（农产品加工及贮藏工程专业论文）大豆蛋白ACE抑制肽的酶法制备及分离纯化.pdf

大豆蛋白a c e 抑制肽的酶法制备及分离纯化 摘要 由蛋白酶在温和条件下水解大豆蛋白而获得的大豆短肽可通过抑制血管紧 张素转化酶( a c e ) 的活性而使血压降低，其食用安全性高，对高血压患者可 以起到降压作用。 本文首先利用胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和碱性蛋白 酶水解大豆分离蛋白，进行大豆分离蛋白的酶解试验，预处理温度、反应时间、 加酶量等因素均对酶解液水解度产生影响。五种蛋白酶单一及复合酶的大豆蛋 白酶解产物对a c e 活性有大小程度不同的抑制作用，对上清液进行a c e 抑制 活性测定，其中以碱性蛋白酶水解物的a c e 抑制活性最高达到4 5 ，胃蛋白 酶次之，为4 0 。 采用截留分子量1 0 kd a 、3 kd a 、1 kd a 的超滤膜对大豆蛋白多酶水解液 进行分级分离。不同蛋白酶解物配置相同浓度，样品分子量范围在1 kd a 以下 的多肽混合物的含量分别为碱性蛋白酶和胃蛋白酶总水解物的7 1 2 5 和 6 9 3 5 。不同分子量范围的水解物均对a c e 活性有抑制作用，其a c e 活性抑 制程度随分子量的减小而增大。分子量范围在1 kd a 以下组分对a c e 的抑制效 果最高，其抑制率分别为6 4 5 7 和7 8 4 9 。胃蛋白酶水解物的 i kd a 部分的 a c e 抑制率高于碱性蛋白酶，而中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶水解物 9 0 的a c e 抑制活性。 关键词：大豆蛋白蛋白酶血管紧张素转化酶血管紧张素转化酶抑制肽 p r e p a r a t i o na n d p u r i f i c a t i o no f a c ei n h i b i t o r yp e p t i d e sf r o m s o y b e a n p r o t e i n b ye n z y m a t i ch y d r o l y s i s a b s t r a c t t h es o y b e a np e p t i d c sd e r i v e df r o mt h ee n z y m a t i ch y d r o l y s a t eu n d e rt h e m o d e r a t ec o n d i t i o nd e p r e s st h eb l o o dp r e s s u r eb yi n h i b i t i n gt h ea c t i v i t yo f a n g i o t e n s i n - ic o n v e f t i n ge n z y m e ( a c e ) ，a n da r er e a l l ys a f et od i e ta n dp a t i e n t s u f f e r i n gi nh y p e r t e n s i o n i nt h i sp a p e r ，f i r s t l y , t h ef i v ee n z y m e sc o n c l u d i n ga l c a l a s ep e p s i nt r y p s i n a s e p a p a i na n dn e u t r a s ew e r ei n d i v i d u a la n dm u l t i p l ea p p l i e dt oh y d r o l y z et h es o y b e a n p r o t e i n t h ep r e t r e a tt e r n p e r a t u r er e a c t i o nt i m ea n dq u a n t i t yo fe n z y m ea d d i t i o n e f f e c t e dt h eh y d r o l y s i sd e g r e eo fs o y b e a n t h es i n g l ea n dm u l t i p l ee n z y m a t i c h y d r o l y s a t ew e r eb o t hp r e s e n t e dt h ea c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yw i t hd i f f e r e n ts c a l p s a m o n ge n z y m e s ，m e n s u r a t i n gt h ea c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo nu p - h u d r o l y s a t e ，t h e h i g h e s ta c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo