（农产品加工及贮藏工程专业论文）米根霉深层发酵甘薯淀粉制备L乳酸工艺研究.pdf

米根霉深层发酵甘薯淀粉制备l 一乳酸工艺研究 摘要 本文以资源丰富的甘薯淀粉为碳源，采用米根霉液体深层发酵，研究获得 高品质l 一乳酸最适制备工艺条件，为l 一乳酸规模化生产提供依据，为聚l 乳 酸的生成提供可靠来源。 通过摇瓶试验确定了米根霉a s 3 8 1 9 的最佳培养条件，在此基础上进行了 1 0 l 罐发酵培养，并探索了两种固定化发酵的方法。试验研究的主要结论如f ： 1 摇瓶发酵最佳培养基( ) ：甘薯淀粉1 5 ，( n h ，) ：s o o 4 ，k h ：p o | 0 0 3 ， z n s o 。7 h 。00 0 4 4 ， m g s o 。7 h 。00 0 2 5 。最佳培养条件为3 2 。c ，摇床转速 2 2 0r m i r l ，装液量1 0 0 m l 5 0 0 m l 三角瓶，发酵1 6 h 后一次性添加c a c o 。7 0g h ( 单独灭菌) 。在最适发酵条件下，该菌株的摇瓶发酵l 一乳酸累积量可达 1 2 0 9 l ，对原淀粉转化率为8 0 ，最高生物量达6 5 9 l 。 2 从罐体溶氧入手，采用调节通气流量，搅拌转速等参数，通过对该菌株 产l 一乳酸的l o l 罐发酵试验研究，探索出了1 0 l 罐优化培养条件为：6 l 发酵 液罐，搅拌转速在发酵前期控制在4 0 0r m i n 左右，在发酵后期控制在6 5 0 r m i n 左右，通气流量在发酵前期控制约0 6l ( l m in ) ，发酵后期控制约 0 5l ( l m if i ) ，溶氧控制在g o 9 5 ，发酵温度3 3 3 1 5 ，利用 流加碳酸钙来控制p h 值5 0 5 5 ，消泡剂的添加采用在发酵初期加0 0 1 和 第3 0h 开始逐步流加o 1 。在此发酵条件下，该菌株的罐发酵l 一乳酸累积 浓度可达1 0 2 5 4g l ，最高生物量达7 2g l ，发酵周期7 0h 。 3 用米根霉发酵甘薯淀粉制备l 一乳酸，聚氨脂泡沫吸附法简便易行，所制 得的固定化细胞稳定性强，可反复发酵，有利于提高设备利用率和生产能力。 另一方面，聚氨脂泡沫来源广泛，价格低廉，机械强度大，使用寿命长。因此， 该固定化法易于扩大生产规模，应用于工业生产。但试验中也发现固定化发酵 对无菌操作非常严格，若中途染菌则造成整个试验失败。 关键词：米根霉l 一乳酸发酵工艺甘薯淀粉固定化细胞 s u b m e r g e d f e r m e n t a t i o np r o d u c t i o no fl l a c t i ca c i d f r o ms w e e t p o t a t os t a r c hw i t h r h i z o p u so r y z a e a b s t r a c t s u b m e r g e d f e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g yf o rt h ep r o d u c t i o no f h i g ho p t i c a lp u r i t yl - l a c t i c a c i d b yr h i z o p u so ，t z a e w a ss t u d i e di nt h i sp a p e r t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： a m u t a g e n i z e ds t r a i nr h i z o p u so r y z a ea s 3 8 1 9w a su s e dt op r o d u c el l a c t i ca c i d f r o ms w e e tp o t a t os t a r c h ，a n dt h ef e r m e n t a t i o n t e c h n o l o g yi ns h a k ef l a s kw a si n v e s t i g a t e d a tf i r s t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a lc o m p o s i t i o n so f m e d i u m ( ) w e r e15s w e e t p o t a t o s t a r c h h y d r o l y t e ，o 4 0 ( n h 4 ) 2 8 0 4 ，o 0 3k h 2 p 0 4 ，o 。