（微生物学专业论文）不同通风模式下室内空气中病毒扩散规律研究.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 中文摘要 随着经济发展，室内生物污染日益成为一个严重的公众健康问题，室内污染引 发的病毒感染呈显著上升趋势。为了给设计建造健康建筑提供理论依据，对3 0 立 方米可控通风生物学实验舱中不同通风模式下室内空气中病毒分布规律进行了研 究。 在本研究中，采用以大肠杆菌为宿主的t 1 噬菌体作为模式病毒。首先测定了 t 1 噬菌体宿主大肠杆菌的一步生长曲线。此外还检测了不同保藏条件下t l 噬菌体 效价的变化和紫外线对噬菌体的灭火作用。t 1 噬菌体形成气溶胶并由气溶胶发生器 发射出来，采用了自然沉降法采样对空气中病毒进行计数。3 0 立方米可控通风生物 学实验舱中的病毒分布在四种模式下进行了计数：无通风模式，上进下排斜向通风， 下进一上排斜向通风，上下进上下排对流通风。 大肠杆菌的一步生长曲线说明了在1 至4 小时达到对数生长期。合适的噬菌体 保藏条件是添加等体积甘油保存于2 0 c 。紫外灭菌3 0 分钟可以完全杀灭t 1 噬菌 体。 与无通风状态相比，上进下排对流通风、下进上排对流通风和上门；进上下排 对流通风都加速了病毒在室内空气中的扩散。室内空气中病毒在上下进上下排对 流通风模式下扩散速度最快，其次是在下进上排对流通风模式下，最慢的是在上进 下排对流通风模式下。 关键词：室内空气；通风模式；病毒；扩散规律 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s a b s t r a c t a sd e v e l o p m e n to fs o c i a le c o n o m i c s ，i n d o o r - a i rb i o l o g i c a lp o l l u t i o nh a sb e c o m e m o r ea n dm o r es e r i o u sp u b l i ch e a l t hp r o b l e m ，a ni n c r e a s i n g l yn u m b e ro fc a s e so fv i r a l i n f e c t i o nc a u s e db yi n d o o r - a i rp o l l u t i o nw e r er e p o r t e d i no r d e rt op r o v i d i n gs c i e n t i f i c e v i d e n c ef o rd e s i g n i n gh e a l t h yb u i l d i n g , t h ed i s p e r s i o nd i s c i p l i n eo fv i r u si ni n d o o r - a i ra t d i f f e r e n tv e n t i l a t i o nm o d ew e r es t u d i e di n3 0c u b i cm e t e r sc o n t r o l l a b l ev e n t i l a t e d b i o l o g i c a lc a b i n t1 b a c t e r i o p h a g eo fe s c h e r i c h i ac o l iw a su s e da sa v i r u sm o d e li nt h es t u d y o n e s t 印g r o w t hc u r v eo f 西幽洲幽ac o i l ：t h eh o s to ft 1p h a g ew a sm e a s u r e d t h e f l u c t u a t i o no ft 1p h a g et i t i e ru n d e rd i f f e r e n ts t o r ec o n d i t i o n sa n di n a c t i v a t i o nt i m eo ft h e u l t r a v i o l e tr a d i a t i o nt 0t 1p h a g ew e r ed e t e c t e d s e d i m e n t a t i o nm e t h o dw a su s e da s s a m p l i n gm e t h o d sf o rq u a n t i t a t i n gt h en u m b e ro fv i r u si ni n d o o ra i r t h ed i s t r i b u t i o na n d d i s p e r s i o no fv i r u s e si ni n d o o ra i rw e r eq u a n t i t a t e di n3 0c u b i cm e t e r sc o n t r o l l a b l e v e n t i l a t e db i o l o g i c a lc