（环境科学专业论文）异养硝化好氧反硝化菌的筛选与脱氮性能研究.pdf

声明尸i 凋 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在本学 位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发表或公布 过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学历而使用过的 材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均已在论文中作了明 确的说明。 研究生签名：锣年歹月舻日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或上 网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送交并授权 其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对于保密论文， 按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：州3 年3 月烀e t 硕士论文 异养硝化好氧反硝化菌的筛选与脱氮性能研究 摘要 本研究从污水处理厂二沉池污泥及垃圾填埋场滤液底泥中成功筛选出两株脱氮效 果良好的异养硝化好氧反硝化菌，将其命名为h y 2 和l y l 。经生理生化鉴定和菌株 1 6 sr d n a 序列分析，确定菌株h y 2 和l y l 分别为不动杆菌( a c i n e t o b a c t es p ) 和恶 臭假单胞茵( p s e u d o m o n a sp u t i d a ) 。 菌株的异养硝化特性研究表明：h y 2 和l y l 在去除n h ：- n 的同时能够同步去除 有机物。h y 2 对n h ：- n 和c o d 的去除率分别为7 8 和8 7 。l y l 对n h ：- n 和c o d 的去除率分别为7 0 和9 2 。研究h y 2 和l y l 在不同条件下去除n h ：- n 的能力，结 果表明h y 2 在p h 为8 0 ，接种量为5 ，摇床转速为1 5 0 r p m ，c n 为1 0 ，n h ：- n 浓 度为5 0 0 m g l ，培养温度为3 0 时对n h ：- n 的降解效果最好，去除率达到9 8 。l y l 在p h 为8 0 ，接种量为5 ，摇床转速为1 5 0 r p m ，c n 为8 ，n h ；- n 浓度为5 0 m g l ， 培养温度为3 0 时对n h ：- n 的降解效果最好，去除率达到8 6 。好氧条件下h y 2 和 l y l 在以硝酸盐为唯一氮源的培养基中能发挥反硝化作用并同步去除c o d ，h y 2 和 l y l 对n o ；- n 的去除率分别达到9 0 和1 0 0 ，c o d 的去除率均超过9 0 。h y 2 和 l y l 在以亚硝酸盐为唯一氮源的培养基中n o ；- n 的去除率分别可达7 5 和8 9 ，降 解过程中没有出现n h ：- n 和n o ；- n 的积累。在最优条件下，研究h y 2 和l y l 的脱 氮过程，经h y 2 降解的n h ：- n 6 3 通过异养硝化好氧反硝化作用脱离系统，3 2 转 化为菌体自身组成物质。经h y 2 降解的n h ：- n 6 6 通过异养硝化好氧反硝化作用脱 离系统，3 0 转化为菌体自身组成物质。菌株h y 2 和l y l 在降解n h ：- n 的过程中 n o ；- n 的积累量很低，几乎没有和n o ；- n 的积累，实现了同步硝化反硝化。 将菌株h y 2 强化应用于曝气生物滤池和s b r 反应器处理氨氮废水。当曝气强度 为4 0 m 3 ( m 2 h ) ，h r t 为1 2 h 时曝气生物滤池的出水水质达到城镇污水处理厂污染物 排放标准g b l 8 9 1 8 2 0 0 2 2 一级标准的a 标准。在完全好氧条件下，经异养硝化好 氧反硝化菌h y 2 强化后的s b r 反应器在稳定运行阶段对c o d 和t n 的去除率达到 8 5 和5 7 ，脱氮效果明显好于普通活性污泥，实现了同步硝化反硝化。 