（运动人体科学专业论文）低氧、离心运动对结蛋白的分布和表达的影响.pdf

北京体育大学 2004 届博士研究生学位毕业论文 1 缩 略 词 表 英文缩写 英文全称 中文名称 a t p a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e 三磷酸腺苷 c a l p a i n c a l c i u m a c t i v a t e d n e u t r a l p r o t e a s e c a n p 钙激活中性蛋白酶 c a m p c y c l i c a d e n o s i n e m o n o p h a s p h a t e 环磷酸腺苷 c g m p c y c l i c g u a n o s i n e m o n o p h o s p h a t e 环磷酸鸟苷 d a b 3 , 3 - d i a m i n o b e n z i d i n e 3 , 3二氨基联苯胺 d m d d u c h e n n e s m u s c u l a r d y s t r o p h y d u c h e n n e 氏肌营养不良 d t t d i t h i o t h r e i t o l 二硫代苏糖醇 e d t a e t h y l e n e d i a m i n o t e t r a a c e t i c 乙二胺四乙酸 e g t a e t h y l e n e g l y c o l b i s ( 2 - a m i n o e t h y l ) e t h e r - n , n , n , n - t e t r a a c e t i c a c i d 乙二醇双2 - 二氨基乙基乙醚 - n , n , n , n - 四乙酸 i f s i n t e r m e d i a t e f i l a m e n t s 中间纤维 i l - 1 , i l - 6 i n t e r l e u k i n - 1 , i n t e r l e u k i n - 6 白细胞介素- 1 , 白细胞介素- 6 k / o k n o c k o u t 敲掉 k d a k i l o d a l t o n 千道尔顿分子量单位 l m g d 2 a l i m b g i r d l e m u s c u l a r d y s t r o p h y 肢带肌营养不良 2 a 症 l s b l o w - s a l t b u f f e r 低盐缓冲液 m p o m y e l o p e r o x i d a s e 髓过氧化物酶 p b s p h o s p h a t e b u f f e r e d s o l u t i o n 磷酸盐缓冲液 p d g f p l a t e l e t d e r i v e d g r o w t h f a c t o r 血小板趋化因子 p m s f p h e n y l m e t h y s u l f o n y l f l u o r i d e 苯甲基硫酰氟化物 r t - p c r r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n 逆转录聚合酶链式反应 t n f t u m o r n e c r o s i s f a c t o r 肿瘤坏死因子 t r i s t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 北京体育大学 2004 届博士研究生学位毕业论文 2 中 文 摘 要 低氧离心运动对结蛋白分布和表达的影响 博 士 研 究 生袁 建 琴 指 导 老 师 王 瑞 元 教 授 本研究目的在于从肌肉特异性骨架蛋白 d e s m i n的角度探讨离心运动造成的骨骼肌损 伤同时观察低氧对肌肉损伤的影响采用 1 2 8 只7 周龄雌性 s d 大鼠为实验对象一次 性跑台离心运动至力竭的损伤模型跑台坡度为- 1 6速度 1 6 米/ 分低氧组动物放置在 氧分压为 1 2 . 7 的低氧舱中相当于海拔 4 0 0 0米高度低氧组动物先在低氧舱中适应 3 天然后分为低氧安静对照即刻1 2 4 7 天组和低氧力竭运动后即刻1 2 4 7 天 组常氧组设安静对照组和一次性力竭运动后即刻1 2 4和 7天组动物分组共计 1 6 组每组 8 只大鼠所有动物力竭运动均在常氧环境下进行 本文主要结果为 1 离心运动后肌纤维局部 d e s m i n染色不同程度不同范围地出现了变淡模糊 甚至缺失出现 d e s m i n阴性纤维表明 d e s m i n细胞骨架破坏是离心运动诱导损伤的形态 学标志 2 d e s m i n免疫组化染色可以作为评估骨骼肌早期损伤的工具离心运动力竭后 d e s m i n 免疫组化染色下降从即刻开始是损伤早期的表现且预示着肌纤维进一步损伤和 坏死在离心运动后第 4 