（分析化学专业论文）单分子荧光光谱成像及单分子漂白行为研究.pdf

硕十学位论文 摘要 单分子荧光光谱能够识别和检测多组分体系中被不同荧光基团标记的分子， 监测微环境变化等。利用单分子荧光光谱研究荧光共振能量转移有助于提高检测 准确率，实现单通道荧光共振能量转移检测。荧光共振能量转移能够分辨在1 1 0 n m 范围内的荧光信号，弥补了近场和远场纳米显微镜检测范围的空缺，常用于研究 分子构象变化，分子相互作用和分子动力学。 在单分子荧光检测中很多生物分子自身不发荧光，需要用荧光团标记。荧光 团漂白制约了其单分子检测的应用，例如荧光团的漂白使其不能实现长时间在细 胞中的追踪。因此研究荧光团的漂白机理对于解决这些问题能够提供有力的理论 依据。以往对荧光团漂白的研究中集中在抑制荧光团漂白的因素，而很少研究荧 光团漂白前的荧光强度变化，本文涉及了该内容。 本文使用普通宽场荧光显微镜主要从单分子荧光光谱、蛋白质问的荧光共振 能量转移和单荧光染料分子的漂白行为三个方面展开研究： 1 、单分子荧光光谱研究。在普通宽场荧光显微镜e m c c d 芯片的前方放置透 射光栅，它将物镜收集的发射光分为一个零极点和一个一级条纹。考察了a l e x a4 8 8 标记的b s a 和a l e x a5 9 4 标记的a n t i b s a 及q d 5 2 5 的光谱信息，测定了光谱分辨 率。零级点的位置对应未放置光栅前的光斑位置，它和一级条纹荧光最强处的像 素差值能够通过光谱分辨率转化为发射光波长。将一级条纹进行拟合后得到和系 综光谱吻合的单分子荧光光谱。单分子荧光光谱能够用于分子识别，检测荧光共 振能量转移，研究量子点蓝移等。 2 、蛋白质之间的荧光共振能量转移研究。荧光共振能量转移技术广泛用于研 究分子构象变化、相互作用和分子反应动力学。本工作利用透射光栅的分光作用， 以生物化的牛血清白蛋白和链酶亲和素为研究体系初步实现了蛋白质之间荧光共 振能量转移的单通道检测。 3 、在单分子水平上研究了罗丹明b 染料的漂白行为。在不同溶剂和不同p h 值的缓冲液中考察溶剂极性和离子电荷浓度对罗丹明b 分子在单分子水平和系综 水平的影响。初步得出罗丹明b 在不同溶剂中的荧光强度在单分子水平和系综水 平不一致的结论。同时研究了罗丹明b 在不同极性溶剂和不同电荷浓度的缓冲溶 液中单步漂白行为。考察了罗丹明b 在荧光漂白前的荧光强度变化，得出了罗丹 明b 单步漂白在荧光漂白前的荧光强度变化是一个随时间变化的线性函数并且该 函数的斜率服从洛伦兹分布的结论。 关键词：单分子；荧光光谱；荧光共振能量转移；罗丹明b ；漂白 i i 单分子荧光光谱成像及单分了漂白行为研究 a bs t r a c t s i n g l em o l e c u l es p e c t r u mc a nb eu s e dt od i s t i n g u i s ht h em o l e c u l e sl a b e l e dw i t h d i f f e r e n tf l u o r o p h o r e si nt h em u l t i c o l o rc o m p o n e n t ss y s t e m ，t oo b s e r v ea n dd e t e c tt h e c h a n g eo fm i c r o - e n v i r o n m e n t t h es i n g l em o l e c u l es p e c t r u mi sh e l p f u lt oo b t a i n e dt h e m o r ee x a c tr e s u l to ff l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ( f r e t ) a n dc a nd e t e c tt h e f r e tw i t hs i n g l ed e t e c t o r f r e tc a nm e a s u r et h ed i s t a n c ei nt h e1 - 10 n mr a n g ea n di t f i l l su pt h er e s o l u t i o nb l a n ko ft h en e a ra n dt h ef a rf i e l do p t i c a ln a n o - m i c r o s c o p e f r e th a sb e e ne x t e n s i v e l yu s e dt om e a s u r ed i s t a n c ec h a n g e sa n dk i n e t i c sa n dd e t e c t t h ei n t e r a c t i o no ft h em o l e c u l e si nv a r i o u sb i o m o l e c u l a rs y s t e m s i nt h e s i n g l e m o l e c u l ed e t e c t i o n ，a l t h o u g hh a r d l ya n yb i o l