fh y d r o l y s a t ef r o ma l c a l a s ew a s4 5 a n dt h e p e p s i n eh y & o | y s a t et o o kt h es e c o n dp l a c ew i t h4 0 a c ei n h i b i t o r ya c t i v i t v t h em e m b r a n e sw i t hm w c oo f1 0 kd a3 kd aa n d1 kd aw e r eu s e dt o c l a s s i f y t h eh y d r o l y s a t ed e r i v e df r o mt h ef i v e e n z y m e s d i f f e r e n te n z y m a t i c h y d r o l y s a t ec o l l o c a t e ds a m et h i c k n e s s t h ec o n t e n to f 1 k d af r a c t i o nw e r e7 1 2 5 a n d6 9 3 5 o f 也et o t a lh y d r o l y s a t ef r o ma l c a l a s ea n dp e p s i nr e s p e c t i v e l y a l l h y d r o l y s a t ew i t hd i f f e r e n tm o l e c u l a rg r a d e sw e r eb o t ha p p e a r e dt h ea c ei n h i b i t o r y a c t i v i t ya n dw h i c hw a si n c r e a s e dw i t ht h el o w e r i n go fm o l e c u l a rm a s s t h e 1 kd a e x h i b i t e dt h eh i g h e ra c ei n h i b i t o r ya c t i v i t vo f6 4 5 7 ( a l c a l a s c ) a n d7 8 4 9 q e p s i n ) r e s p e c t i v e l y t h ea c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo ff r a c t i o n 1 kd af r o mp e p s i n w a sh i g h e rt h a na l lt h a to fo t h e r sa n dt h a to ft r y p s i n a s ep a p a i na n dn c u t r a s ew e r ea b i to fe q u a l t h et r i c i n e s d s p a g es h o w e dt h a tt h ec l a s s i f i c a t i o nb yu l t r a f i t r a t i o n w a sa p p a r e n t l ya n dt h em o l e c u l a rm a s so ft h et h r e eg r a d e sw a so b v i o u s l yl e s st h a n t h a to ft h eo r i g i n a ls o y b e a np r o t e i n ，w h a t sm o r e ，t h em o l e c u l a rm a s sd i s t r i b u t i o no f t h e mg a v ead e s c e n d i n gt e n d e n c y a f t e rt h ec r o s se x p e r i m e n t st oh y d r o l y z et h es o y b c a l lp r o t e i nb yp e p s i n ，t h e o p t i m a lc o n d i t i o nt op r o d u c et h eh y d r o l y s a t ew i t ht h eh i g h e s th y d r o l y s i sd e g r e eo f 1 7 1 w a su n d e rc o n d i t i o n so f3 s u b s t r a t ec o n c c n t r a t i o n ，2 e n z y m eq u a n t i t y a d d i t i o na n d2hr e a c t i o nt i m e t 1 l es o l u b i h t yo fp 1 0 0 0f r o mp e p s i nu n d e