（检测技术与自动化装置专业论文）复杂条件下激光诱导荧光检测系统.pdf

独创性声明 煳必 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南科技大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：量彘日期：2 口fo 午1 名 关于论文使用和授权的说明 本人完全了解西南科技大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留学位论文的复印件，允许该论文被查阅和借阅；学校可以公布该论文的全部 或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此规定) 签名：萝免 导师虢刺& 日期驯彬， 7 惭亍 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 页 摘要 材料在特殊环境条件下的分析和测试手段，在材料研究中具有重要意义。 本文在分析激光诱导荧光方法在材料检测中的优点和作用，以及激光诱导荧 光检测系统国内外研究现状和发展趋势的基础上。针对目前系统存在的通用 性差、结构复杂、价格昂贵和适用范围窄的缺点，设计了可用于不同温度和 气压条件下的激光诱导荧光检测系统。 确定了系统采用斜射式光学结构，并针对斜射式光学结构荧光收集效率 低的缺点，改进了其前置光路和收集光路结构形式；设计了真空室作为样品 室，完成了步进电机控制样品台旋转的软硬件设计；针对激发和发射色散的 不同特点，完成了色散器件的选型和调试；设计了光电倍增管与电流放大器 组合方式实现弱荧光信号探测。 用完成的测量系统测量了典型样品的稳态荧光光谱和时间分辨光谱。实 验结果表明：系统对于罗丹明b 水溶液的最小检测限为10 - 1 z m o l l ，荧光信 号峰值与溶液浓度呈较好线性关系；脉冲激光脉宽为2 5 n s ；获得的 s r o a l 2 0 3 ：e u 2 + 样品的荧光衰减曲线在发光波长在515 n m 处的荧光寿命为 2 2 2 7 + 0 9 n s ，系统满足使用要求。 关键词：激光诱导荧光斜射式稳态荧光光谱时间分辨光谱 西南科技大学硕士研究生学位论文 第1 i 页 a bs t r a c t a n a l y s i s a n d i n s p e c t m a t e r i a l su n d e r s p e c i a l c o n d i t i o n i s v e r y i m p o r t a n t t h i st h e s i ss t u d i e st h em e a n i n ga n dm e t h o d so fm a t e r i a l si n s p e c t i o n ， a n a l y s i st h ep r i n c i p l eo fl a s e r i n d u c e df l u o r e s c e n c ed e t e c t i o na sam e t h o do f m a t e r i a l si n s p e c t i o n i ta n a l y s i si nd e t a i lt h ec u r r e n tl a s e r - i n d u c e df l u o r e s c e n c e d e t e c t i o ns y s t e mr e s e a r c hs t a t u sa n dd e v e l o p m e n tt r e n d t h ep a p e rd e s i g n sal i f d e t e c t i o nd e v i c ew h i c hc a nd e t e c ts m p l e sf l u o r e s c e n c ea td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e a n da t m o s p h e r ep r e s s u r ea f t e rs t u d ya th o m ea n da b r o a d a tp r e s e n ti td e t e c t s s m p l e sf l u o r e s c e n c e a tr o o mt e m p e r a t u r ea n dn o r m a la t m o s p h e r ep r e s s u r e ， w h os eo p t i c a ls t r u c t u r eiso r t h o g o n a ls e t u po rc o n f o c a ls e t u p t h es