o g i c a lm o l e c u l e i n t r i n s i c a l l yf l u o r e s c e sa tc o n v e n i e n te x c i t a t i o nw a v e l e n g t h s ，ab i o m o l e c u l ec a nb e l a b e l e dw i t hf l u o r o p h o r e ( s ) i nac o n t r o l l e dm a n n e rf o ro p t i c a li n v e s t i g a t i o n t h e s t u d y o fb i o m o l e c u l e sh a sb e c o m ea n i m p o r t a n ta p p l i c a t i o n o fs i n g l e m o l e c u l e d e t e c t i o n h o w e v e r , t h et i m es c a l e sa n dt h er a n g eo fo p t i c a le x p e r i m e n t so nb i o l o g i c a l s y s t e m sa tr o o mt e m p e r a t u r ea r ec o n s i d e r a b l yl i m i t e db yp h o t o b l e a c h i n g f o re x a m p l e ， t h ep h o t o b l e a c h i n gl i m i t st h e l o n g t i m et r a c k i n g o ft h ef l u o r o p h o r ei nt h ec e l l b l e a c h i n gi sa ni r r e v e r s i b l ec o n v e r s i o no faf l u o r e s c e n tm o l e c u l eo rp a r t i c l ei n t oa n o n f l u o r e s c e n t e n t i t y t h er e s e a r c ho np h o t o b l e a c h i n gc a np r o v i d et h eh e l p f u lt h e o r y f o u n d a t i o n f o rs e v e r a ld e c a d e s ，t h er e s e a r c h e r sc o n t r i b u t et od i s c o v e r yt h ep r i c i p l eo f t h ep h o t o b l e a c h i n go ft h ef l u o r o p h o r e s h o w e v e r ，u n t i ln o w ，m o s to ft h ep r i n c i p l ea r e n o tc l e a r i nt h ef o r m e rr e s e a r c ho ft h ep h o t o b l e a c h i n g ，m a n yw o r kf o c u so nr e s t r a i n i n g t h ep h o t o b l e a c h i n g ，b u tf e wr e s e a r c h e rs t u d i e do nt h ef l u c t u a t i o no ft h ef l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yb e f o r ep h o t o b l e a c h i n g i nt h i sw o r k ，s e v e r a lf a c t o r st h a t c a ne f f e c tt h e p h o t o b l e a c h i n go ft h es i n g l er h o d a m i n eb m o l e c u l ei sd i s c u s s e d o u rm a i nw o r k sa r ea sf o l l o w ： 1 、s t u d yo nt h es i n g l em o l e c u l ef l u o r e s c e n c es p e c t r u m b yp l a c i n go n e t r a n s m i t g r a t i n gb e f o r et h et h ec h i po ft h ee m c c d i nt h ew i l d f i e l df l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y , o n ez e r oo r d e rp o i n ta n do n ef i r s