a b i na t4v e n t i l a t i o nm o d e ：n ov e n t i l a t i o n , u p i n l e t & d o w n o u t l e t c o u n t e r c u r r e n t v e n t i l a c i o n ，d o w n - i n l e t & u p o u t l e t c o u n t e r c u r r e n tv e n t i l a t i o n , a n d u p d o w n i n l e t & u p d o w n - o u t l e tc o t m t e r c u r r e n tv e n t i l a t i o n o n es t e pg r o w t hc u r v eh a sd e m o n s t r a t e dt h a tt h el o g a r i t h mp e r i o do fe s c h e n c h i a c o l ig r o w t hi sb e t w e e n1a n d4h o u r s t h et1 p h a g ea d d e de q u a lv o l u m eg l y c e r o ls t o r e d a t - 2 0 c a nk e 印i t st i t e rw i t h o u ta n yf l u c t u a t i o n 1 1 l eu l t r a v i o l e tr a d i a t i o n3 0m i n u t e s c a ni n a c t i v a t et 1p h a g ec o m p l e t e l y c o m p a r e dw i t hn ov e n t i l a t i o n , u p i n l e t & d o w n - o u t l e tc o u n t e r c u r r e n tv e n t i l a t i o n d o w n - i n l e t & u p - o u t l e tc o u n t e r c u r r e n tv e n t i l a t i o n , a n du p d o w n i 1 1 1 e t & u p d o w n 。o u t l e t c o u n t e r c u r r e n tv e n t i l a t i o na l l s p e e d e du pd i s p e r s i o no fv i r u s e si ni n d o o ra i r t 1 1 e d i s p e r s i o ns p e e do fv i r u s e si ni n d o o ra i ri sh i g h e s ta tu p d o w n i n l e t & u p d o w n - o u t l e t c o u n t e r c u r r e n tv e n t i l a t i o n , a n ds e c o n di sa td o w n - i n l e t & u p o u t l e tc o u n t e r c u r r e n t v e n t i l a t i o n ，l o w e s ti sa tu p - i n l e t & d o w n o u t l e tc o u n t e r c u r r e n tv e n t i l a t i o n k e yw o r d s ：i n d o o r - a i r ；v i r u s e s ；v e n t i l a t i o nm o d e ；d i s c i p l i n eo fd i s p e r s i o n i i 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：瞄 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同意华中 师范大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 储签名：石觅孙签名：物5 陟5 y 允许北京万方数据电子出版社出版的中国学位论文全文数据库将本人论文 以电子、网络、镜像及其他数字媒体形式公开出版。 作者签名：痊落 7 一。1 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程7 ，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库 中全文发布，并商按“章程中的 规定享受相关权益。回重途塞堡童卮溢卮! 旦坐生；旦二生；塑三生筮查! 