rt h ea c i d e n v i r o n m e n tw a sb e r e rt h a nt h a to fa l k a l i n ea n dw h i c hw a si m p r o v e dw i t ht h e i n c r e a s eo ft e m p e r a t u r e t h ea c ei n h i b i t o r yp e p t i d e sp da n dp ji s o l a t e db yc o n t i n u o u sc h r o m a t o g r a p h i c t e c h n i q u eo fg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h yo n as u p e r d e xp e p t i d e1 0 3 0 0g l c o l u m n a n dt w i c er e v e r s ec h r o m a t o g r a p h yo ns e p h a s i lp e p t i d e5 t mc 1 8s t4 6 2 5 0c o l u m n f r o mt h e 1 kd af r a c t i o no fp e p s i nh y d r o l y s a t ee x h i b i t e dt h ei c 5 0o f0 7 1 4a n d 0 6 2 6m m l ，r e s p e c t i v e l y h o w e v e r ，t h em o l e c u l a rm a s so fp jc o u l dn o tb e c o n f i r m e db ys d s - p a g e t h ea ( = ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo fp jw a ss a s p s p t i b l et op h t h ea c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yu n d e ra c i de n v i r o n m e n tw a sp r o n et ol o s st h a nt h a to f a l k a l i n e a f t e rt h et r e a t m e n to fd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s 1 n o r et h a n9 0 o fa c e i n h i b i t o r ya c t i v i t yw a sr e t a i n e da n dt h e r ew a sa l m o s tn ol o s so fa c ei n h i b i t o r y a c t i v i t y ，w h i c hs u g g e s t e dt h ep j w a st h e r m a ls t a b l e k e yw o r d s ：s o y b e a np r o t e i n ；p r o t e i n a s e ；n n g i o t e n s i n - ic o n v e r t i n ge n z y m e ( a c e ) ； a n g i o t e n s i n ic o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t o r yp e p t i d e ( a c e i p ) 1 v 插图清单 图1 - 1 血管紧张素转化酶对血压的调节作用。4 图1 - 2 降压肽的作用机理假设模型。7 图2 - 1 蛋白质含量标准曲线 图2 2 不同预处理温度对大豆蛋白水解的影响1 5 图2 - 3 不同加酶量对大豆蛋白水解的影响1 6 图2 - 4 反应时间对大豆蛋白水解的影响1 6 图2 5 反应时间对a c e 活性抑制率的影响。1 7 图2 - 6 蛋白消化示意图1 9 图3 1 大豆蛋白碱性蛋白酶解物分级电泳图 图3 2 大豆蛋白木瓜蛋白酶解物分级电泳图2 4 图3 3 大豆蛋白胃蛋白酶解物分级电泳图2 5 图3 4 大豆蛋白中性蛋白酶解物分级电泳图2 5 图3 5 大豆蛋白胰蛋白酶解物分级电泳图2 5 图4 - 1 加酶量对水解的影响 图4 - 2 酶解时间对水解的影晌2 8 图4 _ 3 底物浓度对水解的影响 图4 - 4 加酶量对水解大豆多肽a c e 活性抑制率的影响3 0 图垂5 反应温度对水解大豆多肽a c e 活性抑制率的影响3 0 图4 6 反应时间对水解大豆多肽a c e 活性抑制率的影响。