（环境科学专业论文）微生物与植物联合修复土壤重金属污染.pdf

中山大学硕士学位论文 2g 1 6 和 【8 对重金属c d 和n i 都具有较强抗性，经鉴定，g 1 6 为曲霉菌，鹏 为木霉菌。两株菌对重金属都有一定的活化能力但两株菌都不产吲哚。 3 抗性微生物对重金属污染土壤中生长的植物有一定的促进作用，其株高、鲜 重都高于对照，尤其是两种微生物复合接种，促进作用更为明显。在单独添加c d 或n i 以及复合添加c d 和n i 的土壤中，单一接种抗性菌或两株菌的复合接种都提 高了重金属在植物体内的转运系数和累积系数。不接菌处理时，与单一重金属c d 或n i 污染的情况下比较，在c a n i 复合污染状况下c d 和n i 的转移系数和富集系 数都提高，植物地上和地下c d 和n i 的浓度都比单一重金属污染土壤中植物体内的 含量增加。这表明植物对c d 和n i 的吸收存在一定的正相关性 关键词；植物重金属内生菌根际微生物联合修复 中山大学硕士学位论文 m i c r o p h y t oc o m b i n e dr e m e d i a t i o no n h e a v ym e t a lp o l l u t e ds o i l s m a j o r ：e n v i r o n m e n ts c i e n c e n a m e ：j i a n gm i u s u p e r v i s o r ：p r o f z h a n gr e n d u o a b s t r a c t o n c eh e a v ym e t a l s ，s u c ha sp b ，c d ( n o n - b i o l o g ys u r v i v i n ge l e m e n t s ) a sw e l la sz n ， n i ( b i o l o g ys u r v i v i n ge l e m e n t s ) h a v er e a c h e dc e r t a i nc o n c e n t r a t i o n s i nt h em e d i a ， m i c r o b eg r o w t hc a nb ei n h i b i t e d h o w e v e ra f t e ral o n g - t i m ec o n t a c tw i t hh e a v ym e t a l s , s o m em i c r o b e sc a l lr e d u c et h ep o i s o na n dr e s u m eg r o w i n gs o o na f t e rt h es u f f e r i n g i n m e d i aw i t hh i g hh e a v ym e t a lc o n c e n t r a t i o n s , h e a v ym e t a lr e s i s t a n tm i c r o b e s 啪n o to n l y i n f l u e n c et h ea b s o r b a b i l i t yo fp l a n to nn u t r i t i v em a t e r i a l , e n h a n c et h ea b i l i t yt or e s i s t h e a v ym e t a ls t r e s s ，t h u sc a np r o t e c tp l a n t , b u ta l s op r o m o t et h ea c c u m u l a t i o no fh e a v y m e t a l si nv e g e t a t i o n , t h e r e f o r ea c c e l e r a t et h er e m e d i a t i o np r o c e s so fs o i l sp o l l u t e db y h e a v y m e t a l s t h es u r v i v a ls c o p eo fm i c r o b e si sv e r yw i d ea n dt h e r ea r eav a r i e t yo fm i c r o b e s e x i s t i n gi ns o i l sa n dp l a n t s b a s e do na n a l y s e so fs o i l - a n dp l a n t s a m # e sf r o ma na r e a p o l l u t e dw i t hm i n i n gw a s t ew a t e ri nd a b a om o u n t a i n ，i nt h i st h e s i s , f i r s tw es t u d i e dt h e a n t i - h e a v ym e t a ln a t u r eo fm i c r o b e so ft h es a m p l e s ，s