（农产品加工及贮藏工程专业论文）榨菜后熟优势微生物分离鉴定及发酵剂研制.pdf

嚣毒_ 穴学矮= l 二学绽论文 4 从传统榨菜中分离出的微生物有5 0 以上属于乳酸菌类，乳酸发酵活跃在 榨菜后熟过程中，其中有凡种耐高盐酶蓥种。如嗜盐片球菌，在较高的食盐含量 中繁殖良好，与鲁氏酵母共同作用形成特殊酱香成分糖醇。 5 。对发酵菌株进行优选，选择如生长速度快、代谢旺盛、产酸能力强、耐盐 性和耐温健适宜的兰种菌种，分别为植物乳杆菌、肠膜明串珠菌和乳酸乳杆菌。 将这三种菌作为发酵菌株对人工接种多菌株采用不同接种量，接种配比，含盐量， 含水量及真空度进行正交试验设计弗进行感官评价，优化发酵工艺，得到不同因 素对榨菜产品品质影响顺序，即：菌种比例含盐量 含水量 接种量 真空度。同 时得到较为理想的发酵荆组合，邵接种量为3 、菌种比例为肠膜嗳串珠菌：乳酸 乳杆菌：植物乳杆菌3 ：1 ：l 、含水量为8 0 、含盐量为6 、真空度为o 0 9 1 御a 。 该发酵剂组合生产得榨菜产品与自然发酵榨菜两者在感官评价上无明显差异。对 p h 值和产酸性能测试表明，人工接种发酵工艺用2 0 天左右，就可达到传统发酵 工艺1 8 0 天左右时的产酸量，风味物质的形成在6 0 天左右完成，使榨菜发酵周期 缩短为自然发酵榨菜的1 3 。 6 对人工接种发酵榨菜和自然发酵榨菜进行感官鉴评及理化指标分析，以验 证人工接种多菌种发酵榨菜的可行性。试验结果表明： 人工接种多种菌种发酵榨菜降低了榨菜生产过程中亚硝酸盐的含量，提高了 产晶的安全性。 两种方式生产的榨菜在感官品质及理化指标上无显著差异，在发酵过程中， 人工接种多菌种发酵榨菜的氨基酸态氮含量和蛋白质含量一直高于自然发酵榨 菜，说明人工接种多种菌种加快了榨菜风味物质的形成，缩短了榨菜的发酵周期， 在实际生产中是可行的。 关键词：榨菜微生物鉴定人工发酵 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 标注。 学位论文作者：嘧巍， 签字日期：3 占年月乒日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名： j ， 磊恕 导师签名： 签字日期：土争c ，8 年彭月声日 签字日期：2 争98 年6 月 咖 西南火学硕士学位论文 1 8 世纪初叶，涪陵长江沿岸已有茎瘤芥的栽培，清道光二十五年( 公元1 8 4 5 年) 涪州志物产记载：“又一种名包包菜，渍盐为菹，甚脆。 榨菜生产则始 予清光绪：十四年( 1 8 9 8 ) 。涪州( 今涪陵) 入邱寿安家掌脉师邓炳臣在加工减菜 时用青菜头进行腌制，按加工工艺特点取名为“榨菜”，榨菜从此面世。1 8 9 9 年( 清 光绪二十五年) ，酃寿安开始在自己家中批量加工榨菜，当年运8 0 坛试销宣昌， 获厚利。遂逐年扩大生产，并严密保守加工技术，使其维持1 0 多年的独家经营局 面。1 9 l o 年( 清宣统二年) ，邱家掌脉师谭治合将加工工艺告之欧秉胜，欧便在李 渡石马坝设厂仿制。此后，榨菜加工工艺逐渐传播开来，榨菜厂家如雨后春笋般 在川东青菜头产区广泛分布，至1 9 3 1 年，涪陵县的加王厂户已达百余家，其中年 产l o 坛以上的2 l 家。1 9 5 9 年7 月6 日，商业部在涪陵举办“全国榨菜训练班”， 学习9 个月，参加学习的1 4 2 名学员来自全国1 8 个省( 市) 。此后，青菜头种植 和榨菜加王传播到全国各地，其中以浙江、江苏、上海等地发展最为迅速，并形 成了具有独特风格的浙式榨菜。1 9 9 5 年3 月，涪陵被“全国首批百家中国特产之 多”组委会命名为“中国榨菜之乡。 1 2 传统榨菜现状及发展趋势 1 2 1 国内外市场情况 目前，全国榨菜种植面积已达1 0 0 余万亩，榨菜原料植物青菜头产量达1 5 0 万吨，榨菜产品约7 0 万吨，产值约4 0 亿元。近几年来，我国榨菜年销售量呈逐 年上升趋势，仅有2 0 0 1 年和2 0 0 3 年有小幅回落( 见图1 ) ，年均增幅达到7 6 以 上。其中，涪陵榨菜的发展起到了重要作用。“十五期间，涪陵榨菜成为涪陵区 乃至重庆市农村经济中产销规模最大、品种知名度最高、辐射带动麓力最强的传 统优势产业，实现了规模化种植、产业化经营、现代化生产、规范化管理、名牌 纯产品、全球化销售。 分析榨菜产业的快速发展原因，笔者认为主要有以下几个方面：一是随着人 民生活水平的提高，生活节奏的加快，消费双念的变化，对榨菜这种风味独特、 食用方便的佐餐食品需求增加；二是榨菜产品质量提高，花色品种增多，促进了 满费增长；三是榨菜加工企业更加注重企业形象和广告宣传，努力拓展内外两个 市场，扩大了产品覆盖面。综合考虑上述因素，榨菜生产和消费今后一段时期， 将持续保持增长的势头。榨菜软罐头国内市场年需求量在3 5 年将达4 5 万吨， 榨菜软罐头市场前景看好。市场容量最大的方便中盐榨菜制品，需求也将不断增 加。 嚣褒大掌暖士学坟论文 熟一去筋一淘洗一切分一脱盐一拌料一计量装袋一热合一杀菌冷却一整形烘干一 成黧i 3 棚。 榨菜生产前景看好，但是在榨菜生产中仍然存在一些问题。