（农产品加工及贮藏工程专业论文）低温低酸发酵牛肉专用高效浓缩发酵剂的制备工艺研究.pdf

摘要 本课题戳嚣产发酵牛囱b u n d n e r f l e i s c h 鑫然发酵过程中分离箢选如豹三株优势墓 植物乳杆菌、戊糖片球菌和木糖葡萄球菌为研究对象，对菌株部分特性进行了测 定，系统研究了萤体细胞增殖条件、浓缩分离条件、冻干菌粉发酵剂冷冻过程中抗冷 冻复合干燥剂的配制、成品发酵剂的贮存特性，旨在为低酸发酵肉制晶直投式浓缩型 发酵剂生产提供依据。研究结果如下： 本文测定了植物乳杆落、戊糖辟球菌和本糖葡萄球菌的部分发酵特性，研究发现： 三者均具有较强的耐盐性和耐亚硝酸盐性；植物乳杆菌和戊糖片球菌只具有蛋白降解 能力，燕冰糖蘸甍球蓥具有蛋自洚解能力襄l 旨肪骅瓣能力；植物乳杼蘩帮戊糖片球蓥 菌株对致病菌的抑菌效果较好，木糖葡萄球菌抑菌作用较差。 对植物乳枵菌、戊糖片球菌和木糖葡萄球菌的增建培养基进行了优化，确定了菌 株的复合增殖培养基配方。植物乳杆菌的复合增殖培养基配方为：麦芽汁培养藻中添 加2 乳糖、1 牛肉蛋白胨、2 5 酵母膏、1 0 番茄汁；戊糖片球菌的复合增殖培养 基配方为；麦芽汁培养基中添加0 5 乳糖、1 5 牛肉蛋自胨、5 酵母膏、1 0 番茄 汁；木糖葡萄球菌的复合增殖培养纂配方为：麦芽汁培养基中添加0 5 葡萄糖、1 5 牛瘸蛋自胨、0 1 牛凑膏、1 n a c l 。 同时对菌株的增殖培养条件进行了研究，确定了菌株的培养条件。植物乳杆菌和 戊糖片球藕：培养温度为2 0 ，培养基初始鞋l 德6 5 7 0 。培养黠闼2 0 h ，菌体密 度可分别达3 7 5 1 0 9 c f u m l 和3 6 8 x l o f u m l ：木糖葡萄球菌：培养温度为2 0 ， 培养基初始p h 值7 0 ，培养时间2 0 h ，菌体密度可达5 0 0 x 1 0 9 c f u m l 。 对蘸体细胞浓缩分离条件进行了选择研究，结果驻示：离心方法浓缩菌体的效果 明显高于细菌过滤器的浓缩效果，并且采用高转速离心，可以提高浓缩荫体浓缩倍数， 有嗣于菌体细胞塞集分离。确定落体细胞浓缩分离豹适宜离心条l 串为0 4 c 、 6 0 0 0 r p m 离心3 0 r a i n 。 以1 2 的脱脂乳为冻干悬浮基质添加单因子剖戚冻干保护剂，进行冷冻予燥试 验。从试验结果中发现蔗糖、维生綮c 、甘油和c a c 0 3 是植物乳杆菌、戊糖片球菌 和木糖葡萄球菌的较好单因子保护剂。利用b ( 3 4 ) 藏交试验优化豹植物乳杆菌、戊 糖片球菌和木糖葡萄球菌的复合冻干保护荆配方分别为：在脱脂乳中添加5 蔗糖、 o 5 维生索c 、4 甘油、3 c a c 0 3 ；脱脂乳中添加4 蔗糖、l 维生索c 、3 甘油、 2 c a c 0 3 鞠脱脂襞串添加3 蔗糖、1 5 维生素c 、5 甘油、4 c a c 0 3 ，霹分剐使 植物乳杆菌、戊糖片球菌和木糖葡萄球菌冷冻干燥存活率达到6 3 0 1 、6 6 2 0 和 7 0 4 7 ，裂釜豹冻于薤粉发簿裁的潘蓥数分别为2 6 2 1 0 1 0 c f u g 、2 。5 4 1 0 1 f u g 翔 2 9 1 1 0 1 0 c f u g 。 系统研究了冻干菌粉发酵剂的贮存特髓，结果表明：发酵剂在贮存期闻呈下降趋 势，冷冻保存和冷藏保存的效果要好于室温保存效果，但两者的差别不大。从生产应 用角度考虑，采用o 4 保存 菌落计数结果表明，在冷藏条件下贮存夔粉至第6 个月时，冻干菌粉的活菌数仍在1 0 m c f u g 以上。 关键词l 低酸发酵肉制品；b u n d n e r f l e i s c h 发酵剂；浓缩培养 真空冷冻干燥：保 护剂 t h es t u d i e so np r e p a r a t i o no fh i g he f f i c i e n c ya n dc o n c e n t r a t e ds t a r t e rs p e c i a l i z e df o r t h el o w t e m p e r a t u r ea n dl o w a c i df e r m e n t e db e e fp r o d u c t s a u t h o r ：y uh u i s u p e r v i s o r ：j i ay i n g - r a i n ； s u nb a o - z h o n g m a j o r ：f o o dp r o c e s sa n ds t o r a g ee n g i n e e r i n g a b s t r a c t b i o t e c h n o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，h i g hd e n s i t yc u l t i v a t i o n ，c o m b i n e dc r y o p r o t e c t a n t so f c o n c e n t r a t e dc u l t u r e sp r o d u c t i o na n dq u