关键词：异养硝化好氧反硝化，分离鉴定，脱氮特性，生物强化 a b s t r a c t 硕士论文 a b s t r a c t t w oh e t e r o t r o p h i cn i t r i f i c a t i o n a e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o ns t r a i n s ，n a m e da sh y 2a n dl y l ， w e r ei s o l a t e df r o mt h ea c t i v a t e ds l u d g eo fs e c o n d a r ys e d i m e n t a t i o nt a n ka n ds e d i m e n to f l a n d f i l ll e a c h a t e ，r e s p e c t i v e l y i nt h el i g h to ft h e i rm o r p h o l o g i c a la n dp h y s i o l o g i c a lf e a t u r e s a sw e l la st h e16 sr d n a s e q u e n c e s ，h y 2a n dl y 1w e r ei d e n t i f i e da sa c i n e t o b a c t es p a n d p s e u d o m o n a s p u t i d a h e t e r o t r o p h i cn i t r i f i c a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so fh y 2a n dl y 1w e r ee x a m i n e d t h et w o s t r a i n sp r e s e n t e dt h ea b i l i t yo fc o i n s t a n t a n e o u sr e m o v i n go fb o t ho r g a n i ca n da m m o n i a n i t r o g e n h y 2r e m o v e d7 8 n h ：- na n d8 7 c o d l y lr e m o v e d7 0 n h ；- na n d9 2 c o d 1 1 1 er e m o v a le f f i c i e n c yo fn h ：- nb ys t r a i nh y 2r e a c h e d9 8 u n d e rt h eo p t i m a l c o n d i t i o n so fp h = 8 0 ，i n o c u l a t i o nq u a n t i t yo f5 ，o s c i l l a t i o ns p e e do f15 0 r p m ，c nr a t i oo f 10 a m m o n i an i t r o g e nc o n c e n t r a t i o no f5 0 0 m g la n dc u l t u r et e m p e r a t u r ea t3 0 c 1 1 1 e r e m o v a le f f i c i e n c yo fn h ：- nb ys t r a i nl y lr e a c h e d8 6 u n d e rt h es a m ec o n d i t i o ne x c e p t f o rc nr a t i oo f8 1 1 1 ea b i l i t i e so fs t r a i nh y 2t oa e r o b i cd e n i t r i f ya n dr e m o v ec o dw e r e i n v e s t i g a t e dw h e nn o i - nw a sp r o v i d e da s t h eo n l yn i t r o g e ns o u r c e t h er e m o v a l e f f i c i e n c i e so fn o ；- nb ys t r a i n sh y 2a n dl y1w e r e9 0 a n d10 0 ，r e s p e c t i v e l y a tt h e s a m et i m e ，c o dr e m o v a le f f i c i e n c i e so ft h et w os t r a i n sw e r ea l s oh i g ha n db o t hr e a c h e d 9 0 i nt h ef l a s k sc o n t a i n i n gn o ；- na s t h eo n l yn i t r o g e ns o u r c e ，t h en o ；- nr e m o v a l r a t i o so fh y 2a n dl y lr e a c h e d7 5 a n d8 9 ，r e s