0 4 4 z n s 0 4 7 h 2 0 ，00 2 5 m g s 0 4 7 h 2 0 ，a n dt h a tt h eo p t i m a lc u l t u r et e m p e r a t u r ea n dr o t a t i o nr a t ew e r e3 2 a n d 2 2 0r m i n ，r e s p e c t i v e l y o nt h ec o n d i t i o n sa b o v e ，l - l a c t i ca c i dp r o d u c t i v i t ya n dt h ec r u d e s w e e tp o t a t os t a r c hc o n v e r s i o nr a t ew e r e1 2 0 g 兄e a l d8 0 ，r e s p e c t i v e l y al o lj a rf e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g yf o rp r o d u c i n gl l a c t i ca c i db yt h es t r a i nw a s d e v e l o p e d ，t h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n sw e r ea s f o l l o w s ：1 0 lj a rc o n t a i n e d4 ll i q u i d c u l t u r em e d i u m ，r o t a t i n gs p e e dw a sf r o m4 0 0t o6 5 0r m i n ，a e r a t i o nv e l o c i t yw a sf r o mo 5 t o0 6l ( l m i n ) ，d i s s o l v e do x y g e n ( d o ) w a sa b o v e8 0 ，f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e w a s f r o m3 3 。ct o3 1 5 。c p hw a sf r o m5 0t o5 。5a n dt h ea m o u n to fd e f o a m e rw a sa b o u t 0 1 r e s u l t sw i t ht h e s ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n si n d i c a t e dt h a tt h e a v e r a g ey i e l do f l - l a c t i ca c i d ，t h ec o n v e r s i o nr a t eo f c r u d es t a r c ht ol i a c t i ca c i da n d t o pb i o m a s s a sw e l la s f e r m e n t a t i o nt i m ew e r e10 2 ，5 4g l ，7 8 ，7 2g la n d7 0h ，r e s p e c t i v e l y i m m o b i l i z e dc e l lf e r m e n t a t i o nw i t hc a l c i u ma l g i n a t ea n dp o l y u r e t h a n ef o a mw a sa l s o s t u d i e d r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei m m o b i l i z e dc e l lf e r m e n t a t i o nc i r c u l a t i n gs e v e nt i m e s w i t hp o l y u r e t h a n ef o a mw a ss t i l lf e a s i b l e ，a n dt h el l a c t i ca c i dp r o d u c t i v i t yh a db e e n i n c r e a s e d b u tw ef o u n di ft h ef e r m e n t a t i o nl i q u i dw a sc o n t a m i n a t e db yo t h e rb a c t e r i at h e s u b s e q u e n te x p e r i m e n t w o u l dl e a dt of a i l u r ea tl a s t k e yw o r d s ：r h i z o p u so r y z a e ，l l a c t i ca c i d ，f e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g y ，s w e e tp o t a t o s t a r c h ，i m m o b i l i z e de e l l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据 我所知，除了文中特别加以标志和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果。