（农产品加工及贮藏工程专业论文）大孔吸附树脂分离何首乌中二苯乙烯苷的工艺研究.pdf

大孔吸附树脂分离何首乌中二苯乙烯苷的工艺研究摘要何首乌系蓼科植物何首乌的干燥块根。药理学研究表明，何首乌中的二苯乙烯苷成分具有显著的抗衰老、降血脂、保肝护肝、抗肿瘤、改善记忆的作用。本研究以工业化应用为目标，将易于实现规模化生产的大孔树脂法引入二苯乙烯苷的分离研究。通过6 种大孔吸附树脂的非流动态实验，考察各工艺条件对分离二苯乙烯苷效果的影响：并通过流动态实验，优选出较佳的分离二苯乙烯苷的工艺条件。非流动态实验结果表明：适于分离二苯乙烯苷的树脂为n k a - 9 树脂，其非流动态饱和吸附量为2 9 0 7m g g ；非流动态实验较佳分离条件是：振荡吸附状态，进样液p h 值为4 ，洗脱剂为8 0 的乙醇溶液，吸附温度为2 0 ，此时，n k a - 9 树脂对二苯乙烯苷的吸附率为4 9 4 ，解吸率为9 1 9 。流动态实验结果表明分离二苯乙烯苷较佳的分离条件是：洗脱剂为8 0 的乙醇溶液，进样液p h 值为4 ，洗脱剂的流速为1 0m l m i n ，此时，二苯乙烯苷的纯度为4 5 8 ，回收率为8 0 2 。关键词：何首乌二苯乙烯苷大孔吸附树脂分离s t u d yo nt h es e p a r a t i n gt e c h n o l o g yo fs t i l b e n eg l u c o s i d eb ym a c r o p o r o u sa b s o r b i n gr e s i ni np o l y g o n u mm u l t i f l o r u mt h u n ba b s t r a c t st h ed i e dr h i z o m eo fp o l y g o n u mm u l t i f l o r u mt h u n b ( p m t ) w a ss e l e c t e da st h em a t e r i a li nt h i sp a p e r p h a r m a c o l o g i c a li n v e s t i g a t i o n si n d i c a t e dt h a t2 , 3 ，5 ，4 - t e t r a h y d r o x y s t i l b e n e - 2 一o - b d - g l u c o s i d e ( t h s g ) ，at y p i c a lf u n c t i o n a lc o m p o n e n tf o u n di np m t , c o n t r i b u t e dm a r k e d l yt or e s i s t i n gc a d u c i t y ，r e d u c i n gs e r u ml i p i d s ，p r o t e c t i n gl i v e r , r e s i s t i n gt u l n o u ra n dm e l i o r a t i n gm e m o r y i nt h i sp a p e r , m a c r o p o r o u sr e s i nw h i c hi se a s yt oa c h i e v eal a r g e s c a l ep r o d u c t i o nw a sa p p l i e di nt h s g ss e p a r a t i o n , a i m e dt oab e r e ra p p l i c a t i o ni ni n d u s t r y t h ee f f e c to fe a c hf a c t o ro nt h s gs e p a r a t i o nw a sr e v i e w e db ys t a t i cs t a t et e s to fs i xk i n do fm a c r o p o r o u sa b s o r b i n gr e s i na n dt h eb e s tc o n d i t i o no fs e p a r a t i n gt h s gw a ss e l e c t e db yd y n a m i cs t a t ee x p e r i m e n t s t a t i cs t a t et e s ts h o w e dt h a tt h en k a 一9r e s i ni sa p p r o p r i a t et os e p a r a t et h s ga n di t sa b s o r b i n gv o l u r n ni s2 9 0 7m g gi ns t a t i cs a t u r a t i o ns t a t e i ns t a t i cs t a t ee x p e r i m e n tt h eb e s te x t r a c t i n gt e c h n o l o g yo ft h s gw a sa sf o l l o w e d ：v i b r a t i o n a la b s o r