y s t e mu s e do b l i q u ei n c i d e n c eo p t i c a ls t r u c t u r e ，i m p r o v e m e n tt h ef r o n t a n dc o l l e c to p t i c a lp a t h ，i no r d e rt oe n h a n c ef l u o r e s c e n c ec o l l e c t i n ge f f i c i e n c y a v a c u u mr o o mi sc h o s e na ss a m p l er o o m ，s t e p m o t o rc o n t r o lt h es a m p l ec a r r i e r p o s i t i o n t h es y s t e ms o f t w a r ei sw r i t t e ni nd e l p h i t h ef u n c t i o n si ta c h i e c e sa r e c o n t r o lm o n o c h r o m a t o r ，d a t aa c q u i s i t i o nc a r da n ds t e p - m o t o r t h es y s t e mw a se x p l o i t e dt om e a s u r et h ef l u o r e s c e n c eo fs o l i dz n oa n d w a t e rs o l u t i o no fr h o d a m i n ebs a m p l e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed e t e c t i o n l i m i to fr h o d a m i n ebi s1 宰10 1 2m o l l a n dt h e r ew a sal i n e a rr e l a t i o nb e t w e e n t h ep e a ks i g n a lv a l u ea n dt h ec o n c e n t r a t i o no fs a m p l e t h el a s e rp u l s ea n d s r o a l 2 0 3 ：e u pw a sm e a s u r e db yt h i ss y s t e m t h el a s e rp u l s e w i d t hi s2 5 n sa n d t h es m p l e sf l u o r e s c e n c el i f e t i m ei s2 2 2 7 + 0 9 n s k e yw o r d s ：l a s e r i n d u c e df l u o r e s c e n c e ；o b l i q u ei n c i d e n c e ； s t e a d yf l u o r e s c e n c es p e c t r u m ；t i m e - r e s o l v e ds p e c t r u m 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 i i 页 目录 1 绪论1 1 1 研究背景与意义1 1 2 激光诱导荧光技术国内外现状2 1 2 1 激光诱导荧光概述2 1 2 2 激光诱导荧光研究对象概述3 1 2 3 激光诱导荧光检测系统4 1 3 本论文的主要工作5 2 激光诱导荧光光谱原理6 2 1 荧光的产生6 2 2 激光诱导荧光光谱7 2 2 1 稳态光谱7 2 2 2 时间分辨光谱8 2 2 3 激光诱导荧光优点9 2 3 本章小结1 0 3 激光诱导荧光测量系统研究11 3 1 系统构成11 3 2 系统光路设计1 2 3 2 1l i f 常用的系统光路分析1 2 3 2 2 系统光路的分析1 3 3 2 3 系统光路的改进1 4 3 3 激光器1 5 3 3 1 激光器选择原则1 5 3 3 2 激光器的分析1 6 3 3 3 激光器的选择1 7 3 4 荧光色散1 8 3 4 1 荧光色散组件分析1 8 3 4 2 荧光色散组件的选择1 9 3 5 信号检测系统2 1 3 5 1 光电探测器的分析2 1 3 5 2 光电倍增管的选择2 1 3 5 3 光电倍增管工作电路2 2 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 v 页 3 5 4 信号放大需求分析2 3 3 5 5 信号放大组件的选择2 4 3 5 6 信号采集系统2 5 3 6 样品室2 7 3 6 1 样品室的设计2 7 