to r d e rs t r e a kc a nb eo b t a i n e d t w of l u o r o p h o r s ，t h e a l e x a4 8 8a n dt h ea l e x a5 9 4 ，a r em o d e l st or e s e a r c ht h es p e c t r u mr e s o l u t i o n ，a n dt h e 0 d 5 2 5i su s e dt ov a l i d a t et h er e s u l to fs p e c t r u mr e s o l u t i o n t h ep o s i t i o no ft h ez e r o o r d e rp o i n ti ss a m ea st h ep o s i t i o nw i t h o u tt h eg r a t i n gi nt h eo p t i c a lp a t h t h e d i f f e r e n c eb e t w e e nt h eh i g h e s tf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo ft h ez e r oo r d e rp o i n ta n dt h e f i r s to r d e rs t r e a kc a nb ec h a n g e di n t ol i g h tw a v e l e n g t hb ym u l t i p l yt h ef a c t o ro f s p e c t r u mr e s o l u t i o n t h e nt h es i n g l em o l e c u l es p e c t r u mc a nb eo b t a i n e da n di t i s c o n s i s t e n tw i t ht h ec o r e r e s p o n d i n gb u l kf l u o r e s c e n c es p e c t r a t h es i n g l em o l e c u l e i i i 硕士学位论文 s p e c t r ac a nu s e dt od i s t i n g u is ht h em u l t i c o l o rc o m p o n e n t ss y s t e m ，t od e t e c t t h e f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ( f r e t ) ，t or e s e a r c ht h el o c a l i z e ds u r f a c e p l a s m o nr e s o n a n c ea n ds oo n 2 、r e s e a r c ho nt h ef r e to fp r o t e i n s t h ef l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g y t r a n s f e rh a sb e e ne x t e n s i v e l yu s e dt or e s e a r c ht h es t r u c t u r ec h a n g eo ft h eb i o m o l e c u l e ， t h ed y n a m i c sa n dt h ei n t e r a c t i o no fm o l e c u l e s i nt h i sw o r k ，w eu s et h et r a n s m i t g r a t i n gt od e t e c tt h ef r e tw i t hs i n g l ed e t e c t o rt oo b s e r v et h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h e b s al a b e l e dw i t hb i o t i na n dt h es t r e p t a v i d i n 3 、r e s e a r c ho nt h ep h o t o b l e a c h i n go fr h o d a m i n eb a tt h es i n g l em o l e c u l el e v e l w eo b s e r v et h ed i f f e r e n c ei nt h ee m a m b l ea n ds i n g l em o l e c u l e1 e v e lo fr h o d a m i n eb d i s s o l v e di nt h ee n t h a n o l ，w a t e ra n df o u rd i f f e r e n tp hv a l u eb u f f e r a l s o t h e p h o t o b l e