b i n gs t a t e ；p h4o fs a m p l e ：8 0 a l c o h o ls o l u t i o no fs e p a r a t i o ns o l v e n t ；2 0 o fa b s o r b i n gt e m p e r a t u r e i nt h i sc o n d i t i o n n k a - 9 sa b o r b i n gr a t i oi s4 9 4 a n dt h er a t i oo fd e s o r p t i o ni s9 1 9 t ot h s g ,s u g g e s t e df r o md y n a m i cs t a t ee x p e r i m e n t ，t h eb e s te x t r a c t i n gt e c h n o l o g yo ft h s gw a sa sf o l l o w s ：8 0 a l c o h o ls o l u t i o no fs e p a r a t i o ns o l v e n t ；p h4o fs a m p l e ；1 0m l m i no fs e p a r a t i o ns o l v e n t sv e l o c i t yo ff l o w i nt h i sc o n d i t i o n ，t h ep u r e n e s so ft h s gi s4 5 8a n dt h er e c l a i m i n gr a t i oi s8 0 2 k e yw o r d s ：p o l y g o n u mm u l t i f l o m mt h u n b ，2 , 3 ，5 ，4 - t e t r a h y d r o x y s t i l b e n e 2ob d 烈u c o s i d e ，m a c r o p o r o u sa b s o r b i n gr e s i n s e p a r a t i o nf i插图清单图1 1何首乌的干燥根茎、植株的外观图1图2 - 1大孔树脂吸附作用示意图9图2 22 ，3 ，5 ，4 - 四羟基二苯乙烯2 o b d 葡萄糖苷化学结构式1 0图3 1非流动态实验工艺流程1 6图3 - 2白藜芦醇苷标准曲线1 7图3 ，3 筛选实验中树脂吸附量2 3图3 4 筛选实验中树脂解吸率2 4图3 5 对比实验中乙醇浓度对t h s g 解吸率的影响。2 5图3 - 6 对比实验中p h 值对t h s g 解吸率的影响2 6图3 7 对比实验中温度对t h s g 吸附率的影响2 7图3 8 非流动态吸附趋势2 9图3 - 9 非流动态解吸趋势3 0图4 1流动态实验工艺流程3 2图4 2 流动态流失趋势研究3 6图4 3 流动态解吸趋势研究3 7图4 - 4乙醇浓度对t h s g 分离纯度和回收率的影响3 8图4 5 洗脱流速对t h s g 分离纯度和回收率的影响3 9图4 - 6 进样液p h 值对t h s g 分离纯度和回收率的影响4 0致谢本文是在我的导师陈从贵教授的悉心指导下完成的，从课题的选定、实验方案的制定、到论文的定稿，无不倾注着陈老师的心血。陈老师广博的专业知识已令我收获良多，而陈老师严谨的治学态度和高尚的品格则更令我终生受益。人生不如意十之八九，每每遇失意或挫折，陈老师都会给我以鼓励与支持，在此，我向敬爱的陈老师表示最高的敬意和感谢!在近三年的学习生活中，周先汉老师，王武老师，方红美老师也给予了我很多的关怀和指导，还包括何竞曼、侯双菊、李慧星、干梅、张慧曼、郭洪娜、聂兴龙、韩志萍、蒲传奋等同学以及学院其他老师在实验实施过程中也给予了大力支持，借此机会向他们表示忠心的感谢!最后，我更要感谢我的家人，是他们一直的支持我最终完成学业。i i l作者：鲁坚2 0 0 6 年月第一章绪论1 1 何首乌二苯乙烯苷及其生理活性1 1 1 何首乌及其化学成分何首乌为蓼科蓼属植物何首乌的干燥块根，是经典的补药，始载于神农本草经，列为上品。药用何首乌有生首乌和制首乌之分【1 1 ，二者功效有差异：生首乌味苦、涩、性平，具有润肠、解毒和截疟之功，用于瘰疬疮痈，风疹瘙痒，肠燥便秘，高血脂等。制首鸟昧苦、涩、性温，具有补肝肾、益精血、壮筋骨、乌须发之效，用于肝肾精血亏虚、头昏目眩、须发早白、腰膝酸软及遗精等。何首乌干燥根茎及植株外观图见图1 - 1 。图1 1 何首乌的干燥根茎、植株的外观图f i 9 1 - 1a p p e a r a n c eo f t h ed i e dr h i z o m ea n dt h et r u n ko f p o l y g o n u mm u l t i f l o r u mt h u n b何首乌的化学成分主要包括1 2 j ：1 二苯乙烯类( s t i l b e n e s ) ，包括2 ，3 ，5 4 四羟基二苯乙烯- 2 o p d 葡萄糖苷( 2 ，3 ，5 ，4 - t e t r a h y d r o x y s t i l b e n e 2 o b d g l u c o s i d e ，简称二苯乙烯苷) 、3 ，5 ，4 一三羟基二苯乙烯( r e s v e r a t r o l ，白藜芦醇) 、3 。