e l e c t e ds t r a i n sw i t hg o o de n d u r a n c e f o rh e a v ym e t a l s ，f r o mw h i c hw ef u r t h e rs e l e c t e dt h eo n e sh a v i n gs t r o n gr e s i s t a n c et oh i a n dc da n ds t u d i e dt h e i rb i o l o g i c a ln a t u r e l a s t l y , u t i l i z i n gt h ep o tc u l t u r ee x p e r i m e n t ，w e t e s t e dt h ec o m b i n e dr e m e d i a t i o ne f f e c t so ft h er e s i s t a n c es t r a i n sa n dp l a n t so nt h es o i l s w i t l lh e a v ym e t a lp o l l u t i o n r e s u l t sf r o mt h es t u d yw e r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1t h em e t h o do fp u r ec u l t u r ei s o l a t i o nw a su s e dt oo b t a i nd i f f e r e n tk i n d so ff u n g u s s t r a i n sf r o mt h er o o t sa n dt h i z o s p h e r e so fah e a v ym e t a la c c u m u l a t o r ( a c c a c a a u r i c u l i f o m i s ) a n dn o na c c u m u l a t o r s ( h y g r o r y z aa r i s t a t aa n do r y z as a t i v a ) s c r e e n i n g h i 中山大学硕士学位论文 r e s u l t so f h e a v ym e t a l r e s i s t a n ts t r a i n ss h o w e dt h a tt h ep r o p o r t i o no fh e a v ym e t a lr e s i s t a n t s t r a i n si ne n d o p h y t i cf u n g iw a sh i g h e rt h a nt h a t i nr h i z o s p h e r eo fa l lt h et h r e ep l a n t s t h en u m b e ro fr e s i s t a n ts t r a i n so fe n d o p h ) , t i cf u n g ii nt h eh e a v ym e t a la c c u m u l a t o rw a s l a r g e rt h a nt h a ti nn o na c c u m u l a t o r s i nt h eh e a v ym e t a la c c u m u l a t o r s ，t h ep r o p o r t i o no f h e a v ym e t a lr e s i s t a n ts t r a i n si ne n d o p h y t i cf u n g iw a sh i g h e rt h a nt h a ti nr h i z o s p h e r e h o w e v e r , i nt h en o na c c u m u l a t o r s ( h y g r o r y z aa r i s t a t aa n do r y z as a t i v a ) ，t h ep r o p o r t i o n d i f f e r e n c eo fh e a v ym e t a lr e s i s t a n ts t r a i n sw a sn o to b v i o u sb e t w e e ne n d o p h y t i cf u n g ia n d t h o s ei nr h i z o s p h e r e t h eh e a v ym e t a lr e s i s t a n tf u n g ii nt h ep l a n t sm a i n l yb e l o n gt ot h e s p e c i e sc l o s e l yr e l a t e dt op l a n t s ，s u c ha sp e n i c i l l i u ms p ，a s p e r g i l l u ss p ，f u s a