3 1 图禾7p h 对p 1 0 0 0 溶解性的影响3 2 图4 8 温度对p 1 0 0 0 溶解性的影响3 2 图5 1a c e 活性抑制肽分离、纯化流程3 5 图5 ，2 1 kd a 组分凝胶过滤色谱s u p e r d e xp e p r i d e1 0 3 0 0g l 的洗脱曲线3 7 图5 3 a c e 活性抑制肽g 组分的s e p h a s i l p e p t i d e 5 m m c l 8 s t ( 4 6 x 2 5 0 m m ) 梯度 洗脱曲线 图5 4 s e p h a s 匝p e p l d e 5 v i m c l 8 s t 4 6 2 5 0 洗脱组分的a c e 抑制肽活性检测3 8 图5 5 反相色谱s e p h a s l l p e p t i d e 5 m m c l 8 s t 4 6 2 5 0 对7 、8 、9 的洗脱曲线3 9 图5 6a - l a c e 抑制活性 图5 7 a - l a c e 抑制活性 图5 8j 组分的氨基酸自动分析仪分析4 2 图5 9a c e 抑制肽p j 在不同p h 中的稳定性4 3 图5 1 0 a c e 抑制肽p j 在不同温度中的稳定性4 4 表格清单 表1 - 1 大豆与几种食物的8 种氨基酸含量比较2 表2 - 1 材料与试剂1 1 表2 - 2 主要仪器1 2 表2 - 3 标准曲线。 表2 4 实验用酶作用条件。 表2 5 复合酶系对a c e 的抑制百分率。1 8 表3 - 1 凝胶的配法2 2 表3 2 碱性蛋白酶水解大豆蛋白酶解液中大豆多肽分布2 3 表3 3 胃蛋白酶水解大豆蛋白酶解液中大豆多肽分布2 3 表3 4 中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的超滤分级的a c e 活性抑制率。2 3 表4 1 正交试验试验因素水平表b ( 3 4 ) 2 9 表禾2 试验方案及结果l 9 ( 3 4 ) 2 9 表5 1a l 组分的i c 5 0 4 1 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得 金目l 王些盍堂 或其他教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名： 娠岸 签字日期：妒佴 学位论文版权使用授权书 日 本学位论文作者完全了解金日b 工些太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权盒 目b 王些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名 帐蘼 签字日期：如辞f 月fe t 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名：黼 导师戳。l 它 阿 签字魄母莎月日 电话： 邮编： 致谢 本研究及学位论文是在我的导师范远景副教授的亲切关怀和悉心指导下完 成的。他严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感 染和激励着我。从课题的选择、试验的实施以及论文的修改，范老师都始终给 予我细心的指导和不懈的支持。两年多来，范老师不仅在学业上给我以精心指 导，同时还在思想、生活上给我以无微不至的关怀，在此谨向范老师致以诚挚 的谢意和崇高的敬意。 在此，我要感谢给我实验进行指导的中国科学院等离子体物理研究所的王 军老师，姚黎明老师和赵世光老师，还要感谢安徽农业大学的戴前颖博士和阮 龙博士给我实验的指导，还要感谢在一起愉快的度过研究生生活的研究生3 0 班 的各位同学，正是由于你们的帮助和支持，我才能克服一个一个的困难和疑惑， 直至本文的顺利完成。特别感谢伍玉函同学、黄璐同学、夏莲同学以及我的师 弟师妹们，他们是我学习中的良师和生活上的益友，给予了我无私的帮助和关 心，与他们在一起学习、生活的日子将是我永远美好的记忆。 感谢合肥工业大学研究生院在学习与生活中对我的关怀与帮助。 特别要感谢我的父母，正是他们的理解和默默支持才使得论文研究得以顺 利完成。 张焱 2 0 0 7 年5 月7 日 第一章绪论 1 1 大豆蛋白的组成与功能 大豆属于高蛋白、低脂肪、中等碳水化合物大宗农产作物。大豆蛋白的氨 基酸构成较为合理，赖氨酸含量远高于其它植物蛋白，因此它是动物蛋白最为 理想的替代品，又是谷类蛋白氨基酸良好的互补食品。大豆脂肪的不饱和脂肪 酸含量高，不含胆固醇。大豆中所含的钙、磷、铁等矿物质远高于其它食物。 大豆经科学的加工处理后，其所含的抗营养因子可被除去。作为人类主要食物 的大豆，为历代医学家和营养家所重视。 1 1 1 大豆蛋白的组成 大豆中平均约含4 0 的蛋白质，其中有8 0 一8 8 可溶于水。在水溶性蛋白 质中，含有球蛋白和白蛋白两部分。其中球蛋白占9 4 ，这部分又由7 8 5 大 豆球蛋白和2 1 5 菜豆蛋白组成；白蛋白占6 。大豆水溶性蛋白质经超速离心 沉降分离，依分子量大小分为2 s 、7 s 、l l s 和1 5 s 等四个组成。其中以7 s 和 l l s 组分为最多，占全蛋白的7 0 以上【1 筇】。 据文献报道，大豆及其产品蛋白质含量高，整粒大豆、大豆粉浓缩、大豆 蛋白、大豆分离蛋白分别含大豆蛋白4 2 、5 0 、7 0 、9 0 。