（农产品加工及贮藏工程专业论文）分枝杆菌BD6966固定化发酵产雄烯二酮的研究.pdf

分枝杆菌b d 6 9 6 - - 6 固定化发酵产雄烯二酮的研究 摘要 ，雄烯二酮( a d ) 是合成甾体激素类药物不可替代的中间体，随着薯芋皂素资 源日渐枯竭，利用微生物发酵生产a d 是目前研究的热点课题之一。菌株 m y c o b a c t e r i u ms p b d 6 9 6 6 ( 简称b d 6 9 6 6 ) 可转化植物甾醇为雄烯二酮，但其发 酵过程中存在菌体浓度低、发酵周期长、转化率低等缺点。许多研究表明，固 定化技术能有效保护细胞膜的完整性，促进目标产物的积累。本论文采用海藻 酸钠包埋法和硅藻土吸附法固定菌体细胞，探索固定化条件及发酵条件对分枝 杆菌b d 6 9 6 6 发酵产a d 的影响，主要研究结果如下。 在单因素试验基础上，正交实验优化得到菌株b d 6 9 6 6 的最适固定化条 件，海藻酸钠浓度3 9 1 0 0 m l 、c a c l 2 浓度1 9 1 0 0 m l 、菌体包埋量1 5 m l 5 0 m l 凝 胶，静置固化时间1 h ；该条件下进行菌株b d 6 9 6 6 固定化细胞与游离细胞对比 试验，发酵周期由1 6 8 h 缩短为1 4 4 h ，a d 转化率提高了1 7 9 3 。对固定化菌株 b d 6 9 6 - - 6 发酵条件进行的研究结果表明，将2 0 m l 凝胶菌体混合液装入5 0 m l 转 化培养基2 5 0 m l 摇瓶、发酵温度3 2 、初始p h 8 5 、摇床转速2 3 0 r r a i n 、甾醇添 加量5 9 l 时，a d 转化率最高达8 0 8 3 ，且固定化细胞具有较好的贮存稳定性和 可重复利用性。扫描电镜显示以海藻酸钠为包埋载体时，营养物质可自由传输。 以硅藻土作为菌株b d 6 9 6 6 吸附载体，经吸附固定后，通过正交试验获得 硅藻上吸附固定化细胞的条件为载体添加量7 9 l 、最佳接种量1 8 、甾醇添加 量3 9 l 、发酵时间1 6 8 h ，a d 转化率达到8 1 4 7 ，比游离细胞发酵a d 转化率提 高了1 9 8 2 。对硅藻土吸附固定细胞发酵条件的研究表明，较适的摇床转速2 0 0 r r a i n 、发酵温度3 2 、初始p h 8 7 、甘氨酸添加量4 9 l 发酵培养基，表面活性 剂吐温8 0 对发酵影响不大，金属离子f e 2 + 、z n 2 + 、m 9 2 + 对a d 转化率有明显的促 进作用，其中加入f e s 0 4 7 h 2 00 1 9 l ，a d 转化率最高，其值为8 5 6 4 。 5 l 发酵罐中进行放大试验的结果表明，以硅藻土为载体，加入甾醇5 9 l 时， a d 转化率达到9 5 2 1 。 关键词：细胞固定化海藻酸钠硅藻土发酵条件甾醇雄烯二酮 s t u d yo ni m m o b i l i z e dt e c h n o l o g yp r o d u c i n g a n d r o s t 一4 一e n e 一3 ，1 7 d i o n eb ym y c o b a c t e r i u m s p b d 6 9 6 - 6 a b s t r a c t a n d r o s t 4 一e n e - 3 ，17 一d i o n e ( a d ) i st h ek e yi n t e r m e d i a t e so fm a n ys y n t h e t i c a l s t e r o i dd r u g s w i t ht h ed e p l e t i o no fd i o s e o r e ar e s o u r c e s ，t h eb i o c o n v e r s i o no fa d i s b e c o m i n gt h eh o t s p o to ft h i sd o m a i n m y c o b a c t e r i u ms p b d 6 9 6 6c o u l d t r a n s f o r ms t e r 0 1t oa n d r o s t 一4 一e n e - 3 ，17 d i o n e ，b u ti nt h e p r o c e s so fm i c r o b i a l t r a n s f o r m a t i o nt h e r ea r ep r o b l e m st h a tt h eb i o m a s sc o n c e n t r a t i o ni st o ol o w ，t h a t t h ep e r i o do ff e r m e n t a t i o ni st o o1o n ga n dt h a tt h ec o n v e r s i o nr a t eo fa d i sl o w s