（农产品加工及贮藏工程专业论文）酶法提取米糠蛋白及其褐变抑制.pdf

摘要 一 摘要 米糠蛋白是世界公认的优质植物蛋白，它不但营养价值高且具有低过敏性的特点。我国 作为一个农业大国，稻谷资源丰富，具有开发米糠蛋白的巨大优势和潜力。目前，关于米糠 蛋白的研究和报道很多，但是我国仍然没有实现对米糠浓缩蛋白和分离蛋白的商业化生产， 对米糠蛋白研究还处于实验室阶段。这主要是因为米糠蛋白较其他植物蛋白更加难以提取， 并且在蛋白的提取过程中往往伴随着大量有色物质的生成，导致米糠蛋白品质下降，不具有 很好的食用性和使用性。褐变反应是导致有色物质生成的主要原因。为此，本文结合现有的 研究成果，采用酶法提取米糠蛋白，优化提取条件并对提取过程中导致褐变的主要因素和抑 制方法进行研究，为工业化生产高品质的米糠蛋白提供试验依据和有益探讨。 本研究以东北农业大学农学院提供的米糠为原料，采用复合酶法提取米糠蛋白。依据纤 维素酶、复合蛋白酶和植酸酶共同作用时的最佳配料比，应用响应面法优化提取条件，以蛋 白提取率为指标，水解度为参考指标，确定提取米糠蛋白的最佳反应条件：通过对米糠多酚 氧化酶特性的研究、米糠中还原糖含量、铁和单宁含量的测定，确定可能导致米糠蛋白提取 过程中的主要褐变因素；并在此基础上，考察添加抑制剂、酵母发酵除糖、e d t a 处理、活 性炭脱色等方法对褐变的抑制效果。 研究得到的结果如下： 1 响应面法优化米糠蛋白的最佳提取条件为：温度4 5 ，底物浓度1 8 ，酶添加量 4 7 3 3 u g 。通过检验证实该模型可以较好地反映出米糠蛋白提取的条件。此条件下，蛋 白实际提取率达到7 9 3 3 ，同时水解度 5 。 2 经测定，本试验所用的原料米糠中，米糠多酚氧化酶的最适p h 为4 0 ，最适温度为4 0 ， 9 0 水浴处理2 5 r a i n 后，该酶基本失活；还原糖含量约为8 5 3 ，单宁含量约为0 8 1 ， 铁含量为4 8 3 1 5 m g l 。由此，判断米糠多酚氧化酶导致的酶促褐变与还原糖、金属离子、 酚类物质等导致的非酶褐变均是导致米糠蛋白提取过程中有色物质生成的主要原因。 3 正交试验表明，0 1 5 的半胱氨酸+ 0 3 0 的柠檬酸+ 0 0 1 0 的乙二胺四乙酸二钠的抑制 剂组合，可以有效抑制蛋白提取过程中有色物质的生成，经计算，此时的色素抑制率为 7 1 0 6 ；此外，当h 2 0 2 和n a c i o 的添加量在1 0 7 0 0 时，对褐变反应也有较好的抑制作用， 色素抑制率分别为3 2 3 0 和3 4 2 2 。 4 试验表明，酵母发酵法不能有效除去原料米糠中的还原糖含量，因此得出酵母发酵法不 具有很好的褐变抑制效果：用e d t a 处理过的水提取米糠蛋白，可以减少提取过程中有 色物质的生成。经计算，其色素抑制率约为1 3 4 4 ，说明e d t a 处理过的水具有一定的 褐变抑制效果；数据显示，在吸附温度4 5 ，吸附时间2 0 m i n 的条件下，活性炭对米糠 蛋白的脱色率为5 8 7 5 ，说明活性炭对米糠蛋白提取过程中形成的有色物质具有很好的 吸附性。 关键词：米糠蛋白；褐变抑制；色素物质；酶法；提取 a b s t r a c t s t u d yo ne n z y m a t i ce x t r a c t i o no fr i c eb r a n p r o t e i na n d i n h i b i t i o ni t sb r o w n i n g a b s t r a c t t h er i c eb r a np r o t e i ni sk n o w na sh i g hq u a l i t yv e g e t a b l ep r o t e i nt h r o u g ht h ew o r l d ，i th a sn o t o n l yt h eh i g hn u t r i t i o n a lv a l u e ，b u ta l s ot h el o wa l l e r g i cc h a r a c t e r i s t i c c h i n ai sal a r g ea g r i c u l t u r a l c o u n t r yw h i c hh a sa b u n d a n tr e s o u r c e so fr i c