（农产品加工及贮藏工程专业论文）有机磷农药敌敌畏和亚胺硫磷免疫检测方法的研究.pdf

有机磷农药敌敌畏和砸胺硫磷的免疫学柃测研究 中文摘要 有机磷农药是目前我国使用最多的农药，其中敌敌畏( d i c h l o r v o s ，d d v p ) 和亚胺 硫磷( p h o s m e t ，p m p ) 都是有机磷农药中最常用的品种。 由于d d v p 和p m p 使用广泛，要保证所有食品完全不含其残留是不可能的。 世界上几乎所有国家都制定了食品和饲料中d d v p 和p m p 的最大允许含量并作为 强制性限量标准。目前，检测d d v p 和p m p 的方法主要有气相色谱法和酶抑制法， 但是前者的样品前处理过程复杂并需要昂贵的仪器设备，而后者的假阳性较高。为 此，免疫学方法因其具有快速、准确、灵敏、操作简单、成本低等优点而成为检测 d d v p 和p m p 等有机磷农药的研究热点。 本课题从抗原的构建着手，首先采用m a n n i c h 法将d d v p 、p m p 与阳离子化牛 血清白蛋白( c a t i o n i z e db o v i n es e r u ma l b u m i n ，c b s a ) 偶联，构建了完全抗原 d d v p c b s a 和p m p c b s a ，然后利用紫外和红外光谱分析方法对它们进行了分析。 在此基础上，分别以d d v p c b s a 和p m p c b s a 免疫b a l b c 小鼠，分析了两种抗 体的产生进程、效价和灵敏度。同时以d d v p c b s a 为免疫抗原，采用细胞杂交瘤 技术，获得了能稳定分泌抗d d v p 单克隆抗体的杂交瘤细胞，并对单克隆抗体的效 价和灵敏度进行了分析。 1 完全抗原的构建及其光谱学分析 d d v p 和p m p 的分子量分别为1 9 0 和3 1 7 ，是只有反应原性而无免疫原性的半 抗原( h a p t e n ) ，只有通过与载体蛋白偶联，才能刺激机体产生抗体。 本研究首先制备了c b s a ，然后采用m a n n i c h 法，使其与d d v p 和p m p 偶联， 得到摩尔比分别为4 0 ：1 和1 5 ：1 的d d v p c b s a 与p m p c b s a 。 再利用u v - s 和f t - i r 光谱分析方法，对c b s a 、d d v p c b s a 和p m p c b s a 进行分析。结果表明，c b s a 的u v - v i s 最大吸收峰有微弱蓝移，而d d v p - c b s a 在 2 7 8a m 处有蛋白质的吸收峰，其杂质峰掩盖了d d v p 的特征吸收峰；p m p - c b s a 在 2 7 8a m 处的吸收峰，迭加了p m p 的特征吸收峰。在f t - i r 中，d d v p 与c b s a 偶联 后，在1 2 8 6 1 2 5 8c m o 处和1 0 5 0 9 5 0c m 。1 出现了d d v p 弱峰以及蛋白质1 6 5 0c m 一 处的强峰；p m p 与c b s a 偶联后，在8 3 3 7 9 0c m 。1 处和6 6 3 - 6 4 5c m 。1 处出现了p m p 弱峰和蛋白质1 6 5 0c m d 处的强峰。 上述光谱分析结果表明，d d v p 和p m p 与c b s a 偶联成功。 2 抗d d v p 和p m p 多克隆抗体的制备及其性质研究 以d d v p c b s a 和p m p c b s a 分别免疫b a l b c 小鼠，免疫间隔为1 5d ，免疫 i # 中农业人学2 0 0 9 届硕j ：学位论文 3 4 次后，均能有效地产生抗体。其中，抗d d v p 抗血清效价在免疫7 次后最高达 1 6 1 0 4 ，而抗p m p 抗血清效价在免疫6 次后最高达1 2 x 1 0 4 。间接竞争e l i s a 分析 表明，两种抗血清的灵敏度分别达到4 7 3n g m l 和4 8 2n g m l 。 3 抗d d v p 单克隆抗体的制备及其性质研究 以d d v p c b s a 免疫b a l b c 小鼠后，取其脾细胞与骨髓瘤细胞s p 2 0 融合， 融合率达3 5 。在融合子中能分泌抗d d v p 抗体的阳性融合子达1 0 。采用有限 稀释法，从阳性克隆子中筛选得到一株能稳定分泌抗d d v p 单克隆抗体的杂交瘤细 胞株1 d 3 。其产生的抗体灵敏度为8 0 0n g m l 。 