r i u ms p a n dt r i c h o d e r m as p ，c ta 1 t h e s er e s u l t si n d i c a t e dac l o s er e l a t i o n s h i pb e t w e e nh e a v y m e t a lr e s i s t a n te n d o p h y t i cf u n g u si nh e a v ym e t a la c c u m u l a t o r sa n dt h ea b i l i t yf o rt h e i r h o s tp l a n t st oa c c u m u l a t eh e a v ym e t a l s 2b o t hg 1 6a n dh 8e x h i b i tc o m p a r a t i v e l ys t r o n gr e s i s t a n c et oh e a v ym e t a lc aa n d n i t h ei d e n t i f i c a t i o nr e s u l ts h o w st h a tg 1 6b e l o n g st oa s p e r g i l l u s , s pa n dh 8b e l o n g st o t r i c h o d e r m as p ，b o t ho fw h i c hp o s s e s s e dc e r t a i na b i l i t yo fa c t i v a t i n gh e a v ym e t a l sb u t d i dn o tp r o d u c ei n d o l e 3i nh e a v ym e t a lp o l l u t e ds o i l s , t h o s er e s i s t a n ts t r a i n sp r o m o t e dt h ep l a n tg r o w t ht o c e r t a i ne x t e n t ，r e s u l t i n gi nh i g h e rh e i g h t sa n dl a r g e rf r e s hw e i g h t s t h ee n h a n c e m e n t e f f e c tw a sm o r eo b v i o u sw h e nt w oo ft h em i c r o b e sc o m p l e xw e r ei n o c u l a t e d i nt h es o i l a d d e dw i t ho n l yc do rn i , b o t hs i n g l es t a i ni n o c u l a t ea n dc o m p l e xs t r a i n si n o c u l a t e e n h a n c e dh e a v ym e t a lt r a n s l o c a t i o nf a c t o ra n db i o a c c u m u l a t i o nc o e f f i c i e n ti nt h ep l a n t s i nt h ec a s eo fn o i n o c u l a t i o n ，c o m p a r e dw i t hs i n g l eh e a v ym e t a lp o l l u t i o n ( c ao rn i ) ，t h e t r a n s l o c a t i o nf a c t o ra n db i o a c c u m u l a t i o nc o e f f i c i e n to fc da n dn i ，a sw e l la st h e c o n c e n t r a t i o n so fc da n dn ii nt h es h o o t sa n dr o o t so fp l a n t si n c r e a s e di nt h ec a n i c o m p l e xh e a v ym e t a lp o l l u t e ds o i l s , w h i c hi n d i c a t e dap o s i t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt h e a d s o r p t i o n so fc a a n dn io nt h ep l a n t s k e yw o r d s ：p l a n t , h e a v ym e t a l ，e n d o p h y t e ，r h i z o s p h e r em i c r o b e s ，c o m b i n e dr e m e d i a t i o n 中山大学硕士学位论文 1 1 研究背景 第1 章文献综述 土壤是农业生产的基础，是人类环境的组成部分，是人类最基本、最广泛、最 重要、不可替代的自然资源。