（农产品加工及贮藏工程专业论文）玉米胚芽水酶法提油工艺的研究及其综合利用.pdf

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0 8 6 8 4 3 x 6 z + 6 7 8 5 8 x 6 + 0 0 0 0 2 3 x 4 ，提油率主要受玉米胚芽颗粒大小、纤维素酶添加量的影响；提油 率与纤维素酶添加量、纤维素酶酶解时间、蛋白酶添加量呈正相关；对于 玉米胚芽颗粒大小在小于1 8 6 目时与提油率呈正相关，在大于1 8 6 目时与 提油率呈现负相关。 关键词：玉米胚芽油；低水分；分步酶解；蛋白；提取 玉米胚芽水酶法提油丁= 艺的研究及其综合利用 a b s t r a c t a q u e o u se n z y m a t i ce x t r a c t i o ni s an e wm e t h o dw h i c hf r e eo i lc a nb e o b t a i n e dt h r o u g he n z y m a t i ch y d r o l y s i sa n dc c n t r i f u g a t i o nw i t h o u tm m e f i a i d r y i n g 办ec o n v e n t i o n a lm e t h o d so fs e p a r a t i n go i la n dp r o t e i na l em e c h a n i c a l e x p r e s s i o na n ds o l v e n te x t r a c t i o n a l t h o u g h 虹g ha r r t o b n t s o fo i lc 缀b e e x t r a c t e db yt h e s em e t h o d s , t h ep r o t e i ni nt h er e s i d u ei sd e n a t u r e dw h i c hl e a d s t ot h er e s i d u eb e i n gl e s su s e f u l t h eo b j e c t i v eo ft h i sd i s s e r t a t i o nw a st o d e v e l o pt h et e c h n o l o g yo fa q u e o u se n z y m a t i ce x t r a c t i o no fc o mg e r mo i la n d s t u d yt h em e t h o d so fp r o t e i ne x t r a c t i o n m a i nr e s u l ta n dc o n c l u s i o na r e 私 f o l l o w s ： lu n d e rt h el a b o r a t o r yc o n d i t i o nt h eo p t i m u mp a r a m e t e r sa l e 勰f o l l o w s ： 1 1 啦r a wm a t e r i a la n dl i q u i dr a t ei s1 ：0 7 8 t h es i z eo fc 0 1g e r mi s1 0 5m e s h a n dc e l l u l o s e sa m o u n to fi n f l u xi s6 9 3 6 i l g ，t h er e a c t i o nt i m ei s4 3h 1 k p r o t e a s e sa m o u n to fi n f l u xi s1 6 7 d t l ，岛r e a c t i o nt i m ei s2 8 h u n d e rt h e s e c o n d i t i o n s t h eo i le x t r a c t i o nr a t ei s7 5 3 8 2n eo p t i m u mp a r a m e t e r so fp r o t e i n se x t r a c t i o n 鹊f o l l o w s ：p hw a s 1 0 8 5 ，t e m p e r a t u r ew a s5 2 ，5 ，r e a c t i o nt i m ew a s1 8 6 h , t h er a wm a t e r i a la n d l i q u i dr a t ew a s1 ：9 2 7 ；t h ed e p o s i tp hi s4 2 t h ep r o t e i n se x t r a c t i o nr a t ew a s 7 6 5 4 