p e c t i v e l y u n d e rt h e o p t i m a l c o n d i t i o n s ，t h ep r o c e s so fr e m o v i n gn i t r o g e nw a sd o n e t h er e s u l t sc o n f i r m e dt h a t6 3 r e m o v a lo fn i t r o g e nw a sc h a n g e di n t og a so u to ft h er e a c t i o ns y s t e r mb ys t r a i nh y 2a n d 3 2 w a sa s s i m i l a t e di n t ot h ec e l l s s t r a i nl y lc h a n g e d6 6 r e m o v a lo fn i t r o g e ni n t og a s a n da s s i m i l a t e d3 0 i n t ot h ec e l l s b e s i d e st h ec o n c e n t r a t i o no fn i t r o g e nw h i c hc o n v e n e dt o n i t r i t ea n dn i t r a t ew a sn o th i 曲d u r i n gd e g r a d a t i o n t h e s er e s u l t ss h o w e dt h a ts i m u l t a n e o u s n i t r i f i c a t i o na n dd e n i t r i f i c a t i o nw a sh a p p e n e d t h ep r o c e s so fr e m o v i n ga m m o n i an i t r o g e nw a sd o n eb ys e t t i n gs t r a i nh y 2i nt h e b i o l o g i c a l a e r a t e df i l t e ra n dt h e s e q u e n c i n g b a t c hr e a c t o ri no r d e rt ot e s tt h e b i o a u g m e n t a t i o na b i l i t yf o ra m m o n i aw a s t e w a t e rt r e a t m e n t w h e nt h eb i o l o g i c a la e r a t e d f i l t e rw a so p e r a t e do nt h ec o n d i t i o no fa e r a t i o ni n t e n s i t yo f4 0 m 5 ( m 2 。h ) a n dm 盯o f12 h ，t l l e i n d e x e se f f l u e n tr e a c h e dt h ep r i m a r yd i s c h a r g es t a n d a r df o rw a t e rp o l l u t a n t sf r o mm u n i c i p a l w a s t e w a t e rt r e a t m e n tp l a n t ( g b18 918 2 0 0 2 ) i na e r o b i cc o n d i t i o n ，t h er e m o v a le f f i c i e n c i e so f c o da n dt nb yt h es e q u e n c i n gb a t c hr e a c t o rr e s p e c t i v e l yr e a c h e d8 5 a n d5 7 ，w h e nt h e r e a c t o rw o r k s s m o o t h l y t h e r e s u l t ss h o w e dt h a ts i m u l t a n e o u sn i t r i f i c a t i o na n d t t 硕士论文异养硝化好氧反硝化菌的筛选与脱氮性能研究 a c h i e v e di nt h er e a c t o r a n dt h en i t r o g e nr e m o v a le f f i c i e n c yo ft h ea c t i v a t e ds l u d g ew i t h b i o a u g m