天或更早部分肌原纤维启动重建损伤后的恢复过程中 d e s m i n 表达的增加可能与肌原纤维重建有关 3 d e s m i n 表达主要在转录水平调节离心运动后 d e s m i n m r n a 下调 4 离心运动后 c a l p a i n总活性升高激活的 c a l p a i n开始选择性降解底物蛋白 d e s m i n 降解随之增加 d e s m i n 纤维丝断裂 肌原纤维的固定丧失 引起 z 线流和 a 带紊乱 另外c a l p a i n自溶降解生成的多肽片断可能成为化学趋化剂与中性粒细胞对损伤的早 期应答有关 5 从力竭运动时间d e s m i n 蛋白和 m r n a 表达c a l p a i n 酶活性变化炎症细胞浸 润等几个方面分析本实验条件下的低氧对离心运动所致损伤的影响发现各方面的变化 趋势基本一致表明低氧和常氧状态下大鼠骨骼肌损伤进程相似低氧不能明显加速或加 深损伤 关 键 词 低氧 离心运动 肌肉损伤 结蛋白 钙激活中性蛋白酶 北京体育大学 2004 届博士研究生学位毕业论文 3 a b s t r a c t e f f e c t s o f e c c e n t r i c e x e r c i s e o n d i s t r i b u t i o n a n d e x p r e s s i o n o f d e s m i n i n s k e l e t a l m u s c l e s o f r a t s u n d e r h y p o x i c c o n d i t i o n p h . d . c a n d i d a t e : y u a n j i a n q i n s u p e r v i s o r : p r o f . w a n g r u i y u a n the purpose of this study was to investigate skeletal muscle injury induced by eccentric exercise from the angle of desmin cytoskeleton and to observe effects of hypoxia on muscle injuries. 128 female sd rats of 7-week old were adopted as the objects of this study and the model of injury for a bout of exhaustive eccentric exercise on a treadmill. the gradient of the treadmill was -16and the speed was 16m/min. the rats were randomly divided into the hypoxic groups, which was placed in the hypoxic cabin with the po2 of 12.7%, corresponding to the altitude of 4000m. they were accommodated to this condition for 3 days first, and then they were divided into the hypoxic sedentary control groups (killed on 0,1,2,4,7 days after exercise) and hypoxic exhaustive exercise groups (killed immediately and on 1,2,4,7 days after hypoxic exhaustive exercises). as for the normoxic groups there were one sedentary control group and five exhaustive exercise groups (killed immediately and on 1,2,4, 7 days after a bout of exhaustive exercise). in this study,there were sixteen groups of rats, eight in each group. all the rats in the exercise groups performed exhaustive exercises under normoxic condition. the main results of this study are as follows: (1) after eccentric exercises staining for desmin in part of muscle fibers faded and obscured in different degree and to