作者签名：乃0 毒t f 日期：1 口l 口年占月f 口日 导师签名： 4 为组久 日期：沙加年厶月9 日 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 第一章室内空气病毒污染及扩散规律研究进展 现代社会中，每个人平均每天约有8 0 的时间在建筑内度过，故建筑室内污染 对人体的健康有着很大的影响。建筑是传染病病原滋生、传播的重要场所，其卫生 安全已经受到生物污染的严重威胁，因此越来越受到不同学科的关注。建筑空气微 生物可能来源于病人、建筑本身( 比如被污染的建筑原料) 或者故意释放( 如恐怖 袭击) 【1 。2 】。1 9 7 6 年，美国费城就曾发生过“军团菌”事件【3 】，这一事件是开会时 与会者中1 8 2 人突然生病，周围居民也有2 0 0 与人发病，调查发现病因是空调系统中 滋生的一种革兰氏阴性菌，通过通风系统进入室内空气中引起疾病。2 0 0 3 年严重急 性呼吸综合症( s e v e r e a c u t e r e s p i r a t o r y s y n d r o m e ，s a r s ) 更对整个世界产生了严 重影响，特别是2 0 0 3 年3 月1 4 日至4 月1 5 日短短一个月内，在香港淘大花园发生的 s a r s 病毒以气溶胶形式穿过污水管、排风、天井和窗口连成的空气通道造成3 2 1 人 集中感染事件【4 】。以上两个案例都是细菌、病毒通过通风系统进入室内空气，进而 在传播过程中感染大量居民，造成严重的后果。生物污染对健康的影响包括传染病、 过敏性疾病和致癌致突变等方面【5 9 】。因此室内生物污染以及对人群健康的影响，尤 其是建筑室内空气中病毒污染和扩散规律的研究得到了极大的关注。 1 室内空气中病毒污染状况及其危害 室内生物气溶胶包括细菌、病毒、真菌、生物有机体等几大类，主要通过呼吸 道吸入、与皮肤接触、消化道摄入等方式进入人体，损害易感人群的身体健康。国 内外对于空气中微生物的研究主要涉及细菌和真菌，对病毒的研究并不多。 k a s z n i a - k o c o t 检测了两个哮喘和过敏性鼻炎患病儿童的房间内细菌和真菌数量，发 现这一数量远远高于正常值，这两名儿童在换到清洁房间后，病情明显得到控制【1 1 1 。 调查问卷显示，北美2 7 3 6 的室内建筑材料受到真菌污染，英国1 7 4 6 的室 内建筑材料受到真菌污染，芬兰1 5 的室内建筑材料受到真菌污染【1 2 1 。室内空气尘 埃携带真菌数量在1 0 2 1 0 7 c f u g 范围内。美国卫生学家协会提出，某种真菌浓度高 于5 0 0 c f u m 3 时，建筑内可能形成污染源。刘红梅等发现银川市娱乐场所细菌总数 超标，营业高峰期间细菌总数还有大幅增加的趋势【l3 1 。学校人口密度高，也是容易 滋生微生物的场所，司东霞等通过自然沉降法评估了聊城大学室内空气细菌和霉菌 含量，均处于正常水平【1 4 】；而邵志军等检测了黑龙江某高校，9 0 的场所细菌和霉 菌数量超树1 5 】。家庭居住空间对每个人而言都是重要的场所，然而家庭房间内也有 不同程度的细菌和霉菌污染状况。调查结果表明，夏季唐山市家庭房间内细菌数量 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 超标，尤其卫生间更是严重超标【l 6 。 室内空气污染中主要的一类是病毒。室内空气中病毒来源多样，有的来自室外， 附着在尘埃上随空气进入室内【4 5 】；有的会以建筑材料为媒介传播，尤其是湿度较高 或很难清洁的死角；有的会滋生在空调、通风系统中，随送风气流进入室内；有的 来源于传染病人或病毒携带者，人在打喷嚏、咳嗽时这些病毒就会以飞沫的形式在 空气中传播，一些宠物也可能携带病毒。不同的环境会有不同的污染源，适宜的室 内条件会引起病毒的大量繁殖，从而加重污染。 室内病毒污染会对人的健康造成很大负面影响。首先，影响最严重的是传染病。 空气中的病毒进入人体的方式主要有如下几种：皮肤接触、呼吸道传播、粪口途径 等【l 7 1 ，从而引发接触性疾病、呼吸道疾病、过敏等不良反应【l 引。空气中病毒传播会 引发各种传染性疾病，比如s a r s 病毒引起严重急性呼吸道综合症，流感病毒引起 流行性感冒等等。1 9 8 2 年美国某医院爆发麻疹，是典型的有空气传播病毒引起的感 染。被传染的四名儿童中有三名并未与患病者直接接触，这说明患病儿童咳嗽或喷 嚏排出的病毒颗粒会通过空气传播疾病【l9 1 。其次，致癌与致突变。研究表明，室内 病毒污染可能导致上呼吸道癌，比如喉癌、鼻咽剖7 1 。w 醯d y 等研究表明，污染物 低于细胞毒性剂量是，能导致大鼠d n a 损伤【8 】。s o m e r s 等发现吸入空气污染物的 小鼠基因发生突变，间接地说明了空气中真菌有导致癌症的可能性【2 1 1 。 2 室内空气病毒污染控制 空气微生物除受到来源的影响，还受各种因素的影响。 ( 1 ) 空气温度和相对湿度：空气的温度和相对湿度是通过影响微生物的存活 与增殖从而影响微生物浓度的。一般来说，中等湿度( 4 0 6 0 ) 对于非致病细菌 具有更强的致死性【4 9 1 。含有较多脂质的病毒在相对湿度较低时存活率高，而含有较 少脂质或不含脂质的病毒在相对湿度较高时更稳定1 5 0 l 。实验表明，对于流感病毒而 言，相对湿度较低( 2 0 一3 5 ) 时病毒感染性最高，相对湿度较高( 8 0 9 0 ) 时 无感染性【5 1 挽】。