这些问题主要表现 在以下几个方面。 第一，长期以来，榨菜的生产一鱼采用自然发酵工艺，这种自然发酵生产工 艺处于低水平生产阶段，发酵周期长，原料及设备利用率低。且还存在着产品质 量得不到保证等一系列问题，直接影响到榨菜的生产与销售。榨菜加工的现存工 艺有待于向工业化大生产方向改进，尽管我国重庆、浙江、四川、湖南、湖北、 安徽、士东、江苏、江嚣、福建等省的几十个县( 市) 都有榨菜生产，但除重庆 涪陵、浙江余姚、海宁、桐乡几大榨菜主产区具有一定规模，极具发展潜力外， 其它地区由于受土地、气候、生产企业、加王技术、生产工艺等诸多方面的影响 和限制，生产规模小，产品质量差，市场开拓难，在短期内难以形成竞争优势。 第二，榨菜后熟机制的研究很少，且尚不深入。榨菜后熟发酵过程中的微生 物区系非常复杂，并且伴随着许多生物化学变化，一般加工中依靠自然发酵进行 生产，也就是原料利用环境中的微生物进行自然发酵。这样发酵过程中的生化反 应院较缓慢，榨菜产品的生产周期比较长，一般丽言，以青菜头为原料的榨菜生 产周期为四到六个月，大大制约了榨菜加工的发展。 + 第三，榨菜加工中的副产物的综合开发利用也是当前的研究课题之一。青菜 头副产物的综合利用主要包括利用青菜头绿叶开发冬菜、酸菜，利用腌制原料盐 水开发酱油等。 第四，榨菜产品质量参差不齐。榨菜产品在自然发酵过程中是依靠自然环境 中的微生物的发酵作用进行的，容易受到自然环境中温度、湿度等因素的影响， 不同批次的产品的质量会出现较大的差异，从而导致产品质量参差不齐。并且， 由于榨菜加工过程中存在微生物的活动对榨菜品质有利有蔽，如何恰当地控制 徽生物的活动也是亟待解决的闻题。 第五，榨菜中鬣白质和氨基酸的种类和数量对其品质有重要的作用，而这些 又在很大程度上取决于酶的作用。在加工过程中难免使榨菜本身所含酶的活性受 到影响，那么是否可以利用外加酶以控制酶解的方式来改善榨菜品质，这一问题 也值得探讨。 1 2 3 我国榨菜加工的发展趋势 我国的榨菜加工业在未来是机遇与挑战并存，将呈现以下几个发展趋势：( 1 ) 将向精加工方向发展，产品分类更细、技术含量更高，如极品榨菜、珍品榨菜、 4 弱窝犬学矮 ：掌绽论文 赋予榨菜回味返甜的特征；榨菜中的主要糖苷类物质芥子苷，在腌制加工过程 中被芥子瞢酶( 硫代葡萄糖酶，e c 3 2 3 。1 ) 水解生成异硫氰酸烯丙酯，使榨菜其 有特殊的芳香味，同时它能在腌制过程中抑制腐败菌的生长繁殖，增强榨菜本身 的防腐能力。 温勤华l 沁l 在对传统工艺榨菜后熬期间微生物区系变化及热力致死条件的研究 中，通过对后熟过程中微生物数量变化的统计，提出酵母的酒精发酵对榨菜后熟 成味有一定的贡献，并探讨了热力致死条件。但其研究对微生物种类的鉴定没有 到属、种，因而对微生物在榨菜后熟转化过程中所起作用不能进行深入的分析推 论。 阴文娅等【l l l 将榨菜加工工艺进行了改进，提出一次性腌制榨菜生产工艺。一次 性腌制工艺是榨菜加工工艺改革过程中的一次巨大飞跃，它简化了工艺操作，缩 短了生产周期，对推进榨菜生产现代化起着重要的作用。榨菜次性腌制工艺的 研究就工艺及对榨菜品质的影响等方面作了大量深入的工作，但没有探讨微生物 情况及其作用，也没有分析工艺的改变对榨菜微生物区系的影响。 杨瑁等【1 2 】对四川榨菜后熟期间微生物的变化规律做了深入的研究，共分离细菌 9 属甜种、酵母菌5 属量1 种、霉菌2 属，并发现榨菜中酸麴产生与细蘩活动关系 密切，同时对微生物在榨菜香气形成中的作用进行了推测。 蒋高强【1 3 】对浙涯产榨菜腐败微生物进行了分离鉴定，并对分离褥到的坚强芽孢 杆菌和蜡状芽孢杆菌进行了比较详细的特性研究。但对有益微生物在榨菜后熟期 闻所起的作用没有进行阐述。 1 4 酱腌菜中的微生物 酱腌菜发酵是在有益微生物所分泌的氧化还原酶的酶促作用下使蔬菜中的糖 ( 已糖、戊糖) 发生不完全氧化的过程，如乳酸菌发酵产生乳酸、酵母菌发酵产 生酒精和二氧化碳等。微生物发酵对于酱腌菜的生产是不可缺少的工序，但也是 引起酱腌菜腐败变质的主要原因【l4 1 。研究表明：坚强芽抱杆菌、嗜热脂肪芽抱杆 蓊、巨大芽抱杆菌会弓l 起离盐酱腌菜的腐败u 酗。 蔬菜收获时其表面附着有大量的不同种类的微生物，酱腌菜的腌制过程实质 上也是微生物发酵的过程瑟翻。微生物发酵在蔬菜腌制过程中具有十分重要的作用， 了解蔬菜腌制中的微生物发酵类型是有效控制发酵进程的基础。酱腌菜中的微生 物主要包括细菌、酵母菌和霉菌。酱腌菜中起主导作用的微生物发酵过程是乳酸 发酵，酒精发酵次之，醋酸发酵最少，在有利发酵的同时还伴随着一些有害发酵， 如丁酸发酵等。在自然发酵中各种微生物闻互相影响露产生出定的生长规律， 6 两南大学硕士学位论文 能耐酸性，在p h 值为5 以下能很好生长。另外，低p h 值还可促使亚硝酸盐分解， 减少了残留的n 0 2 。与二级胺作用生成亚硝酸胺的可能性1 2 0 1 。 1 4 2 酵母菌 酵母菌的酒精发酵是食品中的糖类( 单耱、双糖) 在酵母菌的作用下降解为乙 醇的过程，其反应式如下： g 甄，倪璧马2 瓯饿馏+ 2 t 酵母的酒精发酵产生乙醇，本身就有微香，与其它酸结合生成酯更增加榨菜的 香气。