t u d i e ss h o w e dt h a ti m m o b i l i z a t i o nc o u l dm a i n t a i nt h ei n t e g r i t yo ft h ec e l l m e m b r a n e ，a n dp r o m o t et h ea c c u m u l a t i o no ft a r g e tp r o d u c t s i nt h i sp a p e r ，t h e i m m o b i l i z a t i o no fm y c o b a c t e r i u ms p b d 6 9 6 - - 6w i t hs o d i u ma l g i n a t ea n dc e l i t e w a ss t u d i e da n di t sf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw a sa l s oo p t i m i z e d t h e ni tw a s c o n c l u d e da sf o l l o w i n g b a s i n go nt h es i n g l ef a c t o rt e s t ，t h ei m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o nf o r m y c o b a c t e r i u ms pb d 6 9 6 - 6w a so p t i m i z e db yo r t h o g o n a lt e s t s ，a n dt h er e s u l t s w e r ea sf o l l o w i n g ：s o d i u ma l g i n a t e3 9 1 0 0 m l ，c a l c i u mc h l o r i d e lg 】o o m l ，s u s p e n d e dm i c r o b i a lc e l l s 】5 m l 5 0 m l g e l t h ei m m o b i l i z a t i o nt i m elh c o m p a r e dw i t hf r e ec e l l s ，t h ef e r m e n t a t i o np e r i o do fi m m o b i l i z a t i o nc e l l sw a s s h o r t e d ，w h i c hc h a n g e dt o1 4 4h o u r sf r o m1 6 8h o u r s ，a n dt h ec o n v e r s i o nr a t eo f a d i n c r e a s e db yl7 9 3 t h es t u d yo nf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so f m y c o b a c t e r f u m s p 。b d 6 9 6 6s h o w e dt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r ea sf oll o w i n g ：c e l i c o n c e n t r a t i o n2 0 m ls o d i u ma l g i n a t e 5 0 m lm e d i u m 、t e m p e r a t u r e3 2 、p h 8 5 、 r o t a t i o ns p e e d2 3 0 r m i n 、t h es t e r o lc o n c e n t r a t i o n5 9 l ，a n dt h e h i g h e s tc o n v e r s i o n r a t eo f a dw a s8 0 8 3 t h es t o r es t a b i l i t ya n d r e p e a t e df e r m e n t a t i o nw e r ea l s o p r e s e n t e d s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p es h o w e dt h a tn u t r i e n t s u b s t r a n c ec o u l d s h u t t l ef r e e l yi nt h ei m m o b i l i z e dm a t e r i a lw i t hc a l c i u ma l g i n a t ea se m b e d d e d c a r r i e r w i t hc e l i