l o o da n de x e r c i s ea b i l i t y , a n dd i s c u s st h eg sf u n c t i o no fd e l a y i n ge x e r c i s e f a t i g u ea n di t sr e a c t i v ef u n c t i o na f t e rf a t i g u e ，w h i c hl a yat h e o r e t i c a lf o u n d a t i o nf o r t h ea p p l i c a t i o na n dd e v e l o p m e n to fg si ns p o r tf i e l d m e t h o d s ：4 0m i c ea r er a n d o m l yd i v i d e di n t o5g r o u p s ，n a m eb l a n kg r o u p ，e x e r c i s e g r o u p ，l o wg r o u p ，m i dg r o u pa n dh i g h e rg r o u p b l a n kg r o u pe a tn o r m a lf o o d ， e x e r c i s eg r o u pe a tp h y s i o l o g i c a ls a l i n e ，a n dt h eo t h e r se a tg sd i f f e r e n t l y 6 0 0 m g k g , 1 2 0 0 m g k g , 1 8 0 0 m g k ge v e r ym o r n i n gf o rt w ow e e k s t h e nk i l lt h e b l a n kg r o u pm i c e ，t h eo t h e r sm i c es w i mt ot h es t r e n g t hu p ，w r i t et h es w i m m i n g t i m ea n dc o l l e c tb l o o d ，a n dt e s tc k , b l a ，s o d ，m d a ，g s h - p xa c c o r d i n gt ot h e i n s t r u c t i o nb o o k l e t ，o b s e r v a t i o nt h ec h a n g eo f e a c ho t h e r r e s u l t s ：le x e r c i s et i m e ：t h em i dg r o u pa n dt h eh i g h e rg r o u pa r el o n g e rt h a nt h e e x e r c i s eg r o u p ，b u tn od i f f e r e n c ei ne a c ho t h e r ；2c ki nb l o o ds e r u m ：e x e r c i s e g r o u pi sh i g h e rt h a nt h eo t h e r s ，e x p e r i m e n tg r o u p sa x eh i g h e rt h a nt h eb l a n kg r o u p ， t h eh i g hg r o u pi sr e m a r k a b l e ；b l a ：b l a n kg r o u pi sl o w e rt h a nt h eo t h e r s ，a n dn o d i f f e r e n c ei ne x p e r i m e n tg r o u p s ；3a n t i o x i d a s ei n d e x ：s o d ：t h eb l a n kg r o u pi s h i g h e r ，t h ee x e r c i s eg r o u pi st h el o w e r ；m d a ：n od i f f e r e n c ei nt h el o wg r o u pa n d t h em i ng r o u pa n dt h eb l a n kg r o u p ，a n dt h es u p p l e m e n tg r o u p sa x el o w e rt h e e x e r c i s eg r o u p ；g p x ：i i od i f f e r e n c eb e t w e e nt h eh i g ha n dt h eb l a n kg r o u p ，a n dt h e o t