e n t a t i o nw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to ft h ec o n v e n t i o n a la c t i v a t e ds l u d g e k e yw o r d s ：h e t e r o t r o p h i cn i t r i f i c a t i o n - a e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o n ，i s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o n ， n i t r o g e nr e m o v a lc h a r a c t e r i s t i c ，b i o a u g m e n t a t i o n i i i 目录 硕士论文 目录 摘里要。i a b s t r a c t i i l 绪论1 1 1 水体中氮素污染的危害1 1 2 传统生物脱氮技术2 1 3 新型生物脱氮技术2 1 3 1 同步硝化反硝化3 1 3 2 厌氧氨氧化3 1 3 3 异养硝化4 1 3 4 好氧反硝化6 1 3 5 异养硝化好氧反硝化9 1 4 废水生物强化技术1 0 1 4 1 优势功能微生物的选育1 0 1 4 2 生物强化技术的作用方式1 0 1 4 3 生物强化技术的应用11 1 5 本课题研究内容及意义1 2 2 异养硝化好氧反硝化菌的分离及鉴定1 3 2 1 实验材料与方法1 3 2 1 1 分离源13 2 1 2 培养基及试剂13 2 1 3 菌株的分离1 4 2 1 4 菌株的鉴定14 2 1 5 菌株生长曲线的测定1 6 2 1 6 主要仪器1 6 2 1 7 分析方法16 2 2 结果与分析1 7 2 2 1 菌株的分离结果1 7 2 2 2 菌株的形态观察18 2 2 3 菌株的生理生化鉴定1 9 2 2 4 菌株的1 6 sr d n a 序列测定及系统发育分析2 0 2 2 。5 菌株的生长曲线2 2 2 3 本章小结2 4 3 异养硝化一好氧反硝化菌的脱氮特性2 6 t v 硕士论文 异养硝化好氧反硝化菌的筛选与脱氮性能研究 3 1 实验材料与方法2 6 3 1 1 培养基2 6 3 1 2 菌株的异养硝化特性研究2 6 3 1 3 菌株去除氨氮的条件优化2 6 3 1 4 菌株对硝态氮及亚硝态氮的去除2 8 3 1 5 菌株脱氮过程研究2 8 3 1 6 主要仪器2 9 3 1 7 分析方法2 9 3 2 结果与分析2 9 3 2 1 菌株的异养硝化特性2 9 3 2 2 菌株去除氨氮的条件优化3 0 3 2 3 菌株对硝态氮及亚硝态氮的去除能力3 9 3 2 4 菌株脱氮过程研究4 4 3 3 本章小结4 7 4 异养硝化好氧反硝化菌在废水脱氮中的强化应用。5 0 4 1 实验材料与方法5 0 4 1 1 菌株和活性污泥5 0 4 1 2 废水水质5 0 4 1 3 实验装置5 0 4 1 4 实验方法51 4 1 5 分析方法5 2 4 2 结果与分析5 2 4 2 1 曝气生物滤池的启动与运行结果分析5 2 4 2 2s b r 反应器的运行结果与分析5 8 4 3 本章小结6 0 5 结论及建议6 1 5 1 全文结论6 1 5 2 建议6 2 致谢6 3 参考文献6 4 附录。7 1 v 硕士论文 异养硝化好氧反硝化菌的筛选与脱氮性能研究 1 绪论 1 1 水体中氮素污染的危害 由于生物体内的新陈代谢、化学合成及细胞内营养物质的运输都需要水的参与， 水成为生态系统中极其重要的资源。另一方面，地球上可被人类利用的淡水资源非常 有限，全球仅有2 6 6 的淡水资源可被利用。此外，全球仅有0 6 的淡水资源可作为 饮用水。因此，水资源的保护及废水的有效处理显得尤为重要i lj 。随着工农业的迅速 发展，人类的生产活动给环境带来的污染越来越严重。 近年来，人类活动向水体环境中排放的含氮化合物急剧增加，给水环境带来严重 污染。水体中的氮污染物主要为无机氮和有机氮。无机氮主要包括氨氮、硝态氮和亚 硝态氮，其主要来源于城市生活污水经污水处理厂常规工艺处理后所排放的废水、冶 金工业产生的焦化废水及制肥厂排放的废水。有机氮主要包括尿素、蛋白质、有机碱 等，其主要来源于制革工业、印染工业、食品饮料加工行业及农业生产过程中农药的 流失和牲畜的粪便。 氮素污染所造成的危害主要有以下几点： ( 1 ) 水体富营养化 据报道【2 j ，2 0 1 1 年全国地表水污染依然严重，氨氮为长江水系、黄河水系、珠江 水系、辽河水系的主要污染指标之一，主要湖泊( 水库) 富营养化问题突出。