也不包含为获得金胆王业太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签字乡錾芸江芦字日期： 年月5 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解佥g b 工些太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅或借阅。本人授权金 胆王些太堂可以将学位论文的全部或部分论文内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 名：辜荽沪名：隆耳 签字日期：2 一【卜年( ) j i | s 日签字日期：多坪年月7 日 学位论文 工作单位 通讯地址 2 7 一。0 7 2 ；。o 钾 致谢 本论文怒在导瓣潘丽军教授赘悉心指导下通过自己刻苦努力完成的，潘老师严谨 求学、精益求精的治学态度和精神深深地影响着我；导师在学业上给我的谆谆诱导和 生活上绘我静无私关4 不让我深切圭| 羹戆受妥为久簿长静辛劳帮为久学予静幸福；导师不 仅教导我做学问更教导我如何做人，让我受益非浅；在谨记导师教诲的同时，我只有 用宓霆穆的努力寒表达对导雾雾熬敬意。 同时我要感谢姜绍通老师和潘利华老师这些年来对我的无私照顾和关怀，在此向 毽翻表达深深的感激。 我还要感谢郑志、罗水忠、李军红、黄静、马道荣等老师和余赞、陈恒伟、张志 葵、黼维疆、寒立群、王浇瀚、马豢椿、张辫等同学给我的支持和帮助。 最后，我还要特别感谢我的父母这些年来对我的葬育之恩，父母的亲情永远是我 力量豹源泉。 第一章绪论 1 1 乳酸的结构、性质及应用 1 1 1 乳酸的结构和性质 乳酸( 1 a c t i ca c i d ) ，又名0 【一羟基丙酸( 0 t h y d r o x y p r o p a n o i ca c i d ) ，分子式为 c 3 h 6 0 3 ，是- - 7 0 0 天然存在的有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物 中。乳酸分子中有一个不对称碳原子，因此具有旋光性。l 一乳酸为右旋性，d 一 乳酸为左旋性，d l 一乳酸为消旋性，其结构式见图l ，它们的理化性质如表1 。 由于人体只含有l 一乳酸脱氢酶，因而只能利用自体产生或摄入的l 一乳酸，若过 量食用d 一或d l 一乳酸则会引起代谢紊乱，因此世界卫生组织( w h o ) 提倡在食 品、医药等领域用l 一乳酸替代目前广泛使用的d l 一乳酸。同时，人们研究发现 用l 一乳酸聚合物制成的塑料薄膜可1 0 0 生物降解。这些都给l 一乳酸的发展带 来了巨大的促进作用“”1 。 h o o c h 吣乡h h a c u 哆 嗷 j c 卜b d 哪口唆 图1 乳酸的结构式 表1 乳酸异构体的理化性质 塑型鳖盛丛里! 些塑堂鏖【蜘! ：! 堡堕堂塑! ! i ! !堕些垫! ! 鉴! 塑! ! ! l2 5 2 6+ 3 3 。1 3 7 x 1 0 1 6 8 7 d2 5 2 63 3 。 d l1 80 1 3 7 x 1 0 _ 4 1 3 7 x 1 0 4 1 6 8 7 1 1 3 5 纯净的无水乳酸是白色的晶状固体，乳酸易与水互溶，不易结晶。在6 7 1 3 3p a 真空条件下反复分馏，可以得到纯品的乳酸结晶。6 0 浓度以上的乳 酸，已有很高的吸湿性，所以，商品乳酸通常为6 0 的乳酸溶液，药典级乳酸 含量为8 5 9 0 ，食品级乳酸含量8 0 以上。因乳酸分子内有羟基和羧 基，有自动酯化能力，通常为微黄色或无色的乳酸和乳酰乳酯混合物。乳酸越 浓这种趋势越强，在表示乳酸浓度时，往往用游离酸和总酸来表示。3 ，其不同 浓度溶液的各项组成见图2 。 1 2 0 10 0 孽8 0 糕 隶6 0 蚓 蜓4 0 2 0 0 o2 04 06 08 0 1 0 01 2 0 质量分数 图24 i 同浓度乳酸溶液的并项组成 + 单体乳酸+ 聚合乳酸+ 水 充分脱水而形成的聚合乳酸中，聚合体的一般形式可以表示为 n c h s c h o h c o o h h o c h c h 3 c o o 。+ ( n i ) h 2 0 此外，乳酸加热时发生自动酯化，可形成乳交酯 叱一门一 丫丫 i1 1 1 2 乳酸的应用 乳酸，作为一种古老而重要的有机酸，广泛应用于食品、医药、饲料、化 工等领域。由于乳酸的酸性柔和且稳定，有助于改善食品的风味，在食品工业 上广泛用作酸味剂、防腐剂和还原剂。可用于清亮饮料、糖果、糕点的生产， 也可用于鱼、肉、蔬菜的加工和包藏。与柠檬酸、苹果酸等食用酸相比，具有 很强的竞争力。在软饮料方面，乳酸在很大程度上取代了柠檬酸和磷酸等，在 啤酒制造上，美国禁止使用磷酸等无机酸调节p h ，而全部使用乳酸。世界上四 分之一的乳酸用来生产硬脂酰乳酯酸。乳酸，特别是l 一乳酸，对人和畜无害， 而且有很强的杀菌作用，其杀菌能力是柠檬酸、酒石酸、琥珀酸的几倍。在1 0 的糖液中加入3 乳酸时，经过一个月尚未出现异状。在1 0 的糖液中分别 接入大肠杆菌、霍乱菌、伤寒菌，加入o 1 的乳酸3h 后，这些病菌全部死 2 亡，这是其它有机酸无法竞争的。