h e r sa x el o w e rt h a nt h eb l a n k , a n dn od i f f e r e n c ei ne a c ho t h e r s c o n c l u s i o n ：s u p p l e m e n t i n gt h eg sc a nd e c r e a s et h ef r e er a d i c a lp r o d u c t i o nf o r e x e r c i s e ，i n c r e a s et h ee f f e c to fa n t i o x i d a n ti ne x e r c i s ep r o c e s s ，l e n g t h e ne x c i s et i m e a n dd e l a ye x e r c i s ef a t i g u e k e y w o r d s ：g a n o d e r m as p o r ep o w d e re x h a u s t i v ee x e r c i s e ；a n t i o x i d a s e ； e x e r c i s ea b i l i t y 灵芝孢子粉对小鼠抗氧化和抗运动性疲劳作用的研究 缩略语表 英文缩写英文全称 a t p a d p a m p b l a c k 砌 g s h p x l d h l d 5 0 l p o m d a n a d + s o d v 0 2 m a x a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e a d e m p s o m ed i p h s p h a t e a d e n o s i n e 5 - m o m o p h o s p h a t e b l o o dl a c t a t e c r e a t i n ek i n a s e h a , 血ea d e n o s i n ed i n u c l e o t i d e g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e m e d i a nl e t h a ld o s e5 0 l i p o dp e r o m i d a t i o n m a l o n a l d e h y d e n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e s u p e r o x i d ed i s m u t a s e m a x i m u m o x y g e nc o n s u m p t i o n 中文全称 三磷酸腺苷 二磷酸腺苷 一磷酸腺苷 血乳酸 肌酸激酶 黄素腺嘌呤二核苷酸 谷胱甘肽过氧化物酶 乳酸脱氢酶 半到致死量 脂质过氧化 丙二醛 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸 超氧化物岐化酶 最大吸氧量 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。 论文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或 发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均 已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者虢红磊呀 日期：彬 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 及学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者答名锄首 指导教师签名： 日 一急，志 灵芝孢子粉对小鼠抗氧化和抗运动性疲劳作用的研究 第一草刖吾 运动性疲劳的研究虽已有百余年的历史，但仍是当今运动医学中的研究 热点。在运动过程中，一方面，体内会产生自由基，另一方面，体内抗氧化 防御体系发挥积极作用对抗自由基，如何充分利用抗氧化体系对运动的适应， 提高机体运动能力，防治疾病、延缓衰老是我们研究的重要课题。近二十年 采用中药来延缓运动性疲劳的出现和加速运动性疲劳的恢复的研究更是引人 关注。国内这方面的研究很多，如冬虫夏草、淫羊藿糖浆、灵芝液、蒙古黄 芪、枸杞多糖、银杏物提取物、葛根素、银耳多糖、迷迭香、红景天等对消 除运动性疲劳的研究；国外l i u ，cc ( 2 0 0 5 ) 在v o l u n t a r ye x e r c i s ep r o t e c t s a g a i n s ta c u t ed o x o r u b i c i nc a r d i o t o x i c i t yi nt h ei s o l a t e dp e r f u s e dr a t h e a t 一文中提到番茄红素对延缓运动疲劳的出现有一定的作用。