由于富 营养化后的水体溶氧量减少，藻类大量繁殖，水体发黑变臭，使水体中鱼类等水产的 正常生长和繁殖受到影响，从而降低江河湖泊的观赏和利用价值。 ( 2 ) 威胁人类和水生动物的健康 水体中的氮污染会给人类及水生生物的健康造成危害。一方面水体中的亚硝酸盐 易与人和动物血液中具有传送氧气功能的血红蛋白反应，将血红蛋白分子的f e 2 + 氧化 成f e 3 + ，抑制氧的传输能力，从而造成组织缺氧、神经麻痹甚至窒息死亡【3 】。水体中 的硝酸盐若经过硝酸盐还原菌的作用生成亚硝酸盐或与胺、酚氨、氰胺等物质共同作 用形成高度“三致”( 致癌、致畸变、致突变) 物质，对人类的健康造成严重影响【4 ，5 1 。 另一方面，富营养化造成藻类疯狂生长，有些藻类中所含的毒素在水产体内富集后， 通过食物链使人类中毒。 ( 3 ) 增加水处理成本 若以氯气处理水体中的氨氮，氨氮每增加1 9 ，氯气量需增加8 9 1 0 9 。用化学法 处理时，也会相应增加化学试剂的投加量。当氨与含铜组分的设备接触，与铜表面的 钝化层形成铜氨络离子，加剧设备的腐蚀，造成经济损失。 由此可见，氮素污染进一步加剧了我国水资源的短缺，威胁到人类的饮水安全和 1 绪论 硕士论文 身体健康，给我国经济发展及可持续发展战略的实施带来了不可忽视的影响。 1 2 传统生物脱氮技术 传统的生物脱氮技术 6 1 包括硝化和反硝化作用两个过程。其中硝化作用是在好氧 条件下通过自养硝化菌的作用将废水中的氨氮( n h ：- n ) 氧化为亚硝酸盐( n o ；n ) 或硝酸盐( n o ；- n ) 。硝化作用包括两步连续的氧化反应：氨在氨氧化菌的作用下转化 为亚硝酸盐；亚硝酸盐在亚硝酸盐氧化菌的作用下进一步转化为硝酸盐。两步氧化反 应分别由不同的微生物完成，它们分别通过氧化氨或亚硝酸盐获得能量，氧分子作为 电子受体。反硝化作用是指反硝化菌在缺氧条件下将亚硝酸盐氮或硝酸盐氮还原为含 氮气体或合成细胞物质而从废水中脱除。反硝化菌属异养兼性厌氧菌，在有氧气存在 时会以0 2 为电子受体进行呼吸；在缺氧而有n 0 3 n 或n o ；- n 存在时，则会以n o ；- n 或n 0 ：- n 为电子受体，以有机碳为电子供体和营养源进行反硝化作用。 目前，按照传统的生物脱氮理论而建立的脱氮工艺通常设有好氧和缺氧两个工段， 硝化和反硝化作用不能在同一空间内同时完成。目前根据传统脱氮理论而发展的工艺 如a o 、a 2 o 等虽然能够发挥一定的脱氮作用，但仍然存在一些不足： ( 1 ) 自养硝化菌的产能少且在电子传递过程中需要消耗大量能量，因此生长世代 时间较长，且自养硝化菌在环境中对氧和营养物利用方面不如好氧异氧菌占优势，在 废水处理过程中其生物浓度难以处于较高的水平，尤其在低温条件下，其生长速度更 加缓慢，因此废水处理需要较长的水力停留时间，造成运行费用的增加。 ( 2 ) 为满足脱氮效果，处理系统中的微生物浓度必须维持在较高的水平，因此系 统需要进行污泥和硝化液的回流，导致动力消耗的运行成本增加。 ( 3 ) 硝化反应阶段产生的酸造成p h 降低，因此需要加碱中和，这不仅使处理成 本增加，同时还易造成二次污染。 1 3 新型生物脱氮技术 由于传统脱氮工艺存在不足，国内外学者针对生物脱氮过程中存在的问题在理论 和工艺方面做了大量的研究，研究发现硝化和反硝化过程在一定程度上超出了人们的 传统认识【7 - 1 2 1 。例如在环境中发挥硝化作用的不仅有自养微生物，有些异养微生物也 可以发挥硝化作用【l3 1 。在传统脱氮理论中反硝化作用一直被认为只能在厌氧或缺氧环 境下发生，随着人们从土壤、活性污泥等分离出好氧反硝化细菌，人们发现在好氧条 件下某些异养微生物同样可以发挥反硝化作用【1 4 , 1 5 】。随着脱氮理论研究的不断深入， 废水脱氮工艺取得了创新性的发展，随之涌现出的新技术和新工艺主要有：同步硝化 反硝化、厌氧氨氧化、异养硝化、好氧反硝化等。 2 硕士论文 异养硝化好氧反硝化菌的筛选与脱氮性能研究 1 3 1 同步硝化反硝化 同步硝化反硝化( s n d ，s i m u l t a n e o u sn i t r i f i c a t i o nd e n i t r i f i c a t i o n ) 【1 6 j 即在没有明显 独立设置缺氧区的活性污泥法处理系统内总氮被大量去除的过程。同步硝化反硝化的 机理：( 1 ) 宏观环境理论：在好氧活性污泥系统中由于曝气不均匀而出现局部缺氧环 境，因而在生物反应器中的局部缺氧环境中出现反硝化作用，进而实现同步硝化反硝 化作用。( 2 ) 微环境理论：在活性污泥颗粒内或生物膜内由于氧扩散的限制而产生缺 氧区从而使反硝化菌占优势，而在生物絮体表面或生物膜表面则以好氧硝化菌为主， 因而形成有利于s n d 发生的微环境。