5 4 - 三羟基二苯乙烯3 od 葡萄糖昔( p i c e i d ，白藜芦醇苷) 等。二苯乙烯苷( t h s g ) 是何首乌的主要药效成分，中国药典将其作为首乌的质控标准，规定药用首乌中二苯乙烯苷含量不低于1 t 3 1 。2 葸醌类( a n t h r a q u i n o n e s ) ，如大黄素、大黄酚、大黄酸、大黄素甲醚、大黄素甲醚- 8 o1 3d 吡喃葡萄糖苷等，葸醌类总含量为o 3 o 8 。3 磷脂类，何首乌中含有较丰富的磷脂成分，如卵磷脂、肌醇磷脂、乙醇胺磷脂、磷脂酸、心磷脂等，可能与首乌的补益作用有关。4 其它，何首乌中还含有五味子素、胡萝h 苷、没食子酸、儿茶素、b 谷甾酵、苜蓿素等；微量元素含量较多，如钙、铁、锌、锰、锶等，有报道认为，其中铁的含量( 2 4 0 8 8 0p g g 首乌) 超过当归、阿胶、枸杞等补血药；首乌中还含有游离的必需氨基酸类化合物。1 1 2 何首乌二苯乙烯苷的生理活性1 1 2 1 抗衰老作用自由基学说在生物衰老过程中的重要作用为科学界普遍公认，超氧阴离子自由基( o - 2 ) 及羟基自由基( o h ) 等均属氧自由基，它们对人机体内的细胞生物膜、核酸、蛋白质等有强烈的破坏作用，可引起核酸链、多肽链的断裂，不饱和脂肪酸的过氧化等，从而加速生物的衰老过程。因此，清除体内的超氧阴离子可以起到抗衰老的作用。研究表明二苯乙烯苷具有显著减轻超氧自由基氧化损伤的能力，表现出很强的抗衰老作用。朱晓莹【4 】等人探讨了元首口服液有效成分二苯乙烯苷含量与其对超氧阴离子自由基清除率的关系，研究结果显示，随着二苯乙烯苷含量的升高，o 。2的清除率也随之升高，呈现出正相关的变化关系。在二苯乙烯苷对痴呆小鼠自由基代谢影响的实验中发现i ”，二苯乙烯苷可通过降低大脑丙二醛( m d a ) 含量和单胺氧化酶( m a o b ) 活性，以及提高总抗氧化能力( t - a o c ) 来抑制b 一淀粉样肽( a 1 3 ) 诱发的自由基级联反应，从而延缓了机体的衰老。1 1 2 2 降血脂作用高血脂症是引起动脉粥样硬化和冠心病最主要的危险因素之一，己成为威胁中老年人健康的主要病症。目前，我国老年人高胆固醇和高甘油三脂血症的总检出量约为2 0 t 6 j 。二苯乙烯苷具有显著的降血脂作用。二苯乙烯苷能明显降低高脂小鼠血甘油三脂和总胆固醇水平 7 1 。赵玲i g 等使用高胆固酵饲料长期喂养w i s t a r 大鼠，建立高胆固醇血症大鼠模型，同时用何首乌提取物对此模型进行药物干预，观察其对动物血脂的影响，发现二苯乙烯苷可显著降低模型大鼠血清总胆固醇以及低密度脂蛋白胆固醇水平。其他报道还显示，二苯乙烯苷降血脂及抗动脉硬化的作用机制可能与以下作用有关：( 1 ) 二苯乙烯苷能够抑制甘油_ - - j 1 旨和总胆固醇经肠道时的吸收【9 】；( 2 ) 二苯乙烯苷具有抑制5 - 脂氧化酶产物羟二十碳四烯酸( h y d r o x y e i e o s a t e t r a e n o i ca c i d ，5 - h e t e ) 、环氧化酶产物( h i - i t ) 和抑制血栓烷( a 2 ) 的作用【1 0 ：( 3 ) 二苯乙烯苷可抑制血小板源生长因子( p d g f ) 诱导的小牛血管平滑肌细胞的增生【i i j ；( 4 )二苯乙烯苷能显著抑制血管细胞粘附分子1 ( v c a m 1 ) 的表达【1 2 】。1 1 2 3 保肝护肝作用二苯乙烯苷的保肝护肝作用是通过抑制过氧化脂质在肝脏中沉积实现的。研究表明二苯乙烯苷能显著拮抗过氧化玉米油所致的大鼠的脂肪肝、肝功损伤( g o t 、g p t 升高) 、肝脏过氧化脂质的含量升高。体外实验发现，二苯乙烯苷、白藜芦醇及其苷云杉新甙可以抑制二磷酸腺苷( a d p ) 和尼可酰胺腺嘌呤二磷酸核酸( n a d p h ) 所致的大鼠肝微粒体脂质的过氧化l l m 。1 1 2 4 改善记忆功能二苯乙烯苷具有显著的脑保护功能，能有效提高学习记忆能力。时翠飞等人对二苯乙烯苷改善痴呆小鼠学习记忆能力进行了系列研究，采用右侧脑室定向注射6 一淀粉样肽( a b l - 4 0 ) f 5 】、鹅膏蕈氨酸基底前脑注射、腹腔注射东莨菪碱【1 5 j 、d 一半乳糖皮下注射【1 6 1 等多种方式建立了小鼠痴呆模型，并以二苯乙烯苷灌胃预防给药，各组小鼠均作m o r r i s 水迷宫及避暗等行为学测试，行为学实验显示二苯乙烯苷能明显提高学习记忆能力，对珂尔茨海默病( a d ) 可能具有一定的防治作用。二苯乙烯苷能够抑制小鼠皮层和海马区细胞内游离钙离子浓度的升高，降低n 甲基d 天冬氨酸( n m d a ) 受体的活性 1 7 】，降低脑组织中的丙二醛( m d a )含量等，因此其具有显著的脑保护作用。1 1 2 5 抗肿瘤作用二苯乙烯类对肿瘤的生长具有较强的抑制作用1 1 8 。研究发现，其抑制作用并不是通过自然杀伤( n k ) 细胞或细胞毒性t 淋巴细胞实现的。二苯乙烯苷是通过抑制d n a 的合成( i c 5 0 = 8 1m m ) 实现的；同时，二苯乙烯苷还具有抑制人脐静脉内皮细胞形成新生毛细血管网的作用( 浓度为1 0 0 1 0 0 0r a m ) ，可能也通过抑制肿瘤新生毛细血管网的生成而抑制肿瘤生长。