u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s 3n 增o i lq u a l i t yo fa q u e o u se n z y m a t i ce x t r a c t i o ni sb e t t e rl h a nc o n v e n t i o n a l m e t h o d sf r o mp h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t y , a n di sa st h e s a m ea sc o n v e n t i o n a l m e t h o d so nt h ec o n t e n to ff a t t ya c i d a l t h o u g ho nt h ec o n t e n to f v i t a m i nei s l o w e rt h a ns o l v e n te x t r a c t i o n , o x i d a t i o nr e s i s t a n c ei sh i g h e rt h a nm e c h a n i c a l e x p r e s s i o n 4n 地m a t h e m a t i c a lm o d e lo fa q u e o u se n z y m a t i c e x t r a c t i n g o i li s y - - 0 5 9 7 9 4 x 2 - 2 ，1 1 5 6 9 x 1 x x 6 - o 。0 0 3 2 0 ) ( 2 2 + 1 2 5 4 5 6 x 5 + o 9 9 9 7 9 x 1 2 + 0 0 0 2 1 2 x 3 - 0 8 6 8 4 3 x 6 2 + 6 7 8 5 8 x 6 + 0 0 0 0 2 3 x 4 n ee x t r a c t i o nr a t ei s m a i n l y i n f l u e n c e db yt h ev o l u m eo ft h e mg e r ma n dt h ec e l l u l o s e sr e c n t i t m e n t 1 1 l e nt h ee x t r a c t i o nr a t ec o r r e l a t e dp o s i t i v e l y 、 ，i t l lt h ec e l l u l o s e sr e c r u i t m e n t 2 山东农业大学硕士学位论文 t h ec e l l u l o s e sr e a c t i o nt i m ea n dt h ep r o t e a s e sr e c r u i t m e n t a n dw h e nt h e v o l u m eo f t h ec o m g e r mi sb e l o wt h e1 8 6m e s h , w h i c hi sc o r r e l a t e dp o s i t i v e l y w i t ht h ee x t r a c t i o nr a t e ，i fn o t , t h ev o l u m eo ft h ec o r l lg r a i ni s n e g a t i v e l y c o r r e l a t e dw i t ht h ee x t r a c t i o nr a t e k e yw o r d ：c o r ng e r mo i l ；l o wm o i s t u r e ；a q u e o u se n z y m a t i ce x t r a c t i o no f m u l t i p l es t e p s ；p r o t e i n ；e x t r a c t i o n 3 玉米胚芽水酶法提油工艺的研究及其综合利用 1 引言 湎脂被人类利用的历史已有数千年，但人们j f 式对油脂进行科学研究 则起步较晚。1 8 1 3 年法国化学家m e c h e v r e u l 研究了油脂皂化原理，分 离、鉴定了从丁酸到硬脂酸及油酸的一系列脂肪酸结构。2 0 世纪初，通过 科学研究逐步认识到“油脂是混甘三酯的混合物”。到2 0 世纪5 0 年代， 先进分析仪器及分析技术在油脂领域中的应用促使油脂科技得到突飞猛 进的发展。油脂制取、加工理论和技术逐渐趋于完善。 在传统油料工艺的预处理过程中，大多采用的是机械和热力学处理方 法。其中机械处理对油籽细胞破坏程度有限；而湿热处理则又会使蛋白质 剧烈变性，影响其进一步的利用价值。酶法提油是指以机械和酶解方法分 解植物细胞壁，从而使油脂得以释放，并结合离心、溶剂浸出、压榨等工 艺提取油脂的一种提油方式。