因而，乳酸可以直接用作手术室、病房、实 验室、车间等场所的消毒剂。乳酸可添加于烟草中，能保持烟草的湿度，提高 烟草的质量。乳酸可用于制革工业中脱石灰，它能使石灰变成可溶性的乳酸钙 盐而除去，使皮革柔软、细密，从而制成高级皮革。乳酸还可以用来处理纺织 纤维，可使之易于着色，增加光泽，使之触感柔软。l 一乳酸、l 一乳酸钠和葡萄 糖、氨基酸等复合配制成输液，可治疗酸中毒及高钾血症。l 一乳酸铁、l 一乳酸 钠、l 一乳酸钙是补充金属元素的良好药品。由于人体只含有l 一乳酸脱氢酶，d 一 乳酸不能被人体吸收，并且过量食用对人体有毒。因此，世界卫生组织提倡使 用l 一乳酸作为食品添加剂和内服药品，取代目前普遍使用的d l 一乳酸。l 一乳酸 经过聚合可生成直链的或环状的聚乳酸。聚l 乳酸系无毒的高分子化合物，具 有生物相容性，在人体内能被分解成l 一乳酸为人体代谢，不引起变态反应，因 此可用于生产缓释胶囊制剂，可使血液中药物浓度相对降低、提高疗效，降低 副作用，在治疗癌症方面取得可喜进展；也可生物降解纤维，用于制成手术缝 合线随伤口愈合而被机体分解吸收，不需拆线；也可制成生物植片，以修复骨 折或其它机体损伤；聚乳酸与其它材料共聚制成的生物降解塑料，在自然条件 下缓慢分解，它不象p v c 、p p 塑料那样造成“白色污染”。人们发现聚乳酸在 空气、水、和普通细菌存在条件下可完全分解成水和二氧化碳，形成良好的生 态循环。聚乳酸具有良好的初期机械性能，熔点约为1 7 0 ，其模材对氧、水 气具有良好的透过性，又有良好的透明性，另外还有较好的抗菌、防霉性，使 用寿命可达2 3 年，已经成为良好的绿色材料。在美国和同本，聚乳酸已用于 涂料层、透明塑料容器、发泡容器、薄膜、餐馆容器、儿童玩具、蔬菜包装等 方面 “。 乳酸在可生物降解塑料方面的应用，对于减少“白色污染”，实现可持续 发展战略具有及其重要的意义，不久的将来数百万吨级的塑料将被聚乳酸所取 代。 1 2 乳酸的生产方法及研究进展 1 2 1 乳酸的研究进展 1 2 1 1 国内外研究概况 ( a ) 国际方面”“： 1 7 8 0 年，席勒从酸乳中提炼制得乳酸。 18 7 5 年，巴斯德发现使乳变酸的乳酸菌。 1 8 7 8 年，李斯特成功地分离出乳酸细菌，命名为乳杆菌，即今天的乳链球菌。 为纯种培养乳酸菌、进行工业化生产奠定了基础。 1 8 4 1 年，b o u t r o n 和f r e m y 采用自然发酵生产乳酸。 1 8 8 1 年，c h a r l e se a v e r y 公司采用纯种发酵工业化生产乳酸。 1 8 9 4 年， 1 8 9 6 年， 9 1 1 年， 9 1 7 年。 9 3 6 年， 9 8 2 年， e i j k a n a n 发现鲁氏毛霉产少量乳酸。 l e i c h m a n n 分离获褥5 0 下发酵躬优良- g - l 羧蘸一德氏毳楞萤，由溅、 麦芽汁生成乳酸。 囊藤袋瑟华缀霉生产d 一巍黢。 赤木采用德氏乳杆菌以甘藩淀粉为原料进行工业化生产乳酸。 w a r d 分离获褥撬良l 一乳酸产生菌米搬霉，进行表巍培莠产l 一乳酸。 千烟一郎等采用卡拉胶、海藻酸钠固定化粪链球黼、嗜热链球菌，l 乳酸生产能力为1 3 4m g ( m l h ) ，l - 乳酸浓艘为4 6 5g 几。 1 9 8 5 年，中山大树等采用嗜热脂肪芽孢杆菌萃西凝结芽绝杆菌生产l 一乳酸，并采 用卡拉胶固定化凝结芽孢杆菌。 1 9 8 9 年，h a n g 等采嗣米撮霉n r r l 3 9 5 以玉米为原籍壹接发酵生产0 乳酸，产 酸3 5 4 e k g 玉米。 t 9 8 9 年，h m a g 等栗雳海藻羧钙圈定伲米髹鬈予筮予生产l 一巍酸，最高产酸s 2 g l ， 1 9 9 0 年，k i rk o v i t s 等采爰凝缝芽跑概蔻d s m 5 1 6 9 鏊栎发簿，其中l 一飘黢占 9 9 8 。 ( b ) 灏肉方委5 ”8 3 ： 1 9 4 4 年，重庆振元化学药品厂采用德氏乳杆菌发酵生产乳酸菌。 1 9 8 5 1 9 9 2 年，秃锈第二制药厂、浮j e 秦室岛巍酸厂、沈鞫嚣酸厂、镊矧嚣羧 钙厂等采用“双酶法”处理原料，大型发酵罐生产乳酸及乳酸钙。 t 9 9 1 年，薄鹤珠等袋翔寒缀攥发酵l 一毳酸，l 、试。 1 9 9 1 年，曹本昌等采用米根霉发酵l - i l 酸中试。 1 9 9 1 年，杨予跨等慕用寒投霉发酵0 一嚣酸小试。 1 9 9 1 年，刘祖同等固定化米根霉e l - 5 6 发酵生产l 一乳酸。 1 9 9 2 年，曹本昌等分离筛选手酸乳枵萤鼠李糖亚季申麓蛛避行l 一乳酸发酵。 1 9 9 4 年，杜涟祥等分离筛选嗜热凝结芽孢秆菌。 1 9 9 5 年，上海工业微生物研究所协助上海豢明乳酸厂酯化法提取l 乳酸。 1 9 9 7 年，金其荣等分离选育出l 一乳媛达9 9 6 米裉霉突变株，适于米粉、玉米 粉等多种原料。 i 2 1 2 不同菌种的研究情况 ( a ) 缀萤发瓣生产飘酸的磺突 大多数乳酸菌都是革兰氏阳性菌，无孢子，不运动，兼性厌鼠。