酵母在厌气条件下能产生萜类物质，如芳樟酵、苯乙醇，以及一些具有香 气的内脂。鲁氏酵母耐高渗透压，能分解戊糖生成4 乙基愈创术酚( 酱香味物质) ， 又能利用葡萄糖等物质生成湮精、甘油，从而进一步生成脂、糖醇、增进风味。 球拟酵母可产生烷基苯酚类香味物质。汉逊氏酵母能产生乙酸乙酯。同时乙醇具 有防腐能力，二氧化碳也有隔绝氧气的作用，两者都能够增强榨菜的耐贮藏性。 但是，如采长期对厌气条件下酵母菌的酒精发酵不加以控制，对榨菜也会有一定 的不良影响。原因是酒精大量增加，使榨菜酒精浓度高，酒昧太浓，正常风味受 损；另一方面，过量的酒精发酵大量地消耗糖类物质，影响榨菜的营养性【珏l 。 1 。4 3 醋酸杆菌 在蔬菜正常腌制过程中，会有少量的醋酸菌生长繁殖，在好氧条件下把酒精转 化为醋酸，醋酸发酵是食品酒精发酵生成的乙醇，在醋酸杆菌作用下进一步氧化 为醋酸的过程，其反应式如下： 纽瓯馏+ q 量堕赋d 胁皿d 醋酸对产品的风味形成有益，除了醋酸本身具有独特风味外，醋酸可与乙醇形 成乙酸乙酯，对榨菜后熟成味有一定的贡献。 除了以上介绍的几种主要有益菌外，蔬菜腌制中还存在很多其它微生物，其中 很多微生物的生长繁殖会给发酵过程带来负面影响，使腌制品产生不良气味，甚 至腐败。这些微生物通常被称为杂菌，一般包括腐败细菌、某些霉菌和酵母菌等。 杂菌危害甚大，能直接影响发酵进程。抑制杂菌可以通过控制生长条件来控制发 酵过程的方法，即在腌制的一开始就严格控制各种理佬因素，创造一种从营养到 生态环境都有利于乳酸菌生长的微生态条件、以促进乳酸菌的旺盛生长，抑制其 它杂菌的生长，达到控制发酵过程和改善蔬菜腌制品风味和质量的目的；也可以 考虑人工接种纯种微生物来增强发酵体系中有益微生物的种群优势以抑制杂菌生 长繁殖。因内外众多研究者在接种微生物进行蔬菜发酵方面作了大量工作，大量 8 西南大学硕士学位论文 中溶解氧，使好气性微生物的生长受到抑制：食盐溶液中的n a + ，k + ，c a 2 + ，m 矿 等离子，能和细胞原生质中的阴离子结合而对微生物产生毒害作用等【2 7 l 。同时食 盐对蔬菜腌制过程中的有益微生物也有同样的抑制作黑，且盐度越高，抑制能力 越强。l 的食盐溶液可产生0 6 lm a 的渗透压力，而一般细菌细胞液的渗透压力 在3 6m p a l 2 8 j ：当盐浓度在2 4 时，对腐败菌已有明显的抑制作用，但对乳酸 菌影响不大，且发酵产品评价最佳f 2 9 l 。8 盐溶液对乳酸菌的活动有轻微影响，8 以上有明显的抑制，l 麟以上则乳酸藤发酵作用大大减弱。因此，确定食盐溶液的 最佳浓度，使微生物发酵作用与抑制微生物生长达到一个良好的平衡点，是保证 酱腌菜品质的关键。 1 5 3 酸度( p h ) 不论是食品原有的、外加的或发酵后形成的酸度，都有抑制微生物生长的作 用，降低p h 值可以抑制腌制过程中有害微生物的生长繁殖，这主要是由于在 的作焉下，微生物细胞的蛋自质胶体达到等电点发生导致蛋白质凝固，其性质完 全改变，讵常代谢被破坏，微生物受到毒害【3 0 】。榨菜腌制过程中的乳酸菌发酵产 生乳酸，能够降低环境的p h 篷，抑制腐败微生物的生长繁殖强引。 吕承广【3 l 研究了酸度、温度和食盐对发酵作用的影响，通过抑制腌制初期有 害微生物的活动，造成有利予正常发酵作用进行的条件。结果表明，在腌制开始 时通过添加一定量的酸，提高环境的酸度，可抑制有害微生物的生长繁殖和不良 的发酵作用，保证乳酸发酵的正常进行；同时，采取分批加盐的方法，也可减小 对乳酸菌生长的抑制作用，保证正常发酵作用的进行；另井，适当提离发酵初期 的温度，加速环境p h 值的下降，同样能够抑制有害微生物的活动。 1 s 4 气体成分 氧气对微生物的生命活动有着重要的影响。乳酸蓊为兼性厌氧菌，在蔬菜的 腌制过程中，乳酸菌的发酵作用在隔氧的条件下能够正常地进行，而对腌制品起 破坏作用的微生物，如霉蘸、有害酵母和类酵母都是属于好氧性的。榨菜氧化和 好氧微生物繁殖而导致榨菜腐败变质。当榨菜中含氧量超过1 就会加速榨菜的变 质【3 2 】；另钋，异型乳酸发酵及蔬菜本身的呼吸都可以产生二氧化碳，二氧化碳气 体部分溶解于腌渍液中：既对霉菌有“毒害作用，又能防止维生素c 的损耗1 3 孤。 因此，在榨菜的在发酵过程中，根据乳酸菌和有害微生物对氧气需求的不同，采 用隔绝氧气的措施以_ 抑篱l 好氧有害微生物的生长繁殖，徐证乳酸发酵的正常进行。 1 0 文献综述 1 5 5 亚硝酸盐含量 蔬菜腌制品中的亚硝酸盐的消长也倍受广大消费者关注。驻硝酸盐的大量摄 入可导致肠原性青紫症，而少量摄入可与蛋白质中的仲胺结合生成亚硝胺，对人 体有致癌作用。在新鲜蔬菜中，一般硝酸盐含量高两噩硝酸盐的含量低，在蔬菜 的腌制过程中，某些具有硝酸盐还原能力的微生物的作用会将硝酸盐还原成亚硝 酸盐而使囊硝酸盐的含量剧增，从而导致腌制蔬菜的食用安全闯题【3 羽。国内夕 学 者对蔬菜腌制过程中的亚硝酸盐变化规律进行了研究，结果认为蔬菜腌制过程中， 亚硝酸盐的含量在发酵前期往往会迅速升高，并且出现一个贬硝峰，之后随着酸 度的增加又迅速降低，亚硝峰的消长规律受许多因素影响，如温度、酸度、盐浓 度和发酵方式等【3 ”9 1 。