1 2 何首乌二苯乙燎营的开发现状1 2 1 二苯乙烯苷的提取工艺现状二苯乙烯苷属多羟基化合物，具有较强的分子极性，易溶于低分子醇类溶剂、丙酮等，难溶于亲腊性有机溶剂。目前，二苯乙烯苷的提取溶剂多选用乙醇溶液，其提取工艺主要采用室温冷浸法、碱浸酸沉法、加热回流法、微波辐射法以及超声萃取法等。其中室温冷浸法和加热回流法是常用的规模化提取方法。吕丽爽l l 叫等采用中温浸提法提取二苯乙烯苷。取何首鸟粉，加入到6 0 乙醇中，于5 0 c 恒温水浴中加热，一定转速下搅拌6 0m i n ，在4 0 0 0r m i n 条件下离心2 0 m i n ，同上述条件重复提取一次，将两次上清液合并，减压蒸馏( ( 3 7 ) ，测定其二苯乙烯苷的含量。运用相应面分析方法确定了料液比l ：9 、提取时间6 6m i n为最优条件。并测得在此条件下二苯乙烯苷得率达6 , 3 9 ；此法溶剂消耗量大、提取时间长，因而萃取效率较为低下。乙醇加热回流法 2 0 l 是将何首乌粉末( 过6 0 日筛) ，用一定浓度的乙醇加热回流，过滤，将滤液减压蒸千，测定残留物中二苯乙烯苷含量。正交实验表明最优提取条件为乙醇倍数6 0 倍量和回流时间为3 0m i n ，并测得此条件下制首乌二苯乙烯苷的含量为1 2 1 2m g g 。此法在溶剂消耗和提取时间上较前法都有不同程度的提高，萃取效率也有所提升。微波辅助萃取法 2 l 】的原理是依据溶剂极性的不同，微波透过或部分透过溶剂，使得物料被直接加热，这种“体加热”的方式有助于有效物质的快速溶出。通过均匀设计优选出微波辅助萃取何首乌中有效成分的最优工艺条件为：微波辐射时间1 0r a i n 、固液比1 ：5 。在与传统的加热回流法比较实验中，微波萃取法乙醇用量从2 4 0 0m l 下降到6 0 0m l ，萃取时间从2 7 0m i n 减少到1 0m i n ，而萃取液中二苯乙烯苷含量从6 0 3 上升至9 8 6 。超声萃取法原理是利用超声波的空化效应，此空化效应使得液体内部的空穴气泡在溃陷处形成巨大的压力冲击波和微声流，而使得整个生物体在瞬间破裂。因而经超声处理后，这种空化效应使得何首乌细胞壁被有效的击破，何首乌颗粒进一步破碎，促进了胞内二苯乙烯苷的快速溶出。吕丽爽f 19 】等对超声萃取法、室温冷浸法、加热回流法、碱浸酸沉法的提取效果进行了比较实验，结果发现二苯乙烯苷的得率分别为：5 7 1 0 、5 1 3 2 、4 8 0 4 、4 5 9 7 ，超声提取效果最佳。本课题组进行的超声波萃取何首乌中二苯乙烯苷的实验结果显示：超声提取7 分钟可使二苯乙烯苷的提取率达到0 8 6 。由此可以看出，微波辅助萃取法在节约溶剂、缩短萃取时间上较常规方法有很大提高，超声萃取法则进一步缩短了提取时间，两种方法都明显提高了萃取的效率。应该看到，微波萃取法的“体加热”效应虽有助于二苯乙烯苷的溶出，但这种强烈的热效应也会导致二苯乙烯苷的热降解：而超声萃取法能够在热效应不强的条件下有效提取二苯乙烯苷，因此，超声萃取法在提取二苯乙烯苷方面显示出更大的技术优势，理应成为二苯乙烯苷提取工艺改进新的发展方向。1 2 2 二苯乙烯苷的纯化工艺现状随着二苯乙烯菅检测技术的发展，其功效作用被不断发现。对于用作功能食品或药品中功能因子的二苯乙烯苷，其纯度的要求也不断提高。因此，开展二苯乙烯苷的纯化研究具有重要意义。在二苯乙烯苷纯化工艺的研究中，目前主要采用的是高效液相色谱法、结晶法、树脂柱分离法等。高效液相色谱法虽然能够得到纯度极高的二苯乙烯苷的产品，但其纯化效率难以提高，而纯化的成本也相对较高，因而此法主要应用于实验室制备，难以应4用于工业化生产。班翊【2 2 】采用结晶法纯化精制二苯乙烯苷。利用乙醇回流法所得的何首乌浸膏，用适量蒸馏水稀释后以等量乙醚萃取3 次，水层用两倍的醋酸乙酯热回流5 6h ，收集醋酸乙酯层，减压浓缩至原体积的1 1 0 ，室温下静置析晶，过滤，得二苯乙烯苷粗品。粗品于适量热水或热醋酸乙酯中溶解，趁热过滤，放冷析晶，如此反复结晶，得二苯乙烯菅精品，为灰色无定型结晶粉末，经分析，二苯乙烯苷纯度粗品中为6 8 7 1 ，精品中为9 9 9 4 。此法虽也能得到纯度很高的二苯乙烯苷产品，但其溶剂消耗量大，且有毒性，工艺繁琐，资源利用率低。吕丽爽i 刎等人选取了5 种候选树脂对纯化何首乌中二苯乙烯苷进行了探索。在非流动态吸附实验中发现i i 型极性树脂在绝对吸附量、吸附量、吸附率、解吸率四个指标中分别达到1 4 7 5 8m g m l 、8 7 8 3m g m ! 、4 6 8 0 、4 2 6 3 ，均为5 种候选树脂中最优，因而采用i i 型极性树脂进行纯化和富集。在流动态吸附实验中，将何首乌提取液加入i i 型树脂柱，依次采用去离子水、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 7 , 醇梯度洗脱，经高效液相色谱分析，4 0 乙醇洗脱液所得固形物最多，二苯乙烯苷的含量达到8 4 4 7 ，得率为7 5 1 2 。综上，高效液相色谱法和结晶法都能得到纯度很高的二苯乙烯苷，但却都有着各自难以回避的缺陷。树脂柱法的研究刚刚起步，是值得期待的二苯乙烯苷纯化方法，其纯化效果还有待进一步提高，因此在今后一段时间内二苯乙烯苷的纯化工艺研究的重点是对柱填料的选择上。