2 0 世纪7 0 年代，许多学者提出酶法提取油 脂的方法，但是由于受到当时酶制剂工业的影响，其研究工作进展较缓慢。 9 0 年代，随着生物技术的迅速发展及人们对饮食营养及保健的重视，酶法 提油工艺得到了迅速的发展；其主要特点是：油脂在温和条件下得以释放， 与传统方法相比具有较好的品质；而且由于酶解在水相中进行，磷脂进入 水相中，因而不需进行脱胶；同时，将酶法提油与蛋白质的综合利用相结 合，不仅能够快速的实现酶法提油的产业化，而且其蛋白制品也能普遍为 大家所接受。因此酶法提油技术的研究具有很重要的意义。 1 1 概述 现代工业上从油料种籽提取植物油的主要方法是压榨法和浸出法( 陈 陶生，1 9 9 0 ) 。在运用压榨法和浸出法提浊过程中，要以机械的或热力的 手段破坏油料细胞，以达到提高出油率的目的( g a u o w a y m ，j p c l e a n i n g ， 1 9 7 6 ) ，这样的操作虽然使油料的出油率提高，但是油料提油后蛋白变性 严重，从而使其进一步利用变得困难。另外在少量提取油脂时还用到水代 发，如我国传统的芝麻水代取油，要将芝麻炒至冒青烟，此法提油效果不 及压榨法和溶剂浸出法，同时也造成了蛋白质的严重变性( 雕鸿荪，1 9 9 0 ) 。 为同时利用油料的油脂和蛋白质，1 9 5 6 年s u g a r m a n ( s u g a r m a n ，1 9 8 3 ) 首创了以水作为溶剂沿用浓缩蛋白的生产工艺从花生中同时分离油和回 4 山东农业大学硕士学位论文 收分离蛋白质。虽然提油率不高，但是首次在油脂提取工艺中达到了同时 利用油脂与蛋白质的耳的。随着其他科学家对此法的研究提油率进一步提 高，但此方法应用于含油量低的油料，如大豆、胚芽，几乎得不到油 ( l a w h o n , j t ，1 9 8 1 王璋，1 9 9 4 ) 。 1 9 6 7 年，s o r o a ( s o r o a , j m ，1 9 6 7 ) 证实了酶法处理油籽和油果后能 提高油脂的提取率；其主要原因是通过酶解作用可以破坏油料细胞壁的结 构，从而提高油脂的提取率。但在当时由于酶价格太昂贵，使该法的研究 和工业化应用受到限制。到了7 0 年代酶法提油技术得到进一步发展，1 9 7 8 年，a l d e rn i s s e n 提出了大豆蛋白酶法改性制各等电点可溶大豆水解蛋白 ( i s s p h ) 的工艺，为酶法分离大豆油和蛋白质奠定基础。1 9 7 9 年o l s e n 将 微生物蛋白酶a l c a l a s e 运用到大豆油和蛋白质的水法分离中，用酶降解蛋 白质分子以释放其所吸附的油，使油的得率接近6 0 ，蛋白质的得率接近 4 0 。迸入8 0 年代，酶法提油工艺受到了更多国外学者的关注，他们在 大豆、油菜籽、葵花籽等多种油脂展开了更加深入的研究。1 9 8 3 年f u l l b r o o k 等人使用蛋白水解酶和对细胞壁有降解作用的酶从西瓜籽、大豆和菜籽制 取蛋白质和油脂，研究中大豆油回收率毫达9 0 ，菜籽油为7 0 7 2 。1 9 8 6 年m c g l o n e 等人用聚半乳糖醛酸酶、舡淀粉酶和蛋白酶来提取椰子油，油 脂收率为7 4 8 0 。1 9 8 8 年s o s u l s k i 等人对c a n o l a 油料进行酶解预处理 后再进行己烷浸出，可明显缩短浸出时间，提高浸出效率。1 9 9 3 年s o s u l s k i 等人对c a n o l a 细胞组织用碳水化合物酶处理后，油脂流动性增加，从而使 提油率与压榨法相比提高2 0 ，但其油质量与冷榨法相比有所下降 ( s o s u i s k ik ，1 9 9 3 ) 。1 9 9 4 年，t a n o - d e b r a h 等用蛋白酶为主体，辅以 纤维素酶和半纤维素酶处理牛油树籽，使出油率提高2 0 ，他认为采用对 细胞结构有降解作用的酶处理牛油树籽可提高出油率。1 9 9 6 年，d o m i n g u e z 等采用响应面评估了油料的水分含量、酶油料及保温时间对榨油机工作效 率、蛋白质表观消化系数、纤维素含量及色值的影响。1 9 9 6 年，t a n o - d e b r a h 等研究经碳水化合物酶处理后牛油树耔的微观结构，电镜分析结果表明酶 处理能急剧降解牛油树籽细胞壁的结构，从而强有力地证实了酶解提油工 艺的科学性。 ， 玉米胚芽水酶法提油丁艺的研究及j e 综合利用 1 2 酶法提取植物油的工艺 根据酶作用环境，酶法提油工艺分为水酶提油工艺、溶剂水相酶法工 艺、低水分酶工艺。采用何种工艺与油料的种类及性质有关。植物油料酶 法提油工艺通常指水酶法提油工艺。 1 2 1 水酶法提油工艺 水酶法提油工艺是将脱皮后的高油分油籽先磨成浆料，同时加水，而 后加酶，水作为分散相，酶在此水相中进行水解，使油从固体粒子中分离 出来，利用非油成分( 蛋自质和碳水化合物) 对油和水的亲和差异，以及 油水比重不同而将油和非油成分分离。