different extent. it was even lost and negative fibers of desmin occurred, showing that the damage of desmin cytoskeleton is the morphological sign of injuries induced by eccentric exercises. (2) immunohistochemical staining of desmin was proven to be a tool for estimating the early injury of skeletal muscles. decrease of desmin s taining started immediately after exhaustive eccentric exercise, which was the early representation of injuries and indicated that the muscle fibers would be further injured and become necrosis. the remodeling of part of fibers started on the 4 days after exercise or earlier. during the recovery of injury, the increase of desmin expression is likely to be related to the remodeling of myofibrils. (3) the expression of desmin was mainly regulated at the transcriptional level and the contents of desmin mrna decreased after eccentric exercise (4) the total activity of calpain in skeletal muscles increased immediately after the eccentric exercise, the activated calpain started to selectively degradate protein substrate, followed by the increase of desmin degradation, the breakdown of desmin filament, the loss of myofibrillar 北京体育大学 2004 届博士研究生学位毕业论文 4 registry, which resulted in the disorder of the z-line streaming as well as the a-band. in addition, the polypeptide fragments produced by calpain autolysis were likely to become chemoattractant, which was related to the early response of the neutrophils on injuries. (5) analyzing the influence of hypoxia under the condition of this experiment on injuries induced by eccentric exercises from the aspects of the duration of the downhill running until exhaustion on the t readmill,the expression of desmin and desmin mrna, the change of the calpain activity, the infiltration of inflammatory cell, it was found that the trends of those changes were basically consistent, showing that the process of the skeletal muscle injuries of rats under the hypoxic condition is consistent with those under the normoxic condition and that the hypoxia is unable to obviously accelerate or deepen the injuries. key words: hypoxia,eccentric exercese,muscle damage, desmin,calpain 北京体育大学 2004 