a l i t yg u a r a n t e e - t i m eo fs t a r t sc u l t u r e s ，e ta 1 w e r e s t u d i e dh e r es y s t e m i c a l l yw i t ht h r e es t r a i n si n c l u d i n gl a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ，p e d i o c o c c u s p e n t o s a c e u sa n ds t a p h y o c o c c u $ x y l o s u s ，w h i c hw e r es e p a r a t e da n di d e n t i f i e df r o m n a t u r a l l yf e r m e n t e dd r i e db e e f - b u n d n e r f l e i s c h + t h er e s u l t sw e r ef o l l o w i n g ： t h er e s u l to ft h ef e r m e n t i n gc h a r a c t e r i s t i c so ft h es t r a i n si n d i c a t e dt h a tt h r e es t r a i n s h a v et h ep r o p e r t i e st oe n d u r eh i g hs a l ta n dh i 【g hn i t r i t e ；l a c t o b a c i l l up l a n t a r u r na n d p e d i o c o c c u s p e n t o s a c e u s c o u l da f f e c t t h e d e c o m p o s i t i o n o f p r o t e i n ，s t a p h y l o c o c c u s x y l o s u s c o u l da f f e c tt h ed e c o m p o s i t i o no f p r o t e i na n df a t ；l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u ma n dp e d i o c o c c u s p e n t o s a c e u sc o u l di n h i b i tt h eg r o w t h so fs o m ep a t h o g e n i cb a c t e r i a ，b u ts t a p h ，l o c o c c u s x y l o s u sc o u l d n t t h eo p t i m u mm e d i u m so ft h e s et h r e eb a c t e r i aw e r eo b t a i n e d t h eo p t i m u mm e d i u mo f l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u mw a sb a s e do nt h em a l t j u i c em e d i u ma d d i n gw i t h0 5 l a c t o s e 1 p e o t o n eb e e f , 5 y e a s te x t r a c t ，5 t o m a t oj u i c e ；t h eo p t i m u mm e d i u mo fp e d i o c o c c u s p e n t o s a c e u sw a sb a s e do i lt h em a l tj u i c em e d i u ma d d i n gw i t h0 5 l a c t o s e 1 5 p e o t o n e b e e f , 5 y e a s te x t r a c t 1 0 t o m a t oj u i c e ；t h eo p t i m u mm e d i u mo fs t a p h y l o c o c c u sx y l o s u s w a sb a s e do nt h em a l tj u i c em e d i u ma d d i n gw i t h0 5 g l o c u s e 1 _ 5 p e o t o n eb e e f , 0 t b e e f e x t r a c t 。l s o d i u mc h l o r i d e 。 