此工艺是在以水为溶剂，在同时提 取油脂及油料蛋白工艺的基础上发展起来的，是至今研究最多的酶法提油 工艺。酶处理后，经离心或压滤固液分离，固相为油料蛋白和残渣，经干 燥后可用于蛋白和饲料生产，液相破乳后采用离心或滗洗等方法取得油和 蛋白质。该工艺可用于花生、向日葵、大豆、棉籽等的提油。其基本工艺 路线为： 玉米胚芽斗破碎过筛 调整固液e 匕_ + 酶降解处理固液分 离浓缩破乳卜分离的油脂 1 2 2 溶剂水相酶解工艺 溶剂水相酶法工艺是在水酶法提油工艺基础上改进而来，其提油工艺 与水酶法相似只是在酶解前或酶解后加入有机溶剂从而提高提油率， f u l l b o o k 研究表明：酶解前加入有机溶剂提油率高于酶解后。酶解结束后， 酶解液经离心或滗析，使溶剂相与水相分离，再经蒸馏将油中溶剂除去。 该工艺一般用于含油量高的油料果实和种籽的提油。 1 2 3 低水分酶解工艺 低水分酶工艺是指提油前降低油料水分含量，经酶解后采用压榨和浸 出法提油。此方法比上述两种方法废水产生少，但酶在低水分下的作用效 果较差，且不均匀，酶解后需要干燥到更低的水分含量，才能应用于溶剂 的浸提或压榨。因此，只适合高油软质油料种籽的提油。 6 山东农业大学硕”e 学位论文 1 3 影响酶解提油的因素 1 3 1 油料的破碎程度 油料的破碎程度是影响酶解效率和提油效果的重要因素之一。一般情 况下，破碎程度越大，提油效果越好。s o s c u l s k i 等人对三种不同预处理的 油菜籽的研究表明：原料未经破碎而进行酶解时，提油率为删( 油脂 原料) ，而原料经碾压( 辊隙：o 8 8r a m ) 后酶解，提油率为3 9 8 ，原料碾压 酶解后进一步破碎，提油率高达4 0 4 。破碎程度对提油效果的影响还与 油料种类及采用酶解工艺有关，d o m i n g u e z 等采用低水分酶解工艺提取大 豆油时，破碎粒度在o 7 5 1 0 0m m 最好；t a n o d e b r a h 等( t a n o d e b r a h ， 1 9 8 1 ) 认为将油料研磨成很细的粒子，才能获得较高的提油率。这是由于 研磨细度直接影响酶解过程的底物浓度，以及酶的作用面积。在酶解工艺 中，油料破碎程度不仅影响酶解效果，而且还影响清油得率；一般油料粒 度细有利于酶解作用，但若粒度过细却会使酶解后酶解液的乳化程度加 重，生产中一般以4 0 目为宜。 1 3 2 酶 研究文献表明，与非酶促处理相比，经酶处理后油脂的提取率上升。 s o s u l k i ( g a l l o w a y mj p ，1 9 7 6 ) 等人对c a n o l a 菜籽进行酶处理再压榨， 未经酶处理的油料压榨出油率仅7 2 ，经酶处理后可达9 0 - - 9 3 。 1 3 2 1 酶的种类和浓度 酶解作用的效果与油籽细胞的组成密切相关，酶的专一性，决定了采 用单一纯酶在酶解工艺中有很大的局限性。总的来说，对油料细胞壁复合 体有降解作用的酶均有助于提油。因此，选择合适的几种酶混合使用，将 会使细胞降解更彻底、效果更好。同时试验发现，酶的作用效果与油料及 采用的工艺有关。m c g l o n 等( s o r o a j m1 9 6 7 ) 采用水酶法提油工艺提取 椰子油时，酶的作用顺序为复合酶( p c r + a a m + p r ) a m p r ，而s o s c u l s k i ( s o s c u l s k i ，1 9 9 3 ) 等发现采用低水分酶法工艺提取菜子油时，酶作用效果 为复合酶 b p g p e h e c e 。从以上试验结果来看，一般情况下复合酶的 作用效果优于单一酶。 酶浓度( 用量) 的确定，是直接影响工艺效果和经济成本的一项重要技 术参数。一般酶浓度的增加，会提高出油率和分离效果，但也存在个较 7 二氍米胚芽水酶法提油工艺的研究及其综合利用 为适宜的酶浓度范围。如用酶处理法处理油橄榄果肉时，纤维素酶适宜浓 度为2 5 3 。0g t , ，果胶酶适宜浓度为1 5 2 o g l ，酸性蛋白酶适宜浓度 为1 7 2 3 e ：l 。单一使用以上三种酶对油的提取率影响不大，而使用纤维 素酶与果胶酶或使用纤维素酶与酸性蛋白酶都比单一使用两倍浓度的纤 维素酶效果好。当酶的添加量达到一定浓度后，继续提高浓度对提高油的 提取率影响不大，因此在应用中考虑到经济问题，酶的使用度一般为o 5 1 0 。 i 3 2 2 酶解温度、p h 、时间 酶解温度、p h 、时间是与酶解效果及出油率密切相关的工艺条件。酶 解温度不同最高与最低提油率相差2 0 。一般情况下，酶解温度控制在 4 0 5 5 ，也有采用变温操作工艺的。酶解反应的p h 随工艺所采用的 酶类而异，p h 既影响酶的活性，又影响油与植物蛋白的分离提取。