由于土壤中存在着大量的有机物、无机物、微生物和 土壤动物，进入土壤中的污染物通过物理、化学和生物等过程不断地被吸附、分解、 转化和迁移，从而使土壤具有一定净化能力“1 。然而局部的地球化学或人为活动的 强烈作用，使得土壤的净化能力、缓冲能力逐渐退化，我国约有1 0 7 公顷的农业用 土受到不同程度的污染，作物的产量和质量也因此受到影响。随着我国人民生活水 平的提高以及对生活质量和绿色蔬菜与作物要求的提高，植物生长基质士壤环 境状况备受关注。重金属一般以天然浓度广泛存在于自然界中，但由于人类对重金 属的开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多，造成不少重金属如铅、汞、镉、 钴等进入大气、水、土壤环境，引起严重的环境污染。 每一种植物都可能累积土壤或水体中的重金属，但是当介质中重金属过量时， 就会有害于植物的代谢和生长。目前我国受镉、铬、砷、铅等重金属污染的耕地面 积有2 0 0 0 万公顷，约占总耕地面积的i 5 ，全国每年因重金属污染的而减产粮食1 0 0 0 多万吨。一般来说，植物的根部累积重金属的量最大，茎部次之，果实及种子内最 少”，但是经过长时间的累积，其绝对含量还是很大。国内外的专家学者针对重金 属的污染修复进行了研究，但是用物理的或是化学的方法不但有破坏土壤结构和肥 力的可能，而且费用较高。而利用植物的累积去除土壤中的重金属被认为是一种有 效的修复方法“。但用于植物修复的植物不仅要求地上部分对重金属的累积量要高， 而且要求植物的生物量要大。如何提高植物的累积量以及促进植物的生长成了研究 的焦点。有研究发现根际土壤中有效态的重金属浓度同植物富集的重金属量成正相 关”，这表明增加根际土壤中重金属的生物有效性有利于提高植物的提取效率。近来 研究证实添加e d t a 、c d t 、d t p a 等螯合剂能活化土壤重金属“，增加土壤中的重金 中山大学硕士学位论文 属有效态部分，促进植物对重金属的吸收和富集。但是螯合剂的应用存在一定的环境 风险，当施用浓度过高时会对土壤微生物和植物产生毒性嘲，抑制植物的生长。并引 起重金属淋溶下渗到地下水导致地下水的污染。土壤中的微生物种类繁多，数量庞大， 它们可能对污染土壤中重金属的迁移与释放产生影响，从而也就可能左右重金属的 植物有效性。有研究表明植物提取土壤中的重金属不仅和植物的特性有关，和土壤 性质以及微生物的活动也有密切关系”1 。土壤中有些微生物可以减轻植物受重金属 毒害嘲，这不仅为保证生物产品具有较高的安全性以及污染土壤的再利用提供了一 种崭新的广阔的途径，对保护生态环境、治理环境污染也都具有重要意义。 1 2 土壤重金属污染修复研究进展 土壤重金属污染修复的严重性和普遍性，早已引起了国内外广泛关注。近年来， 有关土壤重金属污染修复问题的研究已经成为当今农业，生态和环境领域研究的重 要内容。关于土壤重金属污染的治理途径目前已有以化学固定、土壤淋洗和电动修 复等为主的物理化学方法，利用特殊植物和微生物来去除土壤中重金属或降低重金 属毒性的生物学方法。这些研究领域集中代表了目前人们在重金属污染方面研究的 主流方向嘲 1 2 1 物理化学修复 1 2 1 1 化学固化所谓化学固化，就是加入添加剂( 固化剂) 改变土壤的理化性 质，通过对重金属的吸附或共沉淀作用降低其在土壤中的活性，从而降低其生物有效 性和迁移性n 崛。但固化方法并不是一个永久性的措施，重金属只是被改变了存在形态， 却仍存留在土壤中。而且通过化学固定处理的土壤很难恢复到原始状态，不适宜进一 步利用，对被固定的重金属在较长时期的稳定性和其对生态系统的影响也需进一步 了解。 1 2 1 2 土壤淋洗土壤中的重金属与土壤组分发生作用后，可能被土壤组分表 2 中山大学硕士学位论文 面吸附，也可能形成金属化合物沉淀分散于土壤中。土壤淋洗就是通过提取剂将土 壤固相中的重金属转移至液相中，含有提取剂的土壤经清水洗涤后归还原位再利用， 富含重金属的废液则进行进一步处理，回收重金属和提取剂“”土壤淋洗技术的关 键在于提取剂的选择，但既能提取重金属，又不破坏土壤的结构的理想的提取剂很难 找到。而且，如果处理不当的话，引入的提取剂很可能造成二次污染。 1 2 i 3 电动修复污染土壤的电动修复是一门综合土壤化学、环境化学、电化 学和分析化学等交叉的研究领域，其原理是在污染土壤中插入电极对，并通以弱直流 电使得污染土壤两侧形成电场梯度，土壤中水溶态或是吸附在土壤表面的污染物质 在电场作用下通过电迁移、电渗流或电泳的方式被带到电极两端从而清洁污染土壤 电动修复在重金属修复方面有很大的优势，表现在不破坏土壤结构，没有二次 污染风险，可以采用原位修复等。电动修复近年来发展很快，并且从经济上而言也是 可行的，但其修复效率受土壤类型和土壤中非目标离子干扰较大，甚至出现实际应用 与实验结果相反的现象，从而使这一方法的商业化受到了限制。 i 2 2 生物修复 生物修复是利用生物对污染物的吸收、转化作用将环境中的污染物清除或降解， 从而使污染环境得以修复的过程“4 。生物修复因采用的生物不同而被分为植物修复、 动物修复以及微生物修复。生物修复具有高效、廉价、不产生二次污染、不破坏土 壤结构等优点，近年来 ! 导到广泛关注。