发酵过程中，温度越高，亚硝峰到来越早，持续时间也越 短，反之，则亚硝峰到来越迟且持续时间也越长；酸度越高，距硝酸盐含量越低； 盐分越高，则产酸低且产酸速度慢，因而随着食盐浓度的增加，亚硝峰到来也越 晚，且峰值呈增大的趋势；接种发酵比自然发酵的耍硝峰出现得旱，但峰值小， 持续的时间也短，这是因为接种发酵能迅速降低发酵环境的p h 值，抑制杂菌的生 长。 对于皿硝峰的降解机制，纪淑娟和孟宪军即l 认为，亚硝峰消失的原因一是难 硝酸盐在酸性环境条件下的化学降解，二是乳酸菌对贬硝酸盐的还原作用，酸性 环境( p h 值4 以下) 和亚硝酸盐还原酶是亚硝酸盐降解的主要原因；张庆芳等湖 认为，乳酸菌对亚硝酸盐的降解分为酶降解和酸降解两个阶段，在发酵前期，培 养液p h 值大于4 5 时，以酶降解为主，发酵霜期，由于乳酸蘸本身产酸，使培养 液的p h 值降低，p h 值小于4 o 后，以酸降解为主。由于乳酸杆菌的产酸能力强 予乳酸球蘸，因而在发酵聂期乳酸秆菌降解甄硝酸盐的能力大于乳酸球菌，两在 发酵前期，杆菌与球菌降解贬硝酸盐的能力并无差别【4 l 】。郭晓红等【4 2 】对甘蓝乳酸 发酵初期微生物区系的细菌进雩亍分类并测定了其硝酸盐还原反应，研究表明，所 有的乳酸菌的硝酸盐还原反应都为阴性，而其它细菌属多为阳性，试验结果说明， 榨菜中的主要有益菌之一的乳酸菌不会增加产品中亚硝酸盐含量。蒲朝文等【4 3 】在 1 9 9 8 年至2 0 0 1 年对涪陵地区部分榨菜生产单位进行亚硝酸盐监测，结果表明亚硝 酸盐的平均含量低于国家酱腌菜卫生指标，仅极少数因半成品腌制不充分，存放 时间不够而导致亚硝酸盐超标。刘青梅等洋l 也对浙涯榨菜加工过程中藏硝酸盐的 消长作了研究，结果也指出，发酵正常、完全腌熟的榨菜亚硝酸盐含量不会超标， 可放心食用。 各种影响因素表明，榨菜品质优劣主要由多种微生物活动所致，只有很好地控 制微生物活动，特别是及时腌制，掌握好含水量、水与盐的比例，严防外界空气 引言 第2 章引言 榨菜在我国有着悠久的生产历史，以其清香味鲜，营养丰富，以及鲜、香、嫩、 脆的风味特点在国内外广获殊荣。榨菜与德国酸甜甘蓝、法国酸黄瓜并称世界三 大名腌菜。近年来，酱腌菜正朝着“低盐、增酸、低甜味、无防腐剂”的健康方 向发展。众多研究人员在其生产工艺、产品更新上作了大量的研究工作，使榨菜 的加工工艺日趋成熟，产品也随着时代的要求不断更新，这些工艺不但简化了加 工过程，而且对产品质量的控制和提高都起了重要作用。 ， 从原料青菜头到色、香、味俱全的榨菜，经历了一个后熟转化的过程。研究 榨菜的成熟机制就是为进一步完善榨菜加工工艺服务。但历经多年，榨菜加工仍 然停留在自然发酵的水平上，这不利于其向现代化加工方向发展。普遍认为，榨 菜后熟是青菜头本身生理生化作用和微生物共同作用的结果。在榨菜成熟过程中 同时存在很多不利的因素，如有害微生物的作用，因此在加工过程中控制微生物 的发酵方向是十分重要的。传统榨菜加工依靠水分、盐分来控制发酵方向，这与 现代饮食提倡的低盐背道而驰，因此采用其它方法来替代食盐的发酵控制作用是 有必要的，如人工接种控制发酵就是可以尝试的方法。人工接种控制发酵可以有 效改善发酵过程中的优势菌群，抑制有害菌的生长，使发酵向预期方向进行。 发酵剂质量的优劣直接影响到产品的口感、风味和香气等感官特征。发酵剂的 菌株组成对于榨菜发酵剂的研制是十分重要的。自然发酵的榨菜风味独特，这与 其中微生物的发酵作用是密不可分的。因此，优良的榨菜发酵剂应来源于自然发 酵的优质榨菜。所以对自然发酵的优质榨菜进行菌系分析，确定其菌相组成和比 例，就成为研究榨菜接种发酵的一个首要条件。榨菜的自然发酵受到许多因素的 影响，如食盐浓度、发酵p h 值、溶氧浓度、温度、原料附生微生物的数量及菌相 比例等。这些因素以及它们之间的相互作用通过影响整个自然发酵的进程和菌系 变化影响最终榨菜产品的质量。 本研究以优质榨菜的自然发酵过程为考察对象，研究榨菜自然发酵过程中的菌 系动态变化规律，确定不同发酵阶段的菌种种类及比例，尝试在榨菜中利用接种 微生物进行发酵，为研制适合人工接种多菌种发酵的榨菜发酵剂打下基础，本研 究旨在提高榨菜品质，简化加工工艺，缩短榨菜加工周期，为榨菜加工的现代化 探索路径。 榨菜后熟期闽自然发酵微生物区系分析 第3 章榨菜后熟期间自然发酵微生物区系分析 3 1 材料与方法 3 。 。1 材料 榨菜：涪陵榨菜集团提供 药品：牛肉膏、酵母膏、蛋自腺、琼脂粉、蔗糖、n a c l 、可溶性淀粉、硫酸 镁、硫酸娅铁、硫酸锰、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、葡萄糖、明胶等，以上药品 均势市售分析纯或化学纯。甘露糖、核糖、麦芽糖、果糖、半乳耱、鼠醇、山梨 酵、阿拉伯糖及其他鉴定用药品均为分析纯或生化纯试剂。 