t h i sp a p e rs t u d i e dt h ec u l t u r ec o n d i t i o n so fl a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m p e d i o c o c c u s p e n t o s a c e u sa n ds t a p h y l o c o c c u s x y l o s u s t h ec u l t u r ec o n d i t i o n so f l a c t o b a c i l l u s p l a r t t a r u m a n dp e d i o c o c c r sp e n t o s a c e u sw e r e ：c u l t u r e dt e m p e r a t u r e2 0 ，i n i t i a lp hv a l u e6 5 7 0 。 c u l t u r e dt i m e2 0 h ；t h ec u l t u r ec o n d i t i o no f s t a p h y l o c o c c u sx y l o s u sw a s ：c u l t u r e d t e m p e r a t u r e2 0 ，i n i t i a lp hv a l u e7 0 ，c u l t u r e dt i m e2 0 h 。a f t e ri n c u b a t i o n 。t h ev i a b l e c o u n t so f t h r e es t r a i n sw e r e3 7 5 x 1 0 9 c f u m l 3 6 8 x 1 0 9 c f u m la n d5 0 0 x 1 0 9 c f u m l t h e c o n c e n t r a t i n ge n r i c h m e n tc o n d i t i o n sw e r es t u d i e da n dc h o s e n ，t h er e s u l t si l l s t r u t e d t h a tt h ec e n t r i f u g a le f f e c tw a sb e t t e rt h a nt h eb a c t e r i af i l t e r ；t h ee f f e c to fh i g hr p mw a s h e l p f u lf o rb a c t e r i a sc o n c e n t r a t i n g ，i m p r o v e dt h ec e n t r i f u g a t i o nc o n c e n t r a t i n gt i m e s t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eb e s te f f e c tc o u l db eo b t a i n e da to 4 w i m60 0 0 1 节mf o r3 0 r a i n u s i n g1 2 s k i m m e dm i l ka ss u s p e n d e ds u b s t r a t ，t h ef u n c t i o no fp r o t e c t o r si n c l u d i n g s u c r o s e ，g l y c e r i nw a ss t u d i e d r e s u l t ss u g g e s t e dt h a ts u c r o s e ，v c ，g l y c e r i na n dc a c 0 3h a d b e t t e re f f e c t so np r o m o t i n gc e l lc o u n t a c c o r d i n gt oo r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，t h eo p t i m a l c o m b i n e dc r y o p r o t e c t a n t so fl a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m ，p e d i o c o c c u sp e n t o s a c e u sa n d s t a p h y l o c o c c u sx y l o s u sc o n t a i n e dt h ef o l l o w i n gi n g r e d i e n t sw e r eb a s e do nt h em o d i f i e d s k i m m e d 戚投a d d i n gw i t h5 l a c t o s e ，1 v c ，5 g l y c e r i na n d3 c a c 0 3 ；b a s e do nt h e m o d i f i e ds k i m m e dm i l ka d d i n gw i t h4 l a c t o s e ，1 v c ，3 g l y c e r i na n d2 c a c 0 3 ；b a s e d o nt h em o d i f i e ds k i m m e dm i l ka d d i n gw i t h3 l a c t o s e ，1 5 v c ，5 g l y c e r i na n d2 c a c 0 3 t h es u r v i v a lo f l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ，p e d i o c o c c u s p e n t o s a c e u s ，s t a p h y l o c o c c u s x y l o s u s g o tt o6 3 0 1 。