本文选用灵 芝孢子粉( 灵芝生长后期释放的种子) 作为中药试剂，来探讨灵芝孢子粉对 运动性疲劳的作用。 灵芝又称为瑞草，灵芝草，日本人称其为万年茸，它的英文 r e i s h i m u s h r o o m 。灵芝是具有历史悠久的名贵中药，被我国历代医学家誉为 补中益气、滋补强壮、扶正固本、延年益寿的瑞草。作为药物首载于神农 百草经，因有益心气，安静魂、补肝益气等作用而被列为上品。 自2 0 世纪七十年代以来，我国学者在中西医结合的学术思想指导下，运 用现代医药生物技术对灵芝的提取物或有效成分进行系统的研究。近年来， 灵芝有效成分的分析和药理作用、临床应用等研究已引起国际上的关注，尤 其在日本、美国、韩国、法国、新加坡等国家研究的较为深入。目前对灵芝 的研究己深入到分子水平，成功地分析出灵芝的有效成分，如灵芝多糖，核 苷酸、氨基酸、三萜类、无机离子和有机锗等，最新研究主要集中在多糖、 三萜、蛋白及腺苷类。 据近年来的临床报告统计，灵芝孢子粉具有提高免疫力，耐缺氧能力， 清除自由基，抑制肿瘤，抗辐射，提高肝脏、骨髓合成d n a 、r n a 及蛋白质能 力，加速血液循环，提高心脑的供血能力。在临床上主要用于治疗慢性支气 管炎，冠心病，高血脂症，治疗神经衰弱，可以明显改善失眠、食欲不振、 头昏、头痛、健忘等症状，疗效明显；用于治疗肝病，具有保肝解毒作用。 灵芝孢子粉在临床上的作用已被人们给与肯定，但在运动领域的应用很 少，通过查阅大量运动医学的资料发现，关于灵芝孢子粉对于运动相关的研 灵芝孢子粉对小鼠抗氧化和抗运动性疲劳作用的研究 究有限，只有国内的几篇早期报道如王福满( 1 9 9 9 ) 灵芝液对运动性疲劳的 作用，而且检测指标单一，只采用b l a 、h b 值的变化来说明灵芝对运动性疲 劳的影响，本人结合他们的研究思想，根据灵芝孢子粉的临床应用大胆设想 灵芝孢子粉在运动领域也会有一定的作用，本文结合运动性疲劳的产生机制 之自由基学说，通过给小鼠服用一定量的灵芝孢子粉，检测与自由基 相关酶的变化，反映灵芝孢子粉对自由基的清除能力，再结合b l a 、c k 等指 标反映灵芝孢子粉对运动性疲劳的作用，为今后灵芝孢子粉在运动领域中的 应用提供一定的参考。 灵芝孢子粉对小鼠抗氧化和抗运动性疲劳作用的研究 第二章文献综述 弟一早义陬练迎 2 1 运动性疲劳的研究进展 自1 8 8 0 年莫索研究人类疲劳开始，至今已经有一百多年的历史。第五届 国际运动生化会议将运动性疲劳定义为：有机体生理过程不能维持在特定水 平上进行或不能维持预定的运动强度；即由于运动本身而引起的机体工作能 力暂时降低，经过适当时间休息和调整可以恢复的生理现象，是一个极为复 杂的身体变化综合反应过程。在二十世纪初，运动性疲劳就成为运动生理学 和运动医学领域研究的热点，其产生机制是各国生理工作者十分关注的研究 课题，主要有能量消耗学说，代谢产物堆积学说，离子代谢紊乱，自由基学 说，内分泌失调，保护性抑制学说，其中自由基学说在运动性疲劳的研究中 越来越受到大家的关注。 自由基学说是1 9 5 6 年h a r m a n 在分子生物学的基础上提出的，正常情况 下，自由基的产生和清除保持动态平衡，从而维持机体正常的生理机能。但 是当自由基的产生过多，或清除能力下降，就会干扰人体的正常代谢活动。 自由基的性质不稳定，活性极强，所有的细胞成分都是它攻击的对象，它们 攻击细胞膜，线粒体膜，与膜中的不饱和脂肪酸发生反应，造成脂质过氧化 增强；脂质过氧化产物生成的同时又生成更多的自由基，引起自由基的连锁 反应，从而产生许多有害的次自由基及毒性物质，使细胞膜结构的完整性受 到破坏，引起肌肉、细胞、线粒体、d n a 、r n a 等广泛损伤，进而引起各种疾 病。1 9 7 9 年，d i1l a r d 首次将自由基理论引入运动医学领域，从此开始了运 动与自由基的研究。有关自由基对运动能力影响的研究很多，主要集中在以 下几方面：不同运动方式对自由基生成有不同的影响，长时间有氧耐力训练 能减少运动过程中自由基的生成，使机体抗氧化系统产生适应性变化，减少 体内脂质过氧化产物的生成；剧烈运动可以引起体内自由基生成增多，攻击 细胞膜上的不饱和脂肪酸导致脂质过氧化反应增强，引起运动性疲劳的产生 等等。总之，减少运动过程中自由基的生成和快速清除己生成的自由基，是 缓解和消除运动性疲劳的有效方法之一。 自由基的清除有两种途径，一是利用内源性自由基清除系统清除体内多 余的自由基，二是利用外源性抗氧化n - - 自由基清除剂，阻断自由基对人体 的侵害。 