( 3 ) 微生物学理论：近年来，异养硝化菌和好氧 反硝化菌等新型脱氮菌的发现使硝化和反硝化作用在同一反应器内同时发生成为可 能，为同步硝化反硝化在微生物学方面的解释提供理论基础。 目前，多种可以实现同步硝化反硝化的反应单元已被提出 1 7 】。z h a n g 等【1 8 1 和 w a i t e r s 等【1 9 】利用生物膜反应器实现了同步硝化反硝化。m a 等建立了一个连续流反 应器同时去除土霉素结晶母液( t c m s ) 中的氮和碳，t c m s 稀释液中( 稀释比l ：4 ) 8 2 的c o d 和8 1 的总氮被去除。 同步硝化反硝化有如下优点：( 1 ) 减少反应器体积，投资小；( 2 ) p h 保持在中性 水平，不需要投加酸或碱，有利于硝化细菌和反硝化细菌发挥作用。 1 3 2 厌氧氨氧化 厌氧氨氧化( a n a m m o x ，a n a e r o b i ca m m o n i u mo x i d a t i o n ) 2 1 】是在厌氧或缺氧条件 下，以n o j 为电子受体，n h ：直接被氧化成n 2 的过程( 式1 1 ) 。 n h ：+ n 0 2j n 2 + 2 h 2 0( 式1 1 ) 厌氧氨氧化自发现以来受到研究者的广泛关注。a b m a 等【冽成功运行了大规模的 厌氧氨氧化反应器，其氮负荷达到1 0 k gn m 3 d 。陈胜【2 3 】等用好氧预挂膜低负荷培养法 在较短时间内快速启动厌氧氨氧化反应器，且运行后氨氮和亚硝态氮的出水浓度保持 稳定。 厌氧氨氧化的可能途径如图1 1 所示，电子受体n o ；降解为羟胺，羟胺继续与n h ： 反应生成联氨并最终生成氮气【2 4 1 。 厌氧氨氧化工艺适合于处理低c n 的废水，当c n 大于1 时，厌氧氨氧化菌在与 异养反硝化菌的竞争中不占优势。研究表明，废水有机负荷率是影响a n a m m o x 的重 要因素【2 5 1 。c h a m c h o i 等【2 6 1 研究发现在以脂肪为碳源的u a s b 反应器中，当c o d 超过 3 0 0 m g l 时厌氧氨氧化菌群的活性就会受到抑制。d a p e n a m o r a 等【2 7 】的研究表明浓度 为5 0 m m 的乙酸盐将会对厌氧氨氧化产生7 0 的抑制作用。 与传统的脱氮工艺相比，厌氧氨氧化具有如下优点：( 1 ) 不需要外加碳源作为电 子供体，避免造成二次污染并具有一定的经济性：( 2 ) 产酸量较传统硝化反应大为下 l 绪论 硕士论文 洲4 + 西= 矿h 锄 i - 一一一。 【n 2 h 2 l - _ ， 目前已发现的异养硝化菌来自于不同的环境，e m i k o 等【2 9 】从土壤中分离出2 1 株 具有异养硝化功能的菌株，进一步研究发现其中6 株同时具有反硝化作用。w i t z e 等【3 0 】 氮的菌株么比口，蜒y 刀p s 扣p c 口凰s p n o 4 ，其最大氮去除率可达到2 9 m g ( l h ) 。m e v e l 等p 2 1 4 硕士论文异养硝化好氧反硝化菌的筛选与脱氮性能研究 可以利用b 丙氨酸、有机酸、丙酮肟、三甲胺等多种碳源供生长所需，但可以供硝化 反应所需的碳源却有所限制，只有在有机酸盐、丙酮肟、q 酮戊二酸为碳源时才有硝 化活性。 总体来说，大部分异养硝化细菌都可以利用有机酸盐、牛肉膏等复杂的碳源供生 长或硝化所需，但结构简单的有机酸盐更有利于微生物发挥硝化活性 3 3 , 3 7 j 。 ( 2 ) 温度 温度影响微生物代谢活动中酶的活性，因此温度也是影响微生物生长和异养硝化 活性的重要因素。苏俊峰等【38 】的研究表明温度为3 0 。c 时菌株y 1 1 的硝化活性最高， 经过4 d 去除率可达到8 1 8 6 ，而在1 5 和3 5 时对氨氮的去除率都较低，说明菌株 y 1 1 对温度较敏感。据z h a n g 等1 3 9 】的报道，菌株p s t u t z e r iy z n 0 0 1 可以在4 c 4 5 的温度范围内生长，但在4 c 下生长速度很慢，且氨氮降解率仅为0 3 m g n h ：- n ( l h ) ， 当温度升至i o 。c 氨氮降解率为1 4 8 m g ( l h ) ，在3 0 。c 和3 7 c 氨氮的降解速率相似分别 为5 3 3m g ( l h ) 和5 3 9 m g ( l h ) 。可见低温条件下该菌株的硝化活性明显下降。对于大 多数异养硝化微生物，其最适培养温度在2 8 。c 3 7 c 4 0 m 】。 ( 3 ) p h 与自养硝化菌相比，异养硝化菌可以耐受的p h 范围相对更广。吕永康等【4 3 】分离 出的菌株a l c a l i g e n e ss p c 1 6 在p h 为6 0 1 1 0 范围内均能够生长且能够降解氨氮，特 别是在6 0 - 8 0 ，该菌株表现出很好的生长能力和氨氮降解能力，经过4 d 的培养降解 率高达9 3 。