关键词：有机磷农药；敌敌畏；亚胺硫磷；阳离子化蛋白；多克隆抗体；单克隆抗 体 l l 有机磷农药敌敌畏和弧胺硫磷的免疫学检测研究 a b s 仃a c t o r g a n o p h o s p h a t ep e s t i c i d e s ，w h i c hh a v eb e e nc o n s i d e r e da st h em o s tc o m m o n l y u s e dp e s t i c i d e su n t i ln o w , i n c l u d et h em o s tp o p u l a rd i c h l o r v o s ( d d v p ) a n dp h o s m e t ( p m p ) i ti si m m p o s s i b l et oe n s u r en or e s i d u ei na l lf o o d sf o r t h ew i d ea p p l i c a t i o no fd d v p a n dp m p u pt on o w , a l m o s ta l lt h ec o u n t r i e sa n dr e g i o n sa l lo v e rt h ew o r l dh a v e r e g u l a t e dt h em a x i m u ml i m i tf o rd d v pa n dp m pi nf o o d sa st h em a n d a t o r ys t a n d a r d r e c e n t l y ，t h em a i nd e t e c t i o nm e t h o d sa r eg a sc h r o m a t o g r a p h yt h a th a sd i s a d v a n t a g e so f t h er e l a t i v e l yc o m p l i c a t e dp r o c e d u r ef o rs a m p l ep r e p a r a t i o na n de x p e n s i v ei n s t r u m e n t a n de n z y m ei n h i b i t i o nm e t h o d ，w h i c hh a sar e l a t i v e l yh i g hf a l s ep o s i t i v e t h e r e f o r e ， i m m u n o l o g i c a lm e t h o d sh a v eb e e nb e c o m eah o tr e s e a r c ht o p i cd u et ot h e i rr a p i d ， s e n s i t i v e ，e a s yt oh a n d l ea n dl o w c o s tm e r i t s i nt h i sp a p e r , m a n n i c hr e a c t i o na d o p t e df o r c o n s t r u c t i n gt h ec o m p l e t ea n t i g e n ( d d v p - c b s aa n dp m p c b s a ) t oc o u p l ed d v p , p m pa n dc a t i o n i z e db o v i n es e r u i t l a l b u m i n ( c b s a ) c b s a d d v p - c b s aa n dp m p c b s ah a db e e ni d e n t i f i e da n da n a l y z e d b yu l t r a v i o l e t v i s b l e ( u v - v i s ) s p e c t r o s c o p ya n df o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e d ( f t - i r ) s p e c t r o s c o p y t h ed e v e l o p m e n t ，t i t e r sa n ds e n s i t i v i t i so fa n t i - d d v pa n dp m pa n t i s e r a p r o d u c e db yb o t ha n t i g e n sw e r eo b t a i n e db yi n j e c t i n gd d v p c b s aa n dp m p - c b s a t h e nt h eh y b r i d o m ac e l l s ，w h i c hw e r ec a p a b l eo fc o n t i n u o u s l ys e c r e t i n gt h em o n o c l o n a l a n t i b o d i e s ( m c a b s ) a g a i n s td d v p , h a db e e ns c r e e n e do u tb yf u s i o na n dc l o n eo fc e l l s ， w h i c hw e r ef r o mm o u s es p l e n i cc e l l si m m u n i z e db yd d v p c b s aa n dt h em u r i n es p 2 0 m y e l o m ac e l l s ，r e s p e c t i v e