仪器与设备：o l 蛐p u s 显微镜，日本；n i 嚣岛n y s l 0 0 生物显微摄像仪，日本： s w 二凹1 f 型超净工作台，苏净集团安泰有限公司：a e 2 0 0 s 型电子天平，瑞士 m e t t l e r 仪器厂；瑚型恒温水浴锅，江苏金坛钟大仪器厂；c s l o l - a 型电热鼓 风干燥箱，重庆试验设备厂；c s y f 型恒温培养箱，重庆试验设备厂；手提式高压 杀菌锅，四川成都医疗器械厂；p h s 3 c 型酸度计，成都方舟科技开发有限公司。 其他为实验室常规仪器、器邋。 3 1 。2 方法 3 1 2 1 微生物区系分析方法 分别在榨菜后熟发酵的三个不同阶段取样，采用稀释涂布平板法，对样品中 的微生物进行分离、纯化和计数【4 6 4 7 1 。 3 2 2 1 1 分离培养基 细菌分离采用牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 9 、蛋白胨1 0 9 、n a c l5 9 、琼脂 l 魄、蒸馏水l o m l 。将上述成分溶解定容，调p h 7 。2 7 4 ，分装，1 2 l 灭菌2 妇l i 懿。 酵母菌分离采用豆芽汁培养基：豆芽1 0 0 9 、葡萄糖5 0 9 、琼脂1 5 9 。将黄豆芽 洗净，加l o 翔1 蒸馏水，小火煮沸3 0 m i n ，纱布过滤，补足失水，加入蔗糖和琼 脂，加热溶化，分装，1 2 l 灭菌2 0 m i n 。 。 霉菌分离采用察氏( c z 婶e k ) 培养基：n a n 0 32 9 、k 2 王p 0 4 ，3 h 2 0l g 、k c l0 5 9 、 m g s 0 4 7 h 2 0o 5 9 、f e s 0 4o o 培、蔗糖3 0 9 、琼脂2 魄、水l o 。o m l 。将上述成分用 l o o o m l 蒸馏水溶解定容，分装，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 1 5 西南大学硕士学位论文 放线菌分离采用高氏一号培养基：可溶憔淀粉2 0 9 、硝酸钾l g 、磷酸氢二钾 o 5 9 、硫酸镁o 5 9 、硫酸亚铁0 o l g 、琼脂1 6 9 。将可溶性淀粉用少量蒸馏水调成 糊状，再在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化爱，朴水至l 0 m l ，分装， 1 2 l 灭菌2 0 m i n 。 其他鉴定用培养基成分及配方参照周德庆微生物学实验手册【4 羽。 3 2 2 1 2 计数方法 计数方法参照g b 玎4 7 8 9 。2 2 0 0 3 食品卫生微生物学检验蘸落总数测定的测 定方法f 4 霹。 3 。2 。2 1 。3 分离与纯化 取样：在无菌条件下，取待测榨菜样品2 5 9 ，剪碎置于2 2 5 黻l 0 9 无菌生理 盐水中，充分振荡，即成1 0 1 稀释液。 稀释：在无菌条停下，用l 吐无菌移液管，吸取l 拶稀释渡l 札，移入装有 l 无菌生理盐水的试管中，适当振荡试管使菌液混合均匀，即成l 酽稀释液， 依次作l o 一，l o ，l o 一，l o 一，l o ，l o 一8 十倍梯度稀释。 涂布平板：选取不同的稀释梯度，分别吸取稀释液o 2 m l 于凝固好的平板上， 均匀涂布平板。 培养：将涂布好的平板置于3 2 士l 下连续培养。细菌培养2 4 h ；酵母菌培 养3 4 天；霉菌培养5 7 天。 3 1 2 2 微生物的分类检索鉴定方法 3 1 。2 。2 1 细菌鉴定 细菌鉴定参照伯杰氏细菌鉴定手册( 第八版) 、一般细菌常用鉴定方法、 常用细菌鉴定手骺作形态观察和相关的生理生化试验i 5 吣烈。 ( 1 ) 形态观察： 个体形态观察：在显微镜下观察细胞形态、大小； 菌落形态观察：观察菌落形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度及培 养基的颜色等。 ， ( 2 ) 染色：革兰氏染色法、芽孢染色法等。 ( 3 ) 生理生化及生态特征鉴定； 过氧化氢酶的测定、氧化酶的测定、好氧性测定、糖或醇类发酵试验、葡萄糖 酸盐的氧化试验、v p 试验( 乙酰甲基甲醇试验) 、淀粉水解试验、明胶水解试验、 硝酸盐还 x 嚣零犬学硕士学位论文 益 参 8 迫 籁 程 l麴秘9 01 2 0l 豹 时间( d ) 餐霉麓 口酵母菌 墅细菌 圈2 爨然发酵过程徽生物鬻数变化 f 逅2 m i c r o b eq 岫n t i 哆c 搬l 培嚣证聪i l t l r a l 翩烈嫩哇i 嘁o fz b 糙a i 从图2 中可以看出，榨菜后熟发酵直至成熟的过程中微生物种类及数量的主 要交纯分为三个阶段：第一个阶段，从第l 天到第4 0 天。微生物进行缓慢繁殖， 为以后的榨菜品质的形成创造条件。第二个阶段，从第6 0 天到第9 0 天，为加工 王艺阶段。在这个阶段榨菜话熟过程孛酵母数量急剧增加并达到最大值，细蓥数 量在这个阶段也增至最大，但增幅相对较小。由于盐分的存在和厌氧环境的作用， 以及由于缨菌和酵母菌繁殖高峰的蹬现，造成有机酸的积累，使发酵体系蝉逐渐 下降，因此在这个阶段有害微生物的活动逐渐被抑制。同时，这一阶段乳酸菌和 酵母菌发酵的代谢产物及其相互作用形成的酯类等物质增加了榨菜的番、鲜味。 