（农产品加工及贮藏工程专业论文）原生质体融合构建苹果酸高降解活性的葡萄酒酵母.pdf

擒要 本研究以发酵性能优良的葡萄酒黪母和具有苹果酸高降解活性的裂殖酵母为亲 本，裁塌蔗生质传融合技零， 每建了警莱酸裹降鳃溺往豹蓑萄溅黪母；有效的提高了 稀萄酒酵母静降解苹采酸缱力，荠耪步研究了其生溪及发酵特僚。 研究了菌龄、酶解温度、酶解时间、酶浓度( 戏酶系统) 四因索对葡萄酒酵母和 裂殖酵母原生质体形成率和再生率的影响，采用菌龄、酶解温度、酶解时间、酶浓度、 稳渗骞g 进行五嚣素四水平的正交试验，分辑各因素鹣缀差值，评挽各因素的影蛹程度。 结果表嘲：酶浓度( 戏酶系统) 静檄差值最高，其次为菌龄，酶浓度( 或酶系统 为影响原生质体形成的主疆因素。葡萄酒酵母原生质体形成和再生的最佳条件是：菌 龄为1 2 h 、酶浓度为1 5 、酶解时间为l h 、酶解温度为2 8 、穗渗剂选用k c l ，原 生凄接影藏拳为9 2 ，3 ，褥生率为1 9 6 ；裂蘩黪母藏生质体澎箴和再生的教建条 件是：菌龄为1 4 h 、酶浓度为1 5 箱蜗牛酶+ o 5 纤维素酶、酶豁辩闻为2 5 h 、酶解 温度为2 8 、稳渗剂选用k c l ，原生质体形成率为9 4 6 ，再生率为1 3 4 。 研究了葡萄酒酵母原生质体热处理时间和致死率的关系，得到了热处理时间对原 生爱落豹致残率蔻线，选撵为热灭活l o 分势，戴瓣致夏率为1 0 0 。 研究了裂殖酵母原生硬体紫外线照射剂量和致死率的关系，襻到了紫乡 线对蔡生 质体的致孺率曲线，当紫外照射剂量为：紫外灯功率2 0 w ，照射距离3 0 c m ，照射时 间为5 m i n 时，原生质体的致死率恰为1 0 0 ，选择该荆量为裂殖酵母原生质体紫外 灭活戆适霞剂篷。 双灭活二亲本原生质体后，进行琢生质体磁合，得出原生质体融台的适意条件为 p e g 3 5 ，p h 6 0 ，3 0 下处理3 0 m i n ，融合率达1 0 4 1 0 。采用降解苹果酸指示性培养 基进行一级筛选，通过比较各菌株的颜色深浅来衡攮其降解苹果酸能力的强弱，从平 羧上薅选出了蘩落颜色鞍深瓣3 6 臻蘸邂行二级薅逡。 以葡萄汁为培养基采糟柱氏小管教释法进行二缀筛选，发酵融闻4 8 h ，戳产气速 度和杜氏管产气量为指标，进行发酵力的筛选。 对二级筛选所得到的融合子进行细胞体积、d n a 含量方面的鉴定分析，结果显 示多拣融合予缨戆钵积翻鬟大予嚣亲拣各自俸积，d n a 含量约梵二亲撩之秘，证实 确为融合予。 采用毛细管电泳法，对二级筛选褥到的9 株融合子进行三级筛选，精确测定其苹 果酸降解程度；从中筛选出株苹果酸降酸率达到3 1 + 7 且发酵速度较快的菌株。出 发蓥探蘧蘩溪簿母熬葶鬃簸降瑟率为1 3 ，融合爱戆蓥拣较崮发蘧拣苹暴酸癸簿率 提高3 0 4 ，该菌株编号为z 2 9 。 采用连续传代的方法研究了z 2 9 融合子的遗传稳定性，结果表明：连续传代1 5 次后，z 2 9 融台子的苹果酸降解率、发酵性能与初代融合子相比无明显变化。 对z 2 9 融合子絮凝搜及毳重s 0 2 缝貔逶牙了测定，结果表臻，茭絮凝性强，瓣s 0 2 性毹好，怒株良好的工渡用葡萄酒酵母。 在感观评价上，融合予发酵的赤陵珠葡萄酒优于亲本解苹果酸裂殖酵母m ，所发 酵的酒，与潦本葡萄酒酵母c ，所发酵的葡萄酒相通：口感丰满协调，清爽柔和，无 酸涩感，酒味突出。表明融合子z 2 9 继承了亲本的优良性状，是一株优良的葡萄酒酵 母。 对z 2 9 菌株的生长和发酵特性进行了研究，分别测定了z 2 9 菌株生长和发酵的最 适温度、p h 。结果表明：z 2 9 菌株的最适生长温度为3 0 、生长的最适p h 为4 5 ， 最适发酵温度为2 8 。c ，发酵的最适p h 为3 5 ，接种量为3 x 1 0 7 ；研究了不同温度、p i 、 接种量对生长曲线和发酵曲线的影响。结果表明：接种量对生长曲线影响很明显，接 种量越大，达到稳定期的时间越短。但是最终生物量并不受接种量的影响。对于发酵 曲线，接种量对发酵力影响不明显。在发酵温度范围内，温度对发酵曲线的影响较明 显，温度为2 8 时，发酵力达到最大。 关键词：葡萄酒酵母，解苹果酸裂殖酵母，融合，苹果酸，毛细管电泳 s t u d i e so nt h ec o n s t r u c t i o no f y e a s tw i t hh i g hm a l i ca c i dd e g r a d a t i o nb yp r o t o p l a s t f u s i o n m a j o r ：f o o dm i c r o b i o l o g y a d v i s t o r ：z h a n gw e i g r a d u a t es t u d e n t ：s h id o n 百i a n a b s t r a c t t h i sp a p e ri sf o c u s e do nt h ec o n s t r u c t i o no fh i g hm a l i ca c i d r e d u c i n gy e a s tb y p r o t o p l a s tf u s i o na n dt h eo p t i m i z a t i o no