l y , a n dm c a b sh a db e e ns t u d i e do nt h ea s p e c t so ft i t e ra n d s e n s i t i v i t y t h em a i nr e s u l t sw e r ef o l l o w e d 1 d d v p - c b s aa n dp m p - c b s a c o m p l e t ea n t i g e nc o n s t r u c t i o na n d i t ss p e c t r o s c o p y a n a l y s i s d d v pa n dp m ph a v el o wm o l e c u l es u b s t a n c ew i t h19 0a n d317m o l e c u l ew e i g h t ， a n dh a p t e n w h i c hh a sr e a c t i o n o g e n i c i t yw i t h o u ti m m u n o g e n i c i t y d d v pa n dp m pm u s t c o u p l ew i t hc a r d e rp r o t e i nt of o r mc o m p l e t ea n t i g e ni no r d e rt os t i m u l a t ea n i m a l st o s e c r e c ta n t i b o d i e s i nm a n n i c hm e t h o d ，c b s aw a sf i r s t l yp r e p a r e d ，t h e nw a sc o u p l e dw i t hd d v pa n d p m p c o n j u g a t e sd d v p c b s aa n dp m p c b s aw i t ht l l em o l a rr a t i oo f4 0 ：la n d1 5 ：l i i i 华中农业人学2 0 0 9 届硕十学位论文 w e r eo b a t a i n e d u v 二v i sa n df t - i rw e r ea p p l i e dt oa n a l y z ec b s a d d v p c b s aa n dp m p c b s a i n u v 二s t h em a x i m u ma b s o r b e n tw a v e l e n g h tq m a x ) o fc b s aw a ss l i g h tb l u es h i f t c o m p a r e dw i t ht h a to fb s a a n dt h e r ew a sa na b s o r b e n tp e a ka t2 7 8n n li nd d v p - c b s a ， w h i c hw a st h es u p e r p o s i t i o np e a ko ft h ec h a r a c t e r i s t i ca b s o r b e n tp e a ko fd d v pa n db s a t h ea b s o r b e n tp e a ka t2 7 8n l i li np m p c b s aw a st h es u p e r p o s i t i o no ft h ec h a r a c t e r i s t i c a b s o r b e n tp e a ko fp m pa n db s a i nf t - i r t h es t r o n gb a n d sa t16 5 0c m 1o fp r o t e i na n d t h ew e a kb a n d sa t1 2 8 6 - 1 2 5 8c m qa n d1 0 5 0 9 5 0c m 叫o fd d v pa p p e a r e di n d d v p c b s a a tm es a m et i m e t h es t r o n gb a n d sa t16 5 0c m - 1o fp r o t e i na n dt h ew e a k 一 b a n d sa t8 3 3 7 9 0c m 。