b r i e r l e y 等m 】的研究表明，在p h 为3 0 1 0 0 ，菌株a r t h r o b a c t e rb o 可以正 常生长并具有硝化活性，该菌可以忍受p h 3 0 的酸性环境，并且出现培养后p h 上升 的现象。培养基质不同时，异养硝化菌的最适p h 也会随之改变。在牛肉膏蛋白胨培 养基中，菌株a r t h r o b a c t e rb d 的硝化活性对p h 并不十分敏感，然而在葡萄糖醋酸铵 培养基中，p h 升高硝化活性也随之升高。对于大多数异养硝化细菌，其最适p h 范围 在6 0 8 0 。 ( 4 ) 底物浓度 底物浓度是异养硝化活性和菌株生长的影响因素之一。王瑁等【4 5 】从河流中筛选出 的异养硝化菌在以丁二酸钠为碳源时，当n h ：- n 初始浓度为5 0 m g l 时，氨氮的去除 率可以达到8 4 2 6 ，当n h ：- n 初始浓度为1 4 0m g l 时，相同条件下氨氮的去除率仅 为4 1 9 0 ，说明高浓度的氨氮抑制菌株的生长及硝化。部分异养硝化菌具有对高浓度 氨氮的耐受能力，如菌株a l c a l i g e n e ss p c 1 6 在n h ：- n 浓度为1 0 0 m g l - 2 5 0 m g l 时， 氨氮的去除率超过8 0 4 3 l 。菌株培养过程中有机物的浓度也会影响脱氮性能的发挥。 何霞【4 6 】等在研究菌株b a c i l l u ss p l y 时报道，当t o c 为4 0 0 m g l 时氨氮的去除率并不 高，当t o c 浓度为8 0 0 m g l 时，菌株的脱氮效率显著提高并达到最佳，继续提高t o c 的浓度氨氮的降解率变化不大且不再提高。因此，不同类型的菌株对底物浓度的耐受 1 绪论 硕士论文 力不同，在最适底物浓度下培养，菌株才能发挥良好的脱氮性能。 ( 5 ) 溶解氧 与自养硝化菌相比，异养硝化菌对溶解氧的需求相对较低。v a nn i e l 等7 】研究自 养硝化菌n i t r o s o m o n a se u r o p a e a 和异养硝化菌株t h i o s p h a e r a p a n t o t r o p h a 在不同溶解 氧及c n 条件下的情况，结果发现在低溶解氧，c n = i o 时，系统中t h i o s p h a e r a p a n t o t r o p h a 占主导地位，而大部分n i t r o s o m o n a se u r o p a e a 被淘汰。将异养硝化菌 p s e u d o n o c a r d i aa m m o n i o x y d a n sh 9 1 强化应用于气升式生物反应器处理人工合成废水 时，在溶解氧为o 5 m g l 1 5 m g l 时，氨氮的去除率可以达到8 2 8 8 【4 8 j 。这说明在 低浓度的溶解氧环境中，异养硝化菌同样具有硝化活性。 ( 6 ) c n c n 是影响异养硝化微生物脱氮效果的主要因素。苏俊峰等【3 8 】研究发现菌株y 1 l 在c n 为1 5 “范围内，c n 的值越大，氨氮去除率越高。在c n = 6 时，该菌株经过 4 d 培养可去除9 1 4 2 的氨氮。但是当c n 继续升高，氨氮去除率将不再增加。这是 因为当培养体系中碳源为细菌发挥硝化作用的制约因素时，提高c n 可以更好地满足 其生长硝化所需，当碳源含量提高到一定程度并过量时，过高的c n 反而会对细菌的 新陈代谢造成不利影响从而使氨氮去除率下降。司文攻等【4 9 】在优化耐受高浓度氨氮异 养硝化菌的脱氮条件时发现，菌株n 1 、n 2 、n 3 在c n = 8 时的氨氮去除率均高于c n = 5 时的氨氮去除率。因此，选择合适的c n 才能提高异养硝化微生物的氨氮去除率。一 般，异养硝化菌在c n = 2 l0 时能够发挥硝化活l 生 5 0 , 5 1 j 。 1 3 3 2 异养硝化的代谢途径 由于异养硝化菌的种类繁多，可利用的代谢底物既包括铵等无机氮，又包括如： 肟、芳香硝基化合物【5 2 1 ，因此异养硝化菌的代谢途径尚不十分清楚，研究者们尚没有 统一的认识。目前，研究者们多以丙酮酸肟作为代谢底物来研究异养硝化微生物 的代谢途径，一般认为异养硝化菌氧化丙酮酸肟可能有两种代谢途径：无机途径和有 机途径。无机途径即丙酮酸肟水解为羟胺和丙酮酸，羟胺进一步氧化为亚硝酸。有机 途径即丙酮酸肟直接氧化为亚硝酸。研究表明，异养硝化菌的能量几乎都是通过同化 有机物而获得，其在氧化氨的过程中并不能获得能量。对异养硝化菌的代谢途径的研 究目前仍停留在个别种类的菌株或极少数的代谢基质上，且人们对硝化机理的解释尚 不明确，因此仍需要学者进一步深入研究。 