3 灵芝孢子粉对小鼠抗氧化和抗运动性疲劳作用的研究 运动医学领域大量的研究集中在补充抗氧化剂清除运动性自由基，以提 高运动成绩，减少运动损伤和缓解疲劳。从2 0 世纪8 0 年代起，我国运动医 学界开始重视并致力于借助中药来消除运动性疲劳与提高机体运动能力的研 究，并取得了显著成果。查阅大量资料，发现关于中医对运动性疲劳的作用 研究报道很多，有冬虫夏草、淫羊藿糖浆、灵芝液、蒙古黄芪、枸杞多糖、 银杏物提取物、葛根素、银耳多糖、迷迭香、番茄红素等1 。运用中医理 论对运动性疲劳进行辨证治疗，可用中药调整人体机体的机能，调动机体的 自由基防御体系。中药治疗主要着重于整体调节，调动内因最终达到消除运 动性疲劳，提高身体机能，创造优异运动成绩。但使用中药和中成药应特别 注意“兴奋剂”问题，运动员常因疾病和过度训练而使用中草药和中成药， 但有不少中草药、中成药含有禁用物质。运动员赛前治疗用药要极为慎重， 密切注意，不要误服。 本文选用灵芝孢子粉( 灵芝生长后期释放的种子) 作为中药试剂，探讨 灵芝孢子粉对运动性疲劳的作用。 2 。1 。1 自由基的生物学功能 在生物体内，随着新陈代谢的进行，自由基的生成和消除就相继而生， 正常的生理状态下，二者处于稳定的动态平衡状态，即对身体无害；只有机 体处于某种特殊状态时，自由基的生成大于清除，高浓度的自由基才会损害 机体组织细胞或降低运动能力。 2 1 2 自由基的生成 大多数生命体都是利用氧作为电子终端的受体去氧化体内的能源物质， 为生命活动提供能量。线粒体是能量的加工厂，氧分子大部分在此被还原成 水，然而，根据电子回旋受限理论，氧分子不能一次全部接受电子，而必须 逐个接受还原所需的4 个电子，从而产生单价还原的氧中间产物及其氢化物， 如氧自由基、双氧水和羟自由基等。 这三种自由基的共性是得电子倾向强烈，化学结构不稳定，以致容易引 起细胞组织的损伤；但化学性质又有所不同，羟自由基活性最强，可攻击所 有的生物成分，仅受扩散速度的限制；双氧水虽不是严格意义上的自由基， 但由于易扩散，可以攻击远离其生成部位的细胞成分，对机体的损伤更为严 重，故称为自由基。 4 灵芝孢子粉对小鼠抗氧化和抗运动性疲劳作用的研究 自由基的生成有以下几个生化通道： 2 1 2 1 线粒体电子转移链： 真核细胞主要通过电子传递链在线粒体内还原氧分子。n a d h 一辅酶还原酶 和辅酶一细胞色素c 还原酶均可产生0 - 2 和h ：0 ：由于从2 个电子载体( n a d h 和f a d 2 ) 到1 个电子载体( 辅酶q ) 的转移会引起半醌( q h ) 的产生，因此电子 传递链的这一环节成为氧自由基产生的主要过程。沪2 易被线粒体s o d 还原 为h ：o ：，据估计，每克肝组织线粒体每分钟可产生2 4n m o l0 - - 2 ，并在m n s o d 作用下达到稳态浓度8 1 0 - 8m ，心肌线粒体每分钟可产生0 3 o 6n m o l 的h z o 。( 每毫克蛋白) ，相当于组织氧耗的2 ，氧分压升高时，线粒体h ：0 ： 的产生增多，提示机体代谢率和氧耗增加时，线粒体是氧自由基的重要来源。 2 1 2 2 黄嘌呤黄嘌呤氧化酶途径： 黄嘌呤氧化酶( x o ) 催化的反应被认为是心脏缺血再灌注时产生自由基的 主要来源。缺血时，a t p 降解为a d p 和a m p 以满足心肌收缩的能量需要。在 供氧不充分时，由于不能经氧化磷酸化产生a t p ，a m p 继续被降解，导致次黄 嘌呤堆积，后者在x 0 催化下产生黄嘌呤和尿酸，并伴随一个电子的氧分子还 原而生成o - 2 。 激活x o 这一通路，需要几项前提：首先组织中有充足的次黄嘌呤和黄嘌 呤作为底物；其次，x o 须以氧化形式出现，因为还原型的x 0 利用n a d + 而不 是0 2 作为电子受体，所以不产生沪2 。第三，必须有0 2 作为电子受体。 2 1 2 3 中性粒细胞途径： 直到最近才发现组织损伤后的炎症反应与自由基有关，在这一过程中， 中性粒细胞( p m n ) 起关键作用。p m n 是一种白细胞，在保护组织抗病毒和细菌 感染的急性反应期起重要作用。组织受伤后释放血源性信号因子，如白细胞 介素，可刺激p m n 应答，在受伤部位聚集并释放两种主要的噬菌因子，即溶 酶体酶和0 - 2 。溶酶体可促进受损组织蛋白的裂解，而0 一2 主要是由n a d p h 氧化酶产生的，此过程继而产生h ：0 ：。 考虑到中性粒细胞侵入需要时间， 基的主要来源，而有可能是长期运动， 肉继发氧化应激的重要机制。 5 这一通路不可能是短期运动产生自由 剧烈离心运动，或力竭运动恢复期肌 灵芝孢子粉对小鼠抗氧化和抗运动性疲劳作用的研究 2 1 2 4 其他途径： 过氧化物酶体是脂肪酸和d 一氨基酸非线粒体氧化的细胞器。生理条件 下，过氧化物酶体产生h = o ：而不是o 2 。肝脏是静息状态下过氧化物酶体产 生h ：0 。