t ea st h ea d s o r p t i v ec a r r i e r ，t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rs t r a i n b d 6 9 6 6b yo r t h o g o n a lt e s t sw e r ei n d i c t e da sf o l l o w i n g ：t h ec e l i t ec o n c e n t r a t i o n 7 9 l 、t h ei n o c u l a t i o nq u a n t i t y18 ( v v ) 、t h es t e r o lc o n c e n t r a t i o n3 9 l t h e c o n v e r s i o nr a t eo fa dr e a c h e dt o81 4 7 a f t e r16 8h o u r s w h i c hi s1 9 8 2 h i g h e r t h a nt h ef r e ec ell ss y s t e m t h eo p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw a s p r e s e n t e d ：r o t a t i o ns p e e d2 3 0 r r a i n 、t e m p e r a t u r e3 2 、p h 8 7 、t h eq u a n t i t yo f g l y c i n e4 9 l t h ea d d i t i o no ft w e e n 一8 0d i dn o ta c c e l e r a t et h ec o n v e r s i o nr a t e o b v i o u s l y a d d i t i o no fm e t a li o n ss u c ha sf e 2 + 、z n 2 + 、m 9 2 + c l e a r l yp r o m o t e dt h e f e r m e n t a t i o n ，t h eo p t i m a lc o n v e r s i o nr a t eo fa dr e a c h e dt o8 5 。6 4 ，w i t hf e 0 1 g l t h er e s u l to f5lb i o r e a e t o rf e r m e n t a t i o ns h o w e dt h a t ：t h ec o n v e r s i o nr a t eo f a dr e a c h e dt o9 5 21 w i t hc e l i t ea sc a r r i e ra n d5 9 ls t e r o la ss u b s t r a t e k e yw o r d s ：i m m o b i l i z e dc e l l s ；s o d i u ma l g i n a t e ；c e l i t e ；f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ； s t e r o l ；a n d r o s t 一4 一e n e 3 17 一d i o n e 插图清单 图1 1a d 与a d d 的结构式1 图1 2a d 合成甾体药物的途径一2 图1 3 甾体化合物的结构式3 图1 4 化学合成法制备a d 一4 图1 5 微生物转化法流程图5 图1 6 微生物降解甾醇生成a d 和a d d 的途径5 图2 1 凝胶颗粒制备示意图一1 4 图2 2 固定化细胞凝胶颗粒1 4 图2 3t l c 分析图15 图2 4a d 标品的液相色谱图16 图2 5a d 的标准曲线1 6 图2 6 海藻酸钠浓度对a d 转化率的影响1 9 图2 7c a c l 2 浓度对a d 转化率的影响一2 0 图2 8 固化时间对a d 转化率的影响2 0 图2 9 菌体包埋量对a d 转化率的影响2 l 图2 1 0 发酵液起始p h 对固定化细胞及等量游离细胞对a d 转化率的影响2 3 图2 11 温度对固定化细胞和等量游离细胞转化甾醇的影响2 4 图2 1 2 摇床转速对固定化细胞和等量游离细胞转化甾醇的影响一2 4 图2 13 装粒量对固定化细胞产a d 的影响2 5 图2 1 4 不同底物浓度对固定化细胞发酵产a d 转化率的影响2 5 图2 1 5 发酵时间对固定化细胞和等量游离细胞发酵产a d 转化率的影响2 6 图2 1 6 固定化细胞贮藏稳定性2 6 图2 1 7 固定化细胞重复使用次数2 7 图2 1 8 增殖1 4 4 h 后固定化细胞海藻酸钙凝胶珠表面和剖面扫描电镜图2 7 图3 1 吸附细胞b d 6 9 6 6 的硅藻土扫描电镜图3 2 