p h 值 对酶反应的影响，主要体现在对酶活力的影响，酶制剂中纤维素酶的最适 p h 大多偏酸性p h 4 5 ，因而油料工艺p h 一般以4 5 5 5 较为适宜。酶 解时间随油料和酶的种类各异，酶解时间一般控制0 3 1 0 h 。在固体油料 中酶解时间较长，水相中较短，适宜的酶解时间应从油料细胞成分及提油 的效果两方面考虑确定。 1 3 3 其他影响因素 酶解提油的效果还与所采用的工程设备及是否使用添加剂有关。 t a n o d e b r a h 等人采用水酶法提油工艺提取牛油树籽时发现，离心比震荡 选法提油率高得多。另外发现离心机的转速达到1 0 0 0 0 r p m 时，提油率最 高。在酶解过程和提油过程中添加一些物质，可提高酶解效果，增加提油 率。如在处理橄榄浆时，常加入2 4 的氯化钠或o 5 1 5 的氯化钙以 提高提油率。另外在提油过程中加入甲基纤维素、不溶性聚乙烯氮戊环酮 等添加剂，可提高2 5 的提油率。 1 4 本课题研究的内容、目的和意义 1 4 1 选题的目的 玉米胚芽油是一种营养很丰富的食用油，其主要成分为不饱和脂肪酸， 其中以亚油酸含量为最多，其次为亚麻酸，因为不饱和的脂肪酸是人体中 不能合成而又不可缺少的，因此有“营养健康油”之称。另外玉米胚芽油含 3 山东农业大学硕士学位论文 有人体必须的天然脂肪酸及维生素e 等天然抗衰剂。可作为化妆品的油性 原料用于护肤及护发等多种化妆品中，使头发、皮肤润泽、防止衰老：玉 米胚芽的蛋白大部分是白蛋白和球蛋白，其中的赖氨酸和色氨酸含量很 高，且富含其他人体必需的氨基酸，其生物学价值达6 4 7 2 ，其氨基 酸组分和鸡蛋白接近，因此是一种较好的营养强化剂。所以玉米胚芽的合 理开发和利用就显得尤为重要了。 目前，常用的玉米胚芽制油方法与其他油料基本相同，有压榨法、直 接浸出法和预榨浸出法。其中压榨法制油工艺需要经强烈湿热处理( 蒸炒) ， 出油率约为8 0 左右。直接浸出法和预榨浸出法得率较高，但己烷有一定 的毒性。传统方法制得的玉米胚芽含有较多的氧化物和有色物质，它们会 在压榨和浸出过程中进入油中，给油脂的精炼带来困难。且蛋白质变性严 重，限制了蛋白质的进一步利用。 水酶法提油的出现为同时利用油脂和蛋白质提供了可能，但是国内外 学者在研究水酶法时多采用蒸汽或胶体磨进行前处理，耗能较高，所需水 量较大，因此本研究旨在找出一种能耗低，用水量较少的方法对水酶法进 行改进，从而达到使水酶法提油工业化的且的。 1 4 2 研究内容 1 4 2 1 玉米胚芽提油过程中酶添加顺序的确定采用交叉试验研究酶的最 佳添加顺序。 1 4 2 2 最佳酶解条件的确定单因素试验确定酶解最佳玉米胚芽颗粒大 小、料液比、纤维素酶添加量、蛋白酶添加量、果胶酶添加量及各种酶 的反应时间并运用b o xb e h n k e n 试验设计确定最佳酶解条件。 1 4 2 3 残渣中油脂提取工艺的确定对残渣中的油脂进行浸提法提取，以 确定最优的提取工艺。 1 4 2 4 玉米胚芽残渣中蛋白质提取工艺的确定对玉米胚芽残渣中的蛋白 质进行提取，并采用b o xb e h n k e n 试验设计确定最佳提取条件。 1 4 2 5 研究水酶法提油工艺对玉米胚芽油的质量的影响以及不同的制备方 法对所得玉米胚芽油质量的影响。 1 4 2 6 水酶法提油数学模型的建立对水酶法提油的整个工艺进行分析确 定提油模型。 9 玉米胚芽永酶法提油t 艺的研究及其综合利用 1 4 3 研究意义 水酶法是近年来开始研究和利用的一种新的提油工艺，它是以机械和 酶解为手段降解植物细胞壁，使油脂得以释放。水酶法提油最早被用于椰 子，随后又逐渐用于菜子、棉子、葵花子、可可和棕榈油等。研究表明， 由于油脂在温和条件下得以释放，因此与传统方法相比具有较好的品质： 而且由于酶解在水相中进行，磷脂进入水相中，因而不需进行脱胶；最后， 酶解工艺简单，所需能量少。 因此本课题的研究对于节约能源，增加可利用的蛋白质资源，提高提 取油脂的质量具有重要意义。 1 0 山东农业大学硕士学位论文 2 材料与方法 2 1 原料 玉米胚芽 酶制剂 2 2 主要仪器 a y 2 2 0 电子分析天平 1 0 1 a - 1 型电热鼓风干燥箱 电动搅拌器 仪表恒温水浴锅 s h z w ：c 型循环水式多用真空泵 p h s 2 5 酸度计 l x j b 多管离心机 u v - 9 2 0 0 紫外可见分光光度计 珏0 8 l o 红外光谱仪 d m a x - r c 型x 射线衍射仪 2 3 主要化学试剂 醋酸 硫代硫酸钠 碳酸钠 无水醋酸钠 冰醋酸 3 ，5 - 二硝基水杨酸( d n s ) 无水酒石酸钾钠 无水乙醇 柠檬酸 诸城兴贸玉米开发有限公司 和氏璧生物技术有限公司 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 日本岛津公司 黄骅市卸甲综合电器厂 金坛市中大仪器厂 黄骅综合电器厂 河南巩义市英峪仪器厂 