的主要器官。长期饥饿可增加h 。0 ：产生，主要是由于在过氧化物酶体 内的脂肪酸氧化。长期运动时，脂肪酸是心肌和骨骼肌主要的供能底物，因 此过氧化物酶体是氧自由基产生的潜在部位。 2 1 3 自由基的功能与危害 自由基不是细胞代谢过程中的副产品，而是一种目的性的产物，自由基 是细胞内的一类重要信号分子。自由基在生理浓度范围内对人体是有益的， 氧自由基作为体内的第二信使，可以调节血管舒张，还具有杀毒，吞噬等作 用，但超出生理浓度时自由基对机体就会产生伤害： 自由基对核酸的损伤：主要使d n a 主链断裂，碱基缺失，引起细胞畸变。 d n a 的损伤与衰老、癌症有密切的联系，值得作进一步的研究，在运动领域 的研究更是有限。 自由基对蛋白质的损伤：如羟自由基和脂质过氧自由基使蛋白分子多肽 链断裂，迅速降解成为氨基酸；使巯基形成二硫键引起蛋白质构象变化；蛋 白质交联发生聚合作用；一些关键酶激活或灭活导致信号传导和生理过程的 改变。 自由基对生物膜的损伤：生物膜的脂质层含有大量的多不饱和脂肪酸， 与自由基发生脂质过氧化作用后，细胞膜受体、离子通道、膜蛋白酶的微环 境发生改变，膜的通透性升高，影响机体正常机能。 自由基对细胞膜的攻击使膜的通透性升高，当机体运动时自由基大量生 成，就会使肌细胞内酶和h b 释放到血液中，如c k 、l d h 入血导致钠泵功能损 伤，影响肌细胞的兴奋收缩偶联；当大量的自由基与线粒体膜发生脂质过氧 化反应会影响a t p 生产，导致心肌、肝脏、骨骼肌组织的功能紊乱，这与运 动性疲劳的产生有密切的关系。因此，目前认为自由基的增多引起运动能力 下降是因为自由基使体内各器官的生物膜产生了脂质过氧化的作用。 运动时血浆脂质过氧化物浓度升高已为人们熟知，脂质过氧化物( l 0 0 h ) 可分解成各种分子如乙烷、戊烷及各醛类，丙二醛( m d a ) 是l o o h 分解的中 间产物，化学性质非常活泼，可以在生成部位与组织器官的蛋白质、核酸、 氨基磷脂交联形成连锁反应进一步伤害机体，使疲劳加剧。 6 灵芝孢子粉对小鼠抗氧化和抗运动性疲劳作用的研究 2 2 抗氧化系统的生物学概述 脂质过氧化产生的自由基可被生物体内一些天然的自由基清除剂清除或 与抗氧化剂发生反应而终止连锁反应。抗氧化剂是还原剂，具有传递电子的 作用，与氧化剂发生氧化还原反应，从而清除自由基或抑制自由基的生成， 协助修复由自由基引起的损伤，机体内有两大类抗氧化剂，包括酶类抗氧化 剂( 表1 ) 和非酶类抗氧化剂( 表2 ) 。酶类抗氧化剂，能有效地清除活性氧 并终止自由基的反应过程；非酶类抗氧化剂是一类可以阻止自由基损伤细胞 的防御体系。 表1 酶类抗氧剂及其作用 表2 非酶类抗氧化剂及其作用 2 3 运动与自由基及抗氧化系统 在正常生理条件下，自由基和与之对抗的酶系统处于动态平衡，在运动 状态下，无论是短时间的极量运动，还是长时间的亚极量运动，均引起体内 自由基生成增加。 7 灵芝孢子粉对小鼠抗氧化和抗运动性疲劳作用的研究 2 3 1 急性运动对自由基及抗氧化系统的影响 张蕴琨等口1 1 9 9 5 年、宾晓农等口1 9 9 5 年、丁树哲h 1 、l e e u w e n b u r g h 等隋1 、 杨建昌嫡1 、曹国华口1 分别作了一次关于力竭性小鼠运动实验，测得运动后即刻 肌肉中m d a 增多，说明力竭性运动后即组织自由基增加，自由基的损伤作用 加强；张蕴琨同时发现同一负荷对小鼠不同器官组织的自由基生成影响不同， 骨骼肌最多，肝脏次之，脑组织无明显变化，观察s o d 的变化情况发现肌组 织中s o d 水平下降，脑组织中s o d 升高；郑岩岚田1 9 9 4 年、裴建明等阳1 同年 也分别作递增负荷至力竭的小鼠实验，测得运动前后血浆中l p o 值，发现均 显著增高，说明剧烈运动增加自由基的生成，加速脂质过氧化作用。 另外，韩立明n 1 9 9 5 年，张钧等n 妇2 0 0 0 年，衣雪洁等n 2 1 2 0 0 0 分别作了不 同运动时间对自由基的影响实验，发现长时间运动7 0 m i n 一9 0 m i n 左右，肌组 织中佃a 含量降低或不变；低于6 0 m in 的运动，不但骨骼肌、心肌、肝脏中 m d a 含量增加，连胃、肠组织中m d a 也升高。对比说明长时间超过7 0 m i n 运 动能提高机体的抗氧化能力，加速自由基的清除，减轻自由基对生物体的损 伤；相反，低于6 0 m i n 的运动对自由基的生成远大于清除能力，加大自由基 对生物膜的损伤程度。至于抗氧化酶的变化，韩立明等报道7 0 l i l i n 游泳运动 后肝脏、肾脏和肌肉中s o d 活性明显升高。 运动后不同时间测取的值也有差别。