6 6 2 0 a n d7 0 4 7 ；t h ec e l ls u s p e n s i o ni nf r e e z e d r y i n gc u l t u r es t a r t e r c o n t a i n i n gt h es u i t a b l ep r o t e c t o rm i g h tb el y o p h i l i z e di n t ot h es t r a i n sw i t hh i g hv i a b i l i t y ( t h e n u m b e ro fv i a b l ec e l l2 6 2 x i 0 o c f u g 。2 5 4 x 1 0 1 0 c f u ga n d 2 9 1 x 1 0 1 0 c f u g ) m e a s u r i n go fq u a l i t yg u a r a n t e e t i m e ：s t o r a g ee f f e c tu n d e rf r e e z i n gc o n d i t i o na n d r e f r i g e r a t i o nc o n d i t i o nw a ss u p e r i o rt ot h o s eu n d e ri n d o o rt e m p e r a t u r e ，b u tt h ec o n t r a s tw a s s m a l l n e s s ：t h ep r e p a r e ds o l i df e r m e n t a t i o na g e n t sa r es t o r e du n d e rr e f r i g e r a t i o nc o n d i t i o n f o fs i xm o n t h s k e yw o r d s ：t h el o wa c i df e r m e n t e dm e a t ；b u n d n e r f l e i s c h ；s t a r t e rc u l t u r e ；c o n c e n t r a t e d c u l t u r e s ；v a c u u mf r e e z e - d r y ；p r e s e r v a t i o na g e n t 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得煎韭盎些盘鲎或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：j 博 签字日期：例6 年月昭日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑些盛些盘茔有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑些盘些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：j 裤 导师签名 犀翔 鲢豳 签字日期：o e 年月f ? 日签字日期：年月 日 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 电话 邮编 堡翌堡璧堡茎生堕童星塞垫鎏堡垄篷型堕型鱼三苎塑塞 i 引言 l 。i 低酸发酵牛离研究概述 l 。1 1 低温低酸发酵牛肉及其存农的主要问聪 传统上普遍认为经过低温发酵作用形成的p 疆谴为5 5 和犬于5 ，5 的岗制品为低温低骏发酵肉 剿晶。其中，发簿牛内就怒其代表产品之一i lj 。 发酵牛肉是一类以牛脶体分割部位囱为原料，采用低温腌制、干燥等工艺加工丽成的可以生 鲜或烹调食用的发酵肉制品。与各种千腌火腿、发酵香肠样发酵牛肉也起源于现代食品加工 贮藏监形成以前人们嗣用低温腌髑与千燥方法长期保存肉类8 “。 在欧湘和其能太陆有大量传统的、著名的低酸发酵牛肉带i 晶，妇西班牙、意大利、瑞士、德 国等欧洲豳家生声的c c c i n a 、b r e s a o l a 、b u n d n e r f l e i s c h 、f e n e l a r ，墨西、爨题哥等拉美国家生产 的c h a r q u i 、c a m ed es e c a ，南菲、苏丹、尼日剃亚等非洲国家生产的b r i t o n 、s h c r m u t e 、k i l l s m ， 泰国、马来西亚、印度尼龋照婷亚洲国家生产的d c b o n o t 、s e r u r d i n g 、d e n d e n g 等均属于这类产 品 1 , 3 , 4 1 。