e ，a n dh a sg r e a ts u p e r i o r i 哆a n dp o t e n t i a lt od e v e l o pt h e p r o j e c t so fr i c eb r a np r o t e i n a tp r e s e n t , t h e r ea r em a n yr e s e a r c h e sa n dr e p o r t sa b o u tt h er i c eb r a n p r o t e i n ，b u tt h ec o m m e r c i a lp r o d u c t i o no fr i c eb r a np r o t e i nc o n c e n t r a t i o na n dt h er i c eb r a np r o t e i n i s o l a t eh a dn o tb e e na c h i e v e di nc h i n a t h es t u d yo ne x t r a c t i o no fr i c eb r a np r o t e i ni ss t i l la tt h e l a b o r a t o r ys t a g e t h em a i nr e a s o n sa r et h a tc o m p a r i n g 谢t ho t h e rv e g e t a b l ep r o t e i n ，t h er i c eb r a n p r o t e i ni sh a r dt oe x t r a c t ，a n di so f t e nf o l l o w i n gt h eg r e a td e a lo fc o l o r e dm a t e r i a lp r o d u c t i o ni nt h e p r o c e s so fp r o t e i ne x t r a c t i n g t h e ym a d et h eq u a l i t i e so fr i c eb r a np r o t e i nt ob el o w ，s oi td o e sn o t h a v eg o o de d i b i l i t ya n du s a b i l i t y t h eb r o w n i n gr e a c t i o ni st h em a i nc a u s eo ft h ep r o d u c to ft h e c o l o rs u b s t a n c e t h e r e f o r e ，t h i sr e s e a r c hw a sb a s e do nt h er e s u l t so fp r e s e n tr e s e a r c h e s ，p r e p a r i n g r i c eb r a np r o t e i nw i t he n z y m eh y d r o l y s i s ，o p t i m i z e dt h ee x t r a c t i o nc o n d i t i o n s ，s t u d i e dt h ep r i m a r y f a c t o r so fb r o w n i n ga n dt h em e t h o d so fa n t i b r o w n i n g ，p r o v i d et h ee x p e r i m e n t a lb a s i sa n dt h e b e n e f i c i a ld i s c u s s i o nf o rt h eh i g hq u a l i t a t i v er i c eb r a np r o t e i ni n d u s t r i a l i z a t i o n t h em a t e r i a l sw e r es u p p o r t e db ya g r o n o m yc o l l e g eo fn o r t h e a s ta g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y