届博士研究生学位毕业论文 5 1 前言 关于骨骼肌损伤机制学者们从多种不同的角度进行了阐释最早在 1 9 0 2 年 h o u g h 提 出了组织撕裂假说1 9 6 6 年 d e v r i s 提出了局部缺血痉挛假说随后出现了能 量代谢学说 1 和高机械张力假说 2 近年来学者们从钙离子和自由基代谢方面做了 许多工作钙离子损伤学说认为肌细胞内异常高钙造成肌纤维损伤肌浆网钙转运能 力下降线粒体的钙抑制氧化磷酸化过程可能是骨骼肌超微结构变化的原因 3 自由基损 伤学说认为运动引起体内自由基含量增多导致脂质过氧化加强而对组织和细胞造成 损伤 上世纪 8 0 年代初人们开始注意肌肉酸痛涉及的形态学变化研究发现离心运动引起 骨骼肌肌原纤维超微结构中 z线变化z线流z线锯齿形或波浪形变化z线模糊z 线物进入 i带z线完全破坏或消失随着研究的深入超微结构中 z线的变化很自然的 让人们联想到维持骨骼肌内肌节和 z线正常形态的细胞骨架由此近几年来骨骼肌细胞骨 架蛋白受到了广泛的关注骨骼肌中骨架蛋白在维持肌肉完整性方面起重要作用且它 虽不负责力的产生但涉及力的传导对该结构了解的增强最终会带来更加合理的力量训 练方法和改善疲劳后的恢复而其中结蛋白 d e s m i n 连接于相邻肌原纤维的 z 线之间代表 肌小节外细胞骨架结构的完整性而为运动领域进行相关研究提供了新视野 低氧是指不能满足机体对氧需要的状态在低氧的高海拔环境下进行的高原训练作为 一种有效的训练方法已在多种运动项目训练中被广泛采用然而多年来体育科学领 域对高原训练效果一直存在争议体育领域对低氧理论的研究多集中在血液及心血管循环 系统方面鲜有对骨骼肌及其损伤机制影响的报导 本研究通过跑台离心运动至力竭所致大鼠损伤的模型结合低氧环境以免疫染色和 r t - p c r方法分析结蛋白 d e s m i n在力竭后不同的恢复期中的变化情况并通过测定钙激活 中性蛋白酶进一步探讨 d e s m i n 变化的原因同时在光镜下观察骨骼肌形态学改变观察 低氧对骨骼肌损伤进程的影响 北京体育大学 2004 届博士研究生学位毕业论文 6 2 文献综述 大量的形态学研究表明离心运动会诱导骨骼肌损伤肌原纤维 z线破坏是在离心收缩 后损伤肌纤维中观察到的典型特征结蛋白 d e s m i n 主要分布在胞浆是骨骼肌细胞骨架 的主要成分连接相邻肌原纤维 z线和肌纤维膜主要作用是限制肌小节在肌肉收缩时被 过分牵拉并涉及力量的传导在肌纤维结构的完整和肌肉收缩的同步化中起重要作用 本文试图就低氧常氧两种状态下从 d e s m i n 的角度探讨离心运动造成的骨骼肌损伤由 此对 d e s m i n 及低氧相关研究进行综述 2 . 1 d e s m i n 骨骼肌中最主要的细胞骨架蛋白 2 . 1 . 1 细胞骨架组成 细胞骨架是指真核细胞中的蛋白网架体系由微管2 0 - 3 0 n m微丝5 - 6 n m 及中间 纤维7 - 1 1 n m 组成 微管由微管蛋白组成其排列及功能由微管相关蛋白调节没有组织特异性微管蛋 白分子是由- 微管蛋白和- 微管蛋白组成的杂二聚体每个单体的均分子量为 5 5 k d a 微管蛋白聚合为微管存在微管与微管蛋白数量处于动态平衡中胞浆 c a 2 + 磷酸肌醇水 平及h 变化可改变微管蛋白的聚合程度 微丝见于多数细胞胞质及胞核 主要由肌动蛋白组成 存在着聚合与解聚的动态平衡 4 中间纤维i n t e r m e d i a t e f i l a m e n t s i f s 又称中间丝或中等径纤维蛋白是三种 骨架纤维中最复杂的一种名字来源于它的直径起初用于强调介于细丝 a c t i n和粗丝 m y o s i n 之间的中间性质但后来更注重于其在 a c t i n 丝6 n m 和 微管2 3 n m 之间宽 度的不同1 9 6 8年i s h i k a w a 5 等最早明确表明中间丝作为细胞内纤维性系统中化学和形 态学不同的一类蛋白而存在 中间纤维组装的多肽分为五类角蛋白k e r a t i n s 分子量 4 0 - 6 7 k d a : 在上皮细胞和 上皮起源的细胞中发现结蛋白d e s m i n 分子量 5 2 - 5 3 k d a主要存在于心肌骨骼肌 和平滑肌中波形蛋白v i m e n t i n 5 7 k d a在间质细胞和间质起源的细胞中发现神经 丝蛋白 n e u r o f i l a m e n t在神经元中发现 胶原细胞原纤维酸性蛋白 g l i a l f i b r i l l a r y a c i d i c p r o t e i n 5 0 k d a存在所有神经胶质细胞中 中间纤维的共同结构是具有一个约 3 1 0个氨基酸组成的螺旋杆状中心区域两侧末 端区域是非螺旋的头部区氨基端和尾部区羧基端两条多肽链组成的杆状部分以盘 旋形式缠绕杆状区的长度和氨基酸的顺序是高度保守的不同的中间纤维杆状区的氨基 酸种类和顺序约有 3 0 7 0 % 相同这种杆状相似区域是中间纤维聚合的基础中间纤维头 尾两端高度可变具有不同的氨基酸组成和化学性质因此中间纤维亚基在分子量大小 