1 a n d6 6 3 - 6 4 5c m o f p m pa p p e a r e di np m p c b s a i nc o n c l u s i o n t 1 1 ec o n j u g a t i o nb e t w e e nd d v p p m pa n dc b s ad i do c c u r 2 a n t i - d d v pa n dp m pp o l y 7 c i o n a la n t i b o d i e sp r e p a r a t i o na n dt h e i rc h a r a c t e r s a n a l y s i s b a l b cm i c ew e r ei m m u n i z e db yd d v p c b s aa n dp m p c b s a t h er e s u l t ss h o w e d t h a tb o t ho ft w oc o m p l e t ea n t i g e n sc o u l di n d u c em i c et op r o d u c ea n t i b o d i e sa f t e r3 r d - 4 t h i m m u n i z a t i o n t h ea n t i b o d ya g a i n s td d v ph a dt h em a x i m u mt i t e ro f1 5 10 4a n dt h e a n t i b o d ya g a i n s tp m p h a dt h em a x i m u mt i t e ro f1 6 10 qb ve l i s a t h et w ok i n d so f a n t i s e r ah a das e n s i t i v i t i eo f4 7 3n g m la n d4 8 2n e c m l 3 a n t i - d d v pm o n o c l o n a la n t i b o d i e sp r e p a r a t i o na n di t sc h a r a c t e r sa n a l y 7 s i s t h es p l e n i cc e l l sf r o mb a l b cm i c ei m m u n i z e db yd d v p - c b s aw e r ef u s e dw i t h t h em u r i n es p 2 0m y e l o m ac e l l s a sar e s u l t ，t h ef u s i o nr a t i oo ft h ec e l l sw a su pt o3 5 ， i nw h i c ht h ep o s i t i v ef u s i o nr a t i oo fa n t i - d d v pm c a bw a s10 o n eh y b r i d o m ac e l l l i n e s ：1d 3 ，w h i c hw a s c a p a b l eo fc o n t i n u a l l ys e c r e t i n gh i g ha n ds e n s i t i v i t ym c a ba g a i n s t d d v p w a ss c r e e n e do u tb yt h el i m i t e dd i l u t i o nm e t h o da n dp r o d u c e da n t i b o d i e sw i t ht h e s e n s i t i v i t yo f8 0 0n g m l k e yw o r d s ：o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e s ；d d v p ；p m p ；c a t i o n i z e dp r o t e i n ；p o l y c l o n a l a n t i b o d i e sm o n o c l o n a la n t i b o d i e s i v 有机磷农药敌敌畏和亚胺硫磷的免疫学检测研究 缩略语表 缩写名英文全名中文名称 o p s o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e s 有机磷农药 d d v pd i c h l o r v o s敌敌畏 p m pp h o s m e t 亚胺硫磷 p m p o p m p o - c a r b o x y m e t h y l o x i m e 亚胺硫磷羧甲基肟 a ga n t i g e n 抗原 a b a n t i b o d y 抗体 c b s ac a t i o n i z e db o v i n es e r u ma l b u m i n 阳离子牛血清白蛋白 c o v ac a t i o n i z e do v a l b u m i n 阳离子卵清白蛋白 e i m e n z y m ei n h i b i t i o nm e t h o d 酶抑制法 a o a ca s s o s i a t i o no f o m c ea n a l y t i c a lc h e m i s t s 美国官方分析化学师协会 l d s o l e t h a ld o s e5 0 半致死剂量 t l ct h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y 薄层色谱层析 h p l c