而一定范围内温度越高，越利于微生物存活【5 3 侧。 ( 2 ) 光照。光照对空气微生物有杀灭作用。实验表明，光照对空气微生物杀 灭作用取决于以下因素：光强、光谱、微生物种类即微生物粒径【5 5 1 。 ( 3 ) 风速。风可以使微生物悬浮在空气中，风速越大空气微生物浓度越大【5 6 】； 风可以增加空气中大粒子的比例，随着空气微生物粒径增大，微生物浓度也不断增 大【5 7 1 。 c h e r t 通过应用数学模型( w e l l r i l e y 模型、竞争风险模型等) 说明了传统的 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 公众健康保护方法( 疫苗、隔离、避免与病人接触等) 不足以阻止现代社会中疾 病的爆发，而应该应用更先进的工程学技术与传统方法相结合娜】。这些工程学方 法主要有： 2 1 稀释 用清洁灭菌空气稀释室内空气是一种最简单、最常用的去除空气微生物并减小 其传播机率的方法。这种方法的缺陷主要有：受空气分布模式的影响，室内人员易 对热气流感觉不适。 2 2 过滤 研究表明，过滤可以有效防止外界的病原微生物通过通风系统进入建筑，因而 被广泛运用【5 9 1 。h e p a 过滤装置可以去除0 3 # m 或更大的粒子，即可以除去9 9 9 7 的粒子6 0 ，6 1 1 。此外还有酶联过滤装置，可以破坏微生物的细胞膜。但研究表明，酶 联过滤装置与普通过滤装置的效果无显著差异，因为酶联滤膜表面粘附的粒子会阻 碍更多的粒子与酶接触【6 2 1 。 2 - 3 紫外照射 紫外光是由低压汞蒸气弧灯发射的波长2 5 3 7 r i m 的光，紫外线可以破坏微生物 的d n a r n a ，使其进入宿主后无法增殖，从而降低其危害。紫外照射的效果由两 个因素决定：紫外光的强度和照射时n t 6 3 - 6 6 。研究表明，无细胞壁的微生物更容易 被杀灭，比如天花病毒、流感病毒、腺病犁6 7 】；而像炭疽杆菌的孢子这样有保护膜 的微生物则很难杀灭【6 引。空气的相对湿度过高会降低灭菌效果，因此室内相对湿度 应控制在5 0 左右，相对湿度高于7 5 时灭菌效果会显著下降【6 9 ，7 0 】。 2 4 光催化氧化( p h o t oc a t a l y s e do x i d a t i o n ，p c o ) 光催化作用是在催化剂( t i 0 2 ，w 0 3 ，z n s 等) 的作用下加快光反应的过程。 光催化氧化可以被荧光或小于3 8 7 5 n m 紫外线激活。能有效杀死大肠杆菌、绿脓 杆菌等细菌【7 1 , 7 2 】，并且在杀死细菌的同时还能够分解其产生的毒素，但是随着吸 附的微生物越来越多，紫外线的激活作用就会停止，改进方法是在t i 0 2 中添加a 矿 粒子【7 3 】。 2 5 干燥机旋转器 应用装有硅胶干燥机旋转器的减湿器是一种新方法，杀菌效率大约在9 4 以 上【7 4 】。这种方法还有待进一步研究。 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 2 6 纳米技术( 银纳米粒子) 有人提出了一种新方法，在空气中使用银纳米粒子来控制微生物的生存能力7 5 1 。 实验表明，将银纳米粒子与微生物气溶胶一起注射到小玻璃舱中，9 9 以上的微生 物失去活性。但这种方法还有待进一步研究，因为它对人的健康有何影响还不明确。 3 室内空气中病毒扩散规律研究现状 鉴于室内空气中病毒对人体健康的负面影响，很多学者研究了空气中病毒的扩 散规律。w e l l s 和s t o n e 通过提取房间内空气样品得出依靠空气传播的病原微生物主 要由飞沫产生、并通过气溶胶的形式传播的结论【2 2 1 。w e l l s 推测人呼出的气溶胶粒 径起初较大，但是当它们进入空气后便会在蒸发作用下迅速缩小【2 引，缩小的气溶胶 叫做液滴核，体积很小足以悬浮在空气中。后来l o u d o n 和r o b e r t s 通过检测人们打 喷嚏、咳嗽、大声说话时呼出物的粒径分布验证了w e l l s 的结论【2 4 】，d u g u i d 也报道 了人呼出气溶胶大小分布的详细信息【2 5 1 。d u g u i d 发现9 0 携带细菌的液滴核需要 3 0 6 0 分钟完全消失。许多疾病都可以通过空气途径传播，而且通风系统在气溶胶 的传播和稀释中起重要作用【2 6 2 引，从而稀释作用得到了广泛关注。许多流行病学研 究与通风稀释效应相结合，形成了不同的危险评估模型【2 9 1 ，比如常见的群体行动模 型和w e l l s - r i l e y 方程【3 0 川。与稀释作用相比，通风系统对于微生物气溶胶的分散效 应研究得相对较少，但是b l o c h 和l e c l a i r 在这方面做过一些尝试。运用烟雾或气溶 胶追踪粒子来显现气流模式，这种方法只能定性指示气流方向。微生物气溶胶的传 播机理尚不清楚，比如b e g g s 在他的文章中提出微生物气溶胶在疾病传染中的作用 尚不清楚【2 9 1 。随着2 0 0 3 年s a p s 的爆发和高等数学及更好的实验工具的应用，越 来越多的证据表明通风模式与病毒气溶胶的传染性相关。