和性质上的不同基本上取决于其头尾端的不同中间纤维蛋白的头尾控制区似乎有利于促 进其亚单位间的热力学相互作用一般来说末端区域可能伸到细胞质内其功能是将纤 维连接到具有其它结构组织成分的纤维上起稳定中间纤维和连接其他结构的作用如在 电镜下可以观察到最大的神经丝蛋白质的末端连有小捆似横桥它可以连接到临近的轴 北京体育大学 2004 届博士研究生学位毕业论文 7 索神经纤维 各型中间纤维的蛋白分子都是能形成双股螺旋的聚体再由这样的两个聚体反向平 行以串交叠方式构成四聚体四聚体首尾相连形成原纤维再由 8根原纤维构成园柱状的 1 0 n m 纤维d e s m i n v i m e n t i n 和胶原细胞原纤维酸性蛋白可以形成同种聚合体有时也可 形成异聚体与微丝和微管那种以球状亚基的聚合作用不同中间纤维聚合时不需要 a t p 或 g t p 磷酸化作用对中间纤维蛋白组装起调节作用 c a m p 依赖激酶和钙激活磷脂依赖激酶均 能在体外使 d e s m i n 丝磷酸化使之解聚可逆地磷酸化亚单位在磷酸酶处理后仍保存它们 再组装的能力这个可逆过程由激酶靶位置控制包括 d e s m i n头部控制区的 9 3 5和 5 0 残基 6 构成中间纤维的基本骨架是由单拷贝基因编码的这组不同的基因在不同的细胞和组 织内进行表达, 呈现出组织特异性1 9 7 0 年免疫学家和生化专家研究指出中间纤维蛋 白质的基因是按照胚胎发育时组织出来的途径表达的 7 许多中间纤维亚单位的主要结构已知且它们分布广泛通过免疫细胞化学和电镜观 察发现中间纤维与许多细胞结构有明显的联系如与桥粒细胞核胞浆膜平滑肌密 体微管脂细胞脂小体等相连并且认为中间纤维与细胞空间的机械完整 8 和细胞基质 的骨骼框架作用有关 9 e r i c k s o n 等 1 0 用含大量中间丝的牛心浦肯野纤维证实了中间纤维 的骨架功能几十年来提出了许多中间纤维功能包括作为细胞内空间力量支持者和机 械整合作用对细胞形状的影响为生化反应提供机械支架涉及细胞内运输基因表达 调节和信号传导等 2 . 1 . 2 骨骼肌的细胞骨架体系 肌纤维细胞骨架的主要功能是连接和固定细胞内的结构蛋白它可划分为肌小节内 肌小节外和肌纤维膜下的细胞骨架 肌小节内细胞骨架是指肌小节中与 a c t i n m y o s i n 共存的丝状蛋白主要组成是 t i t i n 和 n e b u l i n 它们纵向排列于肌原纤维收缩单元的肌小节内部t i t i n 是从 z 盘至 m 线连接 z 盘和肌球蛋白之间的蛋白丝 在肌节中有一定的弹性 维持肌球蛋白的中间状态 n e b u l i n 是最长的 a c t i n 结合蛋白在肌肉放松条件下 n e b u l i n 起源于 z 盘延深至 i 带连接于 z盘与 z盘之间与 a带中细肌丝肌动蛋白平行排列主要作用是保持肌动蛋白的正常结 构 1 1 通过与 s y n e m i n 的相互作用 n e b u l i n 也有助于 d e s m i n 丝进入 z 盘的组装 1 2 n e b u l i n 仅限于骨骼肌在心肌中没有发现在不同的横纹肌中n e b u l i n体积和细丝长度之间相 关依据这一点心肌细丝长度明显的不同变化可能与缺乏 n e b u l i n 有关 肌小节外细胞骨架是存在于肌纤维的肌原纤维外部空间的非 a c t i n / m y o s i n 丝由中间 纤维组成包括 d e s m i n , v i m e n t i n和 s y n e m i n 位于相邻的肌原纤维肌纤维外周和肌纤 维膜核膜之间围绕着纤维纵向横向排列纵向的丝从 z盘到 z盘围绕着肌原纤维 为线粒体核和肌纤维膜作为固定点而服务且限制着肌小节的延展性横向的丝主要 是 d e s m i n 见图 1 在 z盘连接着相邻肌原纤维且为纤维轴固定负责由此骨骼肌横纹 北京体育大学 2004 届博士研究生学位毕业论文 8 出现s y n e m i n可以通过它与- a c t i n i n和 z盘周围的 n e b u l i n的相互作用维持中间纤维 和细胞骨架之间的联系 1 2 肌纤维膜下的细胞骨架包括膜和膜连接蛋白如 v i n c u l i n s p e c t r i n d y s t r o p h i n i n t e g r i n sa n k y r i n a - a c t i n i n和 d e s m i n在特定肌纤维膜区域肋小节 c o s t a m e r e s这些蛋白非直接地连接着多数外围的肌原纤维和细胞外基质 1 3 肌小节内肌小节外和肌纤维膜下的细胞骨架连接是由许多蛋白质介导的其中 p l e c t i n似乎起着重要作用 1 4 认为 p l e c t i n功能是作为一个剪补位点d o c k i n g s i t e 和细胞骨架蛋白的调节者z线外周边缘和 z线的 d e s m i n丝之间的侧面连接是由 p l e c t i n 介导的p l e c t i n 连接也出现在肌原纤维外周和肌纤维膜 图 1 肌纤维细胞骨架局部图参 l i e b e r , 2 0 0 2 年 2 . 