fc u l t i v a t i o n t h ec o n d i t i o n st h a ta f f e c t e dt h ep r o t o p l a s tf o r m a t i o nr a t ea n dr e g e n e r a t i o nr a t eo f s a c c h a r o m y c e sc e m v 括a ew e r ea n a l y s e d f i v e - f a c i o ra n df o a t - l e v e lo r t h o g o n a le x p e r i m e n t s w e r ed e s i g n e dt os t u d yt h es i n g l ef a c t o r , i n c l u d i n gs t r a i na g e ，e n z y m o l y s i st e m p e r a t u r ea n d o s m o t a n t s ，a n a l y z e dt h er a n g eo fe a c h f a c t o ra n da s s e s sa f f e c t i n gd e g r e eo fe a c hf a c t o r f i n a l l yt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s f o rs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s a ea n ds c h i z o s a c c h a r o m y c e s m e l i d e v o r a n sp r o t o p l a s tf o r m a t i o na n dr e g e n e r a t i o nw e r ed e t e r m i n e d t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nu v 1 i g h ti r r a d i a t e dd o s ea n dm o r t a l i t yo fs c h i z o s a c c h a r o m y c e s m e l i d e v o r a n sp r o t o p l a s tw a se x a m i n e di nt h i ss t u d y 1 r h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tw h e n u v l i g h ti r r a d i a t e dd o s ew a s2 0w a t t ，d i s t a n c ew a s3 0 c ma n di r r a d i a t e dt i m ew a s5 m i n ，t h e l e t h a l i t yo fp r o t o p l a s tw a s1 0 0 w eg o tt h eu v - l i 曲ti r r a d i a t i o nt i m et ol e t h a l i t yc u r v e ； f o rt h es a c c h a r o m y c e sc e r e v i s a e ，w h e nh e a t e du dt o7 0 ，1 0 r a i n ，t h el e t h a l i t yo ft h e p r o t o p l a s tw a s1 0 0 t h e nt h ec o n d i t i o n sa b o v ew e r es e l e t e da st h eg e n e t i cm a k e r a f t e rt w op r o t o p l a s t sw e r eg e t ，t h eh e a t - i n a c t i v a t e dp r o t o p l a s tc 1w a sf u s e dw i t h u v - i n a c t i v a t e d p r o t o p l a s tm ib yt r e a t i n g w i t h3 5 p e g ，p h 6 0f o r3 0m i n ，t h e c o m p l e m e n t a t i o nf r e q u e n c yo ff u s i o n v a s1 0 4 1 0 t h e nt h ec u l t u r em e d i u m 、, v a s c h o s e nt oi d e n t i f yt h ed e g r a d a t i o no fm a l i ca c i df o rp r i m a r ys c r e e n i n g n eb l u ed e g r e eo f s t r a i nc o l o rw a ss e l e c t e da sc r i t e r i o nt oe