由于乳酸 萤蠢隽台成b 簇维生素秘缀基酸黪麓力奏黻，谴缮箕营养簧求缎裹，在以巍褰蓥 为原料的乳酸发酵研究中，对上6a e i d o p h i l u s 研究最多，但利用肋d e l b r “e c k i i 、 s p p + d e t b r u e c k i i 可以褥到更裹熬乳酸浓度和怒率。诲多磅究黉对不鹅鹩乳酸发酵 4 生产过程申请了专利，例如利用乳杆菌发酵马铃薯淀粉残渣的边糖化边发酵， 并采用电渗析技术分离提纯产物的工艺过程；有人报道了耐乳酸肋d e l b r u e c k i i 的选育，另外，利用电渗析技术、膜分离技术和酯化技术从发酵液中分离乳酸 的工艺过程也进行了研究。 大多数l 一乳酸产生菌乳杆菌或链球菌属在生成一种构型乳酸的同时产生少 量的另一种构型的乳酸。乳酸脱氢酶具有立体特异性，乳酸菌体内乳酸脱氢酶 的同分异构形式决定了产物乳酸的同分异构现象。过程参数对不同菌种的产物 乳酸中l 一乳酸的比例也有一定的影响”3 。 ( b ) 根霉发酵生产乳酸的研究 1 9 8 9 年，h a n g 等对米根霉发酵产l 一乳酸进行了研究，每k g 粗淀粉原料可 生成3 5 0 克的l 一乳酸；1 9 9 4 年s u n t o m s u k 等通过紫外诱变和n t g 诱变处理，得 到乳酸累积浓度达8 9 8 l ，比原始菌株提高了近6 0 ；我国的曹本昌等人于 1 9 9 1 年选育出株优良菌株，对该菌株的性能及产酸条件进行了研究，在5 0 0 l 发酵罐进行扩大实验，当葡萄糖浓度为1 0 时产酸7 0g l 以上，该菌株以玉 米粉作培养基，当玉米粉浓度为1 2 时产酸7 0g l 以上，其中l 一乳酸纯度最 高达9 9 ；将明珠等1 9 9 1 年筛选出一株高产稳定菌株，在摇瓶培养条件下， 初始葡萄糖浓度为1 5 0 叽，3 5 培养4 8h 产l 一乳酸达1 1 8 4 g l ，对糖转化率 达7 8 9 ：杨虹等1 9 9 4 年利用淀粉一酸性培养基富集培养，并结合高锰酸钾一溴 化钾平板法从土壤中筛选出了产乳酸为8 1 l 的菌株，以其为出发菌株进行诱 变，从琥珀酸平板上获得菌株产乳酸达1 0 3g l ，对糖转化率为6 8 9 ；扬子培 等人1 9 9 5 年使用米根霉t l 一5 2 7 9 菌株以玉米淀粉深层发酵生产l 一乳酸，在3 r n 3 的发酵罐中，当玉米淀粉为1 3 0g l 时，产酸9 4 1g l ，对糖转化率为7 95 5 。发酵液经分离、提取和精致，l 一乳酸纯度达9 8 以上，并且发酵过程实现 了很高的稳定性。”2 7 ”“。 1 2 2 乳酸的生产方法 1 2 2 1 发酵法生产乳酸。” 发酵法生产乳酸起源于1 9 4 1 年b o u t r o n 和f r e m y 的自然发酵生产乳酸；纯 种发酵工业化生产乳酸则是1 8 8 1 年由c h a r l e se a v e r y 公司丌始；而大规模工 业化生产l - $ l 酸是在9 0 年代初期形成”1 。 ( a ) 同型乳酸发酵 在同型乳酸发酵中，乳酸是葡萄糖代谢的唯一产物，采用的是e m p 途径， 经过这种途径，1m o l 葡萄糖可生成2m o l 乳酸，理论转化率为1 0 0 ，但由于 发酵过程中微生物有其它生理活动存在，实际转化率不可能达到1 0 0 ，一般 转化率在8 0 以上者，即视为同型乳酸发酵。 ( b ) 异型乳酸发酵 异型乳酸发酵中，发酵产物包括乳酸、c 0 ：、乙醇( 或乙酸) 等，其产物中 乙醇和乙酸的比例取决于微生物体系中的氧化还原作用。兼性异型乳酸发酵菌 如l a c t o b a c i l l u s c a s e i 发酵戊糖，或专性异型乳酸发酵如l e u c o n o s t o c 发酵己糖 或戊糖均采用这种方式。其乳酸对糖的转化率理论上只有5 0 。 ( c ) 混合酸发酵 混合酸发酵是同型乳酸发酵菌在特殊的情况下，如葡萄糖浓度受到限制、 p h 提高或温度降低，而采用的一种乳酸发酵机制，经由e m p 途径，但丙酮酸的 代谢途径却发生了改变，除了生成乳酸外，还生成其他有机酸副产物。 传统意义上的同型乳酸发酵或异型乳酸发酵是针对乳酸细菌而言+ ，米根霉 作为好氧真菌，靠呼吸产能并提供合成菌体的中间体，就发酵产物而吉。，其发 酵类型属混合酸发酵，它经由e m p 途径生成丙酮酸，然后途经几个分支，既有 在乳酸脱氢酶作用下生成乳酸的部分，也有进入三羧酸循环的部分，甚至还有 乙醇等少量副产物的存在，而这些副产物是乳酸的前体物质一丙酮酸在一些酶 的作用下生成的。 1 2 2 2 化学合成法生产乳酸。” 由化学合成法生产乳酸可通过多种途径，如乳腈法，即是乙醛与氢氰酸经 碱性催化作用生成乳腈，然后通过蒸馏回收纯化，并用硫酸水解为乳酸，粗乳 酸用甲醇酯化得到乳酸甲酯，精镏后水解生成乳酸。还包括糖的碱性催化水 解，丙烯乙二醇氧化，乙醛、一氧化碳和水在高温高压下反应和乙二醇的硝酸 氧化等反应过程。 i 2 2 3 酶法生产乳酸” 本崎等研究了2 一氧丙酸酶法转化生产乳酸，他分别从恶臭假单孢菌 p s e p u t i d a 和假单孢菌1 1 3 细胞中提取纯化出l 一2 一卤代酸脱卤酶( 简称l 酶) 和d l 一2 一卤代酸脱卤酶( 简称为d l 一酶) ，使之作用于底物d l 一2 一氯丙酸，即可 制得l 一乳酸或d 一乳酸。 