大豆蛋白质的含 量相当于稻米的5 倍，小麦的3 3 倍，鸡蛋的3 倍，瘦猪肉、牛肉、鱼、虾、鸡的 2 3 倍【3 1 。大豆分离蛋白，是以低温脱脂大豆为原料，应用现代生物化学工程技 术，通过大豆蛋白质进行改性加工而制成的高科技大豆蛋白产品，蛋白质纯度 在9 0 以上。大豆蛋白质营养效价：大豆里蛋白质含量与脂肪含量约等于2 2 5 ： 1 ，而大豆分离蛋白的脱脂蛋白含量约为9 2 。当经过加工的大豆分离蛋白制品 作为主要的或唯一的蛋白质来源摄取时，其蛋白质相当于动物蛋白来源的食品， 完全符合儿童或成人对必需氨基酸和蛋白质的长期要求i ”。 1 1 2 大豆蛋白的氨基酸组成与评价 营养专家的研究表明，大豆蛋白是具有典型代表的植物蛋白，在营养学中 被称为优质蛋白质，因为其氨基酸的模式接近人体蛋白质。人类需要从蛋白质 中获取2 0 种氨基酸，其中9 种氨基酸必须从食物中摄取，被称为“必需氨基酸”。 大豆蛋白富含必需氨基酸，与牛乳和肉制品中的蛋白质一样完整，但是少了荷 尔蒙、饱和脂肪、热量和对生态环境的危害。 大豆蛋白质中含有多种氨基酸，尤其是人体不能合成的8 种必需氨基酸，故 称完全蛋白质。其中赖氨酸和色氨酸含量较高，分别占6 0 5 和1 2 2 。这正是 其他的植物蛋白所缺乏的。大豆的营养价值仅次于肉、奶和蛋，比小米、大米 和小麦粉高，( 表1 1 ) 故有“植物肉”、“人造肉”的美称1 2 。 表1 - 1 大豆与几种食物的8 种氨基酸含量比较( m g 1 0 0g ) t a b l e l - 1c o m p a r i t i o n o ft h ee i g h tk i n d so fa m i n oa c i do ns o y b e a n a n d o t h e r f o o d 大豆小米大米小麦粉 蛋白质的营养价值决定于三个因素：必需氨基酸的含量与组成、消化率及 不同生物对蛋白质中氨基酸的需求量。对大豆蛋白作为营养功能性食品的应用 与机制研究始与上个世纪8 0 年代，生物与临床实验证明大豆中富含多种生物学 活性营养成分并具有降低心血管疾病、抗癌、预防骨质疏松、控制体重、增强 认知能力等功效。美国食品与药物管理局于1 9 9 9 年1 0 月通过健康食品标示法 规，允许食品标签上注明大豆蛋白对预防心血管疾病的功效并建议配合以低脂 的饮食，每日摄取量为2 5 克的大豆蛋白，可以有效地预防心血管疾病的发生。 1 1 3 大豆中的功能性蛋白质 科学实验证实植物中的一些化学物质可以预防或治疗常见的慢性退化性疾 病，如癌症、糖尿病、心血管及高血压等疾病，并将此类食品称之为“功能性食 品”。随着人们生活水平的提高，伴随现代文明而来的各种富裕病如高血压、高 血脂症、肥胖、糖尿病和癌症等越来越引起人们的重视，人们的消费观念已从 单纯的吃饱吃好向防病治病方向转变。蛋白质经酶解后可产生多种具生物活性 的多肽，在功能食品中具有重要作用。 近年来，大豆作为功能性食品尤为引人注目，大豆中的低聚糖、大豆异黄 酮、大豆皂苷、大豆磷脂、大豆多肽、大豆蛋白质、大豆膳食纤维等化学物质 具有显著的生理活性已逐渐经实验证实。据专家预测，大豆将是2 1 世纪的“维 生素”，世界各国对大豆制品及其功能性成分都极为关注。大豆制品是中国人民 的传统食品之一，也作为常用的中药。神农本草经首次记载了大豆及其药用 价值，并列为“中品”，言“生大豆，味甘平，消痈肿，饮豆汁止痛”。中药 大辞典( 下册) 记载：“大豆甘，平。入脾、肾经。具有活血、利水、祛风、解 毒的功效。”现代研究证明大豆及其制品具有广泛的生物功效，如防治癌症、降 低血脂、抗动脉粥样硬化症、改善妇女更年期综合征症状、防止鼻出血综合征 等。 现代科学技术的应用研究证实了大豆的有效功能是与大豆中所含异黄酮、 多糖、皂苷、蛋白质等成分有关。其中蛋白质成分用离心分离或从等电点沉积物 中可得到7 s 和1 1 s 蛋白质，这两种蛋白质能促进肠内胆固醇物质的排泄，与胆 内的固醇物质的吸收，从而使血清胆固醇降低。但对良性胆固醇值及胆固醇正 常的人并无降低作用。 由大豆蛋白酶解而得的低聚肽，具有易消化吸收的特点，因此对于肠胃功 能较弱或为减轻肠胃负担时，可作为蛋白质的营养源。大豆多肽的低抗原性使 食用后不会引起过敏反应，所以大豆多肽可用于肠内营养辅助疗法或手术后恢 复病人的食品。大豆蛋白酶解而得的短肽( c 2 - c 1 2 ) ，可通过抑制血管紧张素转 化酶的活性，抑制血管紧张素i 转化为血管紧张素i i ，降低缓激肽而使血压降低， 故适于高血压患者食用【5 1 。 1 2 降血压的研究 1 2 1 高血压病的现状 高血压病是一种常见的多发病，全世界每年因高血压而死亡1 2 0 0 万人，在 发达国家和比较发达国家，其患病率可高达2 0 以上，就是在发展中国家，近 年来高血压的患病率也在不断增长。目前，我国高血压患病率也已上升到 1 1 8 8 ，患病人数估计已近1 亿，每年死于心血管疾病( 主要是高血压、脑卒中 和冠心病) 的人数达2 0 0 万。