3 6 2 样品室的性能2 8 3 7 样品台控制系统2 8 3 7 1 系统总体设计2 8 3 7 2 步进电机的选择2 9 3 7 3 步进电机驱动3 0 3 8 本章小结3 1 4 系统软件设计3 3 4 1 系统软件概述3 3 4 1 1 软件功能3 3 4 1 2 软件流程3 4 4 2 系统控制程序3 5 4 2 1 单色仪控制程序3 5 4 2 2 采集卡控制程序3 7 4 2 3 样品台控制程序3 8 4 3 本章小结4 0 5 实验结果4 2 5 1 系统性能测量4 2 5 1 1 光电倍增管工作电压的确定4 2 5 1 2 激光聚焦的影响4 2 5 2 稳态荧光测量4 4 5 2 1 实验步骤4 4 5 2 2 罗丹明b 荧光光谱4 4 5 2 3z n o 的荧光光谱4 6 5 3 时间分辨荧光测量4 7 5 3 1 实验步骤4 7 5 3 2s r o a l 2 0 3 ：e u 2 十时间分辨光谱4 7 5 4 本章小结5 0 结论5 1 西南科技大学硕士研究生学位论文第v 页 致谢5 3 参考文献5 4 攻读硕士学位期间发表的论文和参研项目情况5 8 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 页 1 绪论 1 1研究背景与意义 材料是一种可以用来制造成构件、器件或其它物品的物质，已成为国民 经济建设、国防建设和人民生活的重要组成部分。任何一种材料的宏观性能 或行为，都是有材料本身的成分和组织所决定的。材料在制备、加工、运输 和使用中可能会受到加工工艺、组成物质、外部环境等因素的影响，导致材 料的结构和性能发生变化，进而降低材料的性能。通过对材料的成分和组织 进行检测和分析，可以改进加工工艺、组成成分从而提高材料的性能。材料 分析的基本原理是测量信号与材料成分、结构等的特征关系，根据所获得的 测量信号不同就形成了不同的分析方法。基于电磁辐射及运动粒子束与物质 相互作用的各种性质建立的各种分析技术己成为材料现代分析方法的重要组 成部分，大体上可以分为光谱分析、电子能谱分析、衍射分析和电子显微分 析四大类方法n ，。 衍射分析方法是以材料结构分析为基本目的的分析方法，测量的是电磁 辐射或运动电子束、中子束等与材料相互作用产生相干散射相长干涉的结果。 衍射分析多用于多晶态的固体样品或薄膜，对于样品大小有所要求。具体的 使用方法包括x 射线衍射分析、电子衍射分析和中子衍射分析等方法。 电子能谱分析是基于电磁辐射( 光子) 或运动粒子( 电子、原子、离子等) 照射或轰击材料所产生的电子能谱，即电子产额对能量的分布进行分析的方 法。电子能谱分析可用于固体、气体和液体样品，其中液体样品需要蒸发为 气体或做成载体上的液体膜。主要类型有光电子能谱、俄歇电子能谱、离子 中和谱和电子能量损失谱等。 电子显微分析是基于电子束与材料的相互作用而建立的各种分析方法， 包括透射电镜、高压透射电镜、扫描电镜、电子探针和原子力显微镜等。电 子显微分析测量的是材料的微观形貌、结构和成分。电子显微分析可对固体 样品表面结构和表面化学，薄膜和复合膜的形貌、晶体结构以及成分进行分 析。 光谱分析的对象是光与物质相互作用产生的特征光谱的波长、强度以及 时间。光谱分析方法包括原子发射光谱分析、原子吸收光谱分析、紫外可见 吸收光谱分析、荧光分析和拉曼光谱分析等。光谱分析以精度高、速度快、 不污染和损害样品、信息容量大以及自动化程度高等特点陀，发展十分迅速 西南科技大学硕士研究生学位论文第2 页 广泛应用于工业、农业、医学、军事和空间科学等领域。这是由于材料的光 谱性能与材料的基质组成、掺杂种类及浓度、制备方法、制备工艺等密切相 关，所以通过对材料的激发光谱、发射光谱的测试和分析，可以获得有效激 发光范围、发射光能量分布、发射光颜色等信息，进而了解材料的性能。 材料的成分和组织进行分析，不仅需要测量材料中有什么( 定性分析) ， 而且还需要知道材料中各种成分有多少( 定量分析) 。上述的材料分析方法中 x 射线衍射分析、拉曼光谱分析、光电子能谱、荧光分析都可用于材料的定 性和定量的分析。其中荧光分析法发展十分迅速，应用日益广泛，其主要原 因就是荧光分析法具有以下特点： ( 1 ) 高灵敏度：在微量物质的各种分析方法中，应用最为广泛的是比色法 和分光光度法。荧光分析法的灵敏度一般要比这两种方法高2 3 个数量级。 ( 2 ) 选择性好：能产生紫外可见光吸收的分子不定发射荧光，对于某 一给定波长的激发光，不同物质所发出的荧光波长也不尽相同。因而通过控 制激发光的波长，便能实现对分析对象良好的选择性。 ( 3 ) 荧光特性参数多：通过对物质所发射荧光的量子效率、激发和发射波 长关系分析，可了解物质组分，结构；同时还可对物质的荧光寿命、荧光偏 振参数的分析，了解物质的含量，组织等。故荧光分析具有包含物质信息量 大的特点。 ( 4 ) 荧光分析法还具有动态线性范围宽、方法快捷，重现性好，取样容易， 试样需要量少等特点。 