1 . 3 肌细胞中特异性中间纤维 d e s m i n的分布 结蛋白 d e s m i n 来自于希腊语连接之意1 9 7 6年由 l a z a r i d e s命名是骨骼肌 平滑肌和心肌中主要的中间纤维蛋白免疫细胞学和超微结构研究为中间纤维在细胞中的 存在提供了证据以鸡鼠及人为研究对象的实验中 1 5 , 1 6 均表明有 d e s m i n 的存在 1 9 8 3 年t o k u y a s u 1 5 研究第一次证实以完整成年鸡骨骼肌为样品用高分辨率的免 疫电镜观察 d e s m i n 分布显示相邻 z 线之间有 d e s m i n 存在其以丝带形式环绕在 z 线周 围形成明显的 z线之间和相邻肌纤维膜线粒体和细胞核之间的连接但在相邻 t管附 近没有出现 d e s m i n 标记 免疫荧光免疫金标记等方法表明肌肉横向切片中d e s m i n 围绕着 z 线呈网状形式 纵向切片中d e s m i n 在每个肌小节之间呈周期性规则排列以狭长珠状横带穿过肌纤维 且延伸至肌纤维的边缘 免疫金标记表明 d e s m i n 表位的准确位置位于相邻肌原纤维的 z 线 之间 z 线外侧和肌原纤维外周之间有 d e s m i n 桥 且 d e s m i n 集中在肌浆膜的内侧 d e s m i n 是横纹肌纤维中的特定组分在骨骼肌发现 d e s m i n 在肌肉肌腱接点处和神经肌肉接点数 北京体育大学 2004 届博士研究生学位毕业论文 9 量增加 如肌原纤维和腱的附着点 神经和肌纤维之间的化学突触 在肌肉肌腱接点 d e s m i n 出现在接点皱褶里但不直接在接点膜下面而在神经肌肉接点它出现在神经下的核和 突触后的皱褶里在心脏浦肯野纤维中 d e s m i n 含量尤其丰富 d e s m i n连接于 z线之间同时也连接线粒体细胞核和肌膜主要作用是限制肌节在 肌肉收缩时被过分牵拉d e s m i n 依靠连接 z 线而使单个肌原纤维连接起来将收缩运动机 械地整合在一起除了肌浆网外还在浆膜致密斑桥粒和其它细胞器形成连接d e s m i n 在细胞内收缩蛋白间架起平行交错的网络结构力能沿纤维轴的方向传递最后网络结 构将各种方向上的力汇集在结缔组织中d e s m i n 作为主要的中间丝蛋白于整块肌肉中在 神经肌肉接点处的皱褶和邻近肌肉肌腱交接处的胞浆中浓聚可以加强高张力条件下的结 构稳定性 2 . 1 . 4 发育肌中的 d e s m i n d e s m i n是在肌生成中第一个出现的肌肉特异性蛋白来源于单拷贝基因在不同的物 种中几乎相同在人和一些动物中已经克隆出排序好的完整长度的 d e s m i n 基因d e s m i n 基因采用胚胎发育模式表达 d e s m i n合成起始于肌小管融合时在肌小管胞质中弥散分布当成肌纤维融合成肌小 管d e s m i n和它编码的 m r n a 和 d n a有相当多的增加随着成熟进程d e s m i n含量下降 开始时d e s m i n结合已经存在的 v i m e n t i n丝且形成纵向带随后的横纹肌成熟期包括在 肌纤维内部结构组织的主要变化线粒体从细胞浆移至肌原纤维内部重新分布肌丝结构 发生了完全改变z线成直线排列或定位在相邻肌原纤维之间肌小节核从中心移至外周 位置横小管从相对于肌纤维长轴的平行方向移至垂直方向横向从前存在 d e s m i n中 间丝网从纵向转变成占主导地位的横向与 z线连接 1 7 即在纹状肌原纤维出现后d e s m i n 变成横纹形式 1 8 成熟肌纤维中这些许多变化均与胚胎肌小管中中间丝蛋白 v i m e n t i n 和 d e s m i n 从胚胎晚期的最高浓度下降有关 2 . 1 . 5 再生中的 d e s m i n 再生肌纤维从相邻肌纤维基底膜下主要的卫星细胞发展而来肌纤维再生可能因坏死 损伤外伤肌营养不良代谢炎性疾病等引起热林格溶液或丁派卡因局部麻醉药 的应用可导致肌纤维坏死而它们的基底层血管和卫星细胞仍保持完整随后肌纤维 随着卫星细胞的激活而再生它们分裂融合最终形成肌小管d e s m i n 的分布和重排在 再生肌纤维和胎儿肌生成发育中遵循同样的路径这样发现 d e s m i n 在再生肌纤维中数量 增加也和 v i m e n t i n和 n e s t i n短暂地共同表达而在坏死纤维中下降由此再生纤维将 和肌小管一样用免疫组化反应能强烈表达 d e s m i nd e s m i n 表达因此也被认为是辨别再生肌 纤维的一个有用的诊断工具 1 9 2 0 v a t e r 2 1 等 1 9 9 2 研究蛇毒诱导活体退化再生过程中鼠骨骼肌 d e s m i n 的变化在注入 蛇毒后 1 h , 3 h , 6 h , 2 d , 3 d , 4 d , 7 d时间点进行检测发现注射毒素接种后 1 h肌纤维内部结 构开始出现损伤3 h后损伤变得广泛 6 h后有许多扩展的肌纤维坏死多数肌纤维呈现 北京体育大学 