起源予我菡云南蓖明魏牛予巴( 艚牛肉) 和b u n d n c r f l e i s c h 风干牛疼也应属于诧类产品 1 1 , 5 , 6 1 。 有关研究表明，在产品质爨特征方面，发酵牛肉不仅与发酵香肠、于腌火腿一样具有优异的卫 生安全、营养事甯、风味独特、烹调食用方式多样、易于贮存的发酵肉制品产晶特征，丽且由于发 酵牛肉加工原料是为高蛋白、低脂肪的牛肉，其产品高营养与美食特征更加突出，与其他肉制品 相比更糟会潢赞蠹求美味、重营养的肉类产品溃费藉求【 “。在欧溯等疆方发达国家，发簿牛肉 产鼎已由受消费毒冷落豹传统剃品演变成备受湾费者毒睐豹营募荚睬食品。发酵牛肉在戮图也属 高档产品产品供应已由高档宾馆饭店转向高档超市。 在诧转变过程中，欧夔等发达国家与拉美发震中国家的发酵牛肉生产均获褥了较大发展，其 中意太剩、西班牙、巴西等嚣已将发酵牛肉生产推进到王厂化、标准化生产阶段”1 “i h 。以巴蓊 为铡。1 9 8 0 年时c h a r q u i 产量仅有8 8 吨“，藤到1 9 9 5 年其产量邑增长到6 万余吨i z 】。意犬剥的 b r e s a o l a 产品也由上世纪八十年代初豹避t 0 0 吨增长到2 0 0 0 年的8 6 5 0 吨，其市场己由翻内拓袋 到国际市场川。但是，由于牛肉在欧美等西方发达国家瘸高档高价肉类m “l ，加工周期长、产率 低、生产成本离等仍是发酵牛肉规模纯发展豹制约因素，已成为世界各发酵牛肉生产潮迫切需妥 的解决的润藤。 1 1 2 低酸发酵牛肉微生物方西豹研究现状 为实现发酵牛肉生产加工工艺现代化、提高发酵牛肉生产能力，自2 0 世纪6 0 年代以来意 犬和、西班牙、敬西等发酵牛肉生产国就发酵牛肉产品诸多方面开展了大量细致的工作。不仅在 生产工艺方面取樽了突破进展，产蘸生产实现了工厂化帮标准亿，在微生物交化、特憔研究、微 生物作用等方面也取褥了较大的发展，为通过应用发酵剂加快低酸发酵肉制品的发展奠定了一定 的基础。 ( 1 ) 低温低酸发酵牛肉微生物学特性研究进展 河北农业大学硕士学位论文 研究表明墨嚣哥四州健统工艺生产的c e c i n a 产品中均含有一定数董的细菌、霉菌、酵霉菌 | ：1 2 】，而巴西的c h a r q u i 产品中仅发现禽脊一定数堂的细菌、霉菌1 3 j ，b r c s a o l a 产品中仅存在一定 数量的细翦 l 叫”。毽翦，有关发酵牛海中霉蒴季孛属与酵母数璧尚属未知。 ( 2 ) 低温低酸发酵牛肉产品中优势菌株的研究 目前研究发现在b r e s a o l a 与b u n d n e r f l e i s c h 加工过程中的优势菌为木糖葡萄球菌 7 1 ：c c c i n a 产品热工过程中靛优势菡为变异徽球藩帮马胃葡萄球茁、术糖葡萄球藩等葡萄球菌 2 0 i 2 j ；国产 b u n d n e r f t e i s c h 产品加工过程中优势菌为乳酸菌和葡萄球菌，乳酸菌主要是植物乳杆菌、戊糖片 球菌、乳酸片球蓥，麓莓球菌主要是瘸生毽萄球萤、术糖磺萄球鹫、松鼠葡萄球菌“。 ( 3 ) 低温低酸发酵牛肉加工过程中微生物作用研究 在发酵牛肉加工过程中微生物变化作用方面，研究发现在c e e i n a 、b r e s a o l a 与c h a r q u i 产品 加工过程中肉的p 毛傻基本恒定或略有升离，乳酸盐含量基本恒定，一般认为巍酸细萄在c e c i n a 、 b r e s a o l a 与c h a r q u i 加工过程中不具有发酵产生乳酸、降低肉类p h 、提高产品安全质量作用”“”“1 。 干腌火腿、发酵牛肉加工过程中优势菌( 擞球菌与箍萄藏球) 在蛋自质酶解变化过程中不典有显 著作用，分析其原因是微球蔼与葡萄球蔫存在数量较少( 1 0 2 l 矿) 5 7 1 0 1 3 i , 有关c h a r q u i 加工初 始阶段接种木糖葡萄球菌与肉葡萄球菌发酵剂可加剧蛋白质酶解、改进产品感宦质量【1 1 ” ，一方 嚣证碉了主述研究蹒点，另一方嚣瞧表弱将优势菌培养扩大作为发簿剡接耱予原料肉上，增热优 势菌数量能够将发酵牛肉加工过程中微生物提高到发挥作用水平。通过应用发酵剂途径研究优势 菌在发酵牛陶加工避稷中作用是具有应用价值的研究领域。 雪翦，肉类科学界对于乳酸菌、微球菌、葡萄球菌等细菌，汉逊氏褥巴利酵母、法马塔假丝 酵母等酵母、产黄青霉与纳地青霉等霉菌在各类发酵香肠中安全、营养、感官质量特性形成过程 审豹作用已有极为深入地了解，在其研究基础上形成的各种类蘸业发酵荆己应黑于发酵香肠加工 过程 1 6 - - 2 2 。但是在低酸发酵肉制品方面还没有商娥发酵剂可用于低濑发酵肉制品的规模化生产 “3 “j ，因此低酸发酵牛斑发酵剂的制备主要是结食低酸发酵牛肉的工艺参数，依据高酸发酵肉制 品浓缩型千粉发酵荆鼢铡备工艺为依据进行。 1 2 发酵剂菌株的筛选标准 时至今日。