很多学者应用流体动力学 技术研究空气中污染物传播机理，他们得到的装载生物的气溶胶模拟分布模型与 2 0 0 3 年s a r s 爆发时香港病房里的传播模式十分匹配，还证明了装载生物的气溶胶 的分布模式会因房间内通风模式改变而改变【3 2 - 3 4 】。以上是诸多科学家对于室内空气 中微生物传播模型的一些研究和探索，对于进一步的研究起着重要作用。 4 室内空气污染研究中的病毒采样方法 4 1 自然沉降法 自然沉降法是由德国人柯赫( r o b e r tk o c h ) 建立起来的，这种方法是将含有特 定培养基的有盖平皿开启并暴露在空气中一段时间，使得空气中的微生物粒子在重 4 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 力的作用下逐步沉降到平皿中的培养基上，培养后可鉴定空气中微生物的性质【3 绷。 后来奥姆斯基对这种方法进行了修正，认为1 0 0 c m 2 琼脂平皿在5 m i n 内收集到的菌 落数相当于1 0 l 空气中的细菌数。然而，尽管空气中微生物的沉降量与实际浓度有 正向相关关系，但是微生物沉降量也与微生物粒子大小有关，因此这种换算并不 准确【3 6 1 ，故现在广泛使用统一评价单位p f u i r l l ( p l a q u ef o r m i n gu n i t ，p f u ) ，不再 使用空气中微生物数量与沉降量的换算关系【3 7 】。 自然沉降法的优点主要有：平皿价格便宜，使用方便。适用于空气微生物的定 性分析，可以用来分析空气中微生物的性质、组分等并确定空气质量。其缺点主要 有：可能会出现收集菌落过多或重叠等现象，难以计数【3 5 1 ；该方法具有局限性，只 能测定大颗粒，对于空气中悬浮时间长的小颗粒则较难测定；无法确定微生物数量 与空气沉降量的关系；空气中含有非生物，且微生物种类较多，可能交叉污染、相 互影响；采样结果易受气流影响网；培养基的长时间暴露可能会导致缩水等现象从 而影响实验结果【3 9 1 。 4 2 固体撞击式采样器 撞击式采样器的原理是利用抽气装置使空气及悬浮其中的微生物通过狭小喷 嘴( 即裂隙式采样器) 或多孔平板( 即筛网喷管式采样器) ，采样器中设置采集面， 一般为琼脂培养基，空气流向采集面后微生物被捕获。撞击式采样器适合于空气中 微生物的定量测定，简便易行。 4 2 1 筛网喷管式采样器 筛网喷管式采样器应用较早、较多，分为多级撞击型和单级撞击型。其中多级 撞击型较为著名的是安德森采样器，它的筛网是由几个带微孔的金属圆盘组成的， 盘下设置采样皿，圆盘的孔径是逐级递减的，因此不但能测量到微生物粒子的数量， 还能测量其粒径【加】。 安德森采样器的优点主要有：采样率高，大粒子与小粒子均可采集到；采样粒 径范围宽；不影响微生物活性；简便易行【加】。缺点主要有：微生物粒子可能在撞击 中发生误差；多级平板会产生粒子损失；采样皿固定不动，可能发生菌落重叠的现 象；需要的含培养基平皿数量较多，工作量大【加1 。 单级撞击型采样器有m a s l o o 型单级筛板式撞击采样器等。 4 2 2 裂隙式采样器 裂隙式采样器的采样盖上有裂隙分布，其原理为抽入的空气通过裂隙，空气中 的微生物被采样盖下的培养基平皿捕获。此类采样器主要有c a s e l l a 裂隙式采样器、 b o u r d i l l o n 裂隙式采样器等。 5 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 裂隙式采样器的优点主要有：采样体积可调整，采样率高；采样头为金属材质 且可拆卸，便于灭菌；采样时间可以定时预设；有的采样器中采样皿可以转动，从 而避免了微生物粒子的重叠；适用范围广。缺点主要有：采样皿使用时间过长会引 起培养基失水，影响测量的准确性；机身不可灭菌；采样过程中微生物受到的机械 应力过大，易失去活性【4 。 4 3 离心撞击式采样器 离心撞击式采样器的原理是利用气体旋转产生的离心力，是空气中微生物粒子 在惯性下碰撞沉积到采集面上。常见的有r c s 型( b i o t e s t 公司) 和l w c i 型。 离心撞击式采样器的优点：应用范围广；体积小重量轻，便于携带；噪音低， 便于使用。缺点有：对于粒径小的微生物采样率低：抽气时微生物易受损耗；采气 量不恒定且无法直接读取；采样器无法整体灭菌，仅采样条可以灭菌。 4 4 压缩气体采样器 压缩空气采样器的原理类似于撞击式空气采样器，最主要的区别在于带有减压 装置。大多采样器是先将压缩空气减压再常规采样，如a i r t r a c e 型( p m s 公司) 、 s m a c a 2 0 0 型( v m 公司) 。个别采样器先采集压缩空气至培养皿，而后逐步解压， 这样做的目的是防止压强突变对微生物的破坏，如m e r c k 公司的采样器。 4 5 半自动空气微生物采样系统 半自动空气微生物采样系统是将多个撞击式采样器的采样头固定，通过一台中 央控制电脑和无线网络技术将各个采样单元之间连接，从而可以自动在线监测空气 质量，主要用于洁净室区域【4 2 1 。优点在于避免了管线连接，从而避免了管线导致的 清洁死角和对气流的影响【4 3 1 。 