随着荧光分析仪器的不断改进和发展，到7 0 年代，荧光分析法己经成为 一种应用范围很广泛的分析手段，已涉及到工业、农业、环境保护、医药、 卫生和生物科学研究等领域。越来越多的物质种类可以使用荧光分析法进行 定性定量测定，如无机离子、无机化合物、有机化合物、药物、糖类、维生 素、氨基酸、蛋白质( 包括酶) 、核酸等。荧光分析已成为化学工作者、生化 工作者，药物和食品分析工作者所利用的重要分析手段之一。随着电子信息 技术、制造技术、材料技术的发展，尤其是激光器出现使得激光诱导荧光技 术( 1 a s e r i n d u c e df l u o r e s c e n c e ，l i f ) 的产生成为可能。 1 2 激光诱导荧光技术国内外现状 1 2 1激光诱导荧光概述 荧光现象的最早记录是在1 5 6 5 年，西班牙的物理学家n i c o l a sm o n a r d e s 西南科技大学硕士研究生学位论文第3 页 他在一种名为l i g n u mn e p h r i t i c u m 的植物切片的水溶液中观察到了天蓝色的 光，但在当时不能对这一现象作出解释，。一直到了1 8 5 2 年，著名的科学家 s t o k e s 设计和完成了著名的实验，他使用棱镜对太阳进行分光后，发现将硫 酸奎宁溶液放在可见光波段，没有特别现象发生。但是将其放到紫外光波段 时，溶液会发出蓝色的光1 。s t o k e s 的实验结果能够证明硫酸奎宁溶液所发 出的光是通过吸收其它光后所发出的，这也是最早的使用科学方法说明荧光 现象。在科学的了解荧光产生的基本条件后，大量科学家开始关注和研究荧 光光谱，并在理论上和技术上做出了巨大的贡献。 荧光光谱检测技术作为一种高灵敏度的检测技术对计算机技术、材料技 术、先进制造技术等技术的发展具有推动作用，同时这些技术也大大加快了 荧光光谱检测技术的发展。特别是随着1 9 6 0 年美国科学家梅曼成功制作出世 界上第一台激光器，获得了波长为6 9 4 3 n m 的激光临1 。激光器的出现，特别 是随着气体激光器、固体激光器、半导体激光器和可调谐激光器的出现和发 展，为我们提供了高亮度、高单色性的激发光源，大大推进了l i f 检测技术 的发展。 激光诱导荧光作为荧光分析中的一种重要方法。其基本原理就是用特定 波长的激光照射被测物质，使物质的分子或原子发生由低电子态向高电子态 的跃迁。这种处于激发态的分子或原子经过自发辐射回到较低的电子态，同 时发射出荧光。与普通荧光分析相比，l i f 最主要的特点是激发光源具有高 亮度和高单色性，因此其灵敏度高其检测限通常可以达到1 0 1 0 。9m o l l ， 对于某些荧光效率高的物质甚至可达到单分子检测水平 儿“。并且与常规荧光 检测方法相比l i f 用样量少，样品用量最低可减少到1 4 0 ，试剂的用量最低 可至1 2 0 【9 1 。 l i f 检测技术提高了荧光分析的效率，扩大了荧光分析的应用范围。同 时也在常规荧光分析方法的基础上，发展了多种先进的荧光分析技术，例如 荧光上转换飞秒尺度时间分辨荧光分析技术、荧光相关光谱、双光子激发荧 光显微镜、荧光寿命成像显微镜、近场扫描荧光显微镜、受激发射减损荧光 显微镜等，。这些荧光分析技术发展迅速，被应用到各种不同的检测、分析 领域，并取得了良好的效果1 。 1 2 2 激光诱导荧光研究对象概述 由于l i f 检测技术有着突出的优点，因此应用的领域十分广泛，国内外 学者也利用l i f 检测技术开展了大量的科学研究。l i f 检测技术应用领域十 西南科技大学硕士研究生学位论文第4 页 分广泛，如在生物领域中研究d n a 、氨基酸等生物样品，在医学领域中研究 肺癌、皮肤癌等病变n 2 ，环境领域中检测大气、水体的污染物“4 “1 等。 a l e s s a n r ac i a p p o n i 等使用l i f 检测技术对k h 2 p 0 4 进行了分析，通过实验 找到了k h 2 p 0 4 产生荧光的缺陷，对提高该物质的损伤阈值具有指导意义“。 nb r i t u n 等利用l i f 技术测量了不同放电电流、工作压力和距离的磁控管对 于t i 原子和t i 离子密度的影响，所测结果与使用吸收光谱测量的相同”。 f i s c h e r 等利用一些实验鼠进行了对比实验，发现利用吲哚花青o c g ) 等近红 外染料试剂可以诊断包柔氏螺旋体菌导致的关节炎【- 。c h a r l e sr w a r r e n 等利 用l i f 检测技术分析了土壤中的氨基酸的含量，实验结果表明使用l i f 检测 技术优于传统的气相色谱法和高效液相色谱法n 。阎吉祥探讨了激光诱导荧 光的机理，研究了荧光强度对激发速率和自发辐射速率的依赖性，导出了能 级系统上能级粒子数速率方程心。