王和平n 卵等2 0 0 1 年作大鼠力竭性游 泳实验，在运动后不同时间测得m d a 值发现：运动后即刻测得佃a 显著升高， l h 后和2 4 h 后急剧升高；邵邻相4 1 2 0 0 2 年实验结果发现运动组即刻m d a 明 显高于对照组，运动后1 6 h 和2 4 h 上升更显著，肝脏在运动后9 6 h 则明显下 降；徐冬青5 1 1 9 9 9 年让大鼠作急性递增负荷至力竭测得即刻m d a 值显著升高， 运动后4 8 h 仍未恢复。 又有研究关于不同的运动强度对自由基的影响变化，傅静波n 胡2 0 0 0 年进 行安静、亚极量负荷和极量负荷下血中抗氧化酶及m d a 的测定，发现g s h 在 亚极量和极量负荷下均低于安静组，而抗氧化酶s o d 在这两种负荷下高于安 静组，c a t 在极量负荷最高；亚极量和极量负荷运动即刻m d a 明显高于安静 时，且极量又显著高于亚极量：许豪文n 7 1 1 9 8 9 年对比体育系男大学生8 0 0 m 和 3 0 0 0 m 运动后l p o 值，发现3 0 0 0 m 的增加，而8 0 0 f i l 变化不大。 综上所述，急性剧烈运动可以引起肌组织的自由基增加，超过抗氧化系 统清除自由基的能力，急剧运动虽启动了机体的抗氧化系统，但抗氧化系统 8 灵芝孢子粉对小鼠抗氧化和抗运动性疲劳作用的研究 的防御功能却是下降的，大量的自由基导致脂质过氧化作用增强，最终伤及 肌组织；不同强度、不同时间的运动对自由基代谢不同，同一运动对不同组 织的影响也不同。 2 3 2 - 慢性运动对自由基的影响 刘丽萍等u 鲫1 9 9 8 年研究耐力性游泳运动对大鼠肝脏自由基代谢影响发 现，1 5 天游泳组自由基的产生与清除基本平衡，3 0 天游泳组m d a 含量有所下 降，而力竭组的m d a 含量显著增加。说明慢性运动时，自由基的生成与清除 基本平衡，而急性运动自由基的生成运大于清除。 郭海英“们1 9 9 6 年、陈彩珍等2 0 0 0 年、王沛2 0 0 1 年实验发现长期有氧运 动后g s h 值高于安静时，说明长期有氧运动可以加强抗氧化系统的抗氧化能 力，从而削弱自由基对机体的损伤。 隋波等啪1 2 0 0 1 年研究不同时间游泳训练对大鼠肝脏抗氧化系统的影响， 力竭组s o d 活性下降，耐力组无明显变化；小运动量训练后s o d 与安静时比 无明显变化，而大运动量训练后s o d 有显著变化。 综上所述，慢性运动可以使机体对氧自由基产生很好的适应能力，也可 以提高组织抗氧化酶的活性，s o d 、c a t 和g p x 活性加强，g s h 含量增多，从 而清除运动时产生的大量自由基，提高组织对抗自由基的能力。由于在适宜 的慢性运动中，抗氧化酶的活性产生适应性的变化使机体内自由基的防御系 统加强，使自由基的清除能力大大提高，减缓组织的损伤与衰老。 2 4 灵芝孢子粉的生物学功能 灵芝孢子粉是灵芝发育后期弹出的种子，生物学上称担孢子，具有提高 超氧化物歧化酶的活性；提高红细胞的变形能力和降低血小板的聚集性能； 提高细胞合成d n a 、r n a 、蛋白质的能力；提高机体免疫力；具有护肝解毒的 作用；提高机体耐缺氧能力、提高血液供氧能力、加大动静脉氧差和降低机 体安静状态下的耗氧量；降低血液粘度，增加心肌收缩力，增加冠状动脉血 流量和心输出量，改善心律；抗肿瘤、抗放射性射线和有毒化学物质对机体 的损害及镇静、镇痛作用，而其灵芝孢子粉经临床证明毒性极低乜捌1 。 2 4 1 药理成分及作用 虽然灵芝孢子的外部包裹了两层坚韧的外壁，一般的物理化学方法又很 难将其打破，但近年来，随着对灵芝孢子粉的关注，破壁技术不断成熟，灵 芝孢子粉的活性成分渐渐被认识。科学研究表明，灵芝孢子粉的药理成分非 9 灵芝孢子粉对小鼠抗氧化和抗运动性疲劳作用的研究 常丰富，其中有效成份可分为十大类：蛋白质和氨基酸类，糖肽类，维生素类， 胡萝卜素，三萜类，生物碱类，脂肪酸类，内脂和无机离子等。1 6 种氨基酸 ( 其中异亮氨酸、亮氨酸，赖氨酸，蛋氨酸，色氨酸，苯丙氨酸等机体必需氨 基酸的含量非常丰富，均高达1 0g k g ) 。三萜类化合物，包括灵芝孢子酸a 、 b 、c 、e 、( g a n o s p o r e i ca c i da 、b 、c 、e ) ，三萜类是灵芝孢子粉的主要化 学成分之一，具有强烈的药理活性，有止痛镇静，抑制组织胺的释放，抗过 敏、保肝、降压、降脂等作用，并能有效提高机体的抗病能力；灵芝孢子中 富含多糖和寡糖，其中二糖、三糖、四糖分别是1 9 4 、1 6 7 、2 5 0 m g l o o g ，不 同活性的多糖如具有b 一( i - 3 ) - d - 葡聚糖主链的多糖，具有b 一( 1 - 6 ) 一d _ 葡聚 糖主链的多糖半乳糖和葡萄糖以1 3 一糖苷键连接的中性多糖，灵芝多糖类化 合物是灵芝孢子粉的主要有效成分之一，现已证明，灵芝多糖类具有抗肿瘤、 调节免疫作用、降血糖作用、降血脂作用、抗放射、抗氧化和抗衰老作用， l 临床实验也证实灵芝多糖可作为肿瘤放化疗的有效辅助治疗药；灵芝孢子中 的脂肪酸类有二十四烷酸、硬脂酸、棕榈酸、二十二烷酸等。