由于高血压病是引起冠心病、心肌梗塞、脑卒中风 和肾功能衰竭等并发症的主要原因，因此已成为一个十分严重的社会公共卫生 问题【7 ，8 , 9 q 。 1 2 2 高血压病的致病机理 血管紧张素转化酶( a n g o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m e ，a c e l 首次由 s k e n g s ( 1 9 5 4 ) 从马血浆中分离得到，1 9 7 5 年人们证实a c e 主要存在肺及雄性生 殖器官中，其次是肾与胃肠组织。a c e 是膜结合酶，分子量为1 2 9 x 1 0 5 。1 3 6 x 1 0 5 ， 沉降系数为7 9 s ，等电点为4 7 5 ，由单一肽链组成，含大量的低聚糖( 以甘露糖、 半乳糖，n 一乙酰基葡萄糖含量最多，占总量的8 - 3 2 ) ，锌、氯离子是维持酶 活性必需的。 人体肾素一血管紧张素系统( r e n i n a n g i o t e n s i ns y s t e m ，r a s ) 是体内重要的血 压调控系统，直接参与血管收缩、代谢及交感神经的调节，是高血压主要的侯 选原因之一。r a s 由血管紧张素原、肾素、血管紧张素转换酶及血管紧张素受 体组成。肾素能将血管紧张素原( a n g i o t e n s i n ，a n g ) 水解释放出十肽的血管紧张 素i ( a n 9 0 。a c e 是r a s 系统的关键酶，a n g i 是a c e 的底物，a c e 能切下a n # 羧基末端的二肽( h i s l c u ) ，使之变成血管紧张素i i ( a n g i i ) 。在正常条件下，a c e 是a n g i i 生成的主要因素，a c e 的活性决定a n 酉i 产率。a n gi i 是r a s 系统中 最主要的生物活性成分，是强有力的血管平滑肌收缩物质，按单位计算，升压 作用比去甲肾上腺素( n o r a d r e n a l i n ，n e ) 强1 0 4 0 倍。它作用于血管壁上的受体 使周围小动脉和前毛细血管平滑肌直接收缩，同时刺激醛固酮分泌，促进人体 肾脏对n a + 、k + 的重吸收，引起血容量和钠贮量增加，使血压升高。而其前体 a n g 和a n g i 则无活性。激肽释放酶激肽系统( k a l l i k r e i n k i n i ns y s t e m ，k k s ) 中的 激肽如缓激肽的主要作用是作用于血管内皮的缓激放受体，促进一氧化氮和前 列腺素等血管扩张因子的释放，促进血压下降。a c e 在k k s 系统中被称为激肽 酶，它能使激肽失活，使k k s 系统处于抑制状态，导致血管收缩血压升高 1 0 , 1 1 ，1 2 。 肾素一血管紧张索系统 血管紧张素原 肾素 激肽释放酶一激肽系统 呒涨a 晓a 晓 譬要蝣 ( 血管收缩剂j i l 缓 激肽释放酶 ( 活性) 仁n o 释放、 前列腺素 合成 缓释肽1 7 ( 无活性) 血压上升 图1 - 1血管紧张素转化酶对血压的调节作用 f i g 1 1r o l eo f a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m e ( a c e ) i nb l o o dp r e s s u r er e g u l a t i o n r a s 和k k s 系统在血压调节方面是一对相互拮抗的体系，其平衡协调对维 持正常血压十分重要。r a s 产生具有升压作用的血管紧张素i i ，k k s 产生具有 降压作用的舒缓激肽。r a s 与k k s 的平衡失调被认为是高血压发病的重要原因 之一1 3 , 1 4 , 1 5 1 。由于a c e 在r a s 和k k s 系统中对血压调节起重要作用，抑制a c e 活性对降低血压有积极的影响，因而寻找有效的a c e 抑制剂一直是高血压药物 研究中的热点课题。 1 - 3 降血压肽的研究 自1 9 7 7 年c u s h m a n 加l 等根据a c e 底物的化学结构推测出a c e 活性部位的 模型并据此开发设计了第一个化学合成的a c e i ( 血管紧张素转换酶i 肽) 卡托普 利( c a p t o p m ) 以来，其作用得到医学界的普遍认可。1 9 8 1 年c a p t o p r i l 被批准上 市，目前国内外正式用于临床的a c e i 已有1 6 种以上，正在研制的已达余 种。a c e i 治疗高血压的益处已被大家所接受，但其对肾脏的毒副作用以及其 他一些副作用如低血压、干咳等使研究者开始寻找安全性高的a c e - 1 。来源于 食物蛋白质的降血压肽的降血压效果虽然不及化学合成的a c e l ，但无毒副作 用，除降血压外往往还具有免疫调节、减肥和易消化吸收等功能1 6 m j 。 降血压肽是血管紧张素转换酶抑制剂( a c e i ) 一类的药物，通过抑制a c e 活性而达到降血压的作用。