丁志群等使用3 5 5 n m 激光激发了污染水体， 得到了水中溶解有机物( d o m ) 的浓度，证明了l i f 可对大面积水域水质进行 动态检测陀u 。 1 2 3 激光诱导荧光检测系统 国内外目前对于l i f 的研究，不仅探索了l i f 作为一种检测方法时的优 点，而且还搭建了不少l i f 检测系统。s m o l k a 等设计的l i f 检测系统，使 用波长为5 1 4n m 的a r + 激光器作为激发光源，使用多模光纤收集和传输光信 号，采用c c d 作为光电探测器。实验结果表明，该系统在光纤长度为1 3c m 、 激光功率为4 5m w 时，对于罗丹明6 g 的最小探测限浓度为1 0 母m o l l 心“。 杨丙成等使用激光二极管和泵浦固体激光器作为激发光源研制了一种小型 l i f 检测系统，该系统对于罗丹明b 的最小检测限可达3 1 0 叫o m o l l 【2 “。针对 于l i f 检测系统体积大，光路复杂等缺点，采用光纤代替传统光路的l i f 检 测系统发展迅速。许成才等使用光纤简化了l i f 的系统光路，使整个l i f 系 统结构紧凑，最低检测限为1 1 0 巧m o l l 心“。王洪等设计和制作了l i f 微流控 芯片光纤分析仪，该系统采用采用光纤束替代传统光路，实验表明所设计的 系统测量的罗丹明b 的荧光峰值明显，并且具有较好的重复性阳“。目前商品 化的仪器主要有英国e d i n b u r g h 公司的f l s 9 2 0 全功能型荧光光谱仪，法国 p i c o m e t r i c s 公司的z e t a 激光诱导荧光检测器，大连依利特公司的l i f d 2 3 0 激光诱导荧光检测器。 目前的激光诱导荧光检测系统基本上测量的对象大多为某种具体物质或 某一类的物质，因此通用性差。并且现有的l i f 检测系统大多只是测试样品 西南科技大学硕士研究生学位论文第5 页 在常温、常压情况下的荧光信号，系统光路多采用正交式或共聚焦式，光学 系统结构复杂且校准比较烦琐。同时商品化的仪器由于价格昂贵也限制了 l i f 检测系统的发展与应用。通过分析目前l i f 检测系统的优缺点，本文所 设计的l i f 检测系统可以测试固体和液体样品在不同温度和气压情况下的稳 态或瞬态荧光光谱。同时要求系统具有良好的光谱响应，即能测试紫外、可 见波段范围的荧光信号；以及具有较好的线性范围，保证系统可测试弱光信 号和较强光信号。 1 3 本论文的主要工作 本论文研究了l i f 检测系统原理，比较了l i f 和传统荧光分析技术的优 缺点，设计了l i f 检测系统。主要包括以下几方面的工作： ( 1 ) 系统光路设计：研究了目前的l i f 检测系统的光路，设计了适用于 复杂条件下的l i f 测量系统的光路，搭建了l i f 检测系统的前置光路、收集 光路与分光光路。 ( 2 ) 信号检测系统设计：使用光电倍增管、电流放大器、数据采集卡以 及数字示波器搭建了信号检测放大系统。 ( 3 ) 样品室设计：根据实验要求设计了可用于不同温度和气压变化下的 固体和液体样品测量的样品室，样品室中设计了可旋转的样品台，用于测量 激光以不同入射角度照射样品时的荧光光谱。 ( 4 ) 系统总体设计与联调：设计的l i f 检测系统能测试多种样品在不同 温度和气压条件下的稳态或瞬态荧光光谱，包括系统参数的确定和多个分系 统之间的调试。 ( 5 ) 系统性能测试与实验：使用罗丹明b 水溶液作为样品测试了系统 的最小检测限，分析了荧光信号峰值与溶液浓度的关系曲线。同时测量固体 z n o 的稳态荧光光谱和s r o a l 2 0 3 ：e u 2 + 的时间分辨光谱。 西南科技大学硕士研究生学位论文第6 页 2 激光诱导荧光光谱原理 2 1 荧光的产生 荧光光谱属于二次发射光谱，即光致发光，它的产生过程可以使用以波 兰科学家a l e k s a n d e rj a b l o n s k i 名字命名的图表j a b l o n s k i 能级图能够形象的 说明幢“。如图2 1 所示，图中每根水平线都代表了不同的电子态。电子态的 不同是指由于物质中分子具有电子能级，每个电子能级有包括许多振动能级， 从而导致形成差异。图中的垂直方向表明了能量的大小。一般情况下，物质 中的分子在常温常压下处于基态。当受到光的照射时，物质便吸收与它的特 征频率一致的光线并存储其能量，电子会由原来的基态能级跃迁到第一电子 激发态或更高电子激发态中，此时也称电子处于激发态。处于激发态的电子 是不稳定的，因此会通过辐射跃迁和非辐射跃迁等去活化过程失去能量。非 辐射跃迁是指去活化过程中没有发生光子的发射，包括内转化、系间跨跃以 及振动驰豫等几种形式。辐射跃迁是指电子从激发态返回基态时伴随着光子 的发射。光子的发射有两种形式，一种是电子从第一电子激发单重态跃迁回 基态时发生的光子发射现象被称为荧光。另一种是电子从激发三重态跃迁回 到基态发出的光被定义为磷光。