h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 高效液相色谱法 p c a b p l o y c l o n a la n t i b o d y多克隆抗体 m c a bm o n o c l o n a la n t i b o d y 单克隆抗体 p e g p o l y e t h y l e n eg l y c o l 聚乙二醇 h a t h y p o x a n t h i n ea m i n o p t e r i nt h y m i d i n em e d i u mh a t 选择性培养基 h t h y p o x a n t h i n et h y m i d i n em e d i u m h t 培养基 e l i s a e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y 酶联免疫吸附法 h r ph o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e辣根过氧化物酶 p b s t p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n et w e e n 2 0 磷酸盐生理盐水缓冲液( 含吐温- 2 0 ) c b sc a r b o n a t eb u f f e rs o l u t i o n碳酸盐包被缓冲液 s bs u b s t r a t eb u f f e r 底物缓冲液 s s s t o ps l u t i o n 终止液 f t i rf o u r i e rt r a n s f o 衄i n f r a r e ds p e c t r o s c o p y 傅立叶红外光谱 u v v i su l t r a v i o l e t v i s i b l es p e c t r o p h o t o m e t r y紫外一可见光谱 v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密兹 如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：么氧董时间：) 舻c i 年 月 8 日 鲐缮驾 名：铹狲 蚴瓤叫蝴8 日蛳瓤必p 广日 有机磷农药敌敌诞和亚胺硫磷的免疫学检测研究 1 有机磷农药的概述 第一章文献综述 1 1 有机磷农药的定义和分类 有机磷农药( o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e s ，o p s ) 是含磷的有机化合物，也有含硫 和氮元素，大部分是磷酸酯或酰胺类化合物，毒性大，但易分解( 郭树荣和孔育梅， 2 0 0 7 ) 。其结构式为二烷基膦酸酯( r o ) 2 p ( o ) x 或硫代二烷基膦酸酯( r o ) 2 p ( s ) x ，有很 多类别。目前广泛使用的绝大多数有机磷农药都是含有磷酰( p = o ) 或硫代磷酰基( p = s ) 的磷酸或膦酸衍生物。 有机磷农药按其毒性大小可以分为( 陈康颐，2 0 0 4 ) ： ( 1 ) 剧毒类：大鼠经口l d 5 0 在1 0m e g k g 以下。如甲拌磷( p h o r a t e ) 矛l 对硫磷 ( p a r a t h i o n ) ( 2 ) 高毒类：大鼠经口l d s 0 在1 0m g k g 1 0 0m g k g 。如敌敌畏( d i c h l o v o r s ) 。 ( 3 ) 中毒类：大鼠经口l d s o 在1 0 0m g k g 1 0 0 0m e g k g 的农药。如乐果( r o g o r ) 。 ( 4 ) 低毒类：大鼠经口l d s 0 在1 0 0 0m g k g 以上的农药。如马拉硫磷( m a l a t h i o n ) 另外，有机磷农药按中心磷原子连接基团的不同来进行分类，主要包括六大类， 分别是磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酰胺酯和硫代磷酰胺酯、磷酰卤酯、焦磷酸酯和膦 酸酯以及次膦酸i i ( 熊家林等，1 9 9 4 ) 。 我国目前使用吨位最大的农药为有机磷农药、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类农 药( 徐培渝和吴德生，2 0 0 4 ) 。其中，有机磷农药作为一类高效、广谱的杀虫剂正被 广泛地用于农业的防害以及家庭、仓储等的杀虫，但残留农药在食物链中有极强的 富集作用，可以在人类和动物机体内累积并导致慢性中毒，严重威胁着人类的食品 安全。为此，世界各国投入大量资金、人力和物力，一方面加强无公害绿色农药的 研制丌发和应用；另一方面，制定愈来愈严格的农药残留限量标准，以提高食品的 安全性( 王向红等，2 0 0 6 ) 。 1 2 有机磷农药的基本性质及其残留危害 有机磷农药纯品一般为白色结晶，工业品为浅黄色或黄色油状液体，具有特殊 的臭味如同大蒜臭味或韭菜臭。比重通常大于1 ，沸点一般都很高。