另外，低p h 值还可促使亚硝酸盐分解，减少了残留的n 0 2 与二级胺作用生成亚 硝酸胺的可能性。第三个阶段，从第9 0 天到第1 8 0 天。由于酸性代谢产物的积累， 使p h 萤进一步下降，放而使这一阶段有益和有害微生物的生长均基本停止，但还 存在着微弱的代谢活性，随着发酵时间的延长，微生物数量逐渐减少。到l o o 天 以后，微生物总数基本上维持在一个较稳定的低数量水平上。霉蓥在缺氧条件下 一般不能生长，在整个后熟期间其数量变化不大。且没发现霉菌菌落。估计整个 艨熟期间霉菌以孢予的形式存在l l 列。 3 2 2 榨菜发酵过程中的微生物鉴定结果 3 2 2 1 细菌鉴定结果 利用牛肉膏蛋自胨培养基对所采盐、二盐、三盐榨菜进行菌种分离、纯纯 培养，对疑似细菌的菌落进行初步的形态学分析，最终分类归纳出形态不同的3 l 株续菌( 见表3 ) 。其中从一盐榨菜分离得到细蓥8 株，从二盐榨菜分离得到细菌 1 8 4 2 0 3 6 4 2 o 榨菜后熟期间自然发酵微生物区系分析 1 2 株，从三盐榨菜分离得到细菌1 1 株。 表3 榨菜发酵细菌分离结果 t h b l e 3r e s u l t so f b a c t e ai s o l a t e d 五mz h a c a i 3 b 2 、2 b 1菌落为圆形，边缘整齐，白色，直径约1 5 2 o n 腑i 3 b 1 、3 b 1 l细胞为球形，直径为约为o “1 o l im ，呈成对排列无芽孢、无鞭毛，革兰氏染色阳性， 由检索表将其归为片球菌属。 2 b 7 、3 b 8菌落为圆形或豆形，表明光滑，乳白色，直径为0 5 一i o r i l m ，较湿润 细胞为球形或短杆形，0 弘1 oum 成对或以短链排列，无芽孢、无鞭毛，革兰氏染色阳 性。由检索表将其归为明串珠菌属 1 b 3菌落为圆形、表面光滑、有光泽、边缘整齐，凸起，白色，直径约0 5 一1 o m m 。 细胞为球形直径为约为o 5 一1 5pm ，单个或呈对排列，无芽孢、无鞭毛，革兰氏染色 阳性。由检索表将其归为葡萄球菌属。 2 b _ 4 、2 b 8 菌落为圆形，边缘整齐，菌落凸起，白色，直径约为2 5 咖 2 b 1 0 、2 b 1 1细胞为杆状，直径为约为1 肛3 o um ，呈杆状或短链捧列无芽孢、无鞭毛，革兰氏染 3 b 3 、3 b 4色阳性由检索表将其归为乳杆菌属。 3 b - 6 、3 b 9 1 b 4 1 b 2 菌落为圆形，边缘整齐，灰白色。直径约为m m m 细胞为椭圆形至杆状，直或稍弯曲直径为约为1 o 一3 opm ，以单个、成对或成链存在， 无芽孢，以周生鞭毛或侧生鞭毛运动或不运动，专性好氧革兰氏染色多数为阴性。 由检索表将其归为醋酸杆菌属。 按照伯杰细菌鉴定手册( 第八版) 分类学鉴定方法，在形态学分析的基础 上，对3 l 株细菌进行进一步的生理生化实验。结果见表4 6 。 1 9 2 0 榨菜后熟期间自然发酵微生物区系分析 1 4 n a c l 浓度生长试验 2 m l2 b - 22 b 32 b 42 - b 52 b 击2 - b 72 b 82 b - 92 m l o2 m ll2 b 1 2 麦芽糖 + 山梨醇一+一+ +一+ 一一 一+ 产生吲哚试验 2 1 塘或 酵类发酵试验 西南大学硕士学位论文 酪氮酸水解试验 + + 精氨酸利用试验一+一 +一一+一+一 柠孽酸盐试验一+ 一+一+一一 p h 9 6 生长试验 +一一一一一 一一一+ 1 4 0 ，o n a c l 浓度生长+一一 一 一 一一一一一一一 鲁连：+ ：阳性反应：一：阴性反应a ：产酸反应；g ：产气反应：p ：胨化反应；o ：可变反应：r ：还原反应：y ：徽好氧； n ：蕞生鼍氧： s ：凝结反应：b ：产碱反应；n y ：兼性厌氯 表6 三盐榨菜细菌生理生化试验结果 t - a b l e 6r e s u l t so f b a c t e r i ai d e n t i 6 c a t i o no f t h i r ds a l t i n g 3 b 13 b - 23 b 33 b 4 3 m 53 b 63 一b 一73 - b - 83 b 93 b i o3 b ll 麦芽糖 +一+ +一 糖 蔗糖 +一+ +一 或一 果糖 + 半乳糖+ + 核糖 +一一+ +一+一+一 阿拉伯糖 +o+ +一+ 甘露糖 +一一+一+一+一 式一 肌醇 一一+ + +一一一+一 山梨醇+一一+ +一一一+一 鼋笥肇酸硅氧化试验+ + 2 2 两南大学硕十学位论文 3 2 2 2 酵母菌鉴定结果 利用豆芽汁培养基对所采一盐、二盐、三盐榨菜进行菌种分离、纯化培养， 对疑似酵母菌的菌落进行初步的形态学分析，最终分类归纳出形态不同的2 l 株酵 母菌( 见表7 ) 。其中从一盐榨菜分离得到酵母菌7 株，从二盐榨菜分离得到酵母 菌8 株，从三盐榨菜分离得到酵母菌6 株。 