图3 2 硅藻土用量对产物a d 转化率的影响3 3 图3 3 液体种子培养时间对固定化细胞和游离细胞发酵的影响3 3 图3 4 接种量对产物转化率的影响3 4 图3 5 甾醇浓度对产物a d 转化率的影响3 4 图3 6 发酵时间对产物a d 的影响一3 5 图3 7 硅藻土固定化细胞的重复利用次数3 7 图4 1 发酵液起始p h 对固定化细胞及等量游离细胞对a d 转化率的影响”4 2 图4 2 温度对固定化细胞和等量游离细胞转化甾醇的影响一4 3 图4 3 摇床转速对固定化细胞和等量游离细胞转化甾醇的影响一4 4 图4 4 金属离子浓度对固定化细胞发酵的影响”4 4 i v 图4 5 种子培养基中未添加甘氨酸“4 5 图4 6 种子培养基中添加3 9 l 甘氨酸“4 5 图4 7 种子培养基中添加4 9 l 甘氨酸。”4 5 图4 。8 种子培养基中添加5 9 l 甘氨酸“4 5 图4 9 甘氨酸浓度对固定化细胞发酵的影响。4 6 图4 105 l 发酵罐中固定化发酵时间对a d 浓度的影响。4 7 图4 115 l 发酵罐中固定化发酵时间对a d 转化率的影响4 7 v 表格清单 表1 1 能转化甾醇及其衍生物为a d ( d ) 的部分菌株7 表2 1 菌株海藻酸钠固定化条件筛选正交试验因素水平表2 2 表2 2 菌株固定化条件筛选正交试验方案及结果分析2 2 表2 3 正交试验方差分析表“2 3 表3 1 不同载体固定化发酵对a d 转化率的影响3 2 表3 2 硅藻土吸附固定化细胞正交试验因素水平表3 5 表3 - 3 硅藻土吸附固定化细胞正交试验设计及结果分析3 6 表3 - 4 比较实验结果3 6 表3 - 5 海藻酸钙包埋法与硅藻土吸附法的比较3 7 v i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据 我所知，除了文中特别加以标志和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果，也不包含为获得金月鸯至些态堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签字：妈矾桦签字日期：口7 年耳月拍 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盒旦巴工些态堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅或借阅。本人授权金 妲些太堂可以将学位论文的全部或部分论文内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文者签名： 埸醐桦 导师签名： 签字日期： ) ? 年4 月fg 日签字日期：o i 年4 月饽日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 致谢 逝者如斯，不舍昼夜，两年半的岁月稍纵即逝。研究生的生活，不仅让我 的专业知识大大提高，同时更是磨练了我的意志，让我蜕变成一个睿智、沉稳 的青年。两年半的时间，我感受着自己的成长，经历着学校的发展。感谢命运 的安排，让我有幸结识了许多良师益友，是他们教我如何品味人生，让我懂得 如何更好的生活! 人生处处是驿站，已是挥手作别之时，在此，向所有帮助过 我的人献上我最诚挚的谢意! “饮其流时思其源，成吾学时念吾师”。至此论文完成之际，谨向我的导师 潘丽军教授致以诚挚的谢意和崇高的敬意。非常幸运能够成为您的学生，在这 短短的时间里，我不仅体会到知识与研究的魅力，也学会了许多做人的道理。 感谢您从本研究开始一路指导至论文的完成。 同样深深感谢两年半来传授我知识的姜绍通教授、郑志副教授、罗水忠老 师、杨英老师、李兴江老师、陈晓燕老师、韩卓老师给了我许多指导和帮助， 正是你们帮助我完成了人生中最重大的一次蜕变。 此外，研究生期间与我朝 夕相处的同学是我最值得珍惜的宝贵财富，谢谢罗炳华、张丽、桂蕾、蔡静、 刘靖、胡燕红、罗蕾蕾、聂慎德同学对我实验的支持和帮助。 最后，感谢我的爸爸、妈妈，以及我的丈夫，正是因为有你们的鼓励和支 持，才有了今天的我。在我成功的时候，你们的笑容散发着幸福、满足和荣耀 的光芒，照亮了我的前程；在我失败的时候，你们的眼神透露出理解、包容和 鼓励的信息，鼓足了我的勇气! 作者：冯丽桦 2 0 0 9 年4 月1 日 第一章引言 雄烯二酮( 雄甾4 烯3 ，17 二酮，a n d r o s t 一4 e n e 3 ，17 - d i o n e ，简称a d ) 是合 成甾体激素类药物不可替代的中间体，可以说几乎所有甾体激素药物都是以 a d 作为起始原料进行生产的。a d 既可以用化学方法从野生中药材“穿地龙” 中植物提取合成，也可以用微生物发酵的方法降解自然界丰富的动植物甾醇中 获得。近年来随着薯芋皂素资源日渐枯竭，价格日益昂贵，微生物发酵技术生 产a d 乃甾体药物发展的一大趋势。