选择纯化效果更佳、成本更低的填料将是高纯度二苯乙烯苷生产工业化的关键性问题。1 2 3 二苯乙烯苷的检测技术现状目前，二苯乙烯苷的检测方法主要有：薄层扫描法、荧光分光光度法【2 4 j 、酶化学发光法、紫外分光光度法、高效液相色谱法、高效毛细管电泳法以及流动注射化学发光法等。薄层扫描法【2 5 】采用硅胶g 预制板，展开剂为：苯：甲醇：丙酮( 4 4 ：8 ：4 )上行法展开14c l r l ，测定波长3 0 5l l i 1 ，参比波长3 6 5 姗，双长波锯齿扫描，狭健0 4 x 0 4n l r n ，以生首乌样品液5 山于薄层板展开，同板精密度c v = 3 2 ( n = 6 ) 。同法于3 块板上点样，得异板精密度c v = 4 3 。此法适用于对二苯乙烯苷的定性研究。酶化学发光法【2 6 i 利用二苯乙烯苷酸解后产生的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化下，被氧化成葡萄糖酸和h 2 0 2 ，t t 2 0 2 与l u m i n o l 反应而发光，在一定条件下，该发光强度与二苯乙烯苷的含量成正比的原理，建立了酶化学发光法测定二苯乙烯苷的含量。该法对二苯乙烯营的检测限量为2 7 x 1 0 7m o l l ，标准偏差小于2 ，标准回收率在9 6 一1 0 4 之间，线性范围为5 0 x 1 0 4 1 0 x 1 0 。4m o l l 。此法检测较为繁杂，检测能力与紫外分光光度法接近，其特点是不需要二苯乙烯苷标准品，而是使用葡萄糖标准品，就能对二苯乙烯苷含量进行测量。紫外分光光度法【2 7 j n e f l - 苯乙烯苷乙醇溶液在3 1 0n l l l 处有最大吸收峰，由二苯乙烯苷标准品绘制标准曲线，经由标准曲线得回归方程，其r = 0 。9 9 9 2 ( n = 5 ) ，二苯乙烯苷浓度在1 2 5 1 0 0 m g l 范围内与吸收度呈良好的线性关系，精密度实验中，日内r s d 为o 7 5 ，日问r s d 为2 3 。此法操作简单，检测能力较强，主要适用于粗提品中二苯乙烯菅含量的检测，但对量微、高纯度二苯乙烯苷的检测还显能力不足。吴明侠采用高效液相色谱法【2 8 ，将二苯乙烯苷对照品注入液相色谱仪，色谱条件为：o d s 色谱柱( 6m m x l 5 0r a m ) ；流动相：乙腈：水( 2 5 ：7 5 ) ：检测波长：3 2 0n n l ；流速：0 8m l m i n ；柱温4 0 。测定其峰面积，得回归方程，其r = 0 9 9 9 8 ，二苯乙烯苷在1 7 6 8 8 0g g 范围内呈线性，回收率为9 7 9 6 ，r s d 为2 1 3 。高效液相色谱法具有灵敏，重现性高，结果可靠等优点，广泛应用于何首乌提取物以及其它药品和保健品中的二苯乙烯菅的检测，是目前绝大多数检测机构采用的主要检测方法。高效毛细电泳法具有操作简便、灵敏度高的优点，适于何首乌及其制剂中二苯乙烯苷的质量控制。二苯乙烯苷结构中含有四个酚羟基，具有一定的酸性，在碱性条件下可解离而带负电荷，毛细管电泳法正是利用这一原理。所以选用毛细管区带电泳( c z e ) 的模式。袁海龙等【2 9 】以盐酸麻黄碱作内标物，使用熔融石英毛细管柱、2 0m m o l l 硼砂电解液，在电压2 0k v 、温度2 5 、柱上紫外检测波长2 1 4n l n 条件下，虹吸进样，进样时间5s 进行电泳检测。结果证实进样量在1 0 o 1 0 0 0t t g m l 范围内线性关系良好，加样回收率达9 8 7 1 ，r s d 为1 5 1 。党晓怡【3 0 】等贝t j $ 0 用二苯乙烯苷对鲁米诺一过氧化氢发光体系在p i l l 2 的溶液中具有一定的抑制作用，且此抑制作用在一定范围内与二苯乙烯苷的浓度呈线性关系的原理，借此建立了流动注射发光分析法来检测何首乌中二苯乙烯苷的含量，此方法检出限为6 o 1 0 g 九，线性范围在1 0 1 0 4 1 6 x 1 0 4 班。对二苯乙烯苷平行测定1 1 次，其相对标准偏差为1 4 6 。这些检测方法为在不同工作环境下，对二苯乙烯苷含量的测定提供了检测手段上的选择。1 3 大孔吸附树脂在富集中草药有效成分中的应用中药现代化是我国传统中药发展的必然趋势。作为中药现代化的基础性研究，中草药有效成分的提取和分离是目前研究的热点和重点卧3 2 】。吸附脱附法是中草药有效成分提取分离的常用方法。聚酰胺、硅胶、氧化铝是常用的吸附剂。但使用聚酰胺、硅胶、氧化铝等作为吸附剂，存在分离效果差、提取工艺复杂、吸附剂预处理工序复杂以及吸附荆回收率低等缺点，不适合中药现代化的要求1 3 ”。大孔吸附树脂( m a c r o p o m u sa b s o r b i n gr e s i n ) 是近代发展起来的一类有机高分子聚合物吸附剂【34 1 ，2 0 世纪7 0 年代末逐步应用到中草药有效成分提取分离过程中【3 5 1 。与传统吸附剂相比，大孔吸附树脂具有选择性好、吸附容量高、解吸容易、机械强度好、可反复使用和流体阻力较小、交换速度快、耐污染性强等特点，尤其是其孔隙大小、骨架结构和极性可按照需要选择不同的原料和合成条件而改变i j ”。大孔吸附树脂在中草药有效成分的富集领域得到广泛应用。