a c h i n go ft h er h o d a m i n ebi sr e s e a r c h e dt oo b s e r v et h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y b e f o r eq u e n c h i n g ，a n do n ec o n c l u t i o nw a so b t a i n e dt h a tt h ec h a n g eo ft h ef l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yh a sal i n e a rr e l a t i o n s h i pw i t ht i m e a n dt h ed i s t r i b u t i o no ft h es l o p eo ft h e s i n g l es t e pp h o t o b l e a c h i n ga c c o r d st ol o r e n zd i s t r i b u t i o n k e yw o r d s ：s i n g l em o l e c u l e ；f l u o r e s c e n c es p e c t r u m ；f l u o r e s c e n c e r e s o n a n c e e n e r g yt r a n s f e r ( f r e t ) ；r h o d a m i n eb ；p h o t o b l e a c h i n g i v 硕士学位论文 第1 章绪论 单分子检测( s i n g l em o l e c u l e sd e t e c t i o n ，s m d ) 方法是在上个世纪8 0 年代 随着扫描隧道显微镜、近场扫描、荧光探针、光摄技术的出现迅速发展起来的一 种技术，它将分析化学检测推到了最高灵敏限度。单分子检测可以揭示出隐藏在 大量分子中的信息，用于分子识别，分子定量，对分子之间反应实时监测，探索 生物大分子的分子结构和功能信息及探索分子微环境信息。这些都是传统检测方 法很难甚至无法实现的。单分子检测高灵敏，快速，实时检测的优势为其在化学， 生物学，医学和纳米材料科学等前沿学科提供一种强有力的手段。 目前可用于单分子检测的研究方法主要有光学方法和化学方法。其中光学方 法包括扫描近场光学显微镜、表面增强拉曼光谱、共聚焦荧光显微法等；化学方 法包括电化学检测、化学发光检测等。此外扫描隧道显微镜也用于单分子检测。 这些检测单分子的方法都有共同的特征：( 1 ) 高空间分辨能力：( 2 ) 单分子性质和行 为的捕获能力；( 3 ) 能收集微弱信号并放大检测，并做相应的分析处理以获取可信 的信息【lj 。 荧光单分子检测技术是用荧光标记来观察和追踪单个分子的分析方法。单分 子荧光光谱检测能够用于识别多组分体系中的分子，能够为单分子检测提供更多 的信息，在单分子检测中也常被利用。 由于单分子检测的高灵敏检测能力，这一技术已经引起了众多科学家尤其是 分析化学家的兴趣。但是这一技术在国内起步较晚，截止2 0 0 9 年6 月2 3 日2 2 ： 0 0 时，从w e bs c i e n c e 上用s i n g l em o l e c u l e 搜索数据显示文章数量为4 2 ，5 4 2 ，而 由中国地区发表的论文数量只有2 ，5 9 6 篇。起步较晚，发展较为缓慢，但同时也给 这一领域的科研工作者提供了更多了研究机会和研究空间。 1 1 单分子荧光成像方法 单分子成像检测方法已有大量的文献对其进行了报道 2 - 6 】，但是过去数年中， 虽然光源发展成可以采用多重激发光，检测器发展的更为灵敏，但是单分子的检 测方法并没有太大改变1 1 。比较大的进步主要体现在三个方面。一是标记方法的 发展提供了能够检测特种分子的方法；二是能够研究更为复杂的分子体系；三是 发展了能够获得更详实信息的分析工具【1 2 , 1 3 】。 本节中，主要针对两种使用较多的显微镜类型，单分子检测中采用的检测器 和常用来标记样品的荧光团以及常用的提高单分子检测灵敏度的方法进行了论 述。 单分了荧光光谱成像及单分了漂 i 行为研究 1 1 1 显微镜 在分析化学领域，首次试图检测单分子的探索，可以追溯到一个世纪前。p e r r i n 试图去观察单个荧光分子。尽管没有成功，但是开启了单分子检测的先河【1 4 】。1 9 2 8 年，s y n g e 提出开发能够分辨纳米尺度显微镜的构想，然而这一设想在5 0 年后， 由于近场光学显微镜的出现，才得以实现【1 5 。7 1 。随后，扫描隧道显微镜1 8 1 和原子 力显微镜【1 9 1 的出现弥补了电子显微镜的不足，实现了对物质表面分子的研究 2 0 , 2 1 。 三十多年来，随着检测器的发展检测灵敏度越来越高，已经能够实现分子水平上 的检测【2 2 1 、成像1 2 3 1 和操控2 4 1 等，并能在表面【2 5 1 、固体2 6 1 、液体【2 7 1 和流体膜f 2 8 】上 以及单个活细胞【2 9 , 3 0 中追踪单个荧光团。