上海伟业仪器厂 上海安亭科学仪器厂 北京市瑞利分析仪器公司 日本分光株式会社 日本r i g a k u 公司 天津市大茂化学试剂厂 上海伯奥生物科技有限公司 天津市大茂化学试剂厂 天津市红岩化学试剂厂 天津市红岩化学试剂厂 天津市大茂化学试剂厂 上海伯奥生物科技有限公司 天津市红岩化学试剂厂 天津市红岩化学试剂厂 忑米胚芽水酶法提油丁艺的研究及，e 综合利用 2 4 研究方法 2 4 1 水酶法提油实验路线的确定 圈 宁 山东农业大学硕士学位论文 2 4 2 水酶法提油单因素实验 过单因子试验，分别研究体系料液比、玉米胚芽颗粒大小、纤维素酶 添加量、果胶酶添加量、纤维素酶酶解时间、果胶酶酶解时间对水酶法提 油提油率的影响，确定出水酶法提油提的最佳工艺参数范围。 2 4 3b o x b e h n k e n 六因素三水平试验设计 在单因子实验的基础上，设计了六因素三水平b o x - b e h n k e n 响应面试 验。以提油率为相应值，确定水酶法提油的最佳工艺参数。 2 4 4 水酶法提油数学模型的建立 在所有实验的基础上，运用s a s 程序对所有的实验数据进行逐步回 归，确定水酶法提油的数学模型，并最终确定水酶法提油各影响因素对提 油率影响的相关度。 2 5 分析测定方法 2 5 1 淀粉水分含量测定( 黄伟坤，1 9 9 5 ) 精确称取样品2 5 9 ，簧于烘至恒重的称量瓶中，在1 3 0 1 2 的烘箱中烘 2 - 3 h ，直至前后两次不超过0 0 0 1 9 为止。 2 5 2 玉米胚芽灰分的测定( 黄伟坤，1 9 9 5 ) 精确称取玉米胚芽样品5 9 ，均匀分布洗净并在高温电阻炉内加热 ( 9 0 0 士2 5 ) 处理3 0 r a i n 后冷却的坩埚内。将坩埚置于灰化炉加热，直 至样品完全炭化至无烟，即刻将坩埚放入高温电阻炉内，将温度升高至 9 0 0 。c 士2 5 c ，并保持此温度至剩余的碳全部消失或无黑色炭粒为止。关闭 电源，待温度降至2 0 0 时，将坩埚取出放入干燥器内，加盖冷却到室温， 精确称重。 2 5 3 纤维素酶酶活性的测定( 彭志荚，2 0 0 2 ) 2 5 3 1 标准曲线的绘制 取7 支带有2 5 m l 刻度的试管，按下表取试剂并配置后测定其在5 5 0 n m 下的吸光度。 玉米胚芽水酶法提油r t 艺的研究及其综合利用 纤维素酶酶活测定的标准曲线如下图所示： 葡萄糖含量 0 0 7 o 0 6 0 0 5 一 加0 0 4 嚣o 0 3 摹o 0 2 o o l o 0 ，9 2 4 5 x4 - 0 0 2 1 4 r 2 = a9 9 8 6 00 5l 吸光度 图2 1 纤维素酶测定标准曲线 f i 螭1t h es t a n d a r dc b r v eo f c e l l u l o s ed e t e r m i n e 2 5 3 2 纤维素酶酶活的测定 取4 支2 5 m l 刻度的试管，各加o 2 5 m l 酶液。取其中3 支作为测定管， 各管再加3 m lc m c ( 1 ) ，另一支作空白管，同时加p h 4 8 醋酸缓冲液 3 m l 。然后置5 0 士o 5 恒温水浴6 0 r a i n 。分别加入d n s 显色液3 m l 。放沸 水浴锅反应1 0 m i n ，冷却后加水至2 5 m l ，以空白管调零点，在5 5 0 n m 吸收 1 4 山东农业大学硕士学位论文 峰下用分光光度计测o d 值。将测得的各平行样求o d 值的均值。计算纤 维素酶类的活性单位依据以下公式 纤维素酶活力= ( ( b x + a ) x n x l 0 0 0 ) ( o 2 5 0 u g ( r , d ) 式中x ：为样品o d 值的平均值 b 和a 由葡萄糖浓度和相应的o d 值通过回归方程求的 n ：酶粉( 液) 的稀释倍数 t ：酶促反应的时间 0 2 5 ：所加酶液的量 2 5 4 蛋白酶酶活性的测定( 彭志英，2 0 0 2 ) 2 5 4 1 酶样的制备 准确称取o 1 9 固体酶或移取0 1 m l 液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶 解并用玻璃棒捣研，然后将上液倒入容量瓶，沉渣中再添入少量缓冲液捣 研多次，最后全部移入容量瓶，稀释到刻度，用四层纱布过滤，滤液可作为 测试酶用。该酶已经稀释1 0 0 倍。 2 5 4 2 标准曲线的绘制 l 酪氨酸标准溶液按下表配制。 表2 2l - 酪氨酸标准溶液的配制 t a b l e2 2t h es t a n d a r ds o l u t i o no f lt y r o s i n e 试管号01 2345 取1 鹇，m l 酪氨溶液( m 1 ) 0 1 2 345 蒸馏水( m 1 ) 1 098 765 酪氨酸实际浓度( r t g m 1 ) 0 1 02 03 04 05 0 分别取上述溶液各1 o o “( 须做平行试验) ，各加0 4 m o l l 碳酸钠溶液 5 0 0 m l 。