目前应用大孔吸附树脂富集的中草药有效成分主要是在黄酮、皂苷、生物碱以及其他苷类。1 3 3 , 3 8 4 5 1作为一种新型的分离手段，大孔吸附树脂分离技术正在日益广泛的应用于中药制剂生产d t 口 4 6 1 。1 4 本课题的主要研究内容和意义本课题来源于是安徽省教育厅自然科学基金重点研究项目“皖南山区特色野生资源的食用加工及其安全性评价”。选用何首乌为原料，开展二苯乙烯苷的大孔吸附树脂分离研究。研究内容如下：( 1 ) 理论分析大孔树脂分离二苯乙烯苷的机理；( 2 ) 通过非流动态分离实验研究，选择适宜分离二苯乙烯苷的大孔吸附树脂，并探索工艺条件对二苯乙烯菅分离效果的影响：( 3 ) 通过流动态分离实验研究，考察工艺条件( 洗脱剂浓度、进样液p h 值、洗脱流速) 对二苯乙烯苷分离效果的影响，以寻求适宜二苯乙烯苷分离的工艺条件。通过本课题的研究，以期寻求一种适宜分离二苯乙烯苷的大孔吸附树脂分离方法，并通过优化其分离工艺。为二苯乙烯苷的工业化分离提供技术支持。第二章大孔吸附树脂分离二苯乙烯苷( t h s g ) 的机理分析2 1 大孔吸附树脂分离机理2 1 1 大孔吸附树脂吸附机理大孔吸附树脂的是一类吸附与筛选原理相结合的分离材料。2 1 1 1 大孔吸附树脂的吸附作用大孔吸附树脂的吸附作用是通过表面吸附、表面电性或形成氢键而产生的，因此，大孔吸附树脂的吸附作用属于物理吸附的范畴。在物理吸附中，物质表面之所以有吸附能力，是由于处在相界匝上物质分离的特殊状态所造成的。一切物质。不论其聚集状态如何，其分子之间都有相互作用力。在物质的体相，从统计平均的观点来看，任何一个分子在各个方面所受到的作用力是均衡的，相互抵消的，因此分子所受到合力为零，而在界面层的分予( 或原子、离子) 则由于两侧体相中分子对它的作用力不同，而处于不均衡作用力之下，故将受到一个垂直于界面的合力。这就是界面层分子所具有的能量与体相分子不同，即具有附加的界面能。因而界面分子有自发吸引其他分子使其所受作用力部分或完全均衡，并降低自己能量的倾向，其结果将使界面层中某种或几种组分分子的浓度与体相不同，这就是吸附作用产生的原因。吸附量的多少，与吸附剂的孔径、表面积、表面电性能、是否形成氢键等有关【4 7 j 。吸附剂在溶液内是否吸附某种物质，与该物质在溶剂内的表面张力有关，可用下式表示：s = - c r t d _ ，v d c式中：s 吸附剂在稀溶液内每平方厘米面积d x d c 溶液表面张力的增加与溶液中溶质浓对溶质的吸附量度增加的比率c 溶液浓度r 气体常数t 吸附作用时的绝对温度从上式中可知，任何能降低溶剂表面张力( d v d c 为负值) 的溶质都能被吸附剂吸附。反之，凡溶于溶剂内的物质能提高界面张力( d d c 为正值) 的都不被吸附。水的表面张力能是高的，许多溶质能降低它的数值，所以在溶液内能被吸附剂吸附。乙醇的表面张力远远低于水，故许多溶质降低乙醇表面张力不如降低水表面张力大，故一般情况下，溶质在水里较在乙醇里被吸附得多。考虑这一原因，吸附时，应该降低二苯乙烯苷提取液的乙醇浓度。根据大孔吸附树脂表面性质分类，其主要分为非极性、中极性、强极性三类【3 6 1 。其吸附示意图见图2 - 1 。非极性吸附剂是由偶极距很小的单体聚合制得的不带任何功能基，孔表的疏水性较强，可通过与小分子内的疏水部分的作用吸附溶液中的有机物，最适合由极性溶剂中吸附非极性物质。其作用力主要是范德华引力。中极性吸附荆从溶剂中吸附物质，除了范德华引力之外，氢键也起一定作用。既可从极性溶液中吸附非极性物质，又可以从非极性溶液中吸附极性物质。强极性吸附剂对吸附质的吸附主要是通过氢键作用和偶极一偶极相互作用进行的，因此其中的一些品种可以称之为氢键吸附剂。易从极性溶液中吸附极性物质。矿黟黼嗣谚删p 一捧质分子。亲水性薜丹藏永性部分0 嚷附撼丹子图2 - 1 大孔树脂吸附作用示意图f i g2 - 1s o r p t i o ns k e t c hm a po f m a e r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i n根据极性大小对物理吸附剂分类不是很严格。有一些吸附剂是含有少量中极性基团的交联聚苯乙烯，属于介于非极性与中极性吸附剂之间的弱极性吸附剂，这类吸附剂的最大优点是在保持非极性吸附剂特征的同时改善了表面可润湿性，使吸附质从水相到固体相的传质阻力减小，工业应用的前处理技术简化。2 1 1 2 大孔吸附树脂的筛选原理大孔吸附树脂的筛选原理是由其本身多孔性结构所决定的 4 踟。大孔吸附树脂的孔径和比表面积是影响大孔吸附树脂对吸附质吸附的主要因素。大孔吸附树脂比表面是由树脂外比表面和树脂内部孔网形成的内比表面组成的，它是吸附作用的基础，在良好的扩散条件下，比表面越大越好，特别对分子较小的吸附质更为显著。树脂内部孔径是吸附质扩散的路径，是吸附进行的基本条件。在选择吸附树脂孔径时，吸附树脂孔径与吸附质分子直径之比应以6 ：1 为宜，孔径太大，浪费空间。因此。对于同种吸附质。当树脂孔径过小时，吸附质不能进入树脂内部，只能吸附在树脂外表面；当树脂孔径过大时，吸附质既可以吸附在树脂外表面也可吸附在内表面，但树脂的比表面积减小。因此，吸附质的大小对树脂吸附能力的大小有密切的关系田1 。综上，在选择适宜分离二苯乙烯苷的大孔吸附树脂时，应该综合考虑二苯乙烯苷的极性及其分子大小进行选择。