这种方法摆脱了“穿地龙 、黄姜等原料供 应受季节、地域等自然因素的影响而对生产造成的制约，不仅可及时满足国内 外市场对a d 日益扩大的需求，而且对保护自然资源和生态资源、维护人类健 康起了重大作用【l 】。 1 1 雄烯二酮的性质、应用及生产方法 1 1 1 雄烯二酮的结构与性质 雄烯二酮结构式见图1 1 ，分子式：c 1 9 h 2 6 0 2 ，分子量：2 8 6 4 5 ，熔点：17 3 17 4 ，外观呈白色晶体粉末状，无异味，无毒性，可燃，溶于乙醇、醋酸、乙醚 等有机溶剂，不溶于水。a d 的结构类似物雄二烯二酮( 雄甾1 ，4 二烯一3 ，1 7 二酮， a n d r o s t a d i e n e d i o n e ，简称a d d ，分子式：c 1 9 h 2 4 0 2 ) ，结构式见图1 1 。 oo o o 图1 1a d 及a d d 的结构式 f i g 1 1t h es t r u c t u r eo f a da n da d d 1 1 2 雄烯二酮的应用 a d 主要用来生产雄性激素、蛋白同化激素、螺内脂等药物，是许多甾体 药物合成不可替代的关键中间体，对机体起着非常重要的调节作用【2 】。a d d 是合成1 9 一去甲甾体系列雌激素，如雌酮( e s t r o n e ) 、炔诺酮( n o r e t h i s t e r o n e ) 和黄 体酮( p r o g e s t i n ) 的重要前体物。通过a d 与a d d 几乎可以合成所有的甾体类药 物引，以雄烯二酮作为起始原料进行生产甾体药物的简要途径见图1 2 。 雄烯二酮 呵 h 3 c 雄二烯二酮 蛋白同化激素 其他高档 皮质激素 v 卵泡 酮 爆内酯 蛋白同化激素 甲基睾酮甲基雄甾烷醇酮 。h 。 图1 2 雄烯二酮合成甾体药物的途径 f i g 1 2t h ea p p r o a c ho fs t e r o lm e d i c a m e n tu s i n ga d 1 1 2 1 甾体化合物的简介 四十年代末期，人工合成可的松( c o r t i s o n e ) 后，发现其对风湿性疾病有 良好的疗效，因而甾体激素药物受到科学家的极大重视【4 】，并在临床上的应用 目益广泛。世界范围内甾体激素药物产量仅次于抗生素，为第二大类药物，产 值每年以15 的速度递增，2 0 0 0 年销售额突破2 0 0 亿美元。其结构极其复杂【j j ， 它由甾体母核和侧链( s i d e c h a i n ，s c ) 组成，其化学结构( 图1 3 ) 由a 、b 、c 、d 四个环稠合而成，a 、b 、c 环为六元环，d 环为五元环。通常a b 环稠合处和 c d 环稠合处各有一个角甲基，许多甾体化合物在d 环1 7 位有侧链f5 j 。这种甾体 2 。，久fh。3垂c：芗。，弋2h337芝6,ch 5 ，尹3 2 “一 引 1 1 1 2 弋之3 一弋 2 ，博占婚1 6h 名 3 o _ 一 0 雄- 1 ，4 - 二烯- 3 ，1 7 - - - - m j雄4 烯3 ，1 7 - - - - t l 和 l 乡 、l 黄体激瓤耻腺皮质黼 雌激素类口服避孕药t ， 雄性激素促蛋 螺肖内酯一 自合成激素一 图1 - 4 化学合成法制备雄烯二酮 f i g 1 - 4t h ea p p r o a c ho fs y n t h e s i so fa di nc h e m i c a lw a y a d 和a d d 的传统生产方法的局限性在于：( 1 ) 化学工艺过程复杂，步骤 繁琐；( 2 ) 成本高、消耗大( 穿地龙1 7 0 公斤一皂素1 4 公斤一双烯一醋酸地氢表 雄酮一表雄酮一a d ( d ) l 公斤，总成本不低于￥10 0 0 元公斤) ；( 3 ) 破坏环境。 目前穿地龙资源十分紧张，人们无秩序、不科学采挖，不但破坏了地表植被， 还破坏了生态环境。由于人工种植黄姜种植周期长、大量占用耕地，且严重破 坏地力，大量浪费了有限的土地资源。此外，提取皂素过程也严重污染环境j 。 鉴于以上问题，人们积极寻找新的天然甾体药源，如胆酸、海柯皂苷元和 惕告皂苷元等。甾醇也是一大类具有甾核的天然产物，在动植物和海洋生物 中含量丰富，可以开发为制造雄烯二酮的原料，如大豆甾醇和麦角甾醇，因其 侧链中具有一个c 2 2 ( 2 3 ) - 双键，易于用化学方法进行侧链结构改造，已被用作甾 体药物的原料【l2 1 。但是通过化学合成法合成雄烯二酮，需要经过复杂的反应过 程，副产物多，产率偏低，给后续的提取工艺增加了难度，间接的增加了生产 成本。 1 1 3 2 微生物转化法 微生物转化是指利用微生物细胞对有机化合物某一特定部位( 基团) 的作 用，使它转变为结构上相类似的另一种化合物。转化的最终产物不是由营养物 质经微生物细胞的一系列代谢过程后产生的，而是利用微生物细胞的酶系对底 物的某一特定部位进行催化反应形成的1 3 】。 