福林试剂使用溶液1 0 p g ml o m l ，置于4 0 + 0 2 1 2 水浴中显色2 0 m i n , 取出用分光光度计于波长6 8 0 n m ，比色，以不含酪氨酸的0 管为空白管调 零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐 标，绘翎标准曲线如下图所示。 玉米胚芽水酶法提油工艺的研究及其综合利用 6 0 ：5 0 柏 0 韬3 0 鏊2 0 晡 谴1 0 d 0 o 1 0 20 3o 10 5o 6 吸光鹰 图2 2 酪氨酸标准曲线 弼蜉2t h es t a n d a r dc u r v eo f t y r o s i n e 2 5 4 3 蛋白酶酶活性的测定 将酪素溶液放入4 0 恒温水裕中，预热5 m i n 。取4 支试管，各加入 l m l 酶液，取一支作为空白管，加2 m l 三氯乙酸，其他3 管作为测试管各 加入l m l 酪素，摇匀，4 0 保温1 0 m i n ，取出试管。3 支测试管中各加入 2 m l 三氯乙酸，空白管中加l m l 酪素。静置1 0 m i n ，过滤沉淀，各取l m l 滤液分别加0 4 m o l f l 的n a 2 c 0 3 5 m l 。福林试裁1 融。在4 0 显色2 0 m i n 。 6 8 0 n m 处测o d 值。以空白管调零点。将测得的各平行样求o d 值的均值。 依据以下公式： 蛋白酶的活力= a k x 4 1 0 x nu g ( m ) a ：样品平行试验的平均o d 值： k ：吸光常数； 4 ：反应试剂的总体积； 1 0 ：酶解反应时间； n ：酶液稀释总倍数 2 5 5 果胶酶活性的测定( 彭志英，2 0 0 2 ) 2 5 5 1 酶样的制备 准确称取1 0 0 0 9 固体酶或移取l m l 液体酶样，定容至1 0 0 m l ，于5 0 c 水浴浸取1 h ，过滤，滤液为供试酶液。则该酶已经稀释1 0 0 倍。 2 5 5 1 果胶酶活性的测定 1 6 山东农业大学硕士学位论文 取l 果胶酶1 0 m l 加入5 m l 酶液和5 m l 蒸馏水( p h 3 5 ) ，在5 0 水 浴中保温反应l h 。取出后加热煮沸2 3 m i n ，冷却后，补水至2 0 m l 。取5 m l 反应液于1 0 0 m l 碘量瓶中，加1 m 碳酸钠溶液l m ! ，0 i n 碘液5 m l ，摇匀， 具塞，于室温暗处下放置2 0 r a i n 。取出后加2 n 硫酸2 m l ，立即用o 0 5 n 硫 代硫酸钠溶液滴定至浅黄色，加l m l 0 5 可溶性淀粉溶液，继续滴定至蓝 色消失为止。空白试验以煮沸失活的酶液或蒸馏水代替酶液进行滴定。每 个酶样最少做两个平行样。将测得的各平行样求o d 值的均值。依据以下 公式计算果胶酶的酶活： 酶的活力= ( ( b - a ) x n x 0 5 1 7 5 x 2 0 n 1 0 0 0 ) ( c x d x w x t ) u g ( m _ 1 ) 式中； a ：样品滴定所消耗硫代硫酸钠的毫升数； ， b ：空白滴定所消耗硫代硫酸钠的毫升数； n ：硫代硫酸钠摩尔浓度； 0 5 ：l 当量硫代硫酸钠相当于0 5 当量半乳糖醛酸； 2 0 ：反应液总体积； c ：酶液体积以l m l 计； d ：吸取反应液； n ：稀释倍数； t ：酶反应时间； w ：酶粉重量g 或酶液体积m l 2 5 6 脂肪酸组成及含量的分析( 黄伟坤，1 9 9 5 ) 分别取三种不同提取方法所得的玉米胚芽油按g b 佴1 7 3 7 6 - 9 8 ， g b ，- 1 7 3 7 7 9 8 ，动植物油脂脂肪酸甲酯气相色谱法分析测定。 2 5 6 1 样品的甲醋化： 称取0 5 9 玉米胚芽油脂放入5 0 m l 烧瓶中，加入适量k o h c h 3 0 h 溶 液( 约o 5 m o l 1 ) 及沸石，在水浴上回流直至油滴消失。用移液管从冷凝器顶 部加入适量的b f 3 - c h s o h 溶液于沸腾的溶液中，沸腾2 m i n ，经冷凝器顶 部加入适量的己烷于沸腾的混合物中，继续煮沸lr a i n ，停止加热。冷却 至室温后取下冷凝器，加入少量饱和n a c l 溶液并轻摇烧瓶数次，继续加 入n a c l 溶液至烧瓶顶部，吸取己烷层约l m l 于试管中，加入适量无水 1 7 玉米胚芽水酶法提油t 艺的研究及其综合利用 n a 2 s 0 4 ，即可取适l 样品直接进样分析。 2 5 6 2 脂肪酸甲酯的气相色谱分析： 气相色谱仪器，a g i l e n t 6 8 9 0 毛细管柱气相色谱仪，每次进样量为 2 0 皿，手动进样，载气为h e ，流速为2 3 e m s ，f i d 检测器，程序升温1 5 8 里! l 国0 0 。