2004 届博士研究生学位毕业论文 10 高度分裂的肌小节许多纤维充满着多形核细胞和巨噬细胞与之相对应的注射毒素后 1 h d e s m i n 标记与对照组相比变化不明显但 3 h后一些纤维完全没有了 d e s m i n标记而 另一些纤维在过度压缩的病灶区域则表现出堆积的 d e s m i n 带或是在纤维拉长的区域 带模式的破坏毒素注入后 2天肌纤维开始再生在这个阶段多核肌小管呈现强烈的 d e s m i n免疫荧光免疫荧光和免疫金研究表明第 4天 d e s m i n位于相邻 z线之间此时 肌原纤维 z 线还未成直线排列表明d e s m i n 连接着相邻肌原纤维的 z 线并直接牵涉它们 稍晚成直线排列经 7 天再生肌纤维直径增加d e s m i n 标记的强度和规律性上升肌纤 维重新规则排列d e s m i n 中间丝网络正常 b o r n m a n n 2 2 采用免疫组化和免疫细胞化学方法 用 6 0 - 7 0 的热林格溶液注射鼠诱导比 目鱼肌坏死结果发现在头一周内出现 d e s m i n表达证实 d e s m i n细胞内分布与胚胎肌肉 中相似成肌细胞和幼肌小管对 d e s m i n 反应强烈随着成熟反应性下降起初d e s m i n 扩散性分布在成熟期达到肌小节模式并被限制在 z 线周围 f r i d e n 等 2 3 以 6名年轻男性为受试者做离心运动运用 d e s m i n抗体采用免疫荧光 方法在运动前运动后 1 h 3 d 6 d 取大腿产生剧烈酸痛的右侧股外侧肌部位做肌肉活 检观察到运动前运动后 1 h 6 d 三种样本中在 z 线水平可见横向荧光条纹除横向荧 光条纹外运动后 3 d 的样本中连续的 z 线之间出现大量纵向延展的荧光有时延展跨过几 个肌小节运动前运动后 1 h 6 d 三种样本的横向切片中对应着纵向切片的荧光桥肌 原纤维间显示微弱荧光但在运动后 3 d 的样本中肌原纤维间散布较多较强的荧光颗粒 表明运动后 3 天d e s m i n 染色增强肌纤维开始再生 2 . 1 . 6 d e s m i n的生理功能 研究中间纤维的分子特性在很大程度上是为了了解中间纤维在细胞和组织中的功能 尽管许多中间纤维的主要结构已知但功能并不明了如 d e s m i n 在体内的作用仍有争议 s a r n a t ( 1 9 9 2 ) 2 4 认为虽然有明确的生化证据表明成熟肌纤维中含有 d e s m i n 也含 d e s m i n r n a 但无生物学重要性归因于 d e s m i n 生命科学的发展给我们了解中间纤维的功能提供了技术支持 对 d e s m i n 结构和功能了 解的急剧增加来自对敲掉k n o c k o u t k / o d e s m i n基因小鼠的研究利用基因重组技术 除去组织中的 d e s m i n 观察无 d e s m i n 给机体带来的影响从而分析其在体内的作用 l i等 2 5 , 2 6 用同种再重组使鼠 d e s m i n基因进行无效突变发现 d e s m i n k / o鼠生长正常 且多产但是这些鼠证明为多系统紊乱 2 7 出生后可观察到骨骼肌心肌和平滑肌中有缺 陷对心肌和骨骼肌组织进行组织学和电镜分析揭示肌结构严重破裂和退化结构异常 包括肌原纤维侧外成直线排列下降和线粒体异常这些异常最严重的是心脏表现出心肌 进行性退化和坏死 并伴随着广泛的钙化 4 平滑肌异常包括发育不全和退化 缺乏 d e s m i n 鼠变得虚弱且易疲劳缺乏 d e s m i n 使得这些肌纤维在收缩期间更易于损伤相反也有人 2 8 认为 d e s m i n k / o 鼠肌肉产生较小的张力且损伤较小机械压力沿着贯穿肌纤维肌小节之 间的 d e s m i n 从肌原纤维到纤维外部有效传导d e s m i n 缺乏时允许肌小节内部更大程度 的缩短和移动由此降低延纤维传导的力的有效性反之疲劳从纤维外部传到肌原纤维 北京体育大学 2004 届博士研究生学位毕业论文 11 也可能效果很差结果可能会减少固定长度之间的肌小节的疲劳缺乏 d e s m i n 鼠是否易 于疲劳 两种不同的观点可能是由于 d e s m i n k / o 鼠近亲繁殖了几代而显出表现型的不同 2 9 d e s m i n k / o小鼠中即没有 v i m e n t i n也没有 n e s t i n的升高及其它蛋白丝的增加因 此没有通过其它蛋白的变化来对 d e s m i n缺乏进行的补充 2 5 , 3 0 , 3 1 肌小节内 d e s m i n的缺 乏虽然不会干扰主要肌肉的形成但是这种再生纤维中肌原纤维生成通常是发育不全的 显示 d e s m i n 与这些修复过程有牵连表明 d e s m i n 在维持肌细胞肌原纤维的机械完整性中 起重要作用通过连接 z 线和浆膜连接 z 线和其他细胞器浆膜d e s m i n 可以在力学上结 合肌纤维的所有收缩活动这种安排也将保证在肌肉收缩和放松循环中细胞结构适宜的 排列这使得 d e s m i