t h e r i c eb r a np r o t e i nw a se x t r a c t e db yu s i n gc e l l u l o s e ，p r o t a m e xa n d p h y t a s ew i t ht h eo p t i m i z a t i o nr a t i o o ft h e m t h er e s p o n s es u r f a c em e t h o dw a su s e dt oo p t i m i z et h ee x t r a c tc o n d i t i o n s t a k i n gt h e p r o t e i ne x t r a c t i o nr a t i oa st h ei n d e x ，d e g r e eo fh y d r o l y s i sa st h er e f e r e n c ei n d e x ，t h eo p t i m i z a t i o n e 萃t r a c tc o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e d t h ec h a r a c t e r i s t i co fr i c eb r a np o l y p h e n 0 1 - o x i d a s ew a ss t u d i e d a n dt h ec o n t e n t so fd e c r e a s i n gs u g a r , f ea n dt a n n i nw e r ed e t e r m i n e d ，t h ep o s s i b l eb r o w n i n gf a c t o r i ne x t r a c t i n gp r o c e s sw a sc o n f i r m e d f u r t h e r m o r e ，b a s e do nt h i s ，t h ee f f e c to fd i f f e r e n tm e t h o d so n t h eb r o w n i n gi n h i b i t i o nw a se x a m e d ，t h a ti sa d di n h i b i t o r s ，y e a s tf e r m e n t a t i o nt or e m o v eg l u c o s e ， e d t a p r o c e s s i n ga n da c t i v ec a r b o nd e c o l o r i z e t h er e s u l t so fe x p e r i m e n t sw e r ea sf o l l o w s 1 t h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n so ft h er i c eb r a np r o t e i nb yr e s p o n s es u r f a c em e t h o da r e ： t e m p e r a t u r e4 5 c ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n1 8 ，e n z y m ea d d i n g4 7 3 3 u g t h et e s tw a su s e dt o v e r i t yt h em o d e l t h er e s u l ti n d i c a t e dt h et e s t i n gg o o d n e s so fi t u n d e rt h i sc o n d i t i o n ，t h e p r o t e i na c t u a le x t r a c t i o nr a t i oa c h i e v e s7 9 3 3 ，d e g r e eo fh y d r o l y s i s 3 0 时， 褐变随p h 值的增加而加快，在p h 值为2 o 3 5 时，褐变速度与p h 值成反比，p h 值较高 时，食品很不稳定，容易褐变，所以降低反应体系的p h 是控制褐变的方法之一：另外，水 分活度与褐变速度有较大关系，水分含量1 0 1 5 时最容易发生褐变，水分含量为3 0 时 褐变最厉害，因此对于果汁等饮料制品来说，适当降低产品浓度，也可降低褐变速率。 ( 2 ) 添加褐变抑制剂因为美拉德反应中产生了含有共轭双键的有色物质。强氧化剂 可以有效破坏羰基化合物及中间产物中的双键结构，使共轭双键发生断裂，将含有共轭双键 结构的有色物分子破坏成为分子量低、双键含量少的物质。从而改变了生色基团的结构，减 少了生色基团和发色基团的数量，达到抑制褐变的目的。目前常用的氧化剂有：n a c i o 、h 2 0 2 、 0 3 等。另外，也可以添加亚硫酸盐等还原剂达到抑制褐变的目的，因为它们具有还原作用， 可以与美拉德反应中间产物结合，从而阻止或减缓美拉德反应的进行，从而避免或减少有色 物质的生成。此外，亚硫酸盐还能消耗氧和降低p h 值，这些都间接的阻止了褐变反应的发 生( 班玉风等，2 0 0 4 ) 。 ( 3 ) 有机酸和含硫氨基酸添加有机酸的目的是通过降低p h 值以控制非酶褐变，常用 的有机酸有柠檬酸、抗坏血酸、肉桂酸、苯甲酸等。柠檬酸是使用最多的食用酸，作为褐变 抑制剂来说，通常与抗坏血酸或亚硫酸盐混合使用效果更好。亚硫酸盐虽能有效抑制褐交， 但由于其残毒性和对环境的污染。用量受到限制，因此寻找安全可靠的亚硫酸盐替代物迫在 眉睫。研究发现，含疏基的氨基酸对非酶褐变具有强烈的抑制作用，以同样摩尔数添加，其 效果与亚硫酸盐近似。含疏基的氨基酸对非酶褐变抑制作用归功于其疏基硫原子极化形成的 空d 轨道重叠后亲核作用增强，因而在亲核加成反应中s h 的反应速度比n h 2 高2 0 0 - - 3 0 0 倍，使羰基化合物首先与s h 加合而抑制褐变( 李慧芸等，2 0 0 5 ) 。 ( 4 ) 活性炭和吸附树脂活性炭作为一种优良的吸附剂，它具有比其他吸附剂更高的 比表面积，因此它可以吸附更多非极性或弱极性有机分子；并且活性炭的化学稳定性较高， 具有良好的耐酸碱和耐热性；另外，活性炭上吸附键强度要比其它吸附剂低，因而吸附分子 的解吸比较容易，而且吸附剂再生时能耗也比较低。因此，几乎所有的食品工业都会用活性 炭进行脱色精制( 夏洪应，2 0 0 6 ) 。采用大孔吸附树脂主要用于脱去饮品中的色素，可以提 高饮品的色值。饮品中的游离氨基酸在酸性条件下主要以阳离子的形式存在，因此，用大孔 1 3 东北农业大学工学硕士学位论文 强酸阳离子交换树脂可以交换除去其中的氨基酸，从而基本上控制了其非酶褐变发生，避免 了饮品在贮藏过程中色泽加深，保持了良好的色泽。 ( 5 ) 其他对于含糖量较少的食品利用酵母发酵除糖法，可以达到很好的褐变抑制效 果( 已经在蛋粉和脱水肉末中应用) ；还可以利用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的混和酶制剂 除去食品中微量的葡萄糖和氧( 此法在罐装食品中应用) 。去除食品中的铜、铁等金属离子， 也可以有效抑制因其与抗坏血酸及单宁等酚类物质结合所引起的褐变。钙可与氨基酸结合生 成不溶性化合物，因此钙盐具有协同防止褐变的作用( 已经应用于马铃薯食品加工) 。 1 6 课题的研究意义 动物蛋白因含有易导致心血管疾病的饱和脂肪酸和胆固醇。而使其摄入量受到限制。相 对于动物蛋白来说，植物蛋白不仅资源丰富、廉价，还具有独特的生理功能，如对肝硬化患 者的营养支持作用、降低胆固醇水平、减少癌症的发生、改善肾脏病和心血管疾病的症状等， 因此得到了营养学界的极大关注。目前，西方发达国家的膳食中以动物性食物为主，动物蛋 白食用量过多，导致“文明病”泛滥( 如肥胖、高血压、高血脂、心脑血管病、糖尿病等) 。近 年研究发现，用植物蛋白替代动物蛋白能够降低血脂浓度、增加低密度脂蛋白受体的表达， 加速脂质的清除、减少动脉粥样硬化，降低心脑血管病的发生。a p p e l ( 2 0 0 3 ) 称，增加植物 性蛋白质的摄入，可有效地降低高血压患者的血压和预防心血管疾病。 我国人口众多，人均耕地面积少，不可能拿出大量的粮食去转化成动物蛋白，因此积极 开发植物蛋白质资源更是势在必行。为了提高中华民族健康素质，中国食品工业协会还提出 了植物蛋白与动物蛋白并举的方针( 王晶，2 0 0 6 ) 。因此，无论从食物的需求，还是从膳食 营养平衡的角度出发，发展植物蛋白在我国都是一项具有战略意义的大事。 