一般不溶于水 华中农业人学2 0 0 9 届硕十学位论文 而溶于有机溶剂及动植物油中，对光、热、氧较稳定，遇碱易分解。残效期较短， 降解半衰期一般在几天至几周，但是在某些环境条件下也会有较长的残存期，并在 动物体内产生蓄积作用。一般的有机磷工业制品含有不少杂质及副反应产物、中间 体或异构体，其主要杂质为三烷基硫代磷酸酯，其中有的组分毒性极高，可极大的 提高有机磷的毒性( 陈康颐，2 0 0 4 ) 。 农药残留( p e s t i c i d er e s i d u e s ) 是指农药使用后而残存于生物体、农副产品和环境 中的农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称( 王沫，2 0 0 3 ) 。这旱所指的农药 杂质包括无效异构体和农药合成过程中产生的有害产物，降解、代谢产物如对硫磷 的氧化产物对氧磷，代森类杀菌剂的降解产物乙撑硫脲等。 残留农药对人畜产生不良影响或通过食物链对生态系中的生物造成毒害，称为 农药残留毒性( r e s i d u et o x i c i t y ) ，简称残毒( 王沫，2 0 0 3 ) 。农药残毒的大小受农药的 性质和毒性、残留量多少等因素的制约而表现出极大的差异。因食物中的过量农药 残留引起急性中毒的现象一般是高毒农药违规施用造成的。 有机磷农药容易污染植物性食品，尤其是含有芳香物质的植物中残留量高、残 留时间长。农作物中有机磷农药主要来自喷洒直接污染，也可从土壤中吸收，蔬菜 的吸收能力大小依次为根菜类、叶菜类、果菜类。在室温条件下，蔬菜和水果中有 机磷农药生物半衰期为7 1 7d ( 史贤明，2 0 0 3 ) 。 有机磷农药残留经消化道、呼吸道及皮肤吸收而进入人体，特别是脂溶性溶液 经皮肤吸收更快，是一种神经毒剂，对人、畜毒性很强，易造成急性中毒。有机磷 农药进入机体后，通过血液和淋巴系统运送到全身组织器官，其中以肝脏含量最多， 肾、肺、骨中次之，肌肉和脑组织中含量最少( 孟紫强，2 0 0 3 ) 。 体内的有机磷主要经过氧化和水解两种方式生物转化，其中氧化过程可使毒性 增强，如对硫磷在肝脏滑面内质网的混合功能氧化酶作用下，氧化为毒性较大的对 氧磷；而水解可使毒性降低，如对硫磷在氧化的同时，被磷酸酯酶水解而失去作用。 人体内有机磷农药的毒性机理在于其对神经递质胆碱酯酶的抑制作用，这 将使胆碱酯酶失去了分解乙酰胆碱的能力，造成乙酰胆碱积累，引起神经功能紊乱， 从而损害肌体。毒性过程可以用图1 1 表示。 有机磷农药敌敌畏和哑胺硫磷的免疫学检测研究 声 ( g 强o _ r fh o e ( 有机磷农药)+ ( 乙酸疆域酯酶j o f c 3 掩o ) ：p r o e h f 磷酸化豹乙醚腥碱鳋酶，无活性) 图i - 1 有机磷农药残留的毒性机理 f i g 1 1 t h et o x i cm e c h a n i s mo fo r g a n o p h o s p h a t ep e s t i c i d e sr e s i d u e 有机磷农药残留产生的急性中毒与胆碱酯酶受到抑制有关，临床表现：( 1 ) 毒 蕈碱样症状：主要为副交感神经兴奋所致的平滑肌痉挛和腺体分泌增加，表现为恶 心、呕吐、腹痛、多汗、流泪、流涕、流涎、腹泻、大小便失禁、心跳减慢、瞳孔 缩小；支气管痉挛和分泌物增加、咳嗽、气急，重者出现肺水肿。( 2 ) 烟碱样症状： 运动神经过度兴奋引起面、眼睑、四肢和全身横纹肌纤维束颤动，甚至肌肉强直、 痉挛，血压升高和心律失常。( 3 ) 中枢神经系统症：头晕、头痛、疲乏、烦躁不安、 谚妄、抽搐和昏迷。急性中毒具有致突变的危险性。局部损害者还可出现过敏性皮 炎( 王美德和安之璧，1 9 9 2 ) 。 呼吸衰竭是有机磷农药中毒的主要死因，主要由于呼吸中枢麻痹。肺水肿、呼 吸肌麻痹、支气管痉挛及支气管内部液积聚是加重呼吸衰竭的重要因素。心肌损害 是重症有机磷中毒后期引起死亡的常见原因( 陈康颐，2 0 0 4 ) 。 鉴于有机磷农药不稳定，易分解，残留期短，在体内不太容易积累，因此造成 慢性中毒情况并不多见( 郁佳等，2 0 0 7 ) 。但是，目前发现有些有机磷农药及其代谢 物对高等动物确实具有慢性毒性。还有文献表明有些有机磷农药有致敏作用，如敌 百虫、敌敌畏、对硫磷、内吸磷、亚胺硫磷、马拉硫磷能引起过敏性皮炎。另有新 生大鼠试验表明，某些有机磷如敌敌畏和马拉硫磷能损害睾丸中的赛尔托利细胞、 莱狄希细胞以及精原细胞和精母细胞。敌敌畏有抑制细胞有丝分裂和染色体断裂的 作用，这可能是由于对酯酶的抑制，使莱狄希细胞发生退行性变，睾丸酮合成减少， 结果精子生成受干扰( 黄幸纡，1 9 8 1 ) 。 2 有机磷农药残留的检测方法 有机磷农药残留的检测方法包括色谱法、酶抑制法、生物传感法和生物芯片法、 化学发光法与免疫学方法。 色谱法包括薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱。其中，气相色谱法是最 华中农业火学2 0 0 9 届硕：f ：学位论文 典型、应用最广的有机磷农药残留的分析方法( 王向红等，2 0 0 6 ) ，也是检测有机磷 农药残留的国家标准方法。 