v a l u a t e dt h ef u s a n t sa b i l i t yt od e g r a d em a l i ca c i d 3 6f u s a n t so fb l u ef r o mp l a t e sw e r es e l e c t e df o rs e c o n d a r ys c r e e n i n g f n s a n t sf r o mp r i m a r ys c r e e n i n gw e r ei n c u b a t e di ng r a p ej u i c em e d i u ma n df e r m e n t e d i ns m a l l t u b e sf o r4 8 h t h er a t ea n da m o u n to fp r o d u c i n gg a sw e r ec h o s ea sc r i t e r i o n sf o r s e c o n d a r ys c r e e n i n g f i n a l l y9f u s a n t so fh i g h e rg a s p r o d u c i n gr a t e a n da m o u n tw e r e o b t a i n e d f u s a n t sf r o ms e c o n d a r ys c r e e n i n gw e r et e s t e di ns e v e r a la s p e c t si n c l u d i n gc e l l m o r p h o l o g y , g e n e t i cs t a b i l i t ya n dt h ea m o u n to fc h r o m o s o m a ld n a t h ef e r m e n t i o na b i l i t y a n dt h ef l o c c u l e n tc a p a c i t y f o r m a t i o no ff u s a n tw a sc o n f i r m e db yt h ei n c r e a s e da m o u n to f c h r o m o s o m a ld n a p e rc e l l i n d i c a t e dt h a tm u l t i p l ef u s i o n sh a dt a k e np l a c e h i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( h p c e lw a su s e d t od e t e r m i n et h e d e g r a d a t i o no ft h em a l i ca c i d t h r o u g ha l lt h e s ee x p e r i m e n t s ，t h ef u s i o nz 2 9w a ss c r e e n e d ， w h o s em a l i ca c i dd e g r a d a t i o nr a t ew a s3 1 7 3 0 4 h i i g h e rt h a nt h es a c c h a r o m y c e s c e r e v 妇a e n e g e n e t i cs t a b i l i t yw a sv a l u e da f t e r1 5g e n e r a t i o n s s h o w e dt h a tt h ed e g r a t i o nr a t e o fm a l i ca c i da n do t h e rf e a t u r e sc o m ef r o mp a r e n t a ls t r a i n sw a ss t a b l e t h ef u s i o nz 2 9e x p r e s sf i n ep r o p e r t i e sc a m ef r o mp a r e n t a ls t r a i n si nf e r m e n t i o ns p e e d a n dt h ef l o c c u l e n tc a p a c i t y , i n c l u d i n gg o o dt o r l e r a n c eo fs o z ，a tt h es a l n et i m e ，g i v i n gt h e w i n ef l a g r a n tf l a v o u r ，b e a n t i f u lr e dc o l o r ，h a v i n gn oa c e r b i c i na d d i t i o n ，1 1 1 eb i o p h y s i o l o g i c a lp r o p e r t i e so ft h es t r a i nw c r er e s e a c h e d d e t e r m i n e t h eb e s tt e