1 9 6 5 年，f e r r e i t a 1 6 1 从巴西毒蛇( b o t h f o p sj a r a r a c a ) 的 毒汁中分离出一种多肽类的物质，能够增强缓激肽的作用，故将其称为缓激肽 增强因子( b r a d y k i n i np o t e n f i a l i n gf a c t o r s ，b p f s ) 。后来又发现这种肽类物质有 抑制血管紧张素转换酶( a c e ) 的作用，使血管紧张素l ( a n e l ) 转变为血管紧张素 i i ( a n g i i ) 的过程发生障碍。1 9 7 1 年，o n d c l l i l l 等人合成了b p f s 成分之一的壬 肽抗压素( t i p r o t i d e ) ，这是第一个用于临床的血管紧张素转化酶抑制肽。 1 3 1 食品降血压肽 对食物降血压肽的研究开始于o s h i m a 等1 9 7 9 年报道的从明胶酶解液中提 取的a c e 抑制肽。1 9 8 2 年m a r u y a m a s 1 8 增从牛酪蛋白的胰蛋白酶水解物中分 离出一种能抑制a c e 活性的1 2 肽。随后开始从更多蛋白质源中获得了a c e 抑 制肽，现已成功地从鱼贝类、大豆、酪蛋白、玉米、酒糟等众多食物蛋白质中 获得了a c e 抑制肽f 1 9 】。降血压肽的抑制活性与其氨基酸结构和组成密切相关。 c h e u n g 2 0 】等人经研究认为a c e 抑制肽的抑制活性主要取决于c 端氨基酸残基， c 端氨基酸为芳香族氨基酸( 包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸) 和脯氨酸时其抑制 活性较高。另外，n 端为疏水性的缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或碱性氨基酸的 肽与a c e 的亲和力较强，抑制活性较高，但是脯氨酸则例外。最早从蛇毒液中 分离提取的a c e 抑制肽含有许多脯氨酸残基，c 端为脯氨酸的抑制活性最高。 m i y o s h i 2 1 】等从玉米醇溶蛋白酶解液中分离提取了多种c 端为脯氨酸残基、n 端 为亮氨酸残基的a c e 抑制肽，大多显示了强a c e 抑制活性，其中的l e u p r o p r o 的效应可与a c e 的专一性抑制剂c a p t o p r i l 相匹敌。s a i t o i 碉等人从清酒和酒糟 中分离了9 种c 端含有t r p 或t y r 的含5 个或更少氨基酸残基的a c e 抑制肽， 分析了l l e - t y r - p r o a r g - t y r 和t y r - g l y g l y - t y r 两种肤段，认为a c e 抑制肽序列 中的疏水性氨基酸和肽段的c 端氨基酸对其抑制活性有着重要的作用。但不少 抑制活性较强的降血压肽的结构并不符合c h e u n g 等的降血压肽结构模式，如来 源于沙丁鱼c 1 1 肽( t y r - l y s s e r p h c i l c l y s o l y - t y r - p r o v a l m e t ) ，来源于金枪鱼 的c b 肽( p r o t y r - h i s 1 l c l y s - t r p o l y - a s p ) ，m a t s u i ”1 等用碱性蛋白酶酶解沙丁鱼 获得的a c e 抑制肽主要由酸性氨基酸组成，疏水性氨基酸含量很低。另外， s u c t 如蚰等分析了来源于1 5 种鱼贝类a c e 抑制肽的氨基酸组成，发现来源于 鱼类抑制肽含有丰富的a s p 、o l u 、a s g 、p r o 、l i e 和l y s ，来源于贝类的则富含 a s p 、g l u 和l y s 。不同的氨基酸结构和组成短肽的抑制活性差别很大。但是a c e 抑制肽的氨基酸组成和结构与其抑制活性的具体关系尚末研究透彻，有关机理 尚不清楚，可能是不同氨基酸结构的a c e 抑制肽与a c e 的活性中心有着不同 亲和力的缘故。 1 3 2 大豆蛋白降压肽 大豆蛋白质是人体新陈代谢过程中较为重要的营养物质，具有提供构成机 体所需氨基酸和能量供应等营养功能。近些年的研究表明，除营养功能外，大 豆蛋白质酶解产物中的一些短肽还具有广泛的生理调节功能，如促进钙吸收、 降血压、降低胆固醇、免疫调节等。研究发现这些短肽在体内的消化吸收性能 要明显优于单个氨基酸。这些生物活性肽的发现引起了食品科学晃和医药学界 的高度关注，特别是具有降血压活性的血管紧张素转化酶( a n g i o t e n s i n - i c o n v e r t i n ge n z y m e ，a c e ) 抑制肽已成为生物活性肽研究领域最热门的方向之 一 大豆蛋白酶解物中含有血管紧张素转换酶抑制肽，体外实验证实，它具有抵 御肠道蛋白酶的水解作用【矧，还可以明显降低原发性高血压鼠( s p o n t a n e o u s l y h y p e r t e n s i v er a t 。s h r ) 的心脏收缩压，且没有副作用1 1 0 ，目前己成为食物蛋白降 压肽 2 8 - 3 3 研究的热点。在我国开发大豆a c e i 肽，既可以充分利用大豆蛋白资 源，又可以为防止心脑血管疾病流行提供可靠有效的膳食干预模式。 