h i r s c h f e l d 在1 9 7 6 年用全内反显微镜成 功观察到标有8 0 1 0 0 个荧光团的单个抗体分子【3 l 】。借助了标准流体细胞计数仪实 现了常温下单个荧光团的检i 9 1 j 2 7 , 3 2 】。利用近场光学扫描显微镜实现了常温下单分 子成像【2 3 1 ，很快宽场共聚焦也用于观察单分子【3 3 1 。宽场荧光成像是目前研究二维 和三维单分子扩散示踪的主要方法【2 8 3 0 】。 本论文主要讨论两种较为常用的显微镜，共聚焦显微镜和宽场荧光显微镜。 共聚焦显微镜的构想是1 9 5 3 年美国学者马文明斯基提出，但是在3 0 后，利 用激光作为光源，才实现了这一构想。图1 1 为共聚焦显微镜的结构简图。所谓共 聚焦是点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上， 那么反射光通过原透镜应当会聚回到光源，这就是共聚焦。共聚焦显微镜通过一 个位于光路中的小孔来实现。激发光被物镜收集后聚焦在一个很小的区域，约o 5 1 几，通过位于焦平面后的小孔激发样品。如果被检测样品在焦点上，那么其发射 光能够再次通过小孔进入物镜，按照原来的光路返回被物镜收集【3 5 1 。共聚焦显微 镜通过移动透镜系统可以对一个半透明的物镜进行三维扫描，其检测深度可到1 0 0 p m 。所以在单分子检测中激光共聚焦显微镜常用来进行细胞试验。利用共聚焦显 微镜研究标记物进入细胞的过程，研究细胞的生命机制等等。利用共聚焦显微镜 研究被羧氨酸修饰的量子点标记的间充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l ) 进入 小鼠图内的过程3 6 1 。研究人类细胞在多空水凝胶中的黏合、分散和繁殖过程3 7 1 。 用膜联蛋白( a n n e x i nv ) 修饰量子点，让量子点能够去特异性的识别凋亡细胞， 利用量子点不易漂白的特性研究细胞生命过程【3 引。用荧光染料修饰的链酶亲和素 ( s t r e p t a v i d i n ) 不能独立进入细胞，但当它与用生物素修饰的纳米管结合后可以 进入细胞，利用共聚焦显微镜研究了这一过程【39 1 ，研究量子点通过细胞膜表面的 过程等等 4 0 1 。 硕上学位论文 恸| 嚣 ；：。，| 、孑 。 终二，j 磐 ： 小孔 j； c 二物镱光栏 z 蹴黝样晶 焦面 茬焦蕊上 图1 1 共聚焦显微镜示意图【3 4 】 全内反射技术早在19 81 年已有文献报道【4 1 | 。全内反射显微镜利用光在不同介 质界面处产生全反射后在介质的另一面产生消逝波的原理，观察极靠近全反射面 被消逝波激发的样本区域。当光从光密介质入射到光疏介质中时，如果入射角度 大于临界角，则折射光不会穿过光疏介质而是发生反射，从光密介质中反射出来。 光在光密和光疏介质表面产生消逝波能激发2 0 0n m 的深度，大大减小了激发体积， 减少了背景噪音对信号的干扰。经过多年发展，在激光光路，激发角度，物镜n a 值并使之浸油及盖玻片等各方面都不断改良。全内反荧光显微镜包括棱镜型全内 反射显微镜和物镜型全内反射显微镜。图1 2 为全内反射荧光显微镜( t o t a li n t e r n a l r e f l e c t i o nf l u o r e s c e n tm i c r o s c o p e ，t i r f m ) 的结构简图，a ) 为棱镜型全内反显微 镜，b ) 为物镜型全内反显微镜。在棱镜型全内反射荧光显微镜系统中，入射光通 过棱镜进入玻璃水溶液界面，在界面另一侧的显微镜物镜收集被激发荧光团发射 的荧光。该体系搭建容易，且造价比较低。在探测上，该系统背景噪声极低，能 够得到高质量成像，但是放置样品的空间受到棱镜的限制，不利于研究活细胞和 组织等较厚的样品。物镜型全内反射荧光显微镜使用高数值孔径的物镜作为荧光 信号的接受器，同时又作为发生全内反射的光学器件，样品的放置非常方便，并 且可与多种技术联用，例如纳米操纵、光镊技术、原子力显微镜等。全内反射显 微镜可以应用可以分为细胞生物学上的应用和分子生物学上的应用。用于细胞生 物学的研究包括细胞膜表面反应研究【4 引，细胞内吞和胞吐作用【4 4 1 ，定位追踪细胞 膜表面上的分子【45 1 ，病毒通过细胞膜入侵细胞的过程【4 酬，蛋白通过细胞膜的过程 4 7 1 等等。分子生物学上的应用包括蛋白与细胞相互作用，蛋白与蛋白相互作用【4 引， 生物大分子的追踪【49 1 ，基因表达分析【5 0 , 5 1j 等等。 缕基一 篇燮一 单分子荧光光谱成像及单分子漂白行为研究 悻本挤 反射光 桦片界面的消逝渡 睫道譬小：f 2 0 0 h m 片折射率较大 入射光 入射角大于连接角 样品折射率较小 b ) 图1 2 全内反显微镜结构原理图【4 2 】 a ) 棱镜型全内反射显微镜原理图；b ) 物镜型全内反射显微镜原理图 落射式荧光显微镜在普通显微镜的基础上结合高数值孔径的物镜和高灵敏度 的c c d 来实现单分子检测。它结构简单，易于操作，在单分子检测中应用也非常 广泛。 