4 6 液体撞击式采样器 液体撞击式采样器的原理是泵吸入的空气被抽向收集液体，空气中的微生物粒 子经撞击被收集到液体中，它与固体撞击式采样器不同之处在于使用液体作为采集 基质。 液体撞击式采样器的优点主要有：适于含有高浓度微生物空气的采样；样本能 用非常规培养的其他方法进行分析，如p c r 技术。缺点主要有：采样时微生物受到 冲击，容易影响活性；长时间采样可能会引起过度增殖；不宜低温采样；玻璃制品 携带不便m 】。传统液体撞击式采样器的采样管使用玻璃材质制成，具有局限性，新 型产品不再使用玻璃材质，使得使用范围更加广泛。如s a s p c r 型采样器( p b i 公 6 ： 一， 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 司) ，更新材质的同时，专为分子水平分析设计。 4 7 过滤式采样器 过滤式采样器的原理是使空气通过滤器，而微生物留在滤膜上，即用滤膜滤器 代替了传统培养基。被采样本可以通过p c r 、血球计数法、荧光显微镜等方法快速 分析【4 4 1 。滤膜通常材质可以是水不溶性的，如硝酸纤维素酯，也可以是水可溶性的， 如明胶。但是，过滤式采样器不如撞击式采样器使用方便，可能会引起微生物脱水 而失活，滤膜也易堵塞或被水破坏，难以保证采样质量。 4 8 静电沉着采样器 静电沉着采样器的原理是在高压静电场中，给空气中的微生物带上电荷，与带 相反电荷的采集面相吸引，从而达到微生物采样的目的。常见的有l v s 1 0 k 静电沉 着采样器。其优点有：捕获小粒子效率高；在空气中微生物浓度很低时依然有效【4 5 】； 采集空气容量大。缺点有：空气相对湿度高于8 5 时易发生漏电，影响采样效率； 放电过程中会产生臭氧、紫外线等，影响微生物的存活率；设备较大，结构复杂， 不便于消毒灭菌。 4 9 温差迫降采样器 温差迫降采样器利用了粒子从温度高的区带向温度低的区带运动的热泳原理， 达到空气微生物沉着到采样面上的目的。其优点有：可将采样滤纸直接在培养基上 培养；对粒子损伤小。缺点有：对于高浓度的气溶胶回收率较低；采气量小且采集 时间短；采集面需要冷却，使用不便，一般只用于实验室。 如何选择合适的空气微生物采样器非常重要，要考虑到各种因素。一般来讲， 空气微生物采样的目的是保护环境内人或物免受微生物侵害，一旦检测到异常可及 时处理。对于采样器的要求一般有如下几个方面：( 1 ) 采样过程中既保证良好的生物 存活率，又不会引起采样基质变化，如脱水。( 2 ) 具有较高的灵敏度和采样率【蚓。( 3 ) 设备便于灭菌。( 4 ) 具有可重复性。( 5 ) 可以区分粒子的大小【4 7 1 。( 6 ) 使用方便快捷，操 作简单。 据研究表明，评价室内空气微生物的最佳方法是撞击法和过滤法【4 引。 5 论文的创新点及其意义 本研究在3 0 立方米可控通风生物学实验舱内完成，采用气溶胶发生器发射含 有噬菌体的气溶胶，并用液体冲击式采样器和自然沉降法两种方法采样，对采集到 一， 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 的样品进行定量分析。着重研究在不同通风模式下，不同高度、不同位置的噬菌体 数量，分析噬菌体的空间分布。 不同的通风形式具有不同的气流组织形式，而生物颗粒在空气中以气溶胶形式存 在，在不同的气流组织中其运动和分布是不同的，因此有必要对不同通风方式房间内 的生物颗粒分布进行比较，从而客观评价不同通风系统对生物污染的防御能力【7 6 1 。 本研究的创新之处有如下几个方面：( 1 ) 本研究采用t 1 噬菌体作为模式病毒进 行研究，可以更真实的表现室内空气中病毒分布特征。这种噬菌体属于长尾科噬菌 体，具有一个多面体头部和能变形的不可收缩的尾，长度可达5 7 0n l n ，衣壳为正多 面体，直径5 5 6 0 n m ，没有脂质包膜。之前工作最主要的不足在于气溶胶分布模式 不是直接从装载微生物的气溶胶研究中获得的，而是通过其他代替途径，比如不涉 及污染物的纯气流模式【3 2 1 、二氧化碳模拟【3 3 1 、n a c l 模拟【7 6 1 等。( 2 ) 噬菌体对人体安 全无害。噬菌体与带状疱疹病毒、天花病毒和腺病毒同属于基因1 型病毒，即d s d n a 病毒，但噬菌体分类为生物安全1 级，不是人的病原体，更加安全。( 3 ) 实验设备3 0 立方米可控通风生物学实验舱为本课题组自主研发的成果。 第二章模式病毒和宿主菌的增殖及相关特性研究 评估噬菌体数量的时候，常用的方法是利用宿主菌与噬菌体共同培养形成噬菌 斑的方法，这种方法便于操作、易于计数。而研究噬菌体在室内空气中分布特征时， 必须对噬菌体和宿主菌的增殖及相关特性有所了解。在充分了解噬菌体和宿主菌的 相关生长特性后，才能在噬菌体和宿主菌都保持良好活性，才能更有效地测定其分 布规律。这部分内容主要包括噬菌体和宿主菌的增殖培养、大肠杆菌的一步生长f h l 线的测定、噬菌体的效价测定、噬菌体对温度、紫外线的敏感性。 1 材料与方法 1 1 模式病毒与宿主细菌 模式病毒选择t 1 噬菌体，宿主细菌选择噬菌体的特异宿主大肠杆菌。