c ( 2 m i n ) ，保持l o m i n ，进样器与检测器温度分别为2 3 0 。c 和 2 5 0 c ，根据标准物质色谱峰保留时间定性，积分仪测定峰面积归一化法 定量。 2 5 7v e 组成及含量的分析( 黄伟坤，1 9 9 5 ) v e 的组成与含量的测定：r p h p l c 法色谱仪器：i i p 1 1 0 0 液相色谱仪， 流动相：甲醇和水- - 9 8 ：2 ，临用前脱气，c 1 8 柱，预柱：u l t r a s p h e r e o d sl o p m , 4 m mx4 s c m ，分析柱：u t r a s p h e r e o d s s p ，m , 4 6 m mx2 5 e m ，紫外检测器 波长：3 0 0 r i m ，量程o 0 2 ，迸样量：2 0 i _ t l ，流速：1 7 m l m i n ，用标准物质色谱峰 的保留时间定性，积分仪测定峰面积归一化法定量。 2 5 8 油脂的氧化稳定性分析 油脂的氧化稳定性用o s i ( o x i d a t i v es t a b i l i t yi n d e x ) 表示。 分别取三种不同提取方法所得的玉米胚芽油，并以市售大豆油脂作为 对照，每个样品3 m l 放入r a n c i m a t 仪反应管中，加热到1 1 0 的热空气， 以7 l h 的速度通入油样中强制氧化，氧化挥发物通入水中，测定水的电导 率变化，确定油脂的氧化诱导时间。每个样品重复测定3 次，取其平均值。 1 8 山东农业大学硕士学位论文 3 结果与分析 3 1 纤维素酶对玉米胚芽细胞壁破坏作用的研究 将破碎后的玉米胚芽调整料液比至1 ：08 后，加入纤维素酶进行酶 解，酶解过程中每隔1 h 取样，用固绿进行染色，观察纤维素酶对细胞壁 的破坏情况，如下图所示： 图3 1 纤维素酶酶解4 h 4 0 0 倍显微镜照片 f i g3 1t h em i c r o s c o p ep h o t oo f c e l l u l o s er e a c t i o nf o r4h o u r s 图3 2 纤维素酶酶解5 h 4 0 0 倍 显微镜照片 f 电3 2t h em i c r o s c o p ep h o t oo f c e l l u l o s er e a c t i o nf o r5h o u r s 图3 3 纤维素酶酶解6 h 4 0 0 倍显微镜照片 f i g 3 3t h e m i c r o s c o p ep h o t oo f c e l l u l o s er e a c t i o nf o r6h o u r s 1 9 玉米胚芽水酶法提油工艺的研究及其综合利用 由图3 13 23 3 可以看出，纤维素酶在酶解至4 h 时对于玉米胚芽细 胞壁破坏作用不显著，在图片中只看到较为完整的玉米胚芽颗粒，继续酶 解至5 h 时，玉米胚芽细胞壁已经开始破裂，图片中己出现破碎的细胞， 当酶解至6 h 时，图片中已经没有完整的细胞存在，这时玉米胚芽细胞的 初生壁部分已被完全破坏，但玉米胚芽仍被一层胶状的膜所包裹，这层膜 就是玉米胚芽细胞的衬质部分，如果此时加入蛋白酶或果胶酶对其衬质部 分进行酶解一定能够快速的破坏玉米胚芽细胞壁，从而提高清油提取率。 因此，有必要对酶的添加顺序进行确定，以更加快速和完整的破坏玉米胚 芽细胞壁。 3 2 最佳酶解顺序的确定 将粉碎至1 0 0 目的胚芽粉加入到p h = 4 8 的柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液 中，采用料液比l ：1 ，纤维素酶加入量5 0 0 0 u g ，蛋白酶加入量1 0 0 0 u g ， 果胶酶1 5 0 0 u g ，酶解温度5 0 ，采用分步酶解时酶解时间都为6 h 。对各 种酶的不同添加顺序进行对比试验其结果如下图所示； 7 0 6 5 ，、6 0 蕾 v 5 5 糌 苍5 0 襄4 5 蜒4 0 3 5 3 0 l 2 345 图3 4 分步酶解对清油提取率的影响 f i g3 4t h e e f f e c to f a q u e o u se n z y m a t i ce x t r a c t i o no f m u l t i p l es t e p so i lt h eo i l e x t r a c t i o nr a t e l 先加纤维素酶后加蛋白酶2 先加纤维素酶后加果胶酶3 先加纤维素酶后加果胶酶 和蛋白酶4 先加果胶酶后加纤维素酶最后加蛋白酶5 纤维素酶、蛋白酶和果胶酶同 时添加 2 0 山东农业大学硕士学位论文 由图3 4 可以看出，分步添加纤维素酶、果胶酶和蛋白酶与同时添加 相比提油率有明显的提高，其中以