4 微生物转化法的过程如图1 5 所示： 进入分秘 i 底物一f 嚼l菌体细胞一fc = = i 反应产物( 胞内或胞外) j l o 。_ _ _ _ 。一l - _ - - _ _ _ _ _ _ 。- _ _ _ _ - - - _ j _ _ _ _ _ - _ - - 。- 。_ _ _ _ _ - 。_ l - 。_ - 。_ _ 图1 5 微生物转化法流程图 f i g 1 - 5t h ef l o wo fm i c r o b i a lt r a n s f o r m a t i o n 最早发现微生物能转化甾体的是b o n d z y n s k i 和h u m n i c “1 3 】。他们发现在肠 内胆固醇的双键可被氧化。1 9 0 8 年b o n d i 研究了胆酸的代谢以及各种分枝杆菌 分解氧化甾醇类化合物。19 13 年s o h n g e n 也发现很多微生物，例如诺卡氏菌、假 单孢菌、分枝杆菌、棒状杆菌、节杆菌等能以甾醇作为唯一碳源而生长。随后 t u r f i t t 发现微生物能降解胆固醇及0 谷甾醇得到c 1 9 甾体激素。2 0 世纪6 0 年代 中期，s i h 等f m 】首先发现有些微生物可以切除甾醇的饱和侧链而得到雄烯二酮 和雄二烯二酮( 图1 6 ) 。 s o v b e a u s n m o l 微生物一 0o 4 a da d d c h 3 c 卜b i - s i t o s t e r o l $ f i g m o s d e t o lc p m o e s d a r o l 图i 一6 微生物降解甾醇生成雄烯二酮和雄二烯二酮的途径 f i g 1 - 6t h ea p p r o a c ho fp r o d u c t i o no f4 a da n da d du s i n gm i c r o b i a lt r a n s f o r m a t i o n 自从微生物转化应用于生产后，一般采用以化学法和微生物转化法相结合 的办法来生产甾体药物，它具有如下的优点 7 1 ： ( 1 ) 减少合成步骤，缩短生产周期。如原来从孕酮合成可的松需3 0 多步反应， 而用微生物法转化只要3 步就可完成。 ( 2 ) 提高收率，减少副反应。如用微生物法一步可将l9 羟基雄甾4 烯一3 ，17 二酮转化成雌酚酮，得率达8 0 以上，而化学方法需三步才能完成，得率15 - 2 0 。 ( 3 ) 相对比较复杂和难以进行的有机化学反应，采用微生物转化法往往可以 非常专一，非常迅速地完成。 ( 4 ) 微生物转化的优点是反应具有立体选择性和区域选择性。如羟化反应可 以专地在1i 位羟化，a 位或b 位的转化都可以选择合适微生物实现。 ( 5 ) 避免或减少使用强酸、强碱和一些有毒原料，改善操作条件。 5 1 2 微生物发酵生产雄烯二酮的研究进展 微生物降解甾醇侧链的工作始于2 0 世纪6 0 年代，已发现有许多微生物能 降解甾醇。7 0 年代初期，日本的马君应用微生物降解胆甾醇生产a d d 获得成 功【”。6 1 。此后以自然界的动植物甾醇为原料生产甾体药物的研究工作发展迅 速，其中多数以雄烯二酮为甾体药物合成的中间体，微生物降解甾醇生成c 1 7 酮甾体技术得到充分发展并在工业上得到了广泛的应用。现在正开始着手在基 因工程等方面改良a d 生产菌。 1 2 1 微生物生产雄烯二酮的常用菌种 至目前为止，通过研究发现的能利用动植物甾醇及其衍生物转化得到 a d ( d ) 的菌株如下。 1 2 1 1 分枝杆菌属f m y c o b a c t e r i u m ) 能转化产生a d ( d ) 的分枝杆菌属菌种包括：草分枝杆菌( m y c o b a c t e r i u m p h e i ) 、母牛分枝杆菌( m y c o b a c t e r i u mv a c c a e ) 、迪氏分枝杆菌( m y c o b a c t e r i u m d i e r n o f t i u m ) 、耻垢分枝杆菌( m y c o b a c t e r i u ms m e g m a t i s ) 、偶发分枝杆菌 ( m y c o b a c t e r i u mf o r t u i t u m ) 等。其底物可以是动植物甾醇如：胆固醇 ( c h o l e s t e r 0 1 ) 1 17 1 、谷甾醇( s i t o s t e r 0 1 ) 【18 1 、菜油甾醇( c a m p e s t e r 0 1 ) 1 9 】等，也可以 是动植物甾醇的修饰物或衍生物，如：3 o x o 2 4 一m e t h y l c h o l e s t 一4 e n e o i ca c i d ， c h o l e s t 5 e n 3 1 3 o l 2 0 1 ，3 3 h y d r o x y - 2 4 一e t h y l c h o l e s t 5 e n e 21 】等。 