发酵剂的发展可以分为2 代：第1 代发酵剂是由植物中分离提纯的乳酸菌构成 的，主要包括植物乳杆菌和戊糖片球菌。第2 代是由肉中分离提纯的乳酸菌( 清滔乳杆菌、弯曲 乳杆菌等) 构成的，蔽而更符合肉类发酵的生态学特征 2 7 。1 。无论哪种蔚种，在肉品发酵条件( p h 、 a w 、温度、腌制剂) 下，发酵剂在经历尽可能短的停滞期詹应该能够以适当的速度发挥它们 理想的活性。因此，捧兔痰晶发酵捐应该满足戳下条件o 9 l 。 i 2 1 安盒性 作为发酵肉制晶细菌菌种，必须对人体无害，曩体内容包括：必须是革兰氏阳性菌，无致病 性，不得产生细菌毒素( 尤其在葡萄球蘸的筛选中，必须是凝固酶阴性) ；不产生生物胺。 2 低温低酸发酵牛肉专用高效浓缩发酵剂的制备工艺研究 1 2 。2i | 重盐性 氯化钠在发酵番肠中的添加量通常为2 5 3 o ，筛选菌株必须有良好的食盐耐受性要 求能移在至少6 0 的食盐浓度下生长。 1 2 _ 3 有n o 。2 和n o 3 还原能力 肉制品的发色机理是硝酸盐在还原细菌的作用下，还艨成亚硝酸盐，随后与肉中乳酸发生反 应形成皿硝酸，蜃者分解产舷氧化氮( n o ) 与肌红蛋白戏血红蛋白结合生成n o 亚硝基肌( 血) 红蛋自。使彘其有鲜艳翡玫瑰红色。由弛发色桃理来看，所选菌株必绥其有良好的硝酸盐还魇能 力。 1 2 4 产酸特，睦 发酵香肠在常温下之所以有一个较长的货架期是因为它自身固有的“二低一高”：低p h 、 低水分禽董及嵩的含盐量。这就要求l a b 能快速发酵葡莓糖或蔗糖产酸，这是决定发酵成功与 否及发酵食品安全性的一个蘸要工艺条件。这项标准主要针对l a b 中的杆菌和部分球菌。 1 2 5 发酵避程中不褥毒犬釜气体产生，不得有粘液生成 在发簿过程中，如果乳酸菌异型发酵菌株，产生大量c 0 2 ，会影响到香肠的结构致密性；而 且某些菌类的代谢产物中如有粘液状物质，同样也会损坏蠢肠的内部缝织状态。在菌株的筛选中， 这些标准必须考虑。 t 2 。6 挪菌性 对腐败菌如大肠杆菌、金黄色葡蔼球菌等致病菌具有抑翻作用，可以保证产品的微生物安全 性。 1 2 7 具有抗冷冻干燥特性 肉制品发酵剂生产一般采用真空冷冻干燥法因此要求优选菌株必须有较强的抗冷冻干燥能 力。 针对发酵荆菌株的来源、应用条件的不同，筛菌标准应有所佣熏。例如：发酵牛离的发酵湿 度较低、生产周期较长，筛选应用菌株时，考虑到缩短生产周期、增加产品安垒性，虚侧重考虑 蘸抹的畿白、l 肪分解糍力、推蓥特性。现在人们正逐步转l 訇应用干粉发酵翔生产发酵肉制品， 因此，菌株的抗冷冻干燥能力也应侧重考虑，主要表现在：在最佳培养条件下具有较大生物量 ( 菌密度 1 0 9 c f u m l ) ；冻于后具有较高的存活率。虽然影响存活率的因素很多( 保护剂、冻 干工艺簿) ，懂不嗣蓥株间抗冷冻干燥豹能力还燕存在很大的差异；冻干蓠种於活力能够保持 较长时间。一般要求冻干菌粉在存放一年后活菌数不低于1 0 9 c f u g 。 翌垫查些盔兰篓主兰壁鲨苎 1 3 发酵凌制晶于粉发酵剂的制备 1 3 1 薅株增殖培养 ( t ) 蘸株增穰培养基州“1 获得适合乳酸菌大量生长的培养基是制备浓缩型发酵剂的前提。研究表明乳是乳酸菌的良 好天然培养基，传统上一赢采用全脂奶、脱脂奶、1 2 左右的脱脂奶粉来制备发酵剂，僵菌体生 长螽会产生凝器，不易分离。菌体在经典乳酸菌分离和计数垮葬基中生长靼分离状况均较好但 成分复杂、价格昂贵 5 9 1 。适合工业化嫩产浓缩型发酵剂的乳酸菌培养基必须基于原料易得、价格 低廉、翁体产量高、容易浓缩分离细胞，此外，还应增加菌体细胞的抗冻性。因此，增殖培养基 应其毒如下特点t 适会蘼体生长，繁殖速度抉，在较短时闯内可褥到大璧亮活力细胞；菌体 与培养基易分离：成本低廉，煅好能反复利用。对于应用于低酸发酵肉制品的发酵荆菌种来说。 其生长繁殖强度较低，菌体生长较缓幔因此，能否提嵩菌株豹生长繁殖速度以起到发挥菌株发 酵和抑制杂蘸生长的作用应成为 j 舞选菌株增殪培养基的重要指标之一。 一些蔬菜如胡箩h 、黄瓜、番茄等也可作为乳酸菌增殖培养的培养基f 5 ”，但是其中营养物 攒如碳源和氮源的含羹不谚充避，需大量添加，从两使生产搡作过于复杂。 增藉培养基除原料基睡外，各种碳源物质( 葡萄糖、乳糖、麦芽塘等糖类) 、氮源物质( 酪 蛋白水解物、胰蛋白胨等水解蛋白) 、氨基酸及维生素炎( 酵母提取物、丝氨酸、维生索c 等) 、 缓冲盐类( 碳酸钙、磷酸盐、柠檬酸熊、b 磷酸嚣油二钠等) 等增麓因子也是提高菌体生长繁殖 速度的关键因褰。裳1 为国内外研究报道的技为广泛认可的乳酸菌增殖因子。 ( 2 ) 增殖培养方法 巍酸菌在代谢豹过程中分解糖类会产生丈量的有橇羧，其中主要是乳酸。辑着乳酸萄细艴的 增殖，乳酸的含量逐渐增加致使培养液的酸度升高，乳酸茸细胞的增殖受到抑制甚至导致细胞 死亡御j 9 】。因此，对乳酸黼进行浓缩培养的基本原理是 在乳酸菌培养过程中，通过追加营养物 质、排除找谢产物、调节p h 德等獾掩，解殊代谢产物襞酸对细胞生长的撺制作爝，延长乳 酸菌的对数生长期，获得离浓度的细胞培养物帅4 ”。而且篱体浓度越大，冷冻干燥乳酸菌的 存活率越高m i 。目前，国内外浓缩培养乳酸菌的方法有以下几种。 