t 1 噬菌 体，属于长尾科噬菌体，具有一个多面体头部和能变形的不可收缩的尾，长度可达 5 7 0n n l ，衣壳为正多面体，直径5 5 6 0 n m ，没有脂质包膜。t 1 噬菌体由香港科技大 学赵汝常( c h r i s t o p h e ry h c h a o ) 博士惠赠，a t c c 编号：1 1 3 0 3 b 1 。宿主菌选择 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) ，是t 1 噬菌体的特异性宿主。大肠杆菌由香港科技大学 赵汝常( c h r i s t o p h e r y h c h a o ) 博士惠赠，a t c c 编号：1 1 3 0 3 。 1 2 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 培养 宿主菌在培养之前需要首先进行活化。用接种环由斜面挑取l 环大肠杆菌，接 入2 0 m l t s b 培养基( 1 7 9 胰蛋白胨，3 9 大豆蛋白胨，5 9 n a c l ，2 5 9k 2 h p 0 4 ，2 5 9 葡萄糖，溶于1 l 蒸馏水中，1 2 1 高压灭菌3 0 m i n ) ，3 7 c2 2 1 r m i n 摇床培养1 2 h 。 3 m l 活化的大肠杆菌加入1 0 0 m lt s b 培养基中3 7 c2 2 1 r m i n 摇床培养4 h 即得菌 液，菌液用于检测噬菌体的数量。 1 3 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 一步生长曲线 为了研究大肠杆菌的生长状况，以确定接入噬菌体的合适时机，还测定了大肠 杆菌的一步生长曲线。分别取l m l 、3 m l 、5 m l 菌液于1 0 0 m lt s b 中，3 7 2 2 1 r m i n 摇床培养，每隔3 0 m i n 取样5 m l ，分光光度计( u v - 2 4 0 1 p c ，s h i m a d z u 公司) 测其6 0 0 n m 处的吸光值。得到的数据用e x c e l 绘成曲线图。 9 硕士学位论文 m a s t e r 。st h e s i s 1 4 t 1 噬菌体增殖 按1 2 方法培养获得的1 0 0 m l 菌液中加入1 0 0 9 l 噬菌体液，3 7 2 2 1 r m i n 摇 床培养1 2 h ，得到的噬菌体液在1 1 3 5 一i i 自动平衡离心机( 长沙平凡仪器仪表有限公 司) 中3 0 0 0 r r a i n 离心1 0 分钟，取上清液。 1 5t 1 噬菌体效价测定 增殖得到的噬菌体液用p b s ( n a c l8 9 ，k c lo 2 9 ，n a 2 h p 0 42 9 4 9 ，k h 2 p 0 4o 2 9 ， 加蒸馏水定容至i l ，p h 7 2 ，1 2 1 。c 灭菌3 0 m i n ) 作1 0 倍梯度稀释，共7 个稀释度， 取第5 7 稀释度进行双层平板法检测其噬菌体效价。t s a 培养基( 1 5 9 胰蛋白胨， 5 9 大豆蛋白胨，5 9 n a c l ，1 5 9 琼脂粉，加蒸馏水定容至1 l ，1 2 1 c 高压灭菌3 0 m i n ) 作平板底层培养基，1 0 0 9 l 噬菌体稀释液、1 0 0 p l 菌液与5 m lo 7 琼脂液混合作平 板上层培养基，待完全凝固后，3 7 * ( 2 恒温培养1 2 小时，噬菌斑计数，即得到噬菌 体的效价。为了验证这一结果，将原噬菌体液用p b s 作1 0 倍梯度稀释，共4 个稀 释度，再将第4 个稀释度的噬菌体稀释液依次作2 倍稀释，共7 次稀释，双层平板 法检测其噬菌体数量。每个梯度做三组平行实验取平均值。 1 6 温度对空气中噬菌体的作用 如1 4 所示方法培养得到的噬菌体液分别置于4 、2 0 和8 0 ，一组噬菌 体按l ：1 比例添加甘油，另一组不加甘油作对照，处理一天、一周、一月，测定处 理前后噬菌体效价的变化，测得三组数值求平均。如1 4 所示方法培养得到的噬菌 体液置于室温1 天，测定噬菌体效价变化。 1 7 紫外线对空气中噬菌体的灭活作用 噬菌体液如1 4 所示方法培养得到。超净工作台( 北京东联哈尔) 预先灭菌 3 0 分钟，取0 5 m l 噬菌体于平皿中，将平皿置于超净工作台中距离紫外灯最远的 位置，相距约1 2 m ，打开紫外灯3 0 分钟或6 0 分钟，取平皿中o 1 m l 噬菌体用双 层平板法测定效价。3 0 立方米可控通风生物学实验舱( 详见第三章2 1 ) 预先灭菌 3 0 分钟，取o 5 m l 噬菌体于平皿中，将平皿置于3 0 立方米可控通风生物学实验 舱中距离紫外灯最远的位置，相距约3 m ，打开紫外灯3 0 分钟或6 0 分钟，取平皿 中o 1 m l 噬菌体用双层平板法测定效价。分别测定处理前后噬菌体效价的变化， 测得三组数值求平均。 