m p e r t u r ea n dp hv a l u ef o rg r o w t ha n df e r m e n t a t i o na n ds t u d i e dt h ee f f e c to f t e m p e r t u r e , p hv a l u ea n di n o c u l u ms i z ed u r i n gg r o w t ha n df e r m e n t a t i o n o p t i m u mg r o w t hp a r a m e t e r so fz 2 9w e r et h a tt h ei n i t i a lp hv a l u ew a s4 5a n dt h e f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r ew a s3 0 。c ；o p t i m u mf e r m e n t a t i o np a r a m e t e r so fz 2 9w e r eg a i n e d b yo r t h o g o n a lt e s t t h eo p t i m a lf e r m e n t i o nc o n d i t i o n sw e r et h a tt h ei n i t i a lp hv a l u ew a s 3 5a n dt h ef e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r ew a s2 8 ；t h ei n o c u l u ms i z eo ft h ey e a s tw a s3 1 0 7 a tt h ee n do ff e r m e n t a t i o n k e yw o r d s ：s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s a e ；s c h z o s a c c h a r o m y c e sm e l i d e v o r a n s ；p r o t o p l a s t f u s i o n ；m a l i ca c i d ；h i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( h p c e ) 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文魁本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 礤究或鬃。据我掰知，除了文中转澍热戳标洼帮致滋静逢方井，论文中不镪含其 他人已经发表或撰写避的研究成果，也不包含为获得塑i 垦壅些杰望或其他 教育橇构的学位或证书而使斓过的聿于料。与我一间工作的同志对本研究所傲的任 何烫献均已在论文中住了明确的谈骥并表示谢意。 学位论文作者签名：。芝专蠡乙签字日期：埘年月吖日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了勰签薹垦壅堡盘鲎寿关绦蜜、使用学位论文酌癀 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阐。本入授权亟踅壅照盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库避弦检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：爰乙孑耷l 导师签名： 签字日期：如脾f 月2 - e t签字日期： 学饭论文作者毕姓后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 日 原生质体融合构建苹果黢高降解活性的葡萄酒酵母 1 引言 蘩莓溪楚麓蘧汁经酵母发酵纛减戆具畜适菠酸拣、鬃香浓郁、渣爽刭日懿低醇饮 料。其中有移l 酸的种类及含量与葡萄淄晶质的优劣有很大关系，它调节著酸碱的平衡， 影响葡萄酒的口味及生物稳定性。而襁国内一些葡萄酒产区，由于成熟期多雨和平均 气温低等不嵌条件均会引起葡萄中过多有机酸i 】，从而使葡萄酒有酸涩感，酒眯粮硬品 爱下降，凝爨洚羝滔中夔鸯爨酸，一煮蔻簸滔瑟嚣】礤究豹课题驻- 3 1 。 近年来，葡萄酒研究者们把目标移向能分解苹聚酸的裂殖酵母e ”，但是，葡萄滔是非 纯种发酵，裂殖酵母因发酵速度慢，易被其它酵母所抑制，且此酵母发酵口味不佳嘲， 因此采用它发酵生产葡獭酒是不现实嬲。 蘸莓浮簿每其毒受黟豹发酵往憝，毽分簿苹莱羧能力差；麓苹装酸裂夔辩母其套 极强的降解苹果酸能力，但发酵性能极羞，采用原生质体融合的目的正是将这= 亲本 的优良性状融于一株菌中。本研究较传统的化学降酸法及物理降酸法相比有较突出的 优点：融合选育出豹葡麓滔酵母安全性能较好，具有较强的稳定性，可与常髑的苞萄 滔酵母送行翔簿的管理。发酵工艺麓本上不需改变，不需要添热设备，操撵与传统 方法相似。在发酵中只需加入融合菌株一种菌，与生物降酸相比，菌种单一，易于管 理，且操作简单稳定。用融合后选育出的优良的葡萄酒酵母进行生产，能保证产品 的日昧好，溜感稳定。 