缓冲盐法 这是根据乳酸菌的代谢特点设计的，由于乳酸菌随着发酵进程的继续，分解代谢糖类产生的 乳酸等有机酸类含量逐渐增加，致使培养基的酸度升高，乳酸蔺的繁殖便被抑制甚至死亡，所以 普通发酵剂的最赢蒴数仅选1 0 7 - 1 0 8 c f u m r l , ，为了促进乳酸蓖的生长繁骧，可预先在发酵培养液 中加入对乳酸糖生长无影响或有促进作用的缓冲赫溶液；以调节和控制发酵液p h 值的相对稳定， 维持乳酸菌生长繁殪必需的条件，可使含蔷最达w s c f u n a , 左右。t i n e k e h 簿人( 1 9 9 0 ) 曾用2 0 2 9 的超滤浓缩奶和脱脂乳作为培养渡，利用离浓度的蛋白和磷酸盐达到缓冲效果1 ”, 6 0 6 5 “醴l 。美 国和意太利在此领域处于领先地位，但其缓冲盐配方受专利保护 4 ! 墨鎏堡璧垄壁生蜜童星壅墼鎏笪蕉壁型墼墅墨三苎壁壅 一一。 裹1 乳酸蘸增因子 里塑! ! ! ! 翌：! ! 型罂：璺壁哩2 11 型! 唑幽三一 坌壅墨整 堡皇墨垫墼 一些鉴一 酪蛋白水解物较强的促s t 、l b 及各种乳酸萤生长功能，悬目前已 经典培养基配方 知的最有效增楚因子 蛋白旗 蛋鼠晦非摹l 基质培莽基中提拱氮深、各类蛋囱胨中眺胰蚤扫 缝典培养基配方 胨效果最好 葡萄糖对l b 有一定促生长作用也可用于s t r p s i n h a 一1 9 8 2 蔗糖 健生长效果不织显 c l a u d i n e t1 9 8 8 糖类 巍糖 促s t 生长皴果明照特定的浓度水平能减少菌体 一1 9 9 0 ) m r s ( i d f 1 9 9 0 ) 乳糖 脂类及 相关物 质 氨基酸 及维生 素 麦芽耱 卵磷脂 s p a n 8 0 t w n 8 0 b 一磷酸二钠盐 丝氨酸 甲硫氨酸 维生素c 碳酸钙 碳酸锌 硫酸锰 磷酸蘸及拧檬馥盐 细胞脂肪酸含景增加冻干存活率挺高 丽上 具有一定的缓冲作用，对s i 有一定效果 s t 较好的促生长豹旗 间上 同上 罄种傈藏中应糟，维持蕾体活力 可能对菌体某一代谢过程有茧饔作用。 ；刁上 缓冲作用 ( e p o l 3 0 7 7 6 a 1 ，1 9 8 5 ) f p r i n c i p l e s ，1 9 9 0 ) m 1 7 ( 划宇峰等，1 9 9 5 1 m 1 7 潮土 ( 吕家乎。1 9 9 7 ) 同上 周上 化学中和法 悬习翦应用最广泛的方法之一，剥用全垂动发酵罐进彳亍发酵，通进对发酵波p h 僵豹袁接监 控。由控制器自动向培养液中滴加碱液，将发酵过程中产生的过量乳酸中和掉以此来维持发酵 液恒定的p h 值，从而促进乳酸菌的进一步生长繁殖。常用的中和剂有n a o h 、n h 3q - 1 2 0 、c a ( o h ) 2 、 n a 2 c 0 3 等“蝴”艇8 ”。g i l l i l a n d 等认为n 喝h 2 0 的效果最好，但是在中和培养黔：过程孛，乳酸 与滴加的碱澈可生成乳酸铵或乳酸钠等盐类物质当其浓度达到一定水平时，也会抑制乳酸菌的 繁殖研t 。因此中和法所能达到的菌体浓度一般为1 0 9 1 0 f u m l 。这领域法嗣一直处于领先地 位。 膜透析法 该法即选用半透膜制成一个发酵容器，以浓度差为推动力，使乳酸菌在生长繁虢的过程中产 生的乳酸等代谢产物透过。圆射向培养液中不断补充营葵物质，以馒巍酸蓝细胞连续大量增殖并 使其得以浓缩的一种方法”1 。河南职业技术师范学院的乔发东 9 2 1 和北京营养源研究所的陈婕5 9 】 笛入在这方面作了一些研究，所得培葬液的细胞浓度分剐为1 3 1 0 f w m l 和3 5 1 0 1 0 c f u m l 。 河北农业大学硕士学位论文 膜透析法是目前生产乳酸菌浓缩发酵剂最先进的方法。通过该方法制得的培养液中乳酸菌浓度超 过其饨一切方法，并且不需要离心过程，但设备投资大对超滤膜材料的要求比较严格，阐时在 培养过程中荔感染隧菌体，工业上应用并不十努广泛。 在乳酸麓发酵过程中，因为连续佬培养可能出现染葭、易产生突变榇，如可能丢失l a c 质粒 丽丧失产酸能力。另外在罄体壤养过程中降低培养基的氧化还原电势，逐入n 2 或c 0 2 可以减少 发酵罐顶层泡沫，有髓于菌体生长。 综合考虑试验条件、各种培养方法的优缺点、试验目的等因素，本试验优先考虑采用缓冲盐 法黠乳酸蓖进行浓缩培养。 ( 3 ) 培养条件 对乳酸菌的冷冻干燥试验表明】：培养温度比最适温度低l o ，可使乳酸蓥细臆海不饱和 脂肪酸和不溶性多糖宙羹增加提高菌体的冻于存浦率；培养过程中，采用c a ( o h ) 2 和n h 3 h 2 0 较使焉冀它碱类物质调节p l 壤，可获得更高的细臌冻干存活率；纲胞在对数生长末期或稳定生 长初期收获，可提离菌体静冻千存活率。上述研究结聚可望对浓缩型冻予发酵荆的制备提供指导。 1 3 2 菌体瓣富集滚缱分离 在发酵剂的制各中，普遍认为应该选择对数后期的菌体，因为在这个时期细胞生长代谢最旺 盛、活力最麓，相比其谊生长阶段的营体耐不篷环壤的能力也要强唧i 。常用的方法有两天类；一 类是离心法，即借助离心机的离心力作用健菌体沉积，以提高悬浮液的禽萄鲎；二是膜渗析法， 将菌体在生物反应器( 发酵罐) 内培舞，利用膜装置将菌体与培养泼分离，以浓缩藏体。