然而在实验室条件下表现良好的生物修复技 术，在实际应用中由于受多种因素的影响，其优势往往不能得到很好的发挥。目前 生物修复技术在我国还处于研究发展时期。 i 3 土壤重金属污染生物修复研究进展 土壤污染是当今世界面临的主要环境问题之一应用传统的物理化学方法治理 土壤环境的污染不仅成本高、严重破坏土壤结构，且不适于低浓度、大范围污染土 3 中山大学硕士学位论文 壤的治理及应用。而与之相比，具有成本低、无二次污染等优点的生物修复方法正 受到全世界的关注和重视，并成为环境污染治理的前沿性课题。生物修复技术中研 究最多的是微生物与植物修复。 i 3 1 植物修复 自1 9 7 7 年b r o o k s 提出超累积植物的概念，1 9 8 3 年c h a n e y 提出了利用超累积植物 消除土壤重金属的思想，随后关于超富集植物的研究逐渐增多植物修复是以植物 耐受和累积某些或某种污染物为基础，利用自然生长或遗传培养的植物清除环境中 污染物的技术“”。在重金属污染治理中植物修复具有不可替代的优势，并以其治理 过程的原位性、治理成本低廉性、管理与操作的简易性以及环境美学的兼容性受到 人们的重视。 1 3 i 1 植物修复类型 根据植物修复过程与机理，重金属污染土壤的植物修复技术可分为以下三种类 型“”：( i ) 植物稳定即通过耐受重金属植物根系分泌物螯合、沉淀土壤中的重金属， 以降低其生物有效性和移动性，从而防止其进入食物链，减少其对环境和人类的危 害；( 2 ) 植物挥发即利用植物将污染物吸收到体内后，又将其转化为气态物质，释 放到大气环境中，从而减轻土壤污染；( 3 ) 植物提取是利用超累积植物根系从土壤 中吸取重金属，将其转移、贮存到植物地上部分，然后将地上部分收割回收重金属 的过程。其中植物提取是目前研究最多且最有前景的方法。 i 3 i 2 植物修复的不足 尽管和传统物理化学方法相比，植物修复具有技术上和经济上的优势，但其在 土壤重金属污染修复方面仍存在一些不足，主要表现在以下几个方面”：( i ) 目 前大部分超累积植物植株矮小，生物量低，生长缓慢且生长周期长，因而修复效率 和速率低，不易进行大规模商业化运作；( 2 ) 一种植物通常只能耐受或吸收一种或 两种重金属元素，对土壤中其他浓度较高的重金属则表现出某些中毒症状，从而限 制了植物修复技术在重金属复合污染土壤治理中的应用；( 3 ) 植物是活的有机体， 只有在条件适宜的情况下，才能生长良好。因此对土壤肥力、水分、温度等等都有 4 中山大学硕士学位论文 一定要求：( 4 ) 植物根系一般生长较浅，对浅层土壤修复效果较好，而对深层土壤 则显得无能为力。 1 3 2 微生物修复 当铅、铬、镉、砷等非生物生存所需的重金属以及锌、镍等生物生存所需的重 金属物质在介质中达到一定的浓度时可能会对生物产生抑制作用，但自然界中的大 多数微生物与重金属长期接触后，都能尽量减少毒害或受毒害后迅速恢复生长。微 生物修复就是利用对污染物有一定抗性的微生物，在其生理活动过程中，对污染物 进行降解、转化、吸附，从而使其对环境的危害性降低或使其完全无害化的过程“”。 1 3 2 1 微生物修复类型 微生物对土壤重金属污染修复的机理主要有微生物固定以及微生物转化两种 。微生物对重金属的生物固定作用主要表现在胞外络合作用、胞外沉淀作用以及 胞内积累三种作用方式上脚由于微生物对重金属具有很强的亲合吸附性能，有毒 金属离子可以积累在细胞的不同部位或结合到胞外基质上，或被鳌合在可溶性或不 溶性生物多聚物上“1 另外微生物还可以通过产生柠檬酸、革酸等物质与重金属产 生螯合或是形成草酸盐沉淀嘲，从而减轻重金属的伤害。而微生物对重金属进行生 物转化，其主要作用机理是微生物通过氧化、还原、甲基化和脱甲基化作用转化重 金属，改变其毒性删，从而形成对重金属的解毒机制。 l3 2 2 微生物修复的不足 虽然微生物修复具有成本低、对环境影响小、不破坏土壤环境等优点，且其修 复效果在理论上和技术上都已取得了很大进展，但在实际操作中仍存在一些不足 嘲：( 1 ) 生长状况易受温度、水分、盐分以及p h 等环境因素影响；( 2 ) 某些微生物 只能对特定的污染物起作用；( 3 ) 用于现场修复的微生物可能存在竞争不过本土微 生物以及难以适应环境等问题而导致修复效果不理想：( 4 ) 吸附在微生物体内的污 染物可能会因为微生物代谢或死亡等原因又释放到环境中：( 5 ) 另外，与物理、化 学方法相比较，这一技术治理污染土壤时间相对较长。 5 中山大学硕士学位论文 1 3 3 植物与微生物联合修复 对于任何重金属来说，往往只有生物有效态的部分可以被植物吸收，但实际上土 壤中有效态的重金属含量较低。增加土壤中的重金属活性是提高植物提取效率的一 个有效途径。在土壤和微生物共生环境中，微生物可将土壤有机质和植物根系分泌 物转化为小分子物质为自身利用，同时这些小分子物质可能会对土壤中的重金属起 到活化作用；微生物的代谢也可以分泌释放一些有机物质和酶等物质嘧力，对土壤 中重金属也有活化作用。另外，微生物还有很强的氧化还原能力，微生物可对f e 、 氧化物进行还原，使其吸收的重金属被释放出来嘲在重金属污染的土壤中加入 适量的硫，微生物可把硫氧化成硫酸盐，降低土壤p h 值，提高重金属的活性，通过 植物的吸收作用，达到土壤净化的效果嘲 w h i t i n g 等人将表面消毒的遏兰菜的种子种入灭过菌的土壤中，然后再接种 对z n 具有抗性的细菌，结果发现细菌的加入使得植物地上部分累积的z n 是无菌情 况下的2 倍，而累积z n 的总量提高了4 倍。