h u m m e l 等从d 乳酸脱氢酶活力最高的混乱乳杆菌( l a c c o n f u s u s ) d s m 2 0 1 9 菌体中得到d 一乳酸脱氢酶，以无旋光性的丙酮酸为底物得到d 一乳酸。 1 2 2 3 乳酸的生产方法的比较”2 2 1 化学合成法的缺点是产品为外消旋体混合酸，并且其原料是乙醛和剧毒物 氢氰酸，使得人们对其产品的安全性不放心，况且其成本也较高，因而化学合 成法生产乳酸的工艺大大受到了限制；酶法生产乳酸虽可以获得单一光学纯度 乳酸，但工艺比较复杂，难于工业化；微生物发酵法生产乳酸，可以通过菌种 和培养条件的选择而获得具有立体专一性d 一乳酸、l 一乳酸或两种异构体以一定 比例混合的消旋体。另外发酵法生产乳酸能以葡萄糖、乳糖等为碳源，还能利 用淀粉、纤维素等为原料发酵生产乳酸，因此微生物发酵法生产乳酸因其原料 来源广泛，生产成本低，产品光学纯度高，安全性高等优点而成为生产乳酸重 要的方法。 1 3 本课题研究的意义及主要内容 1 3 1 本课题研究的意义o ” 我国甘薯资源丰富，总产量占世界产量的8 0 之多，其中尤以安徽、四 川、山东、河南、河北地区的产量较多。在甘薯精深加工的研究方面，日本的 进展最突出，目前利用甘薯淀粉为碳源发酵生产有机酸和乙醇是甘薯精深加工 的两个重要方面。乳酸发酵主要分为乳酸菌发酵和根霉菌发酵两大类，根霉发 酵的特点是：营养要求简单、发酵温度适中，所产l 一乳酸的的光学纯度高：但 易染杂菌，对无菌操作要求严格，且没有乳酸菌对糖的利用率高。对于这些缺 点可以通过改善操作环境和调控发酵工艺予以克服。要想制得高质量的聚乳 酸，其直接原料l 一乳酸必须具有高的光学纯度。所以利用米根霉对甘薯淀粉进 行深层发酵获取高光学纯度l 一乳酸的研究有着重要意义。 1 3 2 本课题研究的主要内容 以甘薯淀粉为碳源，优化米根霉菌株摇瓶发酵工艺及主要影响因素的研 究：1 0l 罐发酵工艺条件优化及放大过程中关键参数的确定；利用固定化技术 进行深层发酵的探讨。 第二章发酵试验系统的设计与组建 2 1 发酵原理 米根霉能产生淀粉酶和糖化酶，它能利用糖，也可以利用淀粉和淀粉质原 料直接发酵生成l 一乳酸。米根霉作为好氧真菌，靠呼吸产能并提供合成菌体的 中间体，就发酵产物而言，其发酵类型属混合酸发酵，它经由e m p 途径生成丙 酮酸，也有t c a 循环存在，副产物有机酸是乳酸的前体物质一丙酮酸在一些酶 的作用下生成的。米根霉能将大部分糖转化为乳酸，但同时伴随着产生乙醇、 富马酸等其它产物。他们之间的生成情况随着菌种和工艺的不同而异。米根霉 在厌气发酵条件下由葡萄糖生成l 一乳酸和乙醇；若在好气条件下，合理添加无 机盐和微量元素，发酵过程中的其他有机酸最终还会转换为乳酸，异型乳酸发 酵可以转变为同型乳酸发酵，只产生l 一乳酸。此时糖酸转化率接近乳酸细菌的 同型乳酸发酵。 目前国内外采用的经选育的高产l 一乳酸的米根霉，其发酵机制见如下流 程。 米根霉发酵l 一乳酸代谢流程 从代谢流程中可以看出，葡萄糖从细胞外转入细胞内后，首先经过葡萄糖 酵解( e m p ) 途径，转化为6 一磷酸葡萄糖( g 6 p ) ，而后转化为为1 ，6 二磷 酸果糖( f l ，6 2 p ) ，再后转化为磷酸烯醇丙酮酸( p e p ) ，然后转化为丙酮酸 盐( p y r u v a t e ) 。至此，丙酮酸可走4 条途径：其一，就是生成a c e t ) ，1 c o a 乙酰 辅酶a ，进入三羧酸( t c a ) 循环，在这个循环晕会生成( f u m a r a t e ) 延胡索酸 盐、苹果酸赫( m a l a t e ) 、革酰乙酸盐( o x a l o a c e t a t e ) ；其二，就是转化为乙 醛( a c e t a l d e h y d e ) ，嚣螽生藏乙醇；其三，裁是丙嗣酸在( l d h ) 乳酸脱鬣跨 下，生成乳酸；其四，就是生成( x a l o a c e t a t e ) 草酰乙酸盐，而后转化为苹粜酸 盐( m a l a t e ) 秘延胡索酸盐( f u m a r a t e ) 。 我们试验发现，米根霉发酵过程中有少量的其它有机酸如苹果酸、蕊珀 酸、延胡索酸等杂酸存在，遮表明，发酵过程中确实存在丙酮酸的另外几种代 谢途径，所以实验就应尽量减少这戆菲目标途径的流量，以获得最大产物爨； 同时我们也发现，尽管从丙酮酸到乳酸的这个途径属于厌氡酵解，但试验中我 们登须维捺一定兹溶氧，才麓傈证乳酸斡蓠蠹鞫生或，这可能是由予米稷霉蓠俸 生长需要能量，而进入三羧酸循环在有氧情况下则可生成大蹙能量，也许这就 是麓嚣么莹体肉多囊该循环途径豹存在反两有剩予嚣酸静璺三袋蘸器疆；嗣时我 们又发现若实验中溶氧过低，甚至不通氧气，则在生成乳酸的同时_ 乙醇的的含 量大大增加，若溶氧宠是款象俘下，则生成乙簿豹爨缦，l 、；疑时也宥人发现溶 液中二氧化碳的浓度对发酵也有很大影响，这可能烧由于在有丙酮酸生成革酰 乙酸姻途径中二氧化碳的浓发起调节作用：在我们救星标途径中，米根霉秘剐 的菌株不同的地方可能就是乳酸脱氯酶的构型，产物乳酸的构型决定于其关键 酶( 乳酸脱氨酶) 的构型，我们实验发现该菌株的现酸脱氨酶活力很高，在通 氧充遐的情况下，该菌株只怒让狠少量的途径流经三羧酸循环，而不需厌氧环 境仍能保持较高乳酸脱氢酶酶活，这对发酵至关重要”“。 