1 0 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 2 结果与讨论 2 1 宿主菌一步生长曲线 如实验方法1 3 所述，3 m l 活化大肠杆菌溶液加入1 0 0 m lt s b 培养基中，3 7 摇床2 2 l r m i n 震荡培养，每隔半小时取5 m l 培养液，分光光度计( 型号) 在6 0 0 n m 波长测定培养液光密度，以时间为横坐标，o d 6 0 0 i l m 为纵坐标制作大肠杆菌一步生 长曲线，如图1 所示。在0 1 h 大肠杆菌光密度增加缓慢，1 4 h 光密度迅速增加， 而4 h 以后光密度趋于平稳。即1 4 小时为大肠杆菌对数生长期，本实验中即以培养 3 小时的大肠杆菌进行t 1 噬菌体效价测定。 oo 51 52z 533 - 544 655 566 - 5 时j 回( ) 图1 大肠杆菌生长曲线( 3 m l 大肠杆菌活化液) 如实验方法1 3 所述，l m l 和5 m l 活化大肠杆菌溶液加入1 0 0 m lt s b 培养基 中进行一步生长曲线的测定。l m l 大肠杆菌活化液测得的曲线延迟期很长，5 5 h 9 5 h 达到对数生长期；而5 m l 大肠杆菌活化液测得的曲线基本看不到延迟期，o 2 5 h 为 对数生长期。相比之下，3 m l 作为起始大肠杆菌量是合适的。 2 2t l 噬菌体在大肠杆菌上形成的噬菌斑特征 以实验室扩增的t l 噬菌体感染对数生长期的大肠杆菌，按照常规双层平板法 进行噬菌斑形成单位测定，3 7 恒温培养1 2 小时后，可见t 1 噬菌体在大肠杆菌上 形成的噬菌斑呈圆形，直径在2 m m 4 m m 之间，平均3 m m ( 图4 ) 图2t 1 噬菌体在大肠杆菌上形成的噬菌斑 不同的噬菌体有不同的噬萄斑形态，因此在计数过程要注意噬菌斑的太小及形 态。若培养得到形态不同、直径过大或过小的噬菌斑，则要考虑是否受到污染。 2 3 噬菌体效价 将1 0 4 的噬菌体稀释液依次作2 倍稀释，做7 次稀释，运用双层平板培养的方法 测定噬苗体的效价( 表1 ) ，可以看出噬菌体数目成比例递减。 表1 噬菌体效价 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 图3 噬菌体效价的相关系数 计算得出噬菌体的效价为5 9 6 x1 0 7 p f u m l 。图5 显示噬菌体效价的相关系数为 o 9 8 3 4 ，表明测得的噬菌体效价真实可信。 2 4 不同保存条件下噬菌体效价变化 噬菌体分别置于4 c 、2 0 和一8 0 ，并给一半噬菌体添加甘油做保护剂，另 一半不添加作对照，一周和一月后测其效价变化。结果如表2 所示。 表2 不同温度下噬菌体效价变化( 效价单位：x1 0 7 p f u m l ) 一2 0 添加甘油与8 0 。c 不添加甘油这两种条件更适合噬菌体的保藏。保藏过程 中，噬菌体的数量会有增加的情况，可能的原因是噬菌体中可能含有少量的大肠杆 菌，噬菌体会有少量的增殖。噬菌体减少的原因可能是噬菌体死亡。因此，噬菌体 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 最佳保藏条件为2 0 c 并且1 ：1 比例添加甘油，8 0 c 不添加甘油也可以用来保藏噬 菌体，4 c 下适合噬菌体的短期存放，一般不宜超过8 天。 噬菌体置于室温( 3 5 ) 下1 天，检测其效价变化。结果原效价为1 1 2 1 0 7 ， 一天后效价为1 0 8x1 0 7 。噬菌体数量无明显变化，故在室温下噬菌体可以存放一天， 一般实验过程中噬菌体在室温下的短暂存放并不会影响噬菌体的效价，也不会影响 实验结果。 2 5 紫外线对空气中噬菌体的灭活作用 噬菌体分别置于打开紫外灯的超净工作台及3 0 立方米可控通风生物学实验舱 中，3 0 m i n 和6 0 m i n 后测其效价变化，结果如表3 所示。噬菌体原效价为1 1 2 x1 0 7 ， 在超净工作台和3 0 立方米可控通风生物学实验舱紫外照射3 0 分钟后效价为o ，紫 外照射6 0 分钟后效价为0 。说明紫外灭菌3 0 分钟即可完全杀灭噬菌体，在运用这 两台仪器进行实验时灭菌3 0 分钟即可。 表3 紫外线作用后噬菌体的效价变化 小结 1 、为了研究大肠杆菌的生长特性，测定了大肠杆菌一步生长曲线培养。实验表明 大肠杆菌在o l h 处于延迟期，1 4 h 达到对数生长期，4 h 以后进入生长平台期。 2 、通过双层平板法测定噬菌体效价。将噬菌体原液依次进行2 倍稀释，噬菌体效 价呈现良好的梯度关系。 3 、为了研究噬菌体合适的保藏e x i t ：，实验中分别将1 ：1 添加甘油与不添加甘油的 噬菌体保存于4 c 、2 0 c 及8 0 ，分别保存1 d 、8 d 及3 1 d 。实验表明，最适合的保 藏条件是l ：1 添加甘油保存于2 0 ，此外不添加甘油于一8 0 c 也可以保藏噬菌体。 4 、紫外线照射3 0 m i n 即可杀灭生物安全柜与3 0 立方米可控通风生物学实验舱中 的噬菌体。故实验中均采用3 0 m i n 作为灭菌时间。 1 4 第三章三种通风模式下空气中病毒的扩散规律研究 随着室内空气污染日益严重，人们的健康不断受到侵害因此对于室内空气中 病毒扩散规律的研究也变得十分重要。掌握了不同通风模式下室内空气中病毒的扩 散规律，才能做好病毒预防与控制工作。病毒在空气中扩散规律研究是建立在对病 毒与宿主菌的增殖与相关