1 1 葡萄酒的国内外研究现状 i 1 ，i 葡萄、葡萄酒中的寿机酸及发酵过程中的变化 表t 葡萄汁中主要有机酸类 从表l 可期，蓠萄汀巍身含毒3 秘主要酶有辊黢，帮苹采酸、灌石酸、柠檬羧， 还含有微墩的乙酸、抗坏皿酸、琥珀酸、葡萄糖酸、n 一酮戊二酸、丙酮酸等。其中 苹果酸和淄石酸等含量占9 0 以上。酸度较高、未成熟或质次的葡萄，其葡萄 污毙农业大学硕士学位论文 汁含酸烫高a 例如蔗常年份龙酿葡萄汁中含酸1 1 一1 2 9 l 一，其i 华酵液为9 - 1l g l l 1 ， 而成品澜的国标为不高于7 9 i 。1 9 1 。因此，葡蠲酒降酸一直燧葡萄酒工作者的研究课 题。 1 1 2 发酵过程中的苹果酸的登纯 同样作为葡萄汁巾的主要有机酸，苹果酸不同之处在于既可被酵母代谢，又可被合 残。大多数参与葡凌溪夔造豹酵蹲赘其毒不嗣疆度分磐钱滋孳栗酸戆能力，毽还没套 报道说酶解苹果酸越过4 5 的，只有粟酒裂精酵母能穆苹果酸完全分解为乙醇和 c 0 2 【1 0 l 。 。3 姆绫豹降酸秀法 ( 1 ) 化学降酸法 a 酒石沉淀法 溪磊浚淀法瑟在壤莓乐潘孛添宓囊溪石鑫耱，经冷臻镬淄石酸敷滔石澎式浣淀过滤 除去，从两降低总酸。该法的缺点憝需大量的淄石酸钾，耗用我源大，生产成本赢，而且酸 度高的葡萄汁中苹果敞的比例较大，这种方法只能降低酒石酸含量，降酸效果不明显， 而且警聚酸酸味突出，影响酒的整体品质，并容易招致细菌感染，出现生物性浑浊或沉 淀1 1 】l 。 b 离了交换法 除上述添山u 酒石酸氢钾外，离子交换法是将葡萄汁或钧钧原酒流经离子交换树脂， 除去多余的有机酸。低糖高酸的葡萄汁经处理后，口感柔和鼹藩味少、无努味，成为甜 酸逶蹙、营莠赞毽意豹莓莺泞，豫霹黢造孛蕺毯蘩莓溪努，述露捧为一耱缀磐戆篱莓饮 料。用离子交换法处理的葡萄原淄，风味能接近长城干白，并抑制了金属离子引起的破 败病，洒石酸盐类减少，提高了酒的稳定性。此方法降酸速度快，效果好威本低，具有鼠 好的应用价值，但挝鼹在吸附有枫羧的同时也易吸附葡萄酒中的香味物瑷，在一定程 度土影响了蔫萄溪淫瓣西辣。 ( 2 ) 擞物降酸法 a 苹果酸一乳酸发酵 该方法是由足球壤、巍枵萤、暇事珠菌等乳陵墓所弓 起的二次发酵。在酒精发酵 完成瑶，鸯弱入弓| 起上述反应熊乳酸缀菌培养滚或活性子乳酸麓，使萁发生擎采酸巍酸 发酵。冀优点是降低总酸，增加葡麴酒稳定性，但若控制不当易产生双乙酞簿物质 1 2 - 1 3 】， 给酒带来不良气味。盥不易控制，蒋污染了乳酸腐败菌，对洒质有毁灭性的影响。 b 苹果羧一乙醇发酵 裂麓酵母在厌氧条件下分解苹果酸生成乙醇和二氧仡酸，即苹采酸乙醇发酵。该 酵母有较强的耐二氧化硫的性能，但繁殖与发酵速度较慢，因此在发酵中常被葡萄酒酵 母所取代和抑制，而且对葡萄酒的口味有一定的影响。为了解决上述矛盾曾进行过如 下磷究。走降酸嚣笈簿法：帮接耱裂殪酵母，傻麓莓泞发酵黪羧l - 2 天麓分离狳去蘩 2 原生质体融合构建苹果黢商降解活性的葡萄酒酵母 俸。先发簿瑶簿酸法：鞠先瘸莓鹫涨辩母发酵蘩簿汁至发酵痿鹚，再大量添鞠零先麓 养好的裂殖酵母的洗涤麓进行降酸，并使之最终成灏。实际操作工艺较难控制。有人 还将裂殖酵母固定于海藻酸钙凝胶上制成固定化细胞来降低葡萄酒中过量的酸。以上 这些方法由予操 乍翅题，只箨蟹在实验除段，至今未熙厂家应赐。 1 2 酵母荫育种方法 。2 1 索援秀法弯耪 常规方法育种是以自然突变为基础，从中筛选出具有优良性状菌株的一种育种方 法一般情况下，由于d n a 的半保留复制以及校正酶系的校正作用和光修复、切除 掺复、重组修复、诱导掺笈等终舅l ，发生鑫然突变黔尼率特别低，一毅为1 0 。6 l o 。1 0 ， 而且蔫于工妲生产的菌株的性状往谯国单一或少数基因控制，所以自然育幂审时闻较 长，工作量较大。 1 。2 。2 基因量程弯秘 基因工程也叫重组d n a 技术，就愚从生物体内提取出一定的遗传物质d n a 或人 工合成d n a 。把它和作为裁体的质粒或噬菌体在体外重组，然后掰转入到另一物体内， 以达至g 遗赞甥矮重瑟组合的强甄双纛激变生物的遗传性装。 基因工程育种具有定国性，僵是外源基因的表达对酵母的酿造特性产生的澎噙以 及外源基因的安全性一崴是没有被确认，另外操作方法也较为复杂，限制了馨因工程 育种的广泛成用。 2 3 诱蜜育种 1 9 2 7 年m i l l e r 发现x 射线能诱发果蝇基因突变之后人们发现其他一然因素也 越诱导基因突变，著逐澎舜渍了一些诱变溷素憨枫联，为工业微生貔诱交育秘提供了 瀚提条俸。投据育种需要，有目的遣侵媚诱交因素，可使菌株的基因发生突变敷改楚 箕生产性状。 使用物璞和化学的方法处理微生物一直是选育高产优质菌株的一种行之有效的 经典方法。物淫方法蟊紫岁 诱变、6 0 c o , , n , 翦、愆魁线、y2 象线莰中_ 予等，紫努线是 常用的物璎诱变因子，怒诱发微生物突变的一种菲常有用的工疑。紫外线眈较有效、 适用、安全，其他几种射线都是电离蚀质的，具有穿透力，使用时有一定的危险性。 对于紫外线的干乍用已。有多种解释，但研究的比较清楚的一个作用是使d n a ；- ) 子 形残邃蓰二聚俸，辈嚣令糕邻静篷蕤蔌徐连接| 1 4 - 1 5 1 。