当大孔吸附树脂极性过小时，在与溶剂中竞争中，大孔吸附树脂难以完全吸附二苯乙烯苷，造成回收率低下。而当大孔吸附树脂极性过强时，大孔吸附树脂对二苯乙烯苷的吸附作用过强，则造成洗脱困难；当大孔吸附树脂孔径过小时，二苯乙烯苷分子只被吸附在大孔吸附树脂外表面，难以进入孔内，造成大孔吸附树脂吸附量低下。而树脂孔径过大时，树脂比表面积小，造成空间浪费，导致饱和吸附量小。2 1 2 大孔吸附树脂解吸机理解吸是吸附的逆过程，吸附树指对分子的吸附作用力微弱，只要改变体系的亲水一疏水平衡条件，改变吸附剂与吸附质之间的分子引力，改变介质的介电常数，范德华力就会根本改变，原来的吸附就会崩溃，吸附质由解吸剂进入溶剂，成为解吸或脱附的过程，对解吸的要求是吸附质与吸附剂的亲和力大于与吸附剂的亲和力。由于解吸是吸附的逆过程，影响吸附过程的因素也会影响解吸过程。2 2 二苯乙烯苷的化学性质及分子作用力2 2 1 二苯乙烯苷的化学性质二苯乙烯苷又称芪多酚，属多羟基芪类化合物( p o l y h y d r o s t i l b e n e s ) ，广泛存在于藓类和高级植物中。二苯乙烯苷被鉴定为一种植物抗毒素，是由植物在真菌感染、紫外线照射、机械损伤等不利条件下产生的。天然的二苯乙烯苷主要以二苯乙烯苷元侧链结合一个单糖基的形式存在。其化学名为2 ，3 ，5 ，4 - 四羟基二苯乙烯2 o1 3d 葡萄糖苷，分子量为4 0 6 3 9 。其中二苯乙烯苷元为1 ，2 二芳基乙烯化合物，化学式为c 1 4 h 1 3 0 4 。自然界中，普遍是以二苯乙烯苷的形式存在的。二苯乙烯苷的结构式如图2 2 所示：o hh o母一hg l u c d b oo h图2 22 ，3 ，5 ，4 - 四羟基二苯乙烯2 o 1 3 d 葡萄糖苷化学结构式f i g 2 2s n l j c t u r a jf o r m u l ao f 2 354 - t e t r a h y d r o x y s t i l b e n e 2 - o b d g l u c o s i d e1 0二苯乙烯苷属多羟基芪类化合物。从图2 1 看，二苯乙烯苷分子的结构中含有4 个酚羟基基团( 其中一个酚羟基与一个单糖基结合成苷) ，为非对称分布，并且二苯乙烯苷分子量较小。因此可以判断，二苯乙烯苷分子属于极性化合物。二苯乙烯苷具有良好的水溶性，易溶于亲水性的溶剂中，如甲醇，乙醇，丙酮等，而难溶于亲脂性的溶剂中，如乙醚等。2 2 2 二苯乙烯苷的化学稳定性二苯乙烯苷的化学组成与分子结构决定了它的稳定性。二苯乙烯苷的水溶液在高温条件( 8 0 。c ) 下不稳定，其含量与温度呈负变关系；刘振丽等【4 9 1 将二苯乙烯苷在室温、6 0 c 、7 0 c 、8 0 、9 0 c 下放置2 4h 后，其相对含量分别为1 0 0 、9 7 4 5 、8 8 2 3 、6 5 4 1 、2 9 ，1 7 。生首鸟二苯乙烯苷含量高于制首乌，经不同炮制方法所得的制首乌中二苯乙烯苷含量也有所差掣”。笔者认为正是各种炮制方法中炮制温度的不同造成了以上差异。二苯乙烯苷在酸性溶液中很不稳定。在4 硫酸溶液中，室温放置1 2h 后含量降为原来的3 1 6 7 ，而在8 0 下放置4h 则检测不n - 苯乙烯苷。其降解产物为二苯乙烯苷苷元，并进一步降解为酚类化合物【5 ”。二苯乙烯苷具有很强的抗氧化活性 5 2 一射。二苯乙烯苷能够抑制生物膜脂质的过氧化，提高机体s o d 的活性，从而抑制机体氧应激状态的产生例。2 2 3 二苯乙烯苷的分子作用力从吸附效应的角度来看，二苯乙烯苷与大孔吸附树脂之间的吸附作用主要为物理吸附。物理吸附作用的最根本因素是吸附质和吸附剂之间的作用力，也就是范德华力，是决定物质物理性质的重要因素。范德华力是一组分子引力的总称，具体包括三种力：定向力，诱导力和色散力【5 5 】。另外在物理吸附的作用力中还包括一种较为特殊的力，即氢键力。在描述质点的相互作用时，往往是用它们相互作用的能量u ( 也就是使用质点彼此分开所必须消耗的功) 来表示的。因此分子引力的总能量可表示为p 6 】：u 范一华= u 定向+ u 鹾导+ u 色散+ u 氢链各分子间力能量公式见表2 - 1 。定向力：由于极性分子的永久偶极矩产生的分子间的静电引力称为定向力。它是极性分子间产生的作用力。诱导力：极性分子与非极性分子之间的吸引力属于诱导力。极性分子产生的电场作用会诱导非极性分子极化，产生诱导偶极矩因此两者之间吸引，产生吸附作用。色散力：非极性分子之间的引力属于色散力。当分子由于外围电子运动及原子核在零点附近振动，正负电荷中心出现瞬间相对位移时，会产生快速变化的瞬间偶极矩，这种瞬间偶极矩能使外围非极性分子极化，反过来，被极化的分子又影响瞬闻偶极矩的变化，这样产生的引力叫色散力。氢键力 5 7 】；一种特殊的分子间作用力，它是一种介于库仑力与范德华力之间的特殊定向力，比诱导力、色散力都大。当氢原子与一个原子半径较小、而电负性又很强并带未共用电子对的原子y ( y 主要是f ，0 和n ) 结合时，由于y 的极强的拉电子作用，使得h y 间电子密度主要集中在y 一端，而使氢原于几乎成为裸露的质子而显正性，这样，带部分正电荷的氢便可与另一分子中电负性强的y相互吸引而与其未共用电子对以静电引力相结合，这种分子间的作用力口q 做氢键力。