通常磷光的发射必须改变分子的自旋状态， 而且跃迁时光子发射过程中电子的跃迁是禁阻的，所以磷光极少产生。 4 基 单重态兰重态 可：民振动驰豫 - 一| i ，系问i 跨越 王_ f 1 、，一一 ， j ， s l 。 l ii ) o ： ” ，争l 。i ；i il ： 屹吸唾女 荧光 _l i f i g 2 1 图2 1荧光产生示意图 西南科技大学硕士研究生学位论文第7 页 2 2 激光诱导荧光光谱 l i f 检测技术是研究激光照射物质产生荧光后，通过荧光光谱来定性或 定量地分析物质的性质。l i f 作为一种常用的，十分灵敏的荧光光谱检测技 术，适用范围十分广泛心”。根据测试的信号不同可将l i f 检测分为稳态光谱 检测和瞬态光谱检测，如测量原子和分子的种类和浓度时测量的是稳态光谱， 探测分子内的能量传递过程等方面时测试的是时间分辨光谱。 2 2 1稳态光谱 稳态光谱是指测试过程中激发光强度随时间变化远远大于荧光发射对应 的能级跃迁时间的状态。通常可分为定性和定量分析。 ( 1 ) 定性分析 使用荧光分析法定性分析物质时，需要检测物质的对某激发光波长对应 的发射光波长关系。激发光谱通过单色仪获得单色性较好的波长谱分布，可 调谐激光器可直接提供在一定范围变化的单色，高亮度的激发光源。激发光 作用于物质后，测定物质发射的荧光强度在一定波段范围内随激发光波长变 化的连续曲线。通常情况下荧光物质的激发波长和吸收波长的最大值是相同 的，因此可以通过激发谱得到该物质的最佳激发波长。使用最佳激发波长的 光照射物质后，测量物质所发射的荧光信号的强度随波长变化的曲线称为该 物质的荧光发射光谱，也称为荧光光谱。根据2 1 节中荧光产生的原理，可 知通过测量激发光谱和荧光光谱就可以对该物质进行定性分析。 ( 2 ) 定量分析 要对荧光物质进行定量的分析，不仅需要测试物质的激发和发射谱关系， 同时需要测量该荧光物质的荧光强度f 。荧光强度f 作为荧光测试中一个十 分重要的参数，大小是由式( 2 - 1 ) 决定他“。 ，、 f = k q l 音i = k q i o s b c ( 2 1 ) 0 一a 从式( 2 1 ) 中可以看出决定荧光强度的参数有：q 是荧光物质的量子效率； l 是激发光强度；，。是荧光物质吸收的光能；占是荧光物质的摩尔吸收系数； b 是吸收光程；c 是荧光物质的浓度；k 是与收集效率和传输效率等因素有关 的常数。 西南科技大学硕士研究生学位论文第8 页 2 2 2时间分辨光谱 稳态光谱可以对荧光物质做出定性和定量的检测，但是要研究物理或化 学变化随时间的瞬变过程。这种瞬变过程中，激发光持续时间与荧光发射对 应的能级跃迁时间接近。物质在光的激发下其荧光强度随着时间而发生变化， 这种在不同波长处以时间为变量测量荧光的强度分布，就得到时间分辨荧光 光谱图。时间分辨光谱在许多方面得到了很好的应用【2 “。实际上许多分子间 或分子内的弱相互作用信息，特别是动态信息，只有通过时间分辨荧光技术 才能得到，。时间分辨光谱测量的是激发光脉冲结束之后，相对于激发光脉 冲的不同延迟时的荧光发射，反映了激发态电子的运动过程。 荧光寿命( ，c ) 的测量是时间分辨光谱技术中的一种重要方法。荧光寿命定 义为荧光强度衰减到开始时刻强度的1 e 时所经历的时间。每种化合物的荧 光寿命值是不同的，并且其荧光寿命也会因周围环境的不同而发生改变。许 多复杂的分子间作用过程，像超分子体系中分子间的簇集、蛋白质高级结构 的变化等都可通过测量荧光寿命的长短得到反映。 荧光寿命的测量方法有：时间相关单光子记数法( t i m e - c o r r e l a t e d s i n g l e p h o t o nc o u n t i n g t c s p c ) 、相调制法( p h a s e m o d u l a t i o nm e t h o d s ) 和频 闪技术( s t r o b et e c h n i q u e s ) 油。 ( 1 ) 时间相关单光子记数法 目前使用较多的荧光寿命测定技术是t c s p c ，t c s p c 的工作原理是： 脉冲光源发出的脉冲光后通过二向色镜将其分为两束光，这两束光的波长和 脉宽完全相同。一束光作为触发光，使用一个时间响应快的光电探测器将其 转换为电信号触发时幅转换器开始工作。另一束光进入样品室照射于样品激 发样品发射出荧光，样品产生的荧光信号通过光电倍增管转换为电信号，该 电信号作为时幅转换器停止工作的信号。此时时幅转换器将其记录的时间间 隔传输至多道分析仪，并在多道分析仪的相应时间通道记录一个点。通过长 时间的采集和累积，画出光子数随时间变化的图就是荧光衰减曲线。t c s p c 法具有灵敏度高、测定结果准确、系统误差小的优点，但同时该方法所要求 的仪器结构复杂、价格昂贵，并且测量一次所需要的时间长n “。 ( 2 ) 频闪技术 频闪技术也称作脉冲取样技术，其原理是：使用脉冲光源激发样品，脉 冲光源发出光的同时使用电脉冲启动光电倍增管。光电倍增管启动后按一定 的延迟时间间隔顺序检测样品的荧光强度m 1 。在设置延迟时间间隔时需要保 证其小于所测物质的荧光寿命，这样就可以得到样品被脉冲光源激发后不同 西南科技大学硕士研究生学位论文第9 页 时刻的一系列荧光强度。频闪技术与t c s p c 相比不需要使用重复频率很高 的闪光灯或激光器，并且结构简单，测量时间短。该技术的最早提出是在1 9 6 0 年，但是由于当时所使用的测量仪器的分辨率太差，因此一直没有得到广泛 应用。近年来随着计算机技术的发展，该技术获得了新生，其准确性甚至可 与t c s p c 方法相媲美。 ( 3 ) 相调制技术 相调制与以上两种方法的最大不同是采用正弦调制后的激发光来激发样 品，其激光采用的是连续光源。由于样品所发射的荧光是激发光的受迫响应， 因此荧光和激发光有着相同的圆频率。同时由于所测物质存在荧光寿命，因 此所调制荧光信号在相位上会滞后激发光一个相角。另外相对于激发光，荧 光信号由于被部分解调，所以其振幅比激发光小。利用实验测定的相角和解 调参数( 荧光振幅与激发光振幅的比值) 就可计算出相寿命和调制寿命，在单 指数衰减的物质中两者的值相等。相调制技术所用仪器与通常所使用的荧光 分光计相似，因此具有价格便宜，测量速度快的特点，但是需要使用光调制 器与相灵敏度检测系统日”。 2 2 3激光诱导荧光优点 激光诱导荧光具有极高的灵敏度、检测时间短、样品用量少、可实现在 线检测等优点，因此广泛应用于生物、化学、医学、材料研究等领域【6 1 。如 研究温度变化对材料的合成与制备的影响，特别是低温会引起半导体带隙变 化，从而导致荧光光谱强度与峰值的变化阳“。 与传统的荧光检测技术相比，l i f 检测技术最大的不同是采用激光器作 为激发光源。传统的荧光检测中一般使用氙灯、高压汞灯、卤素灯等作为激 发光源【3 5 】。这些传统荧光检测中使用的常用光源，由于其所包含的频谱范围 很宽，因此尽管目前这些灯的功率很大，如大功率高压氙弧灯的功率可达 5 0 0 w ，但是发光强度仍然不是很高。其次由于传统光源的所发射的光谱都是 连续光谱，作为荧光检测的激发光源时需要通过单色仪或棱镜等进行分光后， 从中选择出某一频率的单色光作为激发光。使用单色仪或棱镜等分光器件不 仅很难得到线宽狭窄的单色激发光并且光强会有所损失，限制了对于微弱信 号的探测和分析。目前传统光源所发出的光是向整个空间发散，因此照射的 距离和效果都有限。因此在检测时使用透镜也很难将其聚焦到很小的面积， 以提高光强和用于测量浓度很低或荧光物质含量很少的样品。即使使用透镜 等光学元件对一些定向性好的传统光源进行聚焦后也存在发散角大的问题。 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 0 页 同时传统光源由于稳定性不好，检测时需要附加参考光路来获取参考信号， 以用于对荧光信号进行校准“。附加参考光路的办法不仅增加了检测系统的 设计和制作的难度，而且也会在一定程度上造成荧光信号的失真。 相对于传统荧光检测技术，l i f 检测技术具有以下优点阳6 】 ( 1 ) 激光参数可以精确控制：根据不同被测分子特性，可以选择不同参 数的激光器或使用可调谐激光器，同时也可以针对特定激光器参数选择合适 的荧光探针分子。 ( 2 ) 激光的方向性和单色性好：激光只朝一个方向发射，光束的发散角 度很小，一般在m r a d 数量级，同时光源发射的光谱线纯净，谱线宽度可窄 到小于l o n m ，使分光器件分辨率高，既具有高光谱分辨率。由于只有在照 射光波长与被测分子的吸收能级相匹配时，才能产生荧光信号，所以选择合 适激发波长的激光光源比一般激发光源的利用效率高。 ( 3 ) 激光的强度大：根据荧光产生的原理，照射光越强，被激发到激发 态的分子越多，产生荧光强度越强，测试的灵敏度就越高。同时可对入射激 光和散射背景噪声使用滤光片滤除，因此易于从背景干扰中检测出荧光信号 得到较大的信噪比。 综上所述由于激光诱导荧光具有高空间分辨率、高时间分辨率、高光谱 分辨率三大优点，已经广泛的应用于弱信号的检测、原位跟踪表征及显微成 像与光谱相结合”。 2 3本章小结 本章介绍了荧光产生的原理与产生的两个过程，即分子的激发和去活化， 使用j a b l o n s k i 图表对其进行了详细的说明。同时详细分析了激光诱导荧光光 谱原理，比较了激光诱导荧光与常规荧光的不同，即主要是使用的激发光源 不同。进一步阐述了激光诱导荧光光谱的分析方法，即稳态光谱和时间分辨 光谱。 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 1 页 3 激光诱导荧光测量系统研究 3 1 系统构成 通过本文前两章对于l i f 检测技术的分析和研究，确定了l i f 检测系统 的基本功能，即测试多种固体和液体样品在不同温度和气压条件下的稳态和 瞬态荧光光谱。