在对遏兰菜科非超累积品种t h l a s p i a r v e n s 口进行类似试验的结果表明，与灭菌情况下相比较，根际细菌的接种并没有 增加植物对z n 的累积，但是与无菌对照相比较，细菌的添加增加了土壤中z n 的活 性。a b o u - s h a n a b 等人o o 在生长于n i 污染区的超累积植物a l y s s u m m u r a 根际分离 出三种菌s p h i n g o m o n a sm a c r o g o l t a b i d u s ，m i c r o b a c t e r s u ml j q u e f a c i e n s 和 m i c r o b a c t e r i u m a r a b j n o g l t a b i d u s 。将这三种菌分别接种到表面灭菌的种子种植到 灭过菌的n i 含量高的土壤中，和不接菌相比较，这三种菌使得正m u r a l 地上部分的 累积量分别提高了1 7 ，2 4 ，3 2 4 。c h e n 等人的研究于生长在c u 矿区的超累积 植物e l s h o l t z i as p l e n d e n s 根际分离出1 2 种对5 0 0u m o l lc u 具有抗性的菌株， 并对这些菌株对土壤中非活性态c u 的活化能力进行了检测。结果显示虽然这1 2 个 菌株对c u 的活化能力不同，但都可以增加c u 的活性，甚至达到无菌状态下的3 4 倍。而添加菌的水培实验结果表明，菌的添加增加了植物地上部分和根部对c u 的累 积。由此可见，微生物可以通过改变土壤中重金属的活性促进了植物对重金属的累 积。 另外，在高等植物体内，l 一蛋氨酸( m e t h i o n i n e ) 通过中间体s 一腺昔蛋氨酸和卜 6 中山大学硕士学位论文 氨基环丙烷一卜羧酸( 1 一a m i n o c y c l o p r o p a n e - l - c a r b o x y l i ca c i d 。a c c ) 合成乙烯。乙 烯会促进某些植物开花、生长素运转、茎和根的生长。近年来的研究发现，植物根 际促生长细菌( p l a n tg r o w t h p r o m o t i n gr h i z o b a c t e r i a 。p c p r ) 体内含有a c c 脱氨酶 嘲。植物在重金属胁迫环境下，易合成乙烯，虽然乙烯在植物生长过程中起着重要 作用，但是浓度过高时将会对植物生长产生抑制作用。合成大量乙烯是重金属的毒 害表现之一，而a c c 脱氨酶可以调节乙烯的产量。 b u r d 等人洲在重金属污染的土样中分离出对n i 2 + ，p b 2 + ，z n “，c r 0 4 一都有抗性的 菌株( 杪p 咖a s c o r b a t as u d l 6 5 ，经检验这种菌不但能够产生铁载体，还表现出 a c c 脱氨基酶活性。将正 u y v e r aa s c o r b a t as u d l 6 5 加到表面灭菌的油菜种子，种 植到n i 2 + 含量高的灭菌土中，发现接菌处理的植物幼苗与不接菌处理相比，地上部 分及根长都要长。显然，k u y v e r aa s c o r b a t as u d l 6 5 在实验过程中表现出缓解重 金属对植物幼苗的危害的能力。在2 m mn i “时，1 8 小时后测得乙烯的产量接菌比不 接菌时降低，因此可见微生物对植物的保护可能是通过调节乙烯产量而引起的。 在重金属污染介质中植物对铁的吸收往往会受到重金属的影响，易导致植物缺 铁而影响生长嘲。产铁载体也是促植物生长菌促进植物生长的重要表现。b u r d 等 人胁1 分离w , k u y v e r a a s c o r b a t a s u d l 6 5 的变异品种e u y v e r a a s c o r b a t a s u d l 6 5 2 6 。 这两种菌不但都对n i 2 + ，z n “，p b “，c r m 呈现一定抗性，都具有a c c 脱氨基酶活性， 且它们都能够产生铁载体，但是前者产生的铁载体明显高于后者在n i ，p b ，z n 都 过量的土壤介质中，种植分别接种e l u y v e r aa s c o r b a t as u d l 6 5 及其变异品种 ( u y v e r aa s c o r b a t as u d l 6 5 2 6 的西红柿，油菜和印度芥菜种子。虽然重金属的加 入使得植物的干重、湿重，蛋白质，叶片中叶绿素的含量四个参数都下降，但是与 接菌处理相比，这两种菌的加入使得这四个参数有明显好转。可见这两种菌的加入 缓冲了重金属对植物的毒性。对植物体内重金属含量的比较结果显示，菌的添加没 有增加植物对重金属的吸收。