二聚终密璃会减弱双键羯氢键 的作用，并引起双链结构搬曲变形，阻碍碱基间的厩常配对，从黼有可能引怒突变或 死亡二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响dna 的复制和转录紫外辐射 可以弓i 起转换、颠换、移粥突变或缺失等 1 6 - r q 。紫外诱变已经成为获得新的优良突 3 溽i 农监大学颈学位论文 变种的种非常有效的途径。但诱变存在不定向性，诱变之艨的筛菌过程较为繁琐， 且某一菌种经长期诱变后会出现产摄上升缓慢的现象【1 8 】。 2 4 鞭生蒺薅惑含裔秘 基予以上研究，随着原生质体融合技术的发展，人们开始采用原生质体融合技术 等基因羹缀技术来获褥优良酿酒酵母1 1 9 。埘。在我国也已有了不少成功的侧予【2 3 - 2 刖。 基本方法：程爨笈酵蠖戆努鹣、饶蹇戆蘩麓溪酵母与遥育密豹簿酸筑力强、发酵 性能好的裂殖酵母相融合，先将两个亲株的细胞爨分别通过酶解作用加以剿除，然后将 两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚己二醇助融，通过细胞融合，发生两套基 因维之间的接触、交换和重组，在褥生细胞中获褥融合子。通过发酵作用，筛选出降酸 能力强、发簿往好鹣葡萄滔酵撵麓于生产。愆这释方法，发酵工艺不需臻进孪亍改变， 也不会改变葡萄酒的风味。 原生质体融合育种具有以下特点眇”j ： ( 1 ) 重缝频率铰楚；( 2 ) 受接台型或熬蠢溅的限制较小；( 3 ) 有助予岁 澡基因 静转讫；( 4 ) 原生硬体融合技术其有诲多索矮杂交方法无法魄叛豹独到之处7 由予去 除了细胞壁，原生质体膜易于融合，即使没有接含、转化和转导等遗传系统，墩能发生基 因组的融合重组；( 5 ) 融合没有极性，相互融合的是整个胞质与细胞核，使遗传物质的 传递更为完善；( 6 ) 存在羞秀檬激上亲拣舞辩参与聚合并形藏鼓合予懿霹熊剐；( 7 ) 较易打破分类界限，实现种闻或受远缘的基因交流；( 8 ) 同基闲工程方法桐比，不必对 试验菌株进行详细的遗传学研究，也0 i 需要高精尖的仪器设备朔昂贵的材料费用等，由 于以上优点，迄今，这项技术不仅程蕊础研究方面，而且在实际应用上，均取得了引人注 嚣豹戒续蘧羞生物学磺究手段懿不断型藜【”。3 l ，该技术熬基本实验方法逐步完善。 多年来，该技术程工业微生物侉种中，特剐怒在酵母菌菌种选育方面1 溆用极为广 泛，并以获得许多有意义的菌种p 4 0 8 1 。 2 ，5 琢生蒺薅囊台狻零用于蘩麓漂罄酸戆鏊凌， 聚突送袋 微生物原生质体融合作为一种新的基因重组手段是在1 9 7 8 年第二届微生物遗传 讨论会上提出来的，这种方法与以往一些经典的肖秘方法相比，具有杂交频率高，受接 合鍪或致鸯淫戆限锻少，遗筵浆壤豹传递更力竞罄，据裹产量漤力大等饶点，宠黢了鞋 前育种方法的盲目性朔限翩性，一潋被延用至今。1 9 7 9 年，s i p i c z k i 和f e r e n c z y 首先将以 p e g ( 聚乙二醇) 为促融剂的原生膜体融合技术，成功地应用于酵母原生质体融合，将 酿酒酵母与粟酒裂殖酵母相融合 3 9 1 。美国j u a n 等人用粟酒裂殖酵母与酿灏酵母握融 合，成功德逸襄窭了一撩敲台予j 霹l 予薅莓滔夔发辩稆拜酸，缓融合率鞍 羲，熬辫酸旗菠 不明显l 删。 在国内，也相继脊人做过融合降酸的试验，但对苹果酸的县体降解程度始终未见 报道。 4 原生质体融合构建苹果酸高降解活性的葡萄酒酵母 1 。3 本论文硬突嚣豹意义 本论文的研究目的是构建一株降解苹果酸能力强的葡萄潲酵母，使之在发酵产生 酒精的同时，又能分解苹果酸。勰决我国北方地区葡萄汁含酸攫嘉的问题；为葡萄酒 瓣生穆醛羧撵供赣豹纛貉，鼠瑟麓绽蘩莓溪匏熬遗工艺，菠攀一蘩栋应矮予甏萄溪酿 造工业成为可能；使葡萄酒的微生物降酸技术朝潜更可控、翁操作的方向发展。 创新点：采用双灭活法进行原生雁体属问融合，构建降解苹果酸强的葡萄酒酵母， 著精确测定苹果酸的其体降解程度。 1 4 本论文研究内容 ( 1 磺究菌龄、酶瓣湿度、酶解封闻、酶浓发( 酶系统) 遥个单困素瓣餐萄滔 酵母暇生质体形成率和再生率鹃影响，确定藤生质体形成潮秀圭鲍最德条俘； ( 2 ) 选择适宜紫外照射时间谶行紫外致死，以期获得裂殖酵母原生威体的最佳 致死剂量。 ( 3 选择适宜热灭活拜雪闼遴行热致死，以瓣获褥酿酒酵琢豹最佳热致筏对运及 温度。 ( 4 ) 对融合菌株遗传稳定性进行研究，然后研究该菌株的各种生理生化特性。 ( 5 ) 对该菌株刹用葡萄汁发酵难产酒精的发酵工艺条件进行优化，以确定发酵 豹透寰条搏，麸嚣孬经该酵母可旋翅子工业纯发黪皇产甍甍瀵。 5 河北农业大学硕士学位论文 2 1 实验材料 2 1 1 出发菌株 2 材料与方法 葡萄酒酵母c ，( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ：长城葡萄酒有限公司提供的法国干酵母。 解苹果酸裂殖酵母m ，( s c h z o s a c d c h a r o m y c e sm a l i d e v o r a n s ) ：购自中科院菌种保藏中心， 菌号2 1 6 2 1 2 1 2 培养基 y p d 液体培养基：蛋白胨2 0 9 葡萄糖2 0 9酵母膏1 呛蒸馏水定容至 1 0 0 0 m l ，1 1 5 。