膜渗静 法有对菌体影响小，获樗的菌体浓度高，培养液可蘸复利用等优点，但膜装置成本亮，滤膜的污 染、清洗、杀菌、老化等一系列问题使商业化生产受到一定稷度的限制。由于离心比膜潘析法操 作赫攘、设备清洗和消毒方便、不易浮染、处瑾囊大口5 “，遗台商业化生产儇在离心过穗中， 一方西，离心力机械作用以及瀑度和基屦p h 等因素的影响，会造成部分菌体死亡；另一穷霜 部分菌体必然残窘在上清液中而损失。如果离心工艺掌握不当，菌体死亡率和损失率随之增高。 会使活菌收褥率大大降低，鸯接导致发酵剂的活菌含囊下降。因丽今聪尚有待对离一t l , 力、离心 对闻、温度、基质p h 等因素对乳酸蒴的离心损失率和存活率的影响进行深入细致的研究以寻 求获得蕞蕙蜡蓥收褥率的最佳离心条件。 1 3 。3 千粉发酵剂的制备 ( 1 ) 保护剂及抗酶保护机理 冷冻干燥对菌体主聚形成以下几方面的危害：细胞内冰晶的形成，冰晶有机械刺伤作用和 溶成效果( s o l u t ee f f e c t s ) ；缁臌膜成分的丧失及貘的渗漏鞠穿孔：关键蛋臼豹变槛( 细魏 膜上及c y t o p l a s m i c 上) ；生物细胞貘叠状六棱彤( h e x2p h a s e ) 豹形成； 新睬代瓣过程中各 类荚键作用酶活性的改变t 9 2 - 9 4 】。目前关于保护剂的保护机理的几种假说主要建立在保护荆与细胞 貘宏观结构的作用蒺础上；增强磷月* 膜的稳定性：多羟基的糖类保护剂以氢键或其它方式与细 胞蘩上磷脂膜结合，增大头部空间，降低了磷脂的转变温度，也使磷脂膜之间不致产生折叠粘连 而至细腿援亡f “部, 9 7 邯l 。玻璃体学说：渗透性保护赉的搬入可限豢冰晶的形成孬形成玻璃体， 6 低温低酸发酵牛肉专用高效浓缩发酵；f l | 的制备工艺研究 减少了冰晶的机械破坏作用”j 。包埋作用；某些具包埋特性的材料t 可将菌体包壤掩蔽而减 少细胞内冰晶的形成。但可能影响菌体活性的发挥。保护剂的保护机理是一个涉及范围十分广阔 瓣领域，从国外低温生物学的研究发晨方向来着，多涉及动物胚黯、入体细胞和器宫及部分微生 物等领域对乳酸菌研究相对较少，且多是通过冻干存活率来估测保护剂的冷冻保护效果。 冻于保护剂悬案4 作干燥发酵荆最为关键的因素之一，它不仅影响发酵荆在冻干过程中的细胞 存活率也影响保藏期间的细胞稳定性娜邯”搀“， 保护荆与菌种存活率的荚系 由予在冷冻过程中，鲴蘸细胞的强亡主要憝出于冷冻损伤 i 起瓣。雕此加入保护裁燕 采用 缓慢冷冻更为有效的方法。保护剂明显提高蘸体存活率的原因是由于： i 保护剂中存在的氢键或离子基团具有与细胞蛋白质结合的能力，这种结合起到稳定细胞蛋 白结构的作用，从而保护萤体，避免损伤。不问保护赉j 结台能力不同，所形成的网络结构紧密程 度就不一样。 l | 保护裁豹持农瞧秘形成的霹络，使得干嫌过程中细胞的水分不至于急剧下降，箍健细胞蛋 白质结构遭到破坏，菌体受损。网络结构越紧密，干剂残存水分含最越高。 i 网络结构还使较多的蔺体被包裹其中，从而减少麓体与氧气接触的机会，得到较好的保护。 丽纤维结孝鸯袭垂积太，包裹的蓥相对较少大懿翡蔫体暴露于表面，受损严墼。 保护荆与干粉发酵剂迅速恢复活力的关系 千粉发酵翅复水詹。悬浮液中苞禽有死细胞、授伤缨胞和来攒伤细胞。也就是谎测定瓣存涟 率中包括了未损伤细胞和酃分损伤而未死亡的细胞。损伤细胞恢复活力要比来损伤细胞来得缓慢 而复杂。保护剂为活细胞恢复原有功能和活力提供了良好的环境，干剂加人到原料中使用时，包 裹在大鲎蘩体细胞外蔼的保护荆，起到一个渗透缓冲作用，可调苇液体进入冷冻干燥细飘的建度， 使得细胞有一个适宜的环境能够快速恢复活力i 1 0 2 1 。特别是对损伤细胞，怠好的恢复环境更为 重要，因为它首先嚣蔓修复自身损伤，然后才霹能尽快恢复活力。饿如没有保护荆，液体会快速 渗入细胞，造成受损细胞破裂，死亡和活细胞管时的渗透压休克，从而延缓活力的恢复。表2 是 目前国内外报道的一些乳酸菌冷冻保护荆。 裘2 匿惠锋报道乳酸藿冷冻保护懿 t a b l e 2c r y o p r o t e e t a n t sf o rl a c t l eb a c t e r i ai nn a t i o n a la n df o r e i g nr e p o r t s 分类多元酵糖类 蛋彝质及肽类氨基酸类及其它 名称 甘油 侧金盏花醇 蔗糖 乳糖 麦芽糖 葡萄糖 脱脂乳 血清蛋白 谷氪酸 胱氨酸 夭 冬氮羧 磷酸甘油 海藻糖旗氨酸 曹蒸醇蛋白胨 近年来，人们对海藻赭瓣生理功能和抗递缳护作用产生了浓掣豹装趣。海藻糖是虫延个葡萄 糖分子通过a a - i - i 键连接起来的非还原性双精，它广泛存在于低等植物、藻类、细菌、真菌、 7 滔北农业大学硕士学位论文 昆虫及无脊椎动物中，海藻糖的生要功能是一静典黧的应激代谢物，细胞内海藻糖含量与细臆对 逆境的耐受程度量平行的增减关系，其有稳定细胞膜和蛋白质结构抗逆保护作用“”1 嘟。目前， 海藻糖作为保护焖已在生物制品保藏、食品傈鲜：化装品生产中得到应用，在菌秭保藏方面也开 始受到重视。 值得注意的是，不同菌株问抗冷冻干