n 为维持肌原纤维完整性所必需且在机械损伤后它们的修复或再生所 可能需要缺乏 d e s m i n 的肌纤维脆性增加在收缩活动中更易损伤这也导致越是活跃的 收缩肌肉越易损伤且易产生过度的退化 虽然 d e s m i n 可以在力学上结合肌纤维的所有收缩活动但它并不影响肌肉收缩过程 通过酶处理除去 1 0 n m 丝的细胞在有 a t p 时仍有收缩的能力 有人 3 2 从鸡沙囊肌中获得肌动 球蛋白a c t o m y o s i n经抽提后除去 1 0 n m丝蛋白肌原纤维中表现出同样高的 a c t i n依 赖 a t p 酶活性和钙敏感性其后的数据表明 1 0 n m 丝与 a c t i n 和 m y o s i n 的相互作用无关 也与该过程钙调节无关d e s m i n k / o小鼠心肌收缩装置中多种蛋白包括 a - a c t i n i n t r o p o m y o s i n n e b u l i n 和 m y o s i n 有文献表明 d e s m i n 缺失不影响这些蛋白的定位和表达 2 7 d e s m i n的缺失可能影响单个肌原纤维蛋白的定位和表达但它在肌原纤维形成组装 和初始的侧外成直线中并不起关键作用当在分裂后期的成肌纤维和多核肌小管中截断 d e s m i n 表达后以前存在的中间纤维网络被完全去掉纹状的肌原纤维在侧外仍能组装且 成线性排列t o k u y a s u等不认为 d e s m i n 的分布与单个肌原纤维横纹有关 3 3 也没有证据 表明中间丝在肌原纤维的侧外定位过程中起直接作用 3 4 , 3 5 d e s m i n 中间丝在它们的 z 线侧边连接单个肌原纤维 且使肌小节与肌纤维膜交互相连 形态学数据认为 d e s m i n 与肌肉抵抗性有关 这预示着如果肌小节丧失产生和传导运动的能 力中间丝将在总体上被拉长若是这样d e s m i n 可以延缓相邻肌小节间张力的传递和阻 止力量传输中的递减 2 . 1 . 7 d e s m i n与疾病 一些人类疾病包括几种肌肉和神经障碍与中间丝细胞骨架的组织异常有关超微结 构和 d e s m i n免疫组化研究在相当程度上扩大了我们对肌纤维中细胞骨架病理和一些家族 性神经肌肉疾病的理解d e s m i n 染色被广泛用于鉴别与肌细胞相关或含肌细胞的肿瘤 在人类 d e s m i n 相关肌病通常涉及过量 d e s m i n 引起的非正常沉积 1 6 , 2 2 , 3 3 , 3 8 如型 糖尿病脊柱肌萎缩症 3 6 晶状体中 v i m e n t i n和 d e s m i n的过度表达已经表明会导致白内 障形成和晶状体细胞死亡 2 7 也有的疾病中出现了 d e s m i n 消失c u l l e n 3 7 研究d u c h e n n e 氏 肌营养不良d m d 病人发现 d e s m i n 横带丢失认为 d m d 肌肉中肌原纤维被压缩或拉长 d e s m i n 难以抵抗压缩和营养不良肌拉长所产生的过度拉力由此 d e s m i n 偏离正常的位置 北京体育大学 2004 届博士研究生学位毕业论文 12 无法维持肌原纤维横向的定位 d e s m i n 相关肌病划分为两类包涵体类和颗粒丝类包涵体类以局部区域过量 d e s m i n 为特征颗粒丝类以纤维丝遍布肌纤维为标志在后一类肌病的一个家族报导 d e s m i n 异 常磷酸化并排除了 d e s m i n基因做为肌病的原因但是进一步分析表明编码 b - c r y s t a l l i n的基因突变其介导 d e s m i n丝的正确装配在颗粒丝类型的肌病中最近 证实确实有 d e s m i n的基因突变这些突变是家族的或单个发生的主要在 d e s m i n结构的 杆状区域其涉及纤维丝的形成这类病人典型的特征是心肌感染和肌无力显然 d e s m i n 基因突变对这类肌肉紊乱是致命的 但 d e s m i n 紊乱的原因仍不清楚 人们提出了各种假设 包括过度合成代谢率错误或是 d e s m i n错误地混入 z盘推测可能归因于 d e s m i n转录表 达上的破坏或与 d e s m i n 组装有关 真正的 d e s m i n 肌病在中年早期出现下肢肌肉力量弱步态不稳肌病慢慢发展偶 尔心肌缺陷超前于骨骼肌心肌的变化出现在传导缺陷心率失常充血失败有学者检 查出两个 d e s m i n病例一个是股外侧肌另一个是三角肌来自 d e s m i n结构杆状区域突 变在两个样本中脂肪浸润坏死和肌病的形态学信号已经出现肌纤维在纤维直径上 已表现出很大的变化切片分析揭示大量分裂的纤维提示发育不全的再生也出现了在 肌纤维膜下 d e s m i n 的特征性聚集但尽管缺乏完整的 d e s m i n 或 d e s m i n 聚集仍有许多肌 纤维显示组织很好的肌原纤维 1 3 小鼠 d e s m i n缺乏使得肌营养不良和心肌肌病上升同样人类 d e s m i n突变引起骨骼 肌和心肌损伤d e s m