酶抑制法是快速检测有机磷农药残留的国家标准方法，包括速测卡法和酶抑制 率法。另外，生物传感法和生物芯片法具有高效、高通量等突出优点；化学发光法 则操作简便、快捷，且成本低，灵敏度高；免疫学方法方法则是一种简便、快速、 灵敏、特异的生物检测方法。 2 1 色谱法 2 1 1 气相色谱法 气相色谱法是2 0 世纪5 0 年代发展起来的，在农残分析中的应用始于6 0 年代初。 由于其具有分离效率高、分析速度快、选择性好、样品用量少、检测灵敏度高等优 点，因此广泛应用于分离气体和易挥发或可转化为易挥发的液体及固体样品。目前 该方法已成为农药残留分析中最常用也是最主要的方法( 金维平和曹志林，2 0 0 7 ) 。 应用于有机磷检测的检测器主要有火焰光度检测器( f p d ) ，氮磷检测器( n p d ) 和 电子捕获检测器( e c d ) 等。 有文献表明，利用f p d 检测到1 5 种有机磷农药的最小检出质量低于5 肛g k g ( f a r a j z a d e ha n dh a t a m i ，2 0 0 4 ) ，n p d 对含氮、磷的有机化合物的灵敏度高于f p d 。 还有文献报道，对有机磷农药的最低检测浓度为0 0 4p g d 4 ) 5p l 之间( 祖东云， 2 0 0 0 ) 。另有d o n g 等( d o n ge ta 1 ，2 0 0 5 ) 应用顶部空间固相微萃取法，用e c d 成功检 测了水中1 1 种有机磷农药及其衍生物，最低检出限为o 8 3 5n g l - 1 3 0 n g l 。 g b t5 0 0 9 2 0 2 0 0 3 ( 江苏省卫生防疫站，2 0 0 3 ) 食品中有机磷农药残留量的测定 以及粮、菜、油和肉类、鱼类有机磷农药残留量的测定均采用气相色谱法：其工作 原理是含有机磷的试样在富氢火焰上燃烧后产生的h p o 碎片能放射出波长5 2 6a m 的特征光，后者通过滤光片选择后，由光电倍增管接收，转换成电信号，经微电流 放大器放大后，被记录下来。因此通过对试样的峰面积或峰高与标准品的峰面积或 峰高进行比较定量，可以计算出试品中有机磷农药残留的含量。 范钦华( 2 0 0 9 ) 以敌敌畏为研究对象，对c 1 8 固相萃取、活性炭富集、液一液萃 取等3 种预处理法进行优化并比较，建立了测定痕量敌敌畏的g c f i d 方法。 王建和林秋萍( 2 0 0 8 ) 禾u 用色谱质谱电子轰击离子化法同时测定了敌敌畏、甲胺 4 有机磷农药敌敌畏和亚胺硫磷的免疫学枪测研究 磷、甲拌磷、氧乐果、甲基对硫磷、克百威共6 种杀虫剂的残留量，研究表明检出 限为0 0 0 0 2m g k g - - 0 0 16m g k g 。 吕思禄和赵海峰( 2 0 0 7 ) 建立了快速测定茶叶中多种农药残留的方法：先将茶叶 粉碎，然后用丙酮提取，3 0 0 0r m i n 离心，取上清液于4 0 水浴氮吹至近干，丙酮 溶解后过0 2 2 1 a m 滤膜，气相色谱一质谱联用仪( g c m s d ) 检测，使用基质标准单点 校正进行定量，无公害茶叶农药残留量指标提及的1 3 种农药( 有机磷农药如敌敌畏 等和氨基甲酸酯类农药如联苯菊酯等) 的方法检出限均低于指标要求，且加标回收率 在8 2 6 1 11 4 之间，完全满足检测无公害茶叶的要求。 气质色谱法同时结合了气相色谱和质谱的优点，因而具有灵敏度高、分析速度 快、鉴别能力强等特点，可同时完成待测组分的分离和鉴定，特别适用于多组分混 合物中未知组分的定性定量分析、化合物的分子结构判别、化合物分子量测定，因 此目前被广泛应用于农药残留量检测工作中。 2 1 2 液相色谱法 鉴于有机磷农药具有很强的极性和热不稳定性，会降低气相分析方法的质量， 因此有必要采用高效液相色谱法来检测有机磷农药残留。 有报道分别用反相高效液相色谱法( 李蓉等，2 0 0 6 ) 和高效液相色谱法( 孙志伟等， 2 0 0 7 ) 钡j j 定敌敌畏，分别采用h y p e r s i lc 18 柱( 1 2 0a ，5 岬，4 6n l _ n - i 3 0 0m m ) 和 k r o m a s i lc 1 8 柱( 5g r n ，2 5 0n , l l , n x4 6m m ) 为色谱柱，均以甲醇水为流动相，流速 1 0m l m i n ， 紫外检测波长分别为2 1 5n l n 和2 1 1n n l 检测。结果显示：采用前者， 敌敌畏在o 1 3 - 1 2 0m g l 范围内呈良好的线性关系，检出限为o 1 1 3m g l ，添加平 均回收率为8 9 9 ，r s d 为1 8 7 。相较于后者0 1 0 8 0 0m g m l 范围内呈良好 的线性关系，检出限为1 2 5 x 1 0 之m g ，添加平均回收率为1 0 0 8 9 ，r s d 为0 2 4 ， 可以得出结论：r p h p l c 法和h p l c 法均简单、可靠，可应用于蔬菜中敌敌畏的残 留量的分析检测。 叶江雷等人建立了茶叶中4 种有机磷农药水胺硫磷、亚胺硫磷、甲基对硫磷和 伏杀硫磷残留的高效液相色谱测定方法( 叶江雷等，2 0 0 7 ) 。