大豆蛋白酶解肽通常由蛋白酶在温和条件下水解蛋白质而获得，食用安全 性高，而且它们共同的突出优点是对高血压患者可以起到降压作用，对血压正 常的人无降压作用。除降压功能外，往往同时具有免疫促进减肥及易消化吸收 等生理功能。随着对其作用机制、生理效果及制备方法研究的深入，来源于大 豆蛋白质的降血压肽将显示出良好的应用前景。 血管紧张素转化酶在血压调节中扮演重要角色。大豆蛋白酶解肽通过抑制 血管紧张素i 向血管紧张素i i 的转化以及阻止a c e 使缓激肽失活而起降血压的 作用。利用某些蛋白酶对大豆蛋白质的定位水解而可产生具有降血压活性的短 肽。 研究发现，a c e 是一种金属肽酶，含有两个结合z n “的位点，即所谓“必 须结合位点( o b l i g a t o r yb i n d i n gs i t e ) ”。此外，还含有一个或几个“附加结合点”。 z i l 2 + 结合位点是a c e 催化反应的活性基团所在部位。包括降血压肽在内的各种 a c ei 的共同作用是与a c e 活性部位的z n “结合，使之失活。a c e i 与此基团 结合的强度及与附加结合点结合的数目决定了a c e i 作用的强度和持续时间。 降血压肽是对a c e 活性区域亲和力较强的竞争性抑制剂，它们与a c e 的亲和 力比血管紧张素i 或舒缓激肽更强，而且也较不容易从a c e 结合区释放，从而 阻碍a c e 催化水解血管紧张素i 成为血管紧张素i i 以及催化水解舒缓激肽成为 失活片段的两种生化反应过程，起降血压的作用。图1 2 是c u s h m a n 1 0 l 实验室 根据竞争性抑制剂与a c e 活性的结合点提出的模型假说，该模型后来一直被许 多研究者用来解释降压肽的作用机理。 髓2 物 i 印劓女 啊：物 抑制捌 模型中的六角缺口是羧肽酶的活性点，表示酶的疏水袋，a c e 的环形缺口 表示底物和竞争性抑制剂的取代基r 1 和r 2 - 与a c e 作用的活性点，x 贼示 a c e 活性点的氢键。 图1 - 2降压肽的作用机理假设模型 f i g l 2 t h es u p p o s e dm e c h a n i s m sm o d e lo fa n t i h y p e r t e n s i v ep e p t i d e s 动物实验是评价降血压肽效应的有效方式。降血压肽生物学效应评价的实 验动物一般是原发性高血压大白r ( s h r ) 。降血压肽的动物试验一般采用口服或 静脉注射的方式。以不同剂量喂食或注射s h r ，同时做a c e i 药物对照组。比 较不同剂量对s h r 血压的影响，并与a c e i 药物的降压效果进行比较。值得注 意的是，许多短肽在体外实验中对a c e 具有抑制活性，但在体内实验中却无降 压效果。许多学者认为，a c e 抑制肽摄入体内后存在一个消化降解的过程，有 可能降解为无活性的片断。另外也有些a c e 抑制肽体外实验活性不高，但动物 实验结果却表明其有明显的降血压效果。这可能是a c e 抑制肽被摄入体内后被 胃肠道的消化酶降解，生成了有降血压活性的片段。h i r o y u f if j u i t a 3 4 j 等人根据 与a c e 作用将a c e 抑制肽分成3 类：抑制型肷、底物型肽和药物前体型肽。 其中抑制型肽与a c e 作用后，i c 5 0 值无变化，经s h r 鼠口服均有降血压效果； 底物型肽和与a c e 作用后，a c e 作为此类肽的底物，使i c s o 值升高；药物前 体型抑制肽与a c e 作用后，使这些肽从底物型肽转化为真正抑制活性的肽，i c 5 0 值降低，并且这类肽经s h r 鼠口服后可长期维持其降血压活性。如鸡肉中的 f k g r y y p 和血清中的f f g r c v s p 、e l i k v y l 属于底物型肽；鲣鱼中的r y 、 i k p 、l k p 、i w h 等属于抑制型肽；鲣鱼中的l k p n m 、i w h h t 为药物前体型 肽p 习。多肽抑制a c e 的活性与实验降血压功能的关系仍有待迸一步深入研究。 1 4 国内外a c e 抑制肽的研究现状及应用前景 日本早在2 0 世纪8 0 年代就对降血压肽进行了广泛深入的研究。他们采用 玉米蛋白、大豆蛋白、鱼贝类蛋白、清酒糟等廉价的蛋白质作为原料研究开发 了众多的a c e 抑制肽，制成药片、口服液或作为功能因子添加到各种食品中去， 取得了良好的经济效益和社会效益。 目前从食物蛋白质中制备血管紧张素转化酶抑制肽( a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n g e n z y m ei n h i b i t o r yp e p t i d e s , a c e i p ) 的途径有两种：微生物发酵法和酶解法。微 生物发酵法的关键在于菌种的选择。前人发现瑞士乳酸菌发酵乳中a c e i p 活性 最高。n a k a m u r a 等人研究出工业生产a c e i p