维生素类主要 是v e ，其含量超过6 0 m g l o o g ，另外也含有少量的v c 、v e ，v c 是人体的抗 氧化剂；无机元素有钙、磷、铁、镁、钠、锗、铬、硒等，硒( s e ) 是人体 必须的微量元素，是人体重要的含硒酶和硒蛋白的必需组成部分，硒具有提 高抵抗力、抗肿瘤、保护肝脏、保护视力保护心血管功能、延缓衰老、提高 甲状腺功能、降解重金属等重要功效，其中有机锗与人体健康和疾病的防治 有密切的关系。 2 4 2 药理作用 2 4 2 1 免疫调节作用：增强单核吞噬细胞系统与自然杀伤细胞( n k ) 的功能。 灵芝孢子粉增强腹腔巨噬细胞酸性磷酸酶( a c p ) 活性，提高巨噬细胞的吞噬 指数。灵芝孢子水提取物能提高巨噬细胞溶酶体酶活性，使a c p 和1 3 一葡萄 糖醛酸酶活性增高，并能促进h 2 0 2 的生成。灵芝孢子粉碱提多糖l z s b s 能促 进巨噬细胞分泌白细胞介素i l l b 和肿瘤坏死因子t n p 一2 并产生一氧化氮 ( n o ) 。另外灵芝孢子粉可提高脾脏n k 细胞的杀伤性。 促进细胞免疫和体液免疫功能，灵芝孢子粉可促进刀豆素c o n a 或植物 血凝素p h a 诱导的脾淋巴细胞转化增值，促进脾细胞i l - 2 分泌高浓度l b - n b 大于l o m g l 能促进c o n a 诱导的t 细胞增值。灵芝孢子粉中的多糖s p 及其降 解片段s p l 可促c o r t a 和l p s 诱导的脾淋巴细胞增值，s p 还能提高血清补 1 0 灵芝孢子粉对小鼠抗氧化和抗运动性疲劳作用的研究 体c 3 水平。 2 4 2 2 抗肿瘤作用 灵芝孢子粉及其提取物对肿瘤细胞周期产生抑制，灵芝孢子粉提取液可 引起肿瘤细胞内钙离子浓度子短时间内明显降低，使细胞内钙离子浓度的稳 态失控，胞浆内钙离子水平过低可导致g 1 期阻滞；通过可逆性的抑制a k t 在s e r 4 7 3 位点的磷酸化而抑制n f - k b 的连续活化，继而下调周期素d l 和c d k 4 激酶的表达，而最终在细胞周期的g o g l 期产生抑制。 灵芝孢子粉醇提取物的水溶液部分在体内能抑制小鼠的迟发型过敏反应 和对绵羊细胞的初次抗体应答及鸡红细胞诱导的循环抗体水平，在体外可抑 制有丝分裂原刺激小鼠淋巴细胞和人扁桃淋巴细胞的增值反应。 抗癌作用：在以小鼠或大鼠为实验材料的研究中发现，体外给动物饲用 破壁的孢子粉后，胸腺体重比显著增加，血清凝集素水平增加，t 淋巴细胞 转化能力显著增强；腹腔巨噬细胞吞噬能力显著提高并抑制了动物移植性肿 瘤的生长，提高了血液中谷胱甘肽过氧化物酶的活性。动物在饲用孢子粉后 所表现高活性免疫能力可能与孢子粉中丰富的肽多糖和高含量的v e 有关。最 近发现灵芝孢子的醇提取物在体外具有直接抑制癌细胞生长作用，灵芝孢子 醇提取物在l m g m l 是对人宫颈癌细胞、人肝癌细胞h e p g 2 等均具有较强的 杀伤能力。 2 4 2 3 对神经系统的影响 灵芝孢子粉先用乙醚脱脂后用乙醇回流，得到的提取液浓缩至膏状后制 成水剂，称之为孢醇水，它能使小鼠自主活动明显减少并可延长小鼠的睡眠 时间。另外，l 瞄床用于治疗内脏多动、精神紧张等疾病时也取得了较好的效 果。 2 4 2 4 清除自由基的作用 灵芝孢子粉水提取物可降低2 ，4 一二氧苯氧乙酸引起的m d a 升高，抑制 肌组织脂质过氧化，使m d a 生成量减少，抑制产生超氧阴离子和羟自由基， 并使黄嘌呤氧化酶黄嘌呤系统中的超氧阴离子的生成减少，说明灵芝孢子粉 中的某些成分可能有捕获超氧阴离子的作用。此外，还可以提高肝组织中过 氧化氢酶的活性，加速活性氧自由基反应中生成的过氧化氢的水解。灵芝孢 子粉能清除自由基主要机制是：提高超氧歧化酶活性，能消除体内自由基， 降低体内丙二醛( m d a ) 的含量，提高细胞膜的流动性和封闭度，保护细胞膜、 灵芝孢子粉对小鼠抗氧化和抗运动性疲劳作用的研究 细胞器、核酸、酶等生物活性物质免受自由基破坏。 提高超氧歧化酶的作用主要表现在：提高细胞超氧歧化酶( s o d ) 的活性。 灵芝孢子粉能提高机体超氧歧化酶作用，其作用大小与使用量有关。李瑞、 韩群等用大鼠试验，当口服6 2 5 m g k g 时，其s o d 活性比对照提高1 4 ，当 口服5 0 0 m g k g 时，其s o d 活性比对提高3 2 7 。 抑制超氧阴离子自由基的产生：抑制脂质过氧化，脂质过氧化可导致 细胞膜结构的破坏，使细胞膜的生理活性降低或丧失，细胞膜主动吸收能力 下降。脂质过氧化的产物一脂褐质素会积累于血管内壁和表皮，造成血液循 环障碍和产生老年斑等，降低体内脂质过氧化水平，对提高机体健康、延缓 衰老，提高神经系统的功能，有重大的意义。 