从本质上来看，氢键力也是永久偶极距产生的作用力表2 - 1 分子间力能量公式t a b 2 - 1t h ef o r m u l ao f t h ei n t c r m o l e e u l a re n e r g y式中：“l 吸附剂功能基偶极矩r 两质子中心之间的距离t 热力学温度h 普朗克常数d 斥力常数吸附质分子偶极矩k 波尔兹曼常数a 2 非极性分子的极化度v o 电子振动频率( s 一1 )( 1 ) 极性与非极性分子问的诱导力能量公式( 2 ) 两极性分子问的诱导力能量公式二苯乙烯苷属于极性分子，在分离二苯乙烯苷的过程中，应使用极性的吸附材料以及极性溶剂较为合适。其在吸附和解吸过程中主要分子作用力可能来源于两部分：二苯乙烯苷分子中永久偶极与极性吸附剂或极性溶剂中的永久偶极产生的定向力；另外，二苯乙烯苷分子中含有多个- - o h 酚羟基，o 对h 有极强的拉电子作用，因此h 有很强的电正性，所以有较大的几率与吸附剂或者溶剂中的电负性强的官能团形成氢键【5 s 】。在吸附过程中，当二苯乙烯苷分子与大孔吸附树脂间的分子作用力大于与溶剂之间的分子作用力时，二苯乙烯苷分子将从溶剂中向大孔吸附树脂方向转移，此即二苯乙烯苷被吸附；而在解吸过程中，当二苯乙烯苷分子与溶剂之大孔吸附树脂间的分子作用力大于与大孔吸附树脂间的分子作用力时，二苯乙烯苷分子的移动方向将从大孔吸附树腊向洗脱液转移，此即二苯乙烯苷被洗脱。2 3 吸附工艺对分离效果的影响吸附质在大孔吸附树脂上的吸附和解吸是大孔吸附树脂吸附和溶液溶解竞争作用的结果。上文论述了大孔吸附树脂的选择对吸附和解吸发生影响的机理。而在大孔吸附树脂给定的情况下，通过对吸附工艺的调节也能够对这两种作用发生影响，以得到较好的吸附与解吸的效果。2 3 1p h 值对分离效果的影响体系内p h 值变化会影响该体系内物质分子的电力程度，因此会改变到分子的定向力作用。由此会改变影响到大孔吸附树脂吸附及解吸的性能。溶液p h 值的改变还可以改变吸附质在溶液中的的溶解度。对于酸性化合物，其溶解度随着p h 值的降低而降低，反之上升。在吸附过程中，p h 值降低时，酸性化合物将保持其分子状态，其在溶液中的溶解度下降，从而有利于该物质向树脂转移；而在解吸过程中，口h 值上升时，使得该物质在溶液中的溶解度上升，从而有利于该物质从树脂向洗脱液转移。因此，一般说来在吸附过程中，酸性化合物在酸性溶液中进行吸附碱性化合物在碱性溶液中进行吸附较为合适，中性化合物可在近中性的情况下被吸附。同一原理，在解吸过程中，酸性化合物在碱性溶液中进行解吸，碱性化合物在酸性溶液中进行解吸较为合适【3 引。二苯乙烯苷为酸性化合物，因此在吸附过程中，应适当降低溶液的p h 值，以降低其在溶液中的溶解度，则有利于其被大孔吸附树脂吸附。2 3 2 洗脱液性质对分离效果的影响根据相似相溶原理，选择洗脱液时，洗脱液须对吸附质具有良好的溶解作用，一般来说该作用越大洗脱效果越佳。根据大孔吸附树脂对吸附质吸附力的强弱选用不同的洗篪剂或洗脱荆浓度。为了达到满意的效果，可设不同浓度的洗脱剂洗脱，以确定最佳的洗脱剂浓度。以乙醇溶液作为洗脱剂为例，一方面，随着乙醇的浓度上升，乙醇溶液的极性上升，即能影响吸附质和大孔吸附树脂间的分子间作用力。当乙醇溶液与吸附质问的分子间作用力超过大孔树脂与吸附质间的分子间作用力时，吸附质的将从树脂向乙醇溶液转移；另一方面，乙醇浓度不同，也能够影响吸附质在乙醇溶液中的溶解度呤别。二苯乙烯苷分子为极性分子在选择乙醇作为洗脱剂时，可通过实验调节乙醇溶液的浓度以改变洗脱液的极性，来达n - - 苯乙烯苷分子向洗脱液转移的目的，进而获得较佳的分离效果。2 3 3 洗脱流速对分离效果的影响一般说来，洗脱流速与洗脱量是成反比。洗脱流速过大，在洗脱液通过树脂后，等量洗脱液中吸附质的洗脱量将小于在低流速下吸附质的洗脱量，影响吸附性能：而洗脱流速过小，洗脱时间就会增加，生产效率降低。在实际应用中，应综合考虑来确定最佳的洗脱流速，既要使洗脱完全，又要保证较高的工作效率【6 。在本研究中，将通过考察各个洗脱流速，以寻求二苯乙烯苷洗脱质量与生产效率的最佳结合点。2 3 4 温度对分离效果的影响吸附质在大孔吸附树脂上的吸附是通过分子问作用力实现的。温度升高，一方面吸附质自身分子动能上升，热运动加剧，有挣脱其与树脂间作用力的趋势，因此，其在树脂上的吸附作用降低，另一方面，吸附质在溶液中的溶解度增大。综上，温度升高将导致吸附质在大孔吸附树脂上的吸附速度和吸附量降低【邓l 。所以在本研究中，吸附阶段应该降低体系温度，以最大可能的使二苯乙烯苷被吸附；反之，在洗脱阶段，应该升高体系温度，以最大可能的使二苯乙烯苷被洗脱。2 3 s 初始浓度对分离效果的影响吸附质在大孔吸附树脂上是物理吸附，浓度增加，平衡吸附量增加，吸附率降低，从物理吸附等温方程可以发现，初始平衡吸附时间增加【6 i l 。第三章二苯乙烯苷非流动态分离实验本章将着重研究通过非流动态筛选实验以及非流动态对比实验从六种待定树脂中选择对何首乌中二苯乙烯苷分离效果最佳( 指标：吸附量及解吸率) 的大孔吸附树脂 并对此树脂作非流动态吸附及解吸趋势研究以确定吸附和解吸过程的用时。3 1 材料与仪器3 1 1 材料制何首乌干燥根白藜芦醇苷对照品9 5 乙醇大孔吸附树脂柠檬酸( 食品级)柠檬酸钠( 食品级)3 1 2 仪器s p e