1 1 2 检测器 常用的检测器有雪崩光电二极管( a v a l a n c h ep h o t o d i o d e ，a p d ) 、光电倍增 管( p h o t o m u l t i p l i e rt u b e ，p m t ) 和电子偶合器件( c h a r g e c o u p l e dd e v i c e ，c c d ) 。 单分子检测根据使用检测器的个数分为单通道检测和多通道检测。在实验中采用 一个检测器即为单通道检测，采用两个及以上的检测器即为多通道检测。根据使 用检测器类型的不同又可将检测方法分为点检测和成像检测。点检测通常使用雪 崩二极管或者光电倍增管进行光子计数，成像检测则使用电子耦合器件做检测器。 共聚焦和近场扫描光学显微镜装置中常使用点检测，这类装置可以进行实时检测， 用来反应荧光寿命信息【33 1 。宽场成像检测使用落射式显微镜、非共聚焦显微镜2 8 】 以及全内反显微镜”引。因为所有的像素值能够在同时被记录，成像检测能够用于 粒子追踪研究，对研究单个粒子的同步观察要优于点检测。但同时由于噪音限制 了每帧图片的传送速率，所以限制了像检测中时间分辨率。如果成像范围比较小， 帧的传送速率可以相应得到提高【2 引。但是不管采用哪种检测器都要根据实验要求 使所搭建装置在时间分辨率和量子产率之间处于平衡。例如，尽管光电倍增管的 量子产率只有1 0 2 0 ，但是它有很好时间分辨率( 约2 0p s ) 【5 3 】。同样硅质a p d 在可见光区量子产率能够达到7 0 ，但是时间分辨率却有4 0 0p s 。在宽场成像检 测中采用的检测器c c d 有高达9 0 的量子产率，但是噪音却限制了它的读出效率， 从而使它的时间分辨率受到限制 5 4 , 5 5 】。增强型c c d ( i c c d ) 克服了噪音对信号的 限制，e m c c d ( e l e c t r o nm u l t i p l y i n gc c d ) 的出现使图片传送速率达到1 0m h z 【5 6 】。 硕i ：学位论文 1 1 3 荧光团 通过荧光成像的方法进行单分子检测，需要在观察对象上标记荧光基团( 或 者观测对象本身即是荧光物质，如荧光蛋白) ，运用高灵敏检测器捕捉发射光光 子。荧光标记基团量子产率要高，易被激发，荧光强度波动小，对标记的宿主分 子影响小。如果是用于f r e t 的荧光基团还要满足以下条件：( 1 ) 供、受体的激 发光要分得足够开；( 2 ) 供体的发射光谱与受体的激发光谱要重叠：( 3 ) 供、 受体的发射光谱要足够分得开【57 1 。当前标记的许多有机染料吸收光谱较窄而发射 光谱较宽，并且普遍存在光漂白现象，这样便会造成成像过程中背景噪音高，观 测时间受限制，使其在单分子成像中的应用受到限制。量子点的出现解决了有机 染料易漂白的难题。量子点出现以来至今已经在单分子检测中被广泛应用。荧光 染料除了易漂白之外，还会遇到眨眼现象。比如c y 5 这种常规染料的眨眼现象严 重妨碍了它的使用。r a s n i k 等人【58 】发现在t r o l o x 和去氧酶的联合体系中消除了 c y 5 的眨眼现象，减弱了光漂白，从而扩大了它在单分子检测中的应用。同时针 对量子点的眨眼现象及长时间照射后发生量子点蓝移的现象，本实验室c h e n 等人 【59 】也研究了一种新的克服量子点蓝移和眨眼的方法。近年来有人将染料双标记的 方法引入单分子研究领域，将两种可以发生荧光共振能量转移的染料标记在同一 个生物大分子上对其构象变化和动力学进行研究，提高了检测效率【6 。常用的生 色团有量子点、c y 3 、c y 5 、a l e x a 4 8 8 、a l e x a 5 9 4 、a l e x a 5 3 2 、t m r 、t r 、y o y oi 、 及荧光蛋白如绿色荧光蛋白( g f p ) 等。 1 1 4 提高单分子检测效率 曾有人说过“单分子检测能力的高低与其说是检测灵敏度的提高，不如说是 背景噪音的降低 6 1 】，从一定程度上反映了单分子检测除了使用高能量的光源和 高灵敏的检测器之外，还需要有效的降低背景噪音。单分子检测中样品溶液的浓 度可达10 0 2m o l l 。在稀溶液中，背景值降低从而使信噪比得到提高。因为单分子 信号与探测体积无关，而背景则于探测体积成正比，所以为减少单分子检测时背 景杂散光的干扰，采用了降低探测体积这一有效途径。因此，要获得理想的信噪 比需要将激发体积最小化。全内反显微镜激发体积较小，提高了灵敏度，在单分 子检测中广泛应用。高数值孔径的物镜由于可以尽可能的减少激发体积并收集由 单分子发出的尽可能多的光子也被用于单分子检测。在检测体系中，为了有效减 低噪音获取良好的信号，采用了高效的滤光块和二色分光镜。同时高灵敏的检测 器( 如用在共聚焦显微镜中的雪崩二极管和宽场荧光显微镜中的i c c d 或者 e m c c d ) 也能使采集信号效果更好【| 7 1 。实验中有效的清洗玻片，去除玻片本身的 荧光物质也是有效的减低背景噪音的方法。本实验l i u 6 2 】等人对比了几种玻片清洗 方法对d n a 吸附率的影响，提供了有效的玻片清洗方法。对玻片进行预漂白，将 单分了荧光光讲成像及争分了漂白行为研究 实验所用玻片在滴加样品之前用紫外灯照射0 5 1h ，能够使残留的荧光物质漂白， 以减小其对信号的干扰。在使用成像检测时，有效的调整曝光时间，使累计光子 数增加，也能得到更好的检测效果。 