接种k u y v e r aa s c o r b a t as u d l 6 5 2 6 比k u y v e r a a s c o r b a t as u d l 6 5 对植物的保护效果更明显，说明这两种菌产生的铁载体在植物生 长过程中可能起到很重要的作用。 r a j k u m a r 等人渊在c d 污染区分离到两种促植物生长菌株p s e u d o m o n a ss p p s a 4 和b a c i l l u ss p b a 3 2 ，这两株菌都能产生铁载体，都能溶解p ，但p s m 产i a a ，而b a 3 2 7 中山大学硕士学位论文 不能，另外对c ，的耐受水平也是p s m 比b a 3 2 高。接种这两种菌都促进了印度芥菜地 上部分、根以及活力指数的增长，且p s a 4 比b a 3 2 效果好。这两种菌增强印度芥菜对 c ，的抗性可能和i g g 、铁载体的产生以及对p 的溶解都有关系。w u 等人将对c u ，c d ， p b ，z n 都有抗性的固氮菌a z o t o b a c t e rc h r o o c o c c u bh 烈一5 。溶磷菌b a c i l l u s m o g a t o r i u m h k p 一1 和溶钾菌b a c i l l u s m u c i l a g i n o s u s h k k _ 1 用于芥菜的培养。和不接 菌处理相比较，细菌的接种使芥菜地上部分的重量增加。这些菌的添加基本上也没 有促进植物对重金属的吸收，但是植物体内的s 和n 的含量增加而且和土壤介质中重 金属的含量呈正相关，这可能是因为在应对重金属压力时，植物对s 和n 会产生特别 的需求。不断增加体内n 和s 的量也可能是植物减弱重金属毒性的一个机制。 b e l i m o v 等人删也分离出对c d 有抗性且能促进植物根系生长的菌株。其中属于 v a r i o v o r a xp a r a d o x u s ，r h o d o c o c c u 5s p 和f a v o b a c t e r i u ms p 的11 种菌株在植 物生长介质中有c d 或无c d 情况下都会促进植物根系增长，但是当植物生长在受c d 污 染的介质中时，这些菌的作用效果更明显。在这些菌的作用效果对比来看， zp a r a d o x u s2 c - l ，2 p 一4 ，3 c - 5 和5 c 一2 使植物的根系增长量最大但他们并没有对这 些菌株影响植物根系生长的机制进行探索。 可见，植物根际的p g p r 可以通过以下机制缓解重金属对植物的胁迫，促进植物 生长：( 1 ) 固定大气中的n ，满足植物生长需要；( 2 ) 合成小分子物质，如铁载体等。 溶解扣押土壤中的铁，提供给植物；( 3 ) 合成植物荷尔蒙，如i a a ，促进不同阶段植 物的生长；( 4 ) 溶解土壤中的含p 、k 矿物质，促进植物吸收。( 5 ) 合成酶，如a c c 脱氨酶，调节植物激素的量，从而影响植物的生长。 目前植物一微生物联合修复研究较多的还有菌根真菌。近年来菌根在降解土壤污 染物中的作用已引起国内外很多学者的关注“”，应用菌根技术修复土壤有机污染、 重金属污染，农药污染及放射性核素污染的研究也屡见报道。菌根是土壤中的真菌 菌丝与高等植物营养根系形成的一种联合体“幻。菌根植物与土壤重金属污染的研究 开始于2 0 世纪8 0 年代初。b r a d l e y 等在调查英国矿区植物时发现，在金属尤其是 重金属含量很高的矿区，植物非常稀疏。少量生存的植物中多为菌根植物，且菌根 植物较非菌根植物表现出良好的生长优势。越来越多的研究表明菌根表面延伸的菌 丝体可大大增加根系的吸收面积，可为植物吸收传递营养物质，并能合成植物激素， l 中山大学硕士学位论文 促进植物生长。菌根真菌的活动还可以改善植物根际环境，提高植物抗逆性 随着对重金属污染土壤生物修复技术的研究深入，人们认识到单独的植物修复 或者单独的微生物修复在土壤重金属污染过程中都会受到不同条件的限制，而将植 物与微生物联合应用于土壤重金属污染的治理工作中比单独运用其中一种更能发挥 出生物修复的优势h 册 1 4 内生菌研究进展 内生菌的概念最早是由d eb a r y 提出的，当时只是为了和生活在植物表面的表生 菌相区分。现在内生菌多指那些在生活史上一定阶段或全部阶段生活在植物体内但 并不使其宿主植物表现出症状的菌类洲。早在1 9 2 4 年l e w i s 就报道了禾本科植物体内 存在内生菌，但是此后对内生菌的研究一直较少。直到2 0 世纪3 0 年代发现造成畜牧 业重大损失是因为牲畜食用了侵染内生菌的牧草引起中毒造成咖，内生菌才引起了 广泛的重视。大多数的植物体内都会有内生菌的存在，这些内生菌作为非病原菌和 植物组成共生体系。这个共生体系的形成往往对植物表现出益处，如促进植物的生 长，增强对病原体的抗性，提供高植物对不利环境的抗性等 营养物质的缺乏往往使得植物的生理，形态、生物化学性质都发生变化。在营 养物质缺乏的介质中生长的植物，内生菌的侵染可能会改善植物对营养的吸收。 m a l i n o w s k i 等人m 研究发现，酥油草根系可释放出酚类物质，这些物质通过与土壤 竞争吸附阴离子提高无机磷的活性，或者和土壤中的a 1 、f e 、蛐1 结合，而释放了原 本与a l 、f e 、等结合的无机磷的活性，从而利于植物的吸收。