2 2 发酵工慧流程 蓥穗 l 离子交授一脱鬯“港菠一莲心七一酸簿卜结晶创蠡欧荣 l 溶靖手残鑫 9 整个发酵过程涉及上游菌种选育、发酵调控和下游分离提取，本课题研究 的重点是进行发酵调控，同时对下游分离提取做了初步探索。选取诱变筛选的 高产菌株，首先对孢子的培养条件进行了优化，使孢子生长又快又密，且菌丝 相对较少，有利于产酸；由于外界物理条件和化学条件接近菌体自身生理条件 时对产酸具有重要影响，在进行种子驯化和发酵培养时，尽可能让种子培养条 件接近发酵培养条件，同时选择适合菌体生理特性的培养基，使这些条件结合 起来达到最佳产酸效果；在菌种摇瓶培养充分优化的基础上，着重进行了罐发 酵调控，针对所选菌株，较好地解决了溶氧、菌球、种龄等条件对产酸的影 响，使得罐发酵产酸效果接近摇瓶发酵，这为工厂化生产提供了技术支持。 2 3 实验材料、设备及分析方法 2 3 1 实验材料和试剂 ( a ) 实验材料 菌种：米根霉a s 3 8 1 9 ( 本实验室保藏并经多次诱变) 甘薯淀粉：市售食品级 ( b ) 试剂 s w o - c j - 1 f 型超净台 硼b l l 4 2 0 b s 型骥漫培莠镶 s h y 一2 a 型恒濑水浴摇床 y x 一4 5 0 z 全自动不锈钢双层立式灭菌锅 b c d 2 2 1 l 型冰箱 2 0 2 一l 型电热恒温于燥箱 s p x 一1 5 0 b 墅生倔碚养箱 冰柜 离心辘 7 5 6 紫外及可见分光光度计 w a t e r s 5 1 5 离效滚藤镶谱饺 p u r o s p h e r s t a r c l 8 反相柱 邀热畿风干爨器 电子天平 智能控制发酵罐系统 苏净集团安泰公司 上海歇遂医疗器缀厂 江苏金坛金城图胜仪器厂 上海三串医疗器械有限公司 美菱集团 上海浦东跃欣科学仪器厂 上海薄讯实业公司医疗厂 美菱集团 j e 京医爝离心瓿厂 上海第三分析仪器厂 美餮w a t e r s 公镯 美国m e r c k 公制 上海瀵末获歇科学仪嚣厂 上海舆豪公司 镶江系方生物工程公司 2 3 3 分析方法 2 。3 3 1 慈耱豹溅定：采霜慈黼密色法“” ( a ) 原理： 糖与硫酸越反应，脱水艇成羟带基呋哺洋醛( 羟甲基糠醛) ，瓣与蕙酮缩 合成兰色化合物，其呈色强度与溶液中糖的浓度成难比，可比色定量。单糖、 瑟蘧、襁精、淀耪等糖类都藏接与试舞蓦发玺作瑟，戮此，不需要经过密褒承解 ( 如骚求测定不包括糊精和淀粉的糖类，则腹预先将它们除去) 。 国) 帮品测定： 取样品5m l ，用1 0m l 热水溶于5 0m l 容艇瓶中，加入硫酸锌液0 5 聚l ，在沸水漆上热热s 分镑，数基。立繇在撼动下熬入亚铁锇纯镯渡0 。5m l ， 冷却，加水至刻度，摇匀，过滤。吸取滤液2 5m l 于2 5 m l 容量瓶中，稀释至 刻度，摇匀。吸取此稀释波i m l ，按照标准骟线步骤避行测定。 2 3 3 2 还原糖的测定：采用斐林氏滴定法”1 。 一、试剂配制 ( a ) 斐林氏甲、乙液 甲液：称取分析纯硫酸铜3 5g ，次甲基蓝0 0 5g ，用蒸馏水溶解后稀释至 1 0 0 0 m l 。 乙液：称取分析纯酒石酸钾钠11 7g ，分析纯氢氧化钠1 2 64g ，分析纯亚铁 氢化钾( 黄血盐) 9 4g ，用蒸馏水溶解后稀释至1 0 0 0m l 。 ( b ) 0 1 标准葡萄糖溶液 准确称取已烘干的无水葡萄糖1g ( 无水葡萄糖预先在烘箱内以1 1 0 烘干 至恒重，时间约2h ) ，用少量蒸馏水溶解，加入5m l 盐酸防腐，并用蒸馏水定 容至1 0 0 0 m l 。 二、测定步骤 ( a ) 斐林氏液的标定( 即空白滴定) 吸取斐林氏甲、乙两液各5m l 于2 5 0m l 三角瓶中，预加0l 的标准葡萄 糖液适量，加蒸馏水1 0m l ，( 以煮沸时斐林氏液仍呈现蓝色者为宜。如斐林氏 液变为无色，说明加糖量已过量，应重做) 。煮沸2m i n 后，继续滴加0l 葡 萄糖液至蓝色刚变成无色为终点。继续滴加的操作，应在lm i n 内完成。记录所 耗标准葡萄糖的总毫升数a 。 ( b ) 定糖 ( 1 ) 准确吸取斐林氏甲、乙液各5 m l 放入2 5 0 m l 三角瓶中。 ( 2 ) 用吸管吸取l m l 检液加入三角瓶中，从滴定管加入0 1 标准葡萄糖液 约1 0 m l 。 ( 3 ) 置电炉上加热煮沸2 m i n ( 如发现蓝色消失，则表示检液过浓或标准葡萄 糖液过量，应予适当的稀释或取较少的检液重做) 。 ( 4 ) 在沸腾下继续滴加0 1 标准葡萄糖液至兰色刚消失为终点。此操作必须 在l m i n 内完成。记录所耗标准葡萄糖的总毫升数b 。 三、结果计算 以上测定取得准确结果后，可按下式计算检液中的还原糖含量。 还原糖；竺皇! ! ! 竺。1 0 0 y 式中：a 空白滴定所耗标准葡萄糖液总体积( m l ) b 测定检样时所耗标准葡萄糖液总体积( m l ) ； c 标准葡萄糖液的体积百分浓度； n 检液的稀释倍数； v 滴定时所吸取检液的体积( m l ) 。 