1 2 单分子检测的适用体系 单分子检测方法的快速发展使其在分析检测中的应用随之进步，为科学工作 者解决了以往的检测方法不能克服的难题。单分子成像检测应用体系可以分为在 溶液体系中的检测，界面上的检测和细胞内检测。 1 2 1 溶液体系 单分子检测在溶液体系中运用的最多。1 9 7 6 年h i r s c h f e l d 3 1 1 等人用8 0 1 0 0 个 荧光素异硫氰酸盐分子标记到单个抗体分子上实现了单个生物分子的检测。随着 技术的发展，第一次检测到单个染料分子式在1 9 9 0 年，在溶液体系中检测到了单 个罗丹明6 g 分子【27 1 。 共聚焦显微镜在溶液中实现单分子检测应用始于1 9 9 4 年【6 3 】。随后利用共聚焦 显微镜实现了在溶液中研究被荧光染料标记的脱氧核酸，d n a 等单生物分子的研 究。同时该方法还实现了在溶液中对分子动力学的研究【6 4 , 6 5 。全内反显微镜基于 其较低的激发深度，大大降低了背景噪音，其光源的功率可以调节，为单分子在 溶液中的检测提供了优越了技术条件。利用全内反显微镜检测溶液中的分子马达 的运动f 5 2 , 6 6 】，生物大分子间的相互作用，蛋白分子的相互作用 6 7 , 6 8 】、r n a 和d n a 与蛋白质的相互作用6 9 1 、d n a 与d n a 的相互作用7 、酶反应7 1 , 7 2 1 和分子构象动 力学 7 3 , 7 4 】。 1 2 2 界面 分子在界面的行为影响了界面的组成，改变了界面的性质7 5 , 7 6 】，分子在界面 的吸附使在生物和化学体系中起重要作用。所以单分子检测在界面上行为也研究 较多。蛋白质和d n a 等生物大分子和纳米颗粒、纳米棒等等单粒子在液一固界面， 液液界面和液气界面的行为在单分子检测中研究也比较多。界面上的单分子检测 主要有蛋白质在界面上研究【7 7 , 7 8 j ，d n a 在界面上研究【7 9 1 ，以及纳米颗粒在界面的 行为研究【8 0 1 。 1 2 3 细胞体系 单分子检测在细胞体系中的应用能够检测细胞内分子的定位、运动、以及复 合物的合成，分子进入细胞的机理等等，为人类生命科学提供可靠的手段和理论 支持。首次报道活细胞中单分子成像研究了在细胞表面表皮生长因子与表面生长 硕l ：学位论文 因子受体之间的结合【8 1 1 。主要可以分为生物大分子在活体细胞中的检测【8 2 ，8 3 】和分 子、病毒通过细胞膜表面的过程等等4 0 , 8 4 】。 1 3 单分子荧光共振能量转移应用 单分子成像检测解决了在生物物理学，生物化学和生物学领域中长期困扰的 问题，使科学家能够解决分子在生物过程中的动力学和相互作用【5 引。生物大分子 的结构是分子生物学研究的重点之一。分子特定的功能依赖于它所特有的结构。 为了全面深入地了解生物大分子的功能，需要全面地了解生物大分子的结构，这 对于研究和分析生物大分子的功能至关重要，一直以来都是广大科研工作者研究 的热点。生物大分子分子从非折叠态到折叠态的转变包含了不为人知的中间态， 这一中间态用常规的系综方法无法检测出。而荧光共振能量转移技术由于其“分子 尺”效应，可以检测1 1 0n m 范围内分子构象变化和光谱波动，能够用来研究生物 大分子的折叠中间态。 在生物大分子或两个相互作用的分子上标记两个光谱重叠的生色团，其中一 个受到激发时，由于偶极一偶极的相互作用，另一个生色团也会发出荧光。这一 过程称荧光共振能量转移。受到激发的生色团命名为供体，另一生色团为受体。 单对荧光共振能量转移是指标记在一个分子上的两个生色团间发生荧光共振能量 转移。 测量供受体的发射光强，可以计算f r e t 的效率，通过进一步计算得知生色团 间的距离。生色团间距离的变化可以反应生物大分子在生命活动中的构象变化。 1 3 1 生物大分子构象变化研究 单对荧光共振能量转移( s p f r e t ) 用于研究分子内和分子间的构象变化和折 叠。分子内研究主要是大分子的起伏和稳定、蛋白质分子内部特定点位之间的距 离、折叠和去折叠及催化作用时酶结构改变；分子间的研究主要是受体与配体结 合、酶与底物结合和分离及马达蛋白的运动【57 1 。利用变性剂是蛋白质构象发生变 化，使其发生折叠或去折叠。在这一过程中，结合的蛋白质或者蛋白质本身不同 位点之间的距离发生变化，导致供体和受体之间的距离也随之改变，造成f r e t 效率的变化。由f r e t 效率的变化可以研究蛋白蛋白质构象变化。 利用变性剂盐酸胍( g u a n i d i n i u mc h l o r i d e ) 使蛋白质发生变性。由f r e t 效 率的变化推测蛋白质构象上的变化。d e n i z 等人【85 】用s p f r e t 方法对胰凝乳蛋白酶 抑制剂( c h y m o t r y p s i ni n h i b i t o r2 ，c 1 2 ) 分子在变性剂盐酸胍作用下发生不同程 度变性的现象进行了研究。研究了单个c 1 2 分子折叠，检测了由突变引起的蛋白 质稳定性的变化。a n t i a 等人【8 6 】用a l e x a 4 8 8 和a l e x a 5 9 4 作为供体和受体标记纤维 粘连蛋白( f i b r o n e c t i n ) 分子，运用成像的方法，检测到单个纤维粘连蛋白分子的 节分了荧光光谱成像及单分了漂白行为研究 荧光波动强度的变化。