内生菌侵染的酥油 草比未侵染的酥油草根系分泌出酚类物质的量增加，尤其是在p 不足的时候更明显。 因此生长在p 缺乏的介质中的受内生菌侵染的酥油草比未侵染内生菌的酥油草在植 物地上和根部会累积更多的p ，从而缓解了p 的缺乏对植物的胁迫。z a b a l g o g e a z c o a 等人嘲在半干旱气候区，n 、p 、k 、m g 、c u 、z n 等营养元素匮乏的土壤中进行大田 试验，结果显示在成熟期酥油草体内的c a 、m g 、c u 三种营养元素的浓度比生长期低， 但是侵染内生菌的成熟期的酥油草比未侵染的成熟期酥油草体内的c a 、m g 的浓度要 9 中山大学硕士学位论文 高，可见内生菌提高了成熟期植物对c a ，m g 两种元素的吸收。b e l e s k y 和f e d d e r s t 。j 在研究中也发现内生菌的侵染可能会影响到植物对n 的吸收利用。 而在重金属含量高的环境中，内生菌的侵染也可能会提高其宿主植物对重金属 的抗性。b o n n e t 等人删对z n 和内生菌对黑麦草的生长参数和叶绿素的荧光效应以及 抗氧化酶活性的影响的研究中，用含有0 5 0 i i l m 的的营养液来浇灌黑麦革的幼苗，发 现在在z n s 0 4 的浓度1 ，5 ，l o m m 时，侵染和未侵染内生菌的黑麦草生长都减慢，而在 5 0 m m 时黑麦草生长停止。但是在z n s o , 的浓度1 ，5 ，l o m m 时侵染内生菌的黑麦草的 分蘖数要比未侵染状况下高。这说明了内生菌的侵染提高了黑麦草所能承受的z n 的 阈值。m o n n e t 等人“”用含0 - 2 0m mz n s o , 的营养液进行了类似的试验。在经过8 天的 培养后发现在z n s o , 的浓度为1 ，5 ，1 0 ，2 0m m 的情况下，黑麦草叶片中的z n 的浓 度很明显，有无内生菌的侵染结果没有差别。但在培养1 5 天后，叶片中z n 的浓度比8 天时增加，但是侵染内生菌的黑麦草比未侵染的黑麦草叶片中的z n 的浓度少2 4 - 3 2 ； 侵染和未侵染内生菌的黑麦草的干重和分蘖数都减少，但未侵染的黑麦草在z n s 0 4 的浓度5 枷时就降到最低值；侵染内生菌的黑麦草的干重要比未侵染过的植株高； 在卜l o m m z n 的情况下，侵染内生菌的黑麦草的分蘖数比未侵染的要高。这说明了侵 染过内生菌的黑麦草表现出对z n 的抗性。可见内生菌的侵染可能会提高植物对重金 属的抗性 i 5 研究目的、意义及研究内容 微生物具有种类多，数量大，分布广，繁殖快，个体小，对环境适应性强等特 点，因而也成了人类最宝贵，最具有开发潜力的资源库之一重金属虽然不能被微 生物降解，但对重金属有一定抗性的微生物可以吸附和转化重金属微生物修复存 在着生物量小、难收集等不足，使得这一方法在重金属污染方面的应用存在局限性。 而植物修复也存在着生物量小，修复周期长以及一般只针对单一重金属起作用等不 足，在实际应用中受到限制。某些对重金属具有抗性的微生物，可以帮助提高植物 重金属抗性，减少重金属向植物可食用部分迁移、累积，或者促进重金属在植物中 i o 中山大学硕士学位论文 累积，对这些微生物的筛选在环境保护工作和农业生产中都具有积极意义将这些 微生物与植物联合应用于土壤重金属修复将有助于提高修复效果，扩大生物修复的 应用范围 基于以上研究目的和意义，本论文研究内容如下： ( 1 ) 采集重金属富集植物和非富集植物及其根际土壤，对植物内生菌和根际微生物 的重金属抗性进行研究，以期发现富集植物内生菌与非富集植物以及根际微生物中 重金属抗性菌株类群及分布上的差别。为利用内生真菌与其宿主植物联合修复土壤 重金属污染奠定基础 ( 2 ) 筛选出对重金属c d 和n i 都具有较强抗性的内生菌和根际微生物，研究这些菌 株的生物特性，为其在与植物联合修复中的应用提供理论依据。 ( 3 ) 通过盆栽实验探索内生菌和根际微生物对植物累积重金属量的影响。 中山大学硕士学位论文 第2 章重金属抗性内生真菌与其宿主植物 重金属抗性关系初探 2 1 引言 人类对重金属的开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多，不少重金属如铅、 汞、镉、钴等排入大气，水、土壤环境中，造成严重的环境污染采用物理或化学 方法修复土壤重金属污染不仅有可能破坏土壤结构和肥力，且费用较高；而生物修 复具有投资少、效率高、操作简便等特点，在环境治理中显示出较好的前景。微生 物可通过多种方式改变不同重金属的物理、化学特征，影响重金属在环境中的迁移 与转化，减轻对其他生物体的危害但微生物不能降解或破坏重金属，且微生物个 体太小，吸附的重金属很难从土壤中去除，因此微生物对重金属的修复被认为不是 修复土壤重金属污染的根本途径。植物修复虽然克服了微生物修复难以收集的缺点， 但过量的重金属往往对植物生长产生抑制，且修复植物的生物量太小，修复过程缓 慢。利用微生物和植物联合对重金属污染土壤进行修复是提高生物修复效果的有效 措施嘲目前对植物一微生物联合修复的研究主要集中于根际微生物与其宿主植物， 但根际微生物在实际应用中往往会对多变的土壤环境不适应或者受到土壤本土微生