1 3 4 好氧反硝化 近年来，关于好氧反硝化的报道越来越多，国内外学者已经分离出多株好氧反硝 化菌并且对菌株的脱氮性能及脱氮机理作了相关研究，为脱氮新技术的开发提供了基 础，为废水脱氮问题的解决提供了新思路。 6 硕士论文 异养硝化好氧反硝化菌的筛选与脱氮性能研究 1 3 4 1 典型的好氧反硝化细菌及其分离方法 1 9 8 4 年，r o b e r t s o n 和k u e n e 5 3 1 首次报道了反硝化系统中存在好氧反硝化菌 t h i o s p h a e r a p a n t o t r o p h a ，且观察到当培养基中的溶解氧饱和度达到9 0 时，该菌株仍 然具有反硝化活性。目前国内外已报道多株典型的好氧反硝化菌株，见表1 1 。 表1 1 好氧反硝化菌来源及其生长环境 a ：溶解氧浓度( m g l ) ；b ：溶解氧浓度( i x m o l l ) ；c ：空气饱和程度；：不详 研究者分别从脱硫反硝化系统、活性污泥、土壤、养猪废水等中筛选出多株好氧 反硝化菌，主要存在于副球菌属( p a r a c o c c u s ) 、假单胞菌属( p s e u d o m o n n a s ) 、产碱 杆菌属( a l c a l i g e n e s ) 、芽孢菌属( b a c i l l u s ) 等，目前并未在放线菌和真菌中发现具有 好氧反硝化作用的菌株。这些不同种类的好氧反硝化菌株的发现进一步说明环境中好 氧反硝化作用的存在，同时也为脱氮理论的突破性研究提供了材料。 由于好氧反硝化菌的生长一般并没有区别于环境中其他菌的特殊的要求，因此并 没有筛选好氧反硝化菌的高效方法。目前已报道的筛选方法有以下几种： ( 1 ) 选择性培养基 7 l 绪论 硕士论文 g u p t a 等1 6 2 j 为了更好地富集脱氮副球菌，在培养基中增加m g s 0 4 的浓度以使其他 种类的好氧反硝化菌的生长受到抑制。张亚光等【6 3 】利用以乙酰胺为唯一碳源和氮源的 好氧液体培养基分离出好氧反硝化菌r h o d o c o c c u ss p d n ，该菌株具有较强的产亚硝酸 盐的能力。张苗等科】利用d m 培养基从用于处理电厂烟气的生物滴滤系统中分离出好 氧反硝化菌t a d l ，该菌在高温条件下2 4 h 内的脱氮率可以达到9 9 1 2 ，并且在脱氮 过程中未观察到亚硝酸盐的积累。 ( 2 ) 间歇曝气法 间歇曝气法主要是利用好氧反硝化菌可以在将电子传递给n o ：的同时也可以传 递给0 2 ，因此在好氧环境和缺氧环境的交替过程中将只能将0 2 或n o ：作为电子受体 的完全好氧细菌和缺氧反硝化菌逐渐淘汰，从而使好氧反硝化菌得以保留并分离。 r o b e r t s o n 等【6 5 】采用这一方法筛选出好氧反硝化菌l m d 8 2 5 ，经鉴定该菌即目标菌株 脱氮副球菌。周丹丹等【6 6 】通过每3 d 将曝气时间延长l h - 2 h 的方法从驯化一段时间后的 活性污泥中分离出2 5 株在好氧条件下具有脱氮作用的菌株。 ( 3 ) 酸碱指示剂法 酸碱指示剂法主要利用反硝化作用过程中p h 将升高这一原理，在以n o ；- n 为唯 一氮源的培养基中加入溴百里酚蓝( b t b ) 指示剂，随着反硝化作用中o h 。的积累， 培养基将由黄绿色变为蓝色，进一步挑取培养基蓝色区域的单茵落作为初筛到的好氧 反硝化菌。李卫芬等【6 7 】利用b t b 培养基从草鱼养殖池的池水中筛选出好氧反硝化菌 施氏假单胞菌，该菌对溶解氧具有较高的耐受性，在c n 不低于1 0 时，脱氮率超过 9 6 。肖继波等【6 8 】利用b t b 培养基从稳定运行的处理竹子加工废水的生物接触氧化反 应器中筛选出一株菌落颜色为乳白色的好氧反硝化菌d n 7 ，该菌在中性偏碱的环境中 脱氮率较高，在n o ；- n 低于1 3 8 4 8 m g l 时脱氮率达到9 6 。 1 3 4 2 好氧反硝化作用机理 随着对传统反硝化作用理论认识的突破和科学技术的进步，研究者们对好氧反硝 化的研究逐步深入，目前对好氧反硝化机理的解释主要有以下两方面： ( 1 ) 物理学机理 由于微生物絮体中溶解氧梯度的存在，在好氧大环境下仍有缺氧或厌氧微环境， 因此，好氧大环境中充足的溶解氧可以满足好氧硝化细菌的生长和代谢需要，而缺氧 微环境则为反硝化菌发挥反硝化作用提供了良好的条件，从而在宏观上表现出好氧反 硝化现象。 ( 2 ) 生物学机理 从酶系统来看，传统理论认为反硝化菌在缺厌氧环境下，反硝化酶系才能具有将 亚硝态氮或硝态氮转化为含氮气体的活性。而好氧反硝化菌内存在两种对硝酸盐有还 原作用的酶：一种酶与膜结合，仅在缺氧条件下表达，即膜结合硝酸还原酶；在有氧 8 硕士论文异养硝化好氧反硝化菌的筛选与脱氮性能研究 条件下，