2 3 3 3 酸碱反滴定法滴定乳酸“” 用0 1 m 过量氢氧化钠加入到待测样品中，滴加两滴酚酞指示剂，再用 0 0 5 m 的硫酸反滴，当指示剂由红色变为无色的瞬间，即为滴定终点，此时乳 酸摩尔含量= ( v * v m ) 厂v # * x o 1 ( m ) 2 3 3 4 反相h p l c 法测乳酸” ( a ) 色谱条件 色谱柱为美国m e r c k 公司的p u r o s p h e r s t a rc i8 反相柱，2 5 0 * 46 ( 5 m ) ，流动相采用0 0 0 5m o l l 的h 2 s 0 4 溶液，流速o 8m l m i n ，检测波长2 1 0 n n l ，进样量2 0u l ，柱温为室温，信噪比设为3 。流动相使用前通过了o 4 5pm 孔径的合成纤维素酯膜进行真空过滤，并超声波脱气。 ( b ) 标准曲线绘制 准确称取标准样乳酸0 1 3 5 5g ，用重蒸水定容到1 0 0m l 容量瓶中，作为标 样贮备液。然后分别从中吸取1m l ，3 m l ，5 m l ，7 m l ，9 m l ，加入到1 0 m l 容量瓶中定容，即为进样试液。分析时每次进样2 0 血，每个浓度进样5 次，取 其平均值。以峰面积为x ，样液浓度为y ，建立的乳酸工作曲线的外标方程 为： y = - 0 0 0 1 5 8 + ( 1 1 1x 1 0 。6 、x ，r = o 9 9 9 9 结果表明，在给定的浓度范围内，线性关系良好，相关系数达到o 9 9 9 9 。 2 3 3 5h p l c 法测定其他有机酸”( 同2 3 3 4 ) 2 3 3 6 e d t a 定钙法测定乳酸“3 ( 经高效液相法校f ) 取发酵液l m l 或2 m l 滴到盛有1 0 0 m l 蒸馏水的三角瓶中，然后加入1 0 m l 1 m 氢氧化钠溶液与1 2 滴钙指示剂，用e d t a 溶液滴定，溶液由紫红色变成纯 蓝色为终点。 乳酸含量= 9 x v 咖v ，g l ； v 嗍：滴定终点所用e d t a 溶液的体积，m l ； vm ：吸取发酵液的体积，l ： e d t a 溶液：0 0 5m o l l ： 钙指示剂溶液：1g 钙指示剂( 铬蓝黑r ) 碾碲溶于1 0 0m l 水 中，或混合碾碎于1 0 0g 食赫固体粉末中。 2 3 3 7 生物量的测定 菌体干重法“4 1 ：菌丝体用稀酸洗净过量的碳酸钙，放于8 0 。c 烘干至恒重。 2 3 3 8 氨基氮的测定：甲醛滴定法“。 吸取发酵液2 m l ，加水1 0 0m l ，加入酚酞指示剂3 滴，用0 1 m 氢氧化钠 标准溶液滴至初现微红色，不用记录用量。加入3 6 中性甲醛l om l ，摇匀，放 置l m i n ，再用0 1 m 氢氧化钠标准溶液滴定至呈微红色，记录滴定氢氧化钠标 准溶液的毫升数。 氨基氮( g l ) = v 。x m 。x1 4 2 ； v 。：氢氧化钠滴定体积，m l ； m 。：氢氧化钠摩尔浓度，m o l h ； 1 4 ：代表每摩尔氢氧化钠相当的氮质量： 2 ：代表发酵液体积( m l ) 。 2 3 3 9 溶氧的测定：溶氧电极。 2 3 3 1 0 p h 的测定：p h 电极。 2 3 3 1 1 纸层析法定性测定乳酸”“ 展开剂是以水：苯甲醇：正丁醇= 1 ：5 ：5 ( v ：v ：v ) 的比例相混合，然后 加1 的甲酸；显色剂是0 0 4 的溴酚蓝酒精溶液，用0 1m o l ln a o h 调节p h 到6 ，7 。 2 4 发酵实验系统的组成 图3i o l 罐试验发酵系统 1 4 第三章摇瓶发酵的最适条件研究 3 1 引言 菌株的高产特性不仅由其遗传特性决定，而且与其所处环境条件和菌体生 长变化有关。发酵法生产乳酸除了受菌种的影响外，培养基的组成、培养条件 以及菌体形态等对产量影响很大。在生产上，为了最大限度地发挥菌种的生产 能力，必须提供最适生产培养基和培养条件。否则，即使有了优良菌株，菌种 的生产能力也不能充分体现。因此，探索菌株高产特性充分表达的最佳培养条件 是发酵生产的基础与关键“。 3 2 材料与方法 3 2 1 材料 3 2 1 1 菌种 米根霉a s 3 8 1 9 ，原菌种购自中国科学院微生物研究所，经本实验室多次 诱变选育。 3 2 1 2 培养基 3 2 1 2 1 固体种子培养基( p d a 培养基) 马铃薯2 0 0g ，葡萄糖2 0g ，琼脂2 0g ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h 自然。 制备方法：马铃薯去皮，切成块煮沸3 0r a i n ，然后用2 层纱布过滤，再加糖及 琼脂，熔化后补足水至1 0 0 0m l ，1 2 1 灭菌3 0m i n 。 3 2 1 2 2 液体种子增殖培养基( ) 葡萄糖5 ，液化甘薯淀粉5 ，( n h 4 ) 2 s 0 40 4 ，k h 2 p 0 40 0 3 ，z n s 0 4 7 h 2 0 o 0 4 4 ，m g s 0 4 7 h 2 00 0 2 5 ，f e s 0 4o 0 0 1 。 3 2 1 2 3 发酵培养基