分枝杆菌属的细菌均是通过类似于b 一氧化的边链切除过程，将不同底物的 c 1 7 位边链切除，产生a d ( d ) 。 1 2 1 2 曲霉属口s p e r g i l l u s ) a s p e r g i l l ua u r e o g u l g e 能将2 0 b h y d r o x y p r e g n 一4 一e 1 1 3 一o n e 、 1 7 b a c e t o x y a n d r o s t 、p r e g n a - 4 ，1 6 一d i o n e 一3 ，2 0 一d i o n e 、 3 b h y d r o x y p r e g n 5 e i l 2 0 一o n e 2 2 1 转化为a d ( d ) 。 1 2 1 3 假诺卡氏菌属( p s e u d o n o c a r d i a ) p s e u d o n o c a r d im e t h a n o l i g n i c al m - 1 4 5f e r m - p 6 0 5 7 和p s e u d o n o c a r d i m e t h a n o l i g n i c a 能将胆甾醇f 2 引转化为a d ( d ) 。 1 2 1 4 其它菌株 其它一些能转化甾醇及其衍生物为a d ( d ) 的菌株归纳如下表所示。 6 表1 1 能转化甾醇及其衍生物为a d ( d ) 的部分菌株f 2 4 _ 3 2 】 t a b l e1 1s o m es t r a i n sw h i c hc a nt r a n s f o r m a t es t e r o i d sa n dt h e i rd e r i r i r e st oa d ( d ) 菌株底物 p s e u d o m o n a sn c i b 、0 5 9 0c h o l e s t e r o l 3a ，6 b d i h y d r o x y - 5 b c h o l a n o i ca c i d a r t h o b a c t e rs i m p l e xc h o l e s t e r o l a r t h o b a c t e ro x y d a n ss i t o s t e r o l 3 1 3 一a c e t o x y 一5 a p r e g n 一16 一e n e 一2 0 一o n e t h e r m o p h i l i cm o l d s c h o l e s t 5 e n 3 b o l b a c i l l u s 蔓p 17 b h y d r o x y a n d r o s t 一4 一e n o n e a c r e m o n i u ma l a b a m e n s i sc h o l e s t 5e 1 13 b 0 l a c r e m o n i u mr o s e u m p r e g n 4 e n e 3 2 0 d i o n e f u s a r i u ms o l a n ic h o l e s t 5 e n 3 b o l 36 h v d r o x v a n d r o s t 5 一e 1 1 17 o n e 虽然能转化a d ( d ) 的菌种很多，但目前工业上应用最广的为m y c o b a c t e r i u m 属的菌株。 1 2 2 分枝杆菌发酵产雄烯二酮的研究现状 美国普强公司f 3 3 是最早采用化学合成与微生物转化相结合的方法生产糖 皮质激素的，随后s y n t e x ，s e a r l e ，s q u i b b ， m e r c k ，p f i z e r 和s c h e r i n g 等【3 4 弓5 j 公司也相继采用了该技术，进行产业化生产。我国从l9 5 8 年开始，黄鸣龙等以 薯蓣皂素开环所得双烯醇酮为原料，经环氧化生成中间体c 1 6 ，1 7 环氧化合物， 用黑根霉氧化在c 1 1 仅位上引入羟基，再经溴化氢开环脱氢，c 2 1 碘置换等七 步反应制得醋酸可的松，并由上海通用药厂生产。接着研制生产氢化可的松p 圳、 乙酸强的松、强的松龙、地塞米松和倍他米松等甾体皮质激素。目前，国内外 关于分枝杆菌发酵产a d 的研究主要集中在以下几个方面。 1 2 2 1 菌种选育 菌种的优良直接关系到发酵过程的控制及其产量等，是发酵过程中的一个 至关重要的影响因素。目前以分枝杆菌为亲本的优良选育有： 国外方面，7 0 年代，m a r s c h e c k 3 7 】等用诱变的方法筛选到分枝杆菌 m y c o b a c t e r i u mn r r lb 一3 6 8 3 ，无需加入抑制剂便能有效降解胆固醇、胆甾酮、 植物甾醇等的侧链产生a d d ，该菌的进一步诱变得到了丧失c 1 ，2 脱氢酶活力 m y e o b a c t e r i u mn r r lb 3 8 0 5 的突变株，该菌能有效产生a d 。