表7 榨菜发酵细菌分离结果 t a b l e 7r e s u l t so f v e 弱t si s o l a t e d 劬mz h a c a i 编号酵母菌及菌落形态特征 l 二y 1 、1 y 二2 1 y _ 6 、1 y 二7 2 y 1 、2 y 二3 2 y _ 4 、2 y - 5 2 y 6 、2 y 二8 3 y 二l 、3 y 二3 3 y _ 4 、3 y 二5 菌落形态特征与细菌相似，但比细菌大而厚，菌落质地均匀，乳白色，容易用针挑起 细胞为圆形、椭圆或腊肠形生殖方式为多边芽殖，无掷抱子，有子囊抱子，子囊无色、 无突起，真菌丝少或无，成熟时子囊不易破裂。由检索表将其归为酵母属 1 y - 5 、2 y 2 菌株生殖方式为多边芽殖，无掷抱子，营养细胞非三角形，细胞非尖形，子囊抱子l 4 3 y - 2 个，子囊非管状，抱子帽形或土星形，由检索表将其归为汉逊酵母属 按照酵母菌的特征与鉴定手册分类学鉴定方法，在形态学分析的基础上， 对2 l 株酵母菌进行进一步的生理生化实验。结果见表8 1 0 。 一 表8 一盐榨菜酵母菌生理生化试验结果 t a b l e 8r e s u l t so fy e 弱t si d c n t i 6 c 撕o no f 觚ts a l t i i l g 碳阿拉伯糖同化试验 + 一 oo一 + 半乳糖同化试验 + 2 4 0 榨菜瑟熟期髑自然发酵微生物区系分辑 类淀粉化合物形成测定 一一+ 一一一+ 尿酶试验一一+ 一一一一 备注：o ：雕变反应 表9 二盐榨菜酵母菌生璞生亿试验结果 1 a b l e 9r e s u l t so fy e a s t si d e n t i 6 c a t i o no fs e c o n ds a l t i n g 冬v l2 - y 22 一y 32 一2 - k 52 y 菇 2 誓72 v 8 碳 源 同 化 试 验 阿拉伯糖同化试验+一+一 一一o+ 肌醇同化试验+ d 转b 试验一 上 2 5 攘菜岳熟期阏自然发酵微生物区系分析 ( 勋c 幽d 朋研弦嚣g f d 6 淞) ，1 v 6 、2 y 6 为酿酒酵母( 勋 口m 朋y c 黜c p 九卯括妇f ) ， 1 y 3 、2 v 7 为小红酵母( r 舞a 如幻埘纭辫觑“触) ，1 v 4 为易变球拟酵母( 勋删幼嚣转 w 瑙口f 船) ，1 ￥5 为汉逊德巴利酵母( 眈妇叼旧，1 ) 懈j i l 口船绷盯) ， 2 v 2 、3 y - 2 为 异常汉逊酵母( 胁邶积妇口以d 掰口肠) 。其他菌种生理生化反应比较复杂，阴性阳性 可变反应较多，需做进一步的鉴定工作。 3 2 。2 3 霉菌鉴定结果 利用察氏培养基对所采盐、二盐、三盐榨菜进行菌种分离、纯化培养，根据 真菌的形态与分类和真菌鉴定手册，通过对对疑似霉菌的菌落的菌落特征、 菌丝特征、孢子特征等的观察，鉴定出两属霉菌，结果见表l l 。 表1 1 攘菜发酵霉麓分离结粜 r a b l e llr e s u l t so f m o l di s o l a t e d 蠡i o 娃lz h a c a i 主要特征属名 蓥丝有分黼，分生孢孑梗顼臻不膨犬，无顼囊，经多次分棱产生a 轮小梗，小横青霉属 顶端产生成串的青色分生孢子，孢予穗形如翔把。菌落是青色，致密。n 一比f 胁“一 蓥丝有分隔，有是缨耱，分皇斑予棱璜壤澎天成蔟素，璧球形，矮来表瑟长满爨麴蒜瘸 层辐射状小梗，顶端串生球形的分生孢子，孢子黄色，荫落由白变黄。质地疏松。 彳掣矿学讹s 3 3 本章小结 榨菜基本完成爱熟转化过程需要西六个秀的时间，而后熟过程中细菌和酵母 数量的变化呈现先增加后降低的趋势，至第6 0 9 0 天达到峰值。这反映了微生物的 生命活动与榨菜后熟的密切联系。榨菜后熟时高盐密封的环境中适合一些耐高渗 透压或厌氧菌的生长繁殖。而霉菌在缺氧条件下一般不能生长，在整个后熟期间 其数量变化不大，且没发现霉菌菌落。估计整个后熟期间霉菌以孢子的形式存在。 通过对榨菜生产过程的微生物区系的分析，从传统榨菜生产中分离得到细菌包 括：乳酸片球菌( 舭d c c 姗口c 胁肠c f 耙f ) 、嗜盐片球菌( r 饿c d c c 淞| | i 口却五加) 、 粪链球菌( 翻坳融瀚锨l s 庙8 陆) 、乳链球菌( & 碍脚c c 淞酝以红) 、肠膜髓串珠蔼 ( 翻幻刀傩f o c 所黜删f p d 讲黜) 、枯草芽孢杆菌( 肋c f 胁s 甜6 f f 凰) 、蜡状芽孢杆菌 ( 园舀捌矗转删) 、球形芽孢杆菌( 圆露翻s 葶嬲露g 蹴掰警) 、多粘芽孢轷菌( 鼢c f 蹴s p d ，胂y 阳) 、嗜热脂肪芽孢杆菌( 肋c f 眦ss f 印煳胁p 删印 f ，淞) 、坚强芽孢杆菌( b 口c i 胁 筘燃瓣) 、撼物乳抒蘸岱口d o 掘西勉sp 肠撑敬捌燃) 、发酵乳好菌( 三口黝妇矗跏 ，爸门唧p ，l f “删，、嗜盐乎l 杆菌( 己口c f d 6 口c “协j i i 口，d f d 磊p 厂口丹5 ) 、孚l 酸孚l 杆菌( 三口c ，d 6 口c f ，船 蹈c 船) 等。