因此要求本系统具有良好的通用性以及结构简单，所以系统 设计时采用模块化的设计方法。 整个系统是由光源、光源色散、荧光色散、样品室、信号检测等组件构 成。每个组件采用模块化设计，采用统一接口。各个组件即可以单独使用也 可根据实验要求进行组合与更换。所设计的系统原理框图如图3 1 所示。 图3 1系统原理框图 f i g 3 - is y s t e mf u n c t i o n a lb l o c kd i a g r a m 光源组件包括激光器和光源色散两部分，激光器作用是发射出特定频率 的光激发样品产生荧光，光源色散用于消除激发光中的杂散光，以及对激光 进行整形。荧光色散组件作用是将样品所发射的荧光按波长进行展开后以得 到所需要的光谱。样品室组件包括样品室、低温真空组件和样品台控制系统。 样品室用作放置测试的样品，低温真空组件用于调节测试的样品所在环境的 温度和气压，样品台控制系统可以调整样品的照射角度。信号检测组件包括 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 2 页 了光电倍增管、电流放大器和信号采集器。光电倍增管是将光信号转换为电 流信号，电流放大器将光电倍增管输出的电流信号进行放大和电流电压转 换，信号采集器记录电压信号并传输到终端控制系统。信号检测系统中各个 仪器间的连线采用特性阻抗为5 0 f 2 的同轴电缆，同轴电缆使用满足传输阻抗 和e c m 规范的金属带和薄片组成的屏蔽层。为实现各个分系统之间的方便 连接并为将来扩展系统预留空间，光电倍增管、电流放大器、数据采集卡和 数字示波器都采用b n c 作为信号传输接口。 系统的基本工作原理是：激光器发出某一频率的光，通过光源色散组件 中的棱镜和光阑消除散射光，以及使用透镜进行聚焦后照射于待测样品，激 发样品发出荧光。样品产生的荧光通过荧光色散组件中的单色仪进行分光， 使用光电倍增管将荧光信号转换为电信号。采用低噪声的电流放大进行信号 放大与电流电压转换，并由数据采集系统将模拟信号转换为数字信号输入计 算机进行数据处理。整个系统中使用计算机作为系统的控制平台。 3 2 系统光路设计 3 2 1l i f 常用的系统光路分析 目前所使用的l i f 检测系统光路按照所采用的光学结构不同可分为三种 方式：共聚焦式、透射式和斜入射式b ”。 共聚焦采用共轭焦点技术，即激发光的聚焦点和光阑( 针孔) 分别位于透 镜的两个共轭焦点处n “。由于透镜聚焦点处的光强远远大于样品其它位置， 因此通常样品在聚焦点处被激发出的荧光也远远高于其他位置。荧光检测器 的探测窗口位于光阑的针孔后面，因此所探测的信号只有焦点处的荧光，样 品其它位置所产生的荧光由于不能在光阑的针孔处聚焦而被遮掩。所以共聚 焦式光学结构可大大减小外界杂散光的影响，从而达到高信噪比。但是共聚 焦式光学结构对于激发光路和发射光路的调节，特别是二向色镜的角度及共 焦透镜组的距离要求比较严格。 透射式光学结构中激发光通过透镜聚焦后垂直照射于样品，样品发射的 荧光聚焦后到达探测器。透射式光学系统中可以得到较强的荧光信号，但同 时进入探测器的激发光以及杂散光也很强。因此在实际使用中需要使用滤光 片滤掉杂散光和激发光，所以该光学结构的信噪比与使用的滤光片的滤除光 的性能有很大关系。 斜入射式光学结构是指激发光以4 5 度或3 7 度( 布鲁斯特角) 角照射到样 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 3 页 品上，。斜入射式光学结构适用于多种样品，可分别对激发光路和发射光路 进行调节。当发射光路与激发光路成9 0 度，此时也称为正交式光学结构。使 用正交式光学结构可降低激发光的干扰，能实现较好的信噪比检测。 近年来随着光纤技术的发展，越来越多的仪器使用光纤作为系统光路。 相对于上述由棱镜、透镜、反射镜等各自独立的光学元件构成的系统光路， 使用光纤大大简化了系统光路。提高了系统稳定性，减少了光路调节的麻烦， 有利于l i f 检测仪器的微型化和通用化的发展。但是由于光纤本身存在传输 损耗、材料色散、波导色散等损耗，以及光纤收集光的大小是与数值孔径有 关。因此目前在l i f 检测中使用光纤时的检测限一般都比较高。如s m o l k a 等 研究了空芯光子晶体光纤( h c p c f ) 在高灵敏度l i f 探测中的应用妇“。通过实 验得到可探测的极限浓度为1 0 一m o l l ，这是目前利用光纤的方法探测荧光 所得到的最低浓度h 。 3 2 2 系统光路的分析 上述光学结构各有优点，共聚焦式光学结构以高灵敏度、高信噪比获得 了广泛的应用，但是其结构复杂、不易进行调正。相对于共聚焦式光学结构， 透射式和斜入射式光学结构简单，调节方便。但由于空间位阻，不能使用数 值孔径大的透镜，所以荧光收集效