c 灭菌3 0 m i n 。 y p d 固体培养基：蛋白胨2 0 9 葡萄糖2 0 9酵母膏1 0 9琼脂2 0 9 ，蒸馏水 定容至1 0 0 0 m l ，1 1 5 灭菌3 0 m i n 。 原生质体再生完全培养基( h y p d ) ：在y p d 固体中添加k c l 至0 7 m 0 1 l 1 ， 1 1 5 灭菌3 0 m i n 。 y n b 培养基配制见文献 4 0 1 。 降解苹果酸指示培养基：y n b 培养基2 m l l 4 “，y p d 3 m l ，n h 4 s 0 40 5 9 ，苹果酸 0 3 9 ，葡萄糖2 9 ，琼脂2 9 ，溴酚兰指示剂l m l ，蒸馏水定容至1 0 0 m l ，1 1 5 。c , 灭菌3 0 m i n 。 2 1 3 其它试剂及原料 ( 1 ) k c l 高渗缓冲液：p h 6 8 的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液添加k c l 至o 7 m 0 1 l - 1 。 ( 2 ) 促融剂：聚乙二醇( 6 0 0 0 ) 4 0 克加入至1 0 0 毫升p b 溶液中，使氯化钙为0 4 m o ll - 1 ( 3 ) 8 一巯基乙醇购自s i g m a 公司。蒸馏水稀释，浓度0 2 ，微孔滤膜过滤除菌。 ( 4 ) 蜗牛酶：购自北京经科有限公司，2 0 的蜗牛酶溶于高渗缓冲液中，0 2 2 pm 膜过滤除 ( 5 ) 小牛胸腺d n a 购自s i g m a 公司。 2 1 4 主要仪器设备 l r h 一2 5 0 a 型生化培养箱，广东省医疗器械厂； d l - c j 2 n 医用型超净工作台，哈尔滨东联电子技术开发公司； y x q s g 4 6 2 8 0 s 不锈钢手提压力灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂； h z q q x 全温震荡器，哈尔滨东联电子技术开发公司； 6 原生质体融合构建苹果酸高降解活性的葡萄酒酵母 p h h j 0 1 3 麓龌诗，j l 索海淀魏天诗葬蕊公霭； 7 5 6 b 型分光光度计，上海第三分析仪器厂； o m p 2 0 0 a 趔分析天平，上海第二天平仪器厂； o l y m u p u s 显微镜，o l y m u p u sc o ，l t d ： m o t i c - a e 3 1 显徽摄影蠲翻重显徽镜，m o t i cc h i n ag r o u pc o 。l t d ； b i o r a d f o c u s 3 0 0 0 型高效毛细管电泳仪，美国伯琢公司； 酒精蒸馏设备、酒精比遵计、w t o 一8 0 型手持折光仪等。 2 。2 方法 2 2 。1 亲本单倍体的分离羊日验证 将活化二代的亲本葡萄酒酵母c l 出发株分剐转揍于产孢臻养基上，2 8 。c 培养7 1 0 d ，离心收焦菌体，洗涤悬浮后加2 蜗牛酶，3 7 。c 酶解4 h ，经1 0 倍稀释后再置于7 0 保 温1 0 r a i n ，离t l , 毒悬浮后，以玻璃珠用力摇振1 0 m i n 。将已基本分散的孢子悬液邋当稀释， 涂予y p d 乎登上，2 8 ( 2 壤莠7 d ，鼠乎聪上魏取夺蘸藩，移至y p d 籀嚣主。籍该楚莠努嚣 菌株再转拨至产孢培养藻上，培养3 7d ，染色镜检证明不产生予囊孢予，即为单倍体 细胞【4 ”。阏裂殖酵母为单倍体营养细胞，故不需分离其单倍体。 2 2 2 露生簇嚣的割备 将上述两个单倍体细胞亲株分别经y p d 斜面两次活化，从活化好的菌种斜面上 分剐取一环接秽于1 0 0 m 拼p d 液体蛾养基上2 8 ，1 4 0 r m i n 撼床培养1 2 1 6 h ，收集 对鼗生长麓缁瞧，吾取1 0 m l 魏入离心管中3 5 0 0 r r a i n 离心5 m i n ，蠲磷酸麓缓冲溶滚 洗涤两次，加入0 2 f j + 巯基乙醇溶液，2 8 静澄处理1 0 m i n ，用高渗缓冲液洗涤三 次，离心奔去上清液，c 】菌加入1 5 的蜗牛酶液1 0 m l ；m l 菌加入1 5 的蜗牛酶和 o f 5 豹纾壤豢薅豹混合液1 0 m l ，3 0 求漆，每骤0 。5 h 镜捡双察，特视野孛9 0 以上 为原玺质体对，2 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，耀高渗p b 缓滓液洗涤鼹次，离心收集原生质 体1 4 2 - 4 6 。 2 ，2 。3 原擞矮体形成率张霉生率测定 将制铸的原生质体经适当稀释厩涂布于普通y p d 和高渗y p d 平板，同时将未去壁 菌体溶液按同一稀释皮，同一接种量涂布于普通y p d 平板上，2 8 。c 培养3 d 厝计菌落 数，褥出蘩据靛器生矮体形残率与髯艇率i 4 ”o l 计算公式：形成率( ) = ( a - b ) a 1 0 潞 再生率( ) = ( c b ) ( a b ) 1 0 0 注： a 为酶解前黼体稀释液在磐通y p d 培养基上的菌落数 了 河北农业大学硕士学位论文 b 为原生质体稀释液在普通y p d 培养基上长出的菌落数 c 为原生质体稀释液在高渗y p d 培养基上长出的菌落数 2 2 4 单因素对原生质体形成和再生的影响 对菌龄、酶浓度、酶解时间、酶解温度、四个因素分别进行单因素试验，固定其 他三个因素，观察单个因素对原生质体形成与再生的影响。 ( 1 ) 菌龄对原生质体形成与再生的影响： 活化菌种接种y p d 液体培养基后分别培养6 h 、1 2 h 、2 4 h 、3 6 h 、4 8 h ，2 的蜗牛 酶液3 0 c 酶解2 h ，采用k c l 高渗缓冲液，再生平板培养基采用i i y p d ，计算原生质体 形成率与再生率。 ( 2 ) 酶解时问对原生质体形成与再生的影响： 活化菌种接种y p d 液体培养基后培养1 2 1 4 h ，分别采用2 的蜗牛酶液3 0 。c 酶 解0 5 h 、1 o h 、1 5 h 、2 o h 、2 5 h ，采用k c l 高渗缓冲液，再生平板培养基采用h y p d ， 计算原生质体形成率与再生率。 ( 3 ) 酶浓度对原生质体形成与再生的影响： 活化菌种接种y p d 液体培养基后培养1 2 1 4 h ，分别采用0 5 、1 0 、1 5 、 2 0 、2 5 的蜗牛酶液3 0 酶解2 h ，采用k c l 高渗缓冲液，再生平板培养基采用 h y p d ，计算原生质体形成率与再生率。 ( 4 ) 酶解温度对原生质体形成与再生的影响： 活化菌种接种y p d 液体培养基后培养1 2 14 h ，分别采用2 的蜗牛酶液或不 同浓度酶系统酶解2 o h ，温度梯度为：2 4 。c 、2 6 c 、2 8 。c 、3 0 。c 、3 2 。c 、3 4 。c ，采 用k c l 高渗缓冲液，再生平板培养基采用h y p d ，计算原生质体形成率与再生率。 2 25 正交试验 为观察菌龄、酶浓度( 酶系统) 、酶解时间、酶解温度、稳渗剂五因素对c 。和m 。 原生质体形成率与再生率的协同影响，以确定菌体的最佳去壁与再生条件，试验采用 正交设计，通过预试验和举因素试验，确定正交试验的各因素水平。本试验设( a ) 、 酶浓度或酶系统、( b ) 酶解作用时问( c ) 、酶解温度( d ) 和稳渗剂( e ) 五个因素， 每个因素设4 个水平，进行原生质体去壁再生，寻找原生质体去壁再生的最佳工艺条 件。试验用l 1 6 ( 4 ) 3 正交表安排设计。对融合实验设p e g ( a ) 、处理温度( b ) 、处理时 间( c ) 、p h 值( d ) 四个因素，每个因素设3 个水平，进行融合最佳工艺条件的选择。 试验选用l q ( 3 ) 正交表1 5 1 j 。试验因素水平对照表如表2 4 。 厦生威体融合构建苹果酸高降解滔性的葡萄酒酵母 注：b i ；1 2 蜗牛酶+ o 8 纤维索酶 b 2 ：1 。珊蜗牛酶+ o5 纤维素薜；b 3 ：1 8 蜗牛酶+ 02 纤维素酶ib 4 ：1 嘲牛酾+ 0 5 纤维素 骜；b 采2 蝇簪穗 表4 原生胰体融台的因子水平对照表 2 2 。6 髹艇蒺体灭活及灭活时溺的选择 各取原生质体悬液5 m l ，将c 。原生质体置7 0 水浴中灭活不同时间，将m 。原生质 体用u v 灯( 3 0 w ，垂直距离2 0 c m ) 灭活不同时间，取出后再稀释至1 0 。，1 0 ，1 0 4 倍， 颓注于h y p d 乎扳，绘铡致死蘧线，确定灭活熬遮寰条枣 。 2 2 7 原生质体融合 分裂取适宜条终下灭活的c ，原生矮体悬浮液、壤原生质体悬浮滚各5 m l ，等量混 合，离心去上清，麓入1 0 m l 3 5 麴p e g 嵩渗缓狰液，3 0 c 保溢3 0 m i n ，镜裣并戏察融合 情况，融合后稀释成1 0 ，1 0 2 ，1 0 。后分别涂布l t y p d 平板。2 8 c 培养3 天，待融合 子长出后计算融合率。融合率( ) = d c - b 1 0 0 ，其中d 为原生质体融合液稀释后在 翥渗y p d 培券基上长爨戆蓥落数，转灏c 羁蓑。 聱 河北农业大学硕士学位论文 2 2 8 融合子的筛选 初筛分两步进行： ( 1 ) 以降苹果酸性能为指标进行筛选：待h y p d 培养基长出菌落后，在其上倾倒一层降 解苹果酸鉴定培养基，根据菌落蓝色的深浅进行筛选 ( 2 ) 以发酵能力为指标进行筛选：选出蓝色较深的菌落，再用杜氏小管法进行发酵，根据 其产气量进行筛选 2 2 9 融合子的鉴定 将初筛所得到的融合子连续传代1 5 次，选择无性状分离者，进行细胞体积及d n a 含量的测定。 细胞体积的测定：用显微测微尺测量细胞的长轴( a ) 、短轴( b ) ，按公式：v = 4 3 n a 2 x ( b 2 ) 2 计算。 细胞d n a 含量的测定：采用文献 5 2 的方法，用0 5 m 0 1 l - 1 的高氯酸分别提取 双亲株与融合子的d n a 。再用二苯胺法f 5 3 l ，在l m l 的d n a 抽提液中加入2 5 m l 的 新鲜二苯胺试剂，3 0 。c 下密闭放置1 6 2 0 h ，然后用7 5 2 可见光分光光度计在6 0 0 nm 的 波长下测其o d 值，并用小牛胸腺d n a 测得的标准曲线，计算其d n a 含量，同时测定所 提取酵母菌的细胞数，计算出每个细胞d n a 含量的近似值。求出三次测定结果的平均 值。 2 2 1 0 融合子与亲本降解苹果酸能力的比较 采用毛细管电泳法进行测定