在4 5 c a n 温条件下用乙 酸乙酯正己烷混合溶剂提取待测目标物、活性炭层析柱净化，用1 0 0m l 乙酸乙酯 正己烷淋洗待测组分，以e c l i p s ex d b c 8 色谱柱、乙腈水混合液梯度洗脱分离、 二极管阵列检测器测定。结果表明，上述4 种农药在6 5m i n 内能很好地分离；样品 5 华中农业人学2 0 0 9 届硕 ：学位论义 中添加的待测组分能定量回收，回收率8 9 0 1 0 8 0 ，相对标准偏差1 8 9 5 9 6 ( 1 0g g m l ，n = 5 ) ，检出限分别为：水胺硫磷9 8 2g g k g 、亚胺硫磷 7 8 8 肛g k g 、甲基对硫磷2 1 9 嵋k g 、伏杀硫磷o 7 2g g 埏。 陈珠灵等( 2 0 0 5 ) 采用高效液相色谱法对蔬菜中甲基对硫磷、乙基对硫磷、甲拌 磷进行同时分离和检测，以s h i m p a c kv p o d s 为分离柱，流动相为甲醇：水= 8 5 ： 1 5 ，紫外检测波长为2 5 0n n l ，该方法所测得的3 种有机磷在0 0 2 - 2 0 “l 范围内 具有良好的线性，检出限达( 1 0 5 0 ) 扯l ，加标回收率在9 7 4 4 1 0 1 2 2 。但是， h p l c 对检测器的使用有一定的选择性因而导致了检测的局限性。 2 1 3 薄层色谱法 通过改良硅胶成分( n a b ie ta 1 ，2 0 0 2 ) 的薄层色谱，分离出有机磷农药，定性准确， 虽然定量测定准确度和灵敏度低，但仍然是一种常用的定性测定方法。 薄层色谱溶出法：痕量有机磷农药的定量常采用钼蓝比色法。此方法是将有机 磷农药浸出液在硫酸高锰酸钾混合液中消解成为磷酸，然后与钼酸铵作用生成钼磷 酸，后者与还原剂氯化亚锡、抗坏血酸、氢醌和硫酸肼等还原成磷钼蓝，磷钼蓝使 溶液呈深蓝色，其色度与磷含量成j 下比，在含磷量0 0 5 - 2 0g g m l 范围内服从 l a m b e r t b e e r 定律( 吴谋成，2 0 0 2 ) 。 采用色谱法，一般要对样品进行预处理，残留检测的预处理技术包括：常规提 取方法有浸渍振荡法、索氏抽提法、萃取法和超声波提取法。新的提取方法：超临 界流体萃取、固相微萃取、基质固相分散萃取、加速溶剂萃取、凝胶渗透色谱等方 法，在这里就不一一详述了。 2 2 酶抑制法 酶抑制法( e n z y m ei n h i b i t i o nm e t h o d ，e i m ) 操作简便，速度快，不需昂贵的仪器， 特别适合现场检测及大批样品的筛选检测，但假阳性较多。 g b t5 0 0 9 19 9 2 0 0 3 中蔬菜中有机磷农药的快速检测正是利用了胆碱酯酶在有 机磷农药存在情况下，其活性受到抑制的原理( 王林等，2 0 0 3 ) 。它包括两种方法： 速测卡法( 纸片法) 和酶抑制率法( 分光光度法) 。前者的检测原理是有机磷农药抑制胆 碱酯酶使其底物靛酚乙酸酯( 红色) 的催化水解受到阻碍，影响产物靛酚( 蓝色) 的生 成，由此判断是否有高剂量的有机磷农药存在。后者酶抑制率法( 分光光度法) 的检 6 有机磷农药敌敌畏和亚胺硫磷的免疫学检测研究 测原理与前者相同，只是其中催化反应的底物由乙酰胆碱代替了靛酚乙酸酯。乙酰 胆碱的水解产物能产生黄色物质，因而可以通过用分光光度计在4 1 2n l n 处测定吸光 度随时间的变化值，计算出抑制率，从而判断出样品中是否有高剂量有机磷农药存 在。 同时，有薄层酶抑制法检测有机磷农药残留：快速高效薄层定性分析方法：有 报道用自制硅胶薄层板建立血清中有机磷农药乐果、甲级对硫磷、甲胺磷和敌敌畏 的测定方法( 间慧芳等，2 0 0 6 ) 。即取微量血清样品点在薄层板上，在最适合的展开 剂中展开，然后等待晾干后，用4 一( 4 硝基苄基) n t t 啶、四乙烯五胺显色法显色。采用 此方法，根据薄层板上斑点颜色的深浅与标准版进行比较，可以对以上四种农药残 留进行半定量测定。研究显示，四种农药残留的检出限在1 0 肛肛l 以下。 2 3 生物传感法 生物传感法在有机磷的检测中，大大缩短了检测的周期与时间。虽然有着分析 速度快，准确度高和成本低等优点，但是存在生物固化膜不稳定这一缺点。检测有 机磷的生物传感器是基于乙酰胆碱酯酶被一种或几种分析物( 如农药) 的抑制作用来 进行检测的。余孝颖等( 1 9 9 6 ) 早在1 9 9 6 年建立了对敌敌畏的检测方法：通过乙酰胆 碱酯酶和牛血清白蛋白通过戊二醛共价交联，以乙酰胆碱酯酶为分子识别物质，以 离子敏场效应管为换能器制成场效应管传感器，对敌敌畏的检测范围为5 1 0 8 x 1 0 5m l l ，此方法具有较强的抗干扰能力，传感器的寿命在2 0d 以上。李元光等 研制了有机磷农药现场快速检测仪片状一次性使用乙酰胆碱酯酶电极与单片微机的 有机结合体( 李元光等，2 0 0 1 ) 。h o l g e r 和r o l f ( 2 0 0 2 ) 幂u 用有机磷农药可以特异性地 抑制胆碱酯酶这一特性研制了一次性生物传感器，它对对氧磷的最低检测限为 2 “g l ( g 。 刘鹂等( 2 0 0 6 ) 采用戊二醛为交联剂制备了一种基于丁酰胆碱酯酶的离子敏场效 应管生物传感器，并将其应用于敌敌畏的测定，考察了不同p h 值、底