2 4 2 5 提高机体耐缺氧的能力 研究表明，蹦小鼠口服孢子粉6 0 0 m l k g d ，1 4 天后在无氧环境下存活 时间显著延长，说明口服孢子粉能增加抗缺氧能力。推测口服孢子粉能增加 血液中红细胞和血红细胞的含量，提高机体的带氧和含氧功能并降低机体耗 氧量。 灵芝孢子粉对人体有扶正固本的效果，有多方面的药理活性，近十年来， 多家高校和研究机构对灵芝孢子粉的有效成分提纯和测定加以研究，总结灵 芝孢子粉有效成分对动物和人体免疫系统、自由基和抗氧化酶系统、抗肿瘤 等不同方面作用乜2 | ，为灵芝孢子粉的进一步研究和应用提供理论依据和方 法。 2 4 3 毒性实验及突变实验 给小鼠口服灵芝孢子粉，l d 5 0 大于l o g k g 体重，属实际无毒级；鼠伤 寒沙门氏菌哺乳动物微粒体酶试验，骨髓微核试验及小鼠精子畸变试验表明 无致突变和致畸作用。3 0 天喂养试验结果表明对小鼠最大无毒作用的剂量大 于3 9 k g ，对小鼠每日灌胃2 5 9 k g 或1 2 5 9 k g ( 约临床5 0 倍或2 5 倍) ，6 0 天后测的血液学、血液生化学、尿液及组织病理学指标均无明显影响。急性 毒性试验时，皮下注射1 5 9 k g 仅仅引起部分动物入睡而不会死亡，剂量达到 2 0 9 k g 时，小鼠翻正反射消失，4 0 h 内死亡。 1 2 灵芝孢子粉对小鼠抗氧化和抗运动性疲劳作用的研究 第三章实验研究 3 1 实验材料 3 1 1 实验对象： 3 1 2 补 3 1 3 试 健康雄性昆明小鼠4 0 只，体重2 2 + 2 9 ，由大连医科大学动物 实验中心提供，c l 型，许可证号：s c x k ( 辽) 2 0 0 4 - 0 0 1 7 。 剂： 灵芝孢子粉：粉末，9 5 破壁，深褐色，有效成分灵芝多糖、 三萜类、微量元素。实验时用蒸馏水配制成不同浓度 ( 3 0 m g m l 、6 0 m g m l 、9 0 m g m 1 ) 受试物以供实验。 剂： b l a 试剂，c k 试剂，s o d 试剂，m d a 试剂，g s h - p x 试剂均购 自南京建成生物工程研究所。 3 1 4 主要仪器： 7 2 2 可见分光光度计；z d - - 6 0 0 电热恒温水浴箱；9 5 c 水浴箱； l d z 5 2 型自动平衡低速离心机；微量移液器；电子天平 3 2 实验方法t 3 2 1 实验设计： 将4 0 只小鼠随机分为五组，分别为空白组，运动组，低量组，中量组， 高量组，运动组服用生理盐水，低量组服用6 0 0 m g k g 剂量的孢子粉，中量组 服用1 2 0 0 m g k g ，高量组服用1 8 0 0 m g k g 。饲养两周后，第十五天将空白组小 鼠处死，测抗氧化酶s o d 、g s h p x 、m d a 值，作为基础值：其余各组小鼠做一 次性力竭游泳实验，记录力竭时间，处死测得b l a 、c k 值及抗氧化酶值，各 组比较，得出结论。 力竭性游泳试验： 两周后，清晨小鼠空腹游泳，水深2 5 c m ，( 尾部不接触水箱底部) ，水温 2 8 一+ 2 c ，小鼠在运动过程中，有专人负责驱赶小鼠，避免小鼠偷懒，直到小 鼠力竭为止，力竭标准是小鼠沉水1 0 秒不上浮。 3 2 2 实验流程： 为避免人为主观思想干扰，每次游泳小鼠来自不同的组别，有专人负责： 小鼠游泳力竭后，有专人记好各项记录，同时有专人负责小鼠吹干、取血， 血样处理，准备测各项指标。 1 3 灵芝孢子粉对小鼠抗氧化和抗运动性疲劳作用的研究 3 2 3 各指标具体测定方法： 3 2 3 1c k ，b l a 的测定： 将备好的血样及配好的试剂，3 7 。c 水浴箱预温5 m i n ，准备测试。 测c k 酶的原理：c k 催化三磷酸腺苷和肌酸，生成磷酸肌酸，后者很快 全部水解为磷酸，此时三磷酸腺苷和二磷酸腺苷仍稳定，加入钼酸铵可生成 磷钼酸，可进一步还原成钼蓝，在6 6 0 h m 处进行比色，此实验根据生成无机 盐的量依公式可算出酶的活性。 测b l a 的原理：以n a d + 为氢受体，l d h 催化乳酸脱氢产生丙酮酸，使n a d + 转化成n a d h 。其中p m s 递氢使n b t 还原为紫色呈色物，呈色物的吸光度在 5 3 0 h m 时与乳酸含量成线性关系，最终比色测定b l a 含量。 3 2 3 2 抗氧化指标的测定： 运动后即刻由专人取血( 眼球取血) 2 m l ，部分注入试管中，用于测红细 胞的s o d 、g s h _ - p x 、m d a 值，按试剂盒说明进行操作后，用7 2 2 分光光度计 进行比色处理。 样本的前处理：将采好的以加入肝素抗凝的血液取5 0 u l ，冲入盛有l m l 生理盐水的玻璃离心管中，2 0 0 0 转m i n 离心3 m i n ：用玻璃吸管吸去上清液， 留下沉淀的红细胞；加入双蒸水0 2 m l ，混