从传统榨菜生产中分离得到酵母藤包括：鲁氏酵母( 触加煳心嚣 2 7 西南犬学硕士学位论文 糟姒函、球形酵母( 磊矗煳勰嬲譬如务淞) 、酿酒酵母( 黜e 葫疽凇哟，c 镪黜聊珞蠡) 、 小红酵母( 尺 d 如f d ，口研加“砌) 、易变球拟酵母( 而朋，n 筇括坩一s d f 如) 、汉逊德巴 剩酵母 含 盐量 含水量 接种璧 真空度( b d a e e ) 。从直茂分析图结果可以看出，最优 3 7 l 2 3 毒2 l 毒3 3 毒l 2 幸， l 2 3 4 2 3 4 l 2 3 4 2 l i l l 2 2 2 2 3 3 3 3 瘁4 邸秘 6 6 叟文 7 2 03 幸躺绣 4 7王t ，2 郇跎 2 2 5 7 4 3 8 8 2 22 ；龉粥 2 23毒凹”4毒|蓑粥 ；23毒in 6 8 9沁挖穆搭撼黜她魁斛列垃b瓣r 橡票a 工接张多疆挣发簿工艺研究 由图8 及图9 可知，在榨菜后熟过程中，酸度呈一个上升趋势，在发酵期，人工 发酵的榨菜的酸度直高予自然发酵的榨菜，并且人工发酵榨菜的酸度更快达到 峰值。在第1 8 0 天时，人工发酵和自然发酵榨菜产品的酸度趋于一致。从图9 也 可看出，人工接种发酵榨菜的p h 值下降的更快，最终p h 值为3 5 5 ，而自然发酵 榨菜p h 下降眈人王发酵榨菜慢，最终p h 值为3 9 7 。榨菜酸度的交他与乳酸菌的 作用关系密切，在发酵的初期，乳酸菌繁殖，酸度上升( 或p h 值下降) 明显，酸 度的积累对乳酸菌的活动起到了一定的抑制作用。乳酸菌的作用诱发了酵母菌的 增殖，酵母的酒精发酵产生乙醇，进一步抑制了乳酸菌的作用。试验结果说明， 人工接种发酵榨菜艇快了微生物的代谢活动，加快了有机酸的积累，促进了榨菜 风味的形成，缩短了榨菜的发酵周期，成熟时间仅为自然后熟的l ，3 。 毒。2 。3 。2 盘然发酵及人工接种发酵榨菜氨基酸态氮含量的比较 o 5 0 4 鼬 鼬 鬟 滋o 3 榴 避 豢o 2 o2 0幻6 0如l 刃l 时间( d ) 潮1 0 榨菜发酵氨基酸态氮交纯曲线 f i g 1 0 ( 湘a n g ec u r v eo f 卸曲o i dn i t 帕g e no f 出a c a i 榨菜在发酵过程中，氨基态氮含量逐渐增加，达到一定值后，趋于平稳。如 图所示，两种榨菜后熟过程中，氨基酸态氮含量差异不显著，但人工接种发酵的 榨菜的氨基酸态氮在后熟的第6 0 天左右达到最大值，自然发酵榨菜在第9 0 天左 右达到最大值。据分析榨菜成品中含氨基酸达1 7 种之多，其中谷氨酸、天门冬氮 酸含量最高，而谷氨酸及天门冬氨酸钠盐具有强烈鲜味【5 7 】。同时，榨菜发酵过程 中氨基酸在酸的作用下还可变成醇，醇与酸化含为酯，产生榨菜的鲜、香味。试 验结果说明，人工接种发酵榨菜和自然发酵榨菜产品最终氨基酸态氮含量无显著 差异，堡人工接种发酵缩短了氨基酸态氮的生成时闻，从面蠢瑟快榨菜风味形成， 缩短榨菜的生成周期。 3 9 榨菜人正接种多菌种发酵工艺研究 g 堪 钲 舞 曙 狻 o4 06 0_ 9 0 时闻( 纛) 图1 2 榨菜发酵还原糖含量变化曲线 f 螗1 2 c h a n g ec u r v eo fr e d u c i n gs u g a ro fz h a c a i 榨菜的糖分在腌制过程中，除了赋予榨菜以甜昧井，也是微生物的营养物质。 当乳酸菌在糖介质中活动时，可将糖转变为乳酸、乙醇、醋酸和二氧化碳等。如 图1 2 所示，榨菜在发酵过程中还原糖含量先缓慢下降，在发酵中期有所回舞，然 后张逐渐下降。人工接种发酵榨菜在第2 0 天左右还原糖含量有所回升，而自然发 酵的榨菜还原糖岔量的回升在第6 0 天左右，较人工接种榨菜有所滞后。但是两种 榨菜还原糖含量的差异不显著。榨菜发酵过程中，由于还原糖被分解利用，含量 有所下降。但在发酵过程中，还原糖含量的回升现象可能是在发酵过程中多糖在 酶的作用下转化为双糖、单糖，转化得到的糖量大于微生物发酵消耗的还原糖含 量。试验结果说明，发酵菌种对榨菜申还原糖豹分解无显著影响。 4 2 3 5 自然发酵及人工接种发酵榨菜亚硝酸盐的比较 4 ， 西南大学硕十学位论文 龟 暑 、一 皤 啦 媚 嫠 器 甥 8弱粥l l 鞠 时间( d ) 图1 3 榨菜发酵亚硝酸盐含量变化曲线 f 穗，1 3 。c 妇g ec 科eo f 珏蠹毳eo f 痃a c 鲑 腌制蔬菜中亚硝酸盐含量超标的闽题倍受广大消费者关注。如图1 3 所示，在 整个发酵过程中，人工接种发酵榨菜的驱硝酸盐含量明显低于自然发酵榨菜，从 亚硝酸盐峰值出现的时间来看，人工发酵榨菜出现在第2 0 天，而自然发酵榨菜出 现在第4 0 天；从峰的最大值来看，人工发酵为l o 。2 1 m g l ( g ，而自然发酵为 17 2 3 m 眺g ；从最终产品的含量来看，人工发酵为0 。9 9 m 眺g ，自然发酵为 3 4 5 m g l ( g 。试验结果说明，人工发酵能够使榨菜亚硝酸盐的含量明显降低，从而 提高榨菜产品的安全性。 4 2 。3 。6 最终产品的理化指标的比较 表1 7 自然发酵与人工接种发酵榨菜的瑗化指标比较 t a b l e l7p h y s i c a la n dc h e m i c a li n d e xo fn a t i l r a la n d 州i f