近些年来，随着 基因工程技术的进展，有研究者从基因方面考虑寻找非致病微生物菌落，经过 诱变等方式处理获得突变菌株，提高产物产量【3 8 ，39 1 。r a n j i t 等就构建了一株含 7 有质粒p j l l 的节杆菌，能对甾醇侧链进行选择性降解生成a d 而不降解甾核。 国内对a d ( d ) 生物转化的研究起于2 0 世纪9 0 年代初期，9 0 年代中期停滞 了一段时间，近些年又有所复兴。其中，中科院上海有机化学研究所王敬一1 4 0 l 等选用了一株牝牛分枝杆菌，生物中心的陈知本【4 i 】等选用了一株分枝杆菌，上 海医科大学的王黎明等【4 2 】选用了株诺卡菌，上海医科大学的史济平等1 4 3 选用 了一株珊瑚红球菌分别进行了研究。这些菌种的转化能力都不是很高，一般底 物投料量在0 1 0 2 5 时，a d ( d ) 收率只有3 0 左右。只有陈知本等研究的 分枝杆菌在适当的发酵条件下，得到了8 9 的最高产率f 4 。在菌种的诱变选育 方面：中国药科大学的李莹【4 4 】等采用紫外光、y a g 倍频脉冲激光及两者复合 诱变方法进行诱变育种，得到一株高产优质分枝杆菌突变株，使产a d 能力提 高了116 ，且不再产生结构类似物a d d 。哈尔滨理工大学的吴宝华等”5 j 采用 紫外线照射、n t g 、5 - b u 等化学诱变剂及复合诱变方法，筛选出了一株转化大 豆甾醇达9 5 ，a d ( d ) 产率达4 5 的高产节杆菌菌株。 1 2 2 2 添加抑制剂、培养基优化 在抑制剂的选择方面，主要研究了n i 2 十，c 0 2 + ，m n 2 + ，a ，a 一联毗啶、邻菲 罗啉等酶抑制剂对a d d 积累的影响，证明添加适当的抑制剂可抑制9 a 。羟化酶 活性，防止甾核降解，有利于a d d 的积累。但是抑制剂对甾醇降解酶也有轻 微抑制作用，因此添加时间非常关键。时间提前，抑制甾醇降解酶活性使甾醇 转化率降低，a d d 产率随之下降；时间延长，部分a d d 会被进一步降解，无 法大量积累h6 l 。由于这些抑制剂一般会对菌体生长产生毒性或抑制作用，所以 往往在菌体生长好后加入，并且要控制好最佳浓度。浓度太低，不能完全抑制 9 a 一羟化酶活性；浓度太高，不仅会对菌体产生毒性，使活细胞数量下降，而且 会抑制c 2 6 羟化酶，阻碍甾体边链的降解】。 培养基优化方面也有一些新成果涌现。哈尔滨理工大学的车成彬等”掺j 发现 葡萄糖为碳源不如玉米浆为碳源产率高，并且磷酸盐充足能提高产率。这可能 是因为一方面磷酸盐的缓冲能力使菌体处在一个较为适宜的p h 环境中，另一方 面磷酸盐对于侧链降解酶的作用有利【4 引。复旦大学的叶丽等po j 发现葡萄糖浓度 太高对发酵反应有抑制作用，可能是因为葡萄糖通过糖酵解及己糖单磷酸途径 产生还原剂n a d p h ，因此提高葡萄糖添加量后细胞中n a d p h 过多，增强了还 原反应，反而阻碍了氧化反应，使甾体1 ，2 一脱氢酶活力降低，a d d 产量随之下 降”。实验还研究了h c 0 3 对a d d 的生成影响，证明适量的h c 0 3 。，并延长发 酵时间确实有利于a d d 的产生。这与文献( 52 报道某些微生物在降解c 2 4 有分枝 的甾醇侧链时，h c 0 3 - 会直接参与反应相吻合。总体来说，经过培养基优化， 在投料浓度在0 2 - - - , o 3 时，一般转化率能提高到5 0 。但随着底物投料浓度 上升，转化率呈下降趋势。 8 1 2 2 3 发酵系统的研究 微生物转化法生产a d ( d ) 经过了两个较大的发展阶段，即传统单一水相系 统微生物转化和包括两相系统、双水相系统、浊点系统在内的新型发酵系统微 生物转化。 两液相培养系统是指将细胞培养与萃取分离耦合的由水相和有机溶剂相组 成的培养系统。l a n n ec 等【5 3 】考察了10 7 种有机溶剂的介电常数、偶极矩、氢键、 极化强度和l o g p 值( p 为有机溶剂在辛醇和水两相体系中的分配系数) 等参数，认 为只有l o g p 值能很好预测生物相容性。也有其他很多学者认为有机溶剂的l o g p 值能很好地表征有机溶剂对细胞毒性的影响【54 1 。然而，近年来a c r u z 等利用四 种l o gp 值的邻苯二甲酸盐作为有机溶剂，以磷酸缓冲液及营养物质作为水相。 结果证明，在所用有机溶剂范围内，生物转化产量与溶剂l o gp 值无关p 引。a c r u z 等还试验了l o g p 值在3 10 2 _ 间的15 种羧基酸酯对a d ( d ) 产量的影响，也表明实 验所用溶剂对细胞的毒性与l o g p 值无关，与溶剂在细胞内的积累能力有关【5 州。 中国药科大学的郝雪秦等利用植物甾醇为底物，探索适合菌株 m y c o b a c t e r i u