分别在变性剂盐酸胍浓度为0m o l l ，lm o l l ，8m o l l 时 测量f r e t 效率。随着变性剂浓度增加，由于离子间相互作用使纤维粘连蛋白分 子二聚体紧凑结构被破坏掉，纤维粘连蛋白分子打得更开，f r e t 效率也随之变小。 除了用于蛋白构象研究之外，f r e t 也用于研究d n a 和r n a 的构象变化。 l e m a y 等人【8 7 】研究了用2 氨基嘌呤荧光素对c y 3 荧光团标记的腺嘌呤核糖开关折 叠作用的影响。个别适配体分子在折叠和去折叠速率中表现出了很大的变异性， 腺嘌呤的存在减少了这种情况。在核糖开关中，由于终止剂构象竞争使得腺嘌呤 键合区域不能发生折叠。因此，核糖开关的功能取决于配合体键合的相关速率以 及转录过程。z h u a n g 等人【8 8 】用s p f r e t 研究了四膜虫核酶的折叠反应。用c y 3 和 c y 5 做供体和受体，分别标记在四膜虫核酶的5 端和3 端，观察单个r n a 的f r e t 的变化，研究了p 1 双链的停靠和去停靠的折叠过程。 1 3 2 生物大分子动力学研究 针对动力学上研究也主要是根据f r e t 效率的变化而开展。z h u a n g 等人【8 9 】利 用s p f r e t 研究了发夹型核酶的停靠和去停靠过程，从f r e t 的效率不同推测出了 野生型的双向键和核酸停靠的速率常数只有一个，而去停靠的速率常数有四个。 a o k i 等人【9o 】用绿色荧光蛋白( g f p ) 做供体标记0 【e n o 和d e n o ，罗丹明作为受 体标记d n a 片段，用f r e t 的方法研究相互间的动力学，讨论了影响最大联合速 率的因素。也可利用变性剂使酶发生变性研究其动力学。k u z m e n k i n a 等人【9 l 】采用 盐酸胍做变性剂，研究了r n a s e h 酶的动力学。 1 3 3 分子相互作用 1 3 3 1 蛋白与蛋白作用 利用s p f r e t 研究影响蛋白之间键和的影响因素和键和的中间过渡态等。l i u 等人【9 2 j 用s p f r e t 的方法研究了用f l a s h 做供体标记的钙调蛋白( c a l m o d u l i n ， c a m ) 与t e x a sr e d 做受体标记的c 2 8 w 之间反应的构象动力学。s p f r e t 的研究 显示出c a m 和c 2 8 w 的反应存在一个中间过渡态。测量中间态f r e t 效率推测出 c a m 和c 2 8 w 联合体n 基末端区域之间的距离分布很宽，这表明了在两个可区分 的构象态之间有构象的波动。s c h l e i f e n b a u m 等【9 3 】在普列克底物蛋白中标记上荧光 蛋白对，检测蛋白质激酶c 的活性，在激酶作用下磷酸化时，普列克底物蛋白结 构发生变化，发生f r e t ，由荧光光谱的变化，可以反映该过程发生的程度。l i 等人p 4 j 用5 7 3 n m 发射波长的量子点，和6 3 8 n m 发射波长的量子点分别标记兔抗 i g g 和羊抗兔i g g ，观察了量子点间的f r e t 现象，讨论了p h 和离子强度对量子 点和兔- i g g 键合的影响，得出了量子点和兔l g g 的反应是静电键合反应的结论。 硕l ：学位论文 利用s p f r e t 研究细胞体系中的蛋白相互作用能够探索细胞机制。s a k o 等人【8 1 】 用f r e t 的方法证明在活体细胞中e g f 发生二聚。将c y 3 一e g f 和c y 5 一e g f 加 入到细胞中，如果不发生二聚作用，由于标记在e g f 上的c y 3 和c y 5 相距较远， 难以观测到f r e t 现象。用5 3 2n m 的激光激发c y 3 一e g f ，利用双通道显微镜获 得荧光图象，将在5 8 0n m 和6 7 0n m 处同时获得荧光图象叠加后得到的图象可以 说明荧光共振能量转移的发生。m o r s e 9 5 1 用r l u c 和e y f p 标记蛋白，用生物荧光 共振能量转移( b i o l u m i n e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ，b r e t ) 的方法研究 了植物和单细胞中的蛋白与蛋白相互作用。 1 3 3 2 蛋白与d n a 作用 b o k i n s k y 等人【9 6 】在b 1 5r n a 上标记c y 3 和c y 5 荧光团，用s p f r e t 的方法探 测了b 1 5r n a 和c p b 2c o f a t o r 键合之前的构象动力学，由c p b 2 键合诱导产生的 构象转变，研究了b 1 5r n p 的折叠动力学。表明了c b p 2 和目标r n a 的键合在两 个模型下进行：一个是非特异性模型，形成快速，而且诱导产生了很大的r n a 的 构象波动，f r e t 效率在0 1 0 9 之间浮动；另一个是特异性模型，形成了慢而且 稳定的天然r n a 结构，f r e t