米糠蛋白作为一种兼顾了环境和经济效益的植物性副产资源，具有其他植物蛋白无法比 拟的低过敏性和高蛋白质生物价的特性。因此，对于像我国这样米糠资源丰富的国家来说， 米糠蛋白的开发利用具有重要的实际意义。 本课题研究的意义主要有以下几个方面：( 1 ) 优化复合酶法提取米糠蛋白的条件，增加 米糠蛋白的提取率，为提取米糠蛋白提供有力的数据支持。( 2 ) 对导致米糠蛋白褐变的主要 因素进行研究，为生产高品质的米糠蛋白提供理论依据。( 3 ) 在保证米糠蛋白高提取率的同 时，针对导致米糠蛋白褐变的主要因素，寻找有效可行的褐变抑制方法和途径，控制并减少 酶法提取米糠蛋白过程中色素物质的生成，提高米糠蛋白的利用价值，增加其在食品中的应 用范围，以期对我国工业化生产米糠蛋白起到推动作用。 1 4 材料与方法 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 原料 米糠：东北农业大学农学院提供。 2 1 2 酶制剂等 纤维素酶( c e l l u l a s e ) ：天津利华酶制剂有限公司，经测定酶活力为9 0 0 0 u g 复合蛋白酶( p r o t a m e x ) ：丹麦诺维信公司，经测定酶活力为1 0 0 0 0 u g 植酸酶：康地恩生物科技有限公司，经测定酶活力为5 0 0 0 u g 酵母：安琪高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司 2 1 3 主要试剂( 以下试剂均为分析纯) 正已烷、乙醇、乙醚、氢氧化钠、硼酸、盐酸、浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、无水碳酸钠、 干酪素、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、葡萄糖、酒石酸钾钠、磷酸、 钨酸钠、磷钼酸、高氯 酸、硝酸、乙酸锌、亚铁氰化钾、单宁、3 ，5 二硝基水杨酸、柠檬酸、半胱氨酸、h 2 0 z 、 n a c i o 、e d t a 2 n a 、活性炭等。 2 1 4 主要仪器和设备 p h s 3 c 型精密p h 计 h h s 2 1 - 4 电热恒温水浴锅 微型漩涡混和器 低速离心机l d 4 2 a 型 j j i 电动搅拌器 t d l - 5 0 0 b 冷冻离心机 h v p i i 型消化炉 上海雷磁仪器厂 上海医疗器械五厂 上海精科试验有限公司 北京医用离心机厂 常州国华电器有限公司 上海安停科学仪器厂 上海纤检仪器有限公司 东北农业大学工学硕士学位论文 k d n - 0 4 1 3 凯氏定氮仪 电子分析天平 d h g 9 2 4 0 a 型电热恒温鼓风干燥箱 7 2 2 分光光度计 p e a a 8 0 0 型原子吸收分光光度计 2 2 方法 2 2 1 主要成分的含量测定 上海新嘉电子有限公司 梅特勒托利多仪器上海有限公司 上海一恒科技有限公司 上海精密科学仪器有限公司 美国 2 2 1 1 蛋白质含量的测定 凯氏定氮法( g b t 5 0 0 9 3 2 0 0 3 ) ，样品的系数为5 9 5 。 2 2 1 - 2 脂肪含量的测定 索氏抽提法( g b t 5 0 0 9 6 2 0 0 3 ) 2 2 1 3 水分含量的测定 恒重法( g b t 5 0 0 9 4 - 2 0 0 3 ) 2 2 1 4 纤维含量的测定 重铬酸钾碘量法：称取1 克过筛米糠样品装入离心管，加1 0 r a l 乙酸和硝酸混合液，盖 上塞，在沸水浴中煮沸2 5 m i n ，同时定期搅拌。离心弃去上清液，再用水洗三次，得沉淀。 向沉淀中加入l o m l o 5 m o l l 的硫酸重铬酸钾溶液，混匀，将此溶液放入沸水中煮沸1 0 m i n ， 定期搅拌。冷却，溶液部分转移到三角瓶中用2 0 - - 一3 0 m l 水冲洗沉淀，洗液并入三角瓶中， 加入2 0 碘化钾1 0 m l ，在暗处放置5 r a i n 。加入1 5 0 m l 水稀释，释放出的碘用o 1 m o l l 硫 代硫酸钠标准溶液滴定，滴定至溶液由棕红色变为黄色时，加入2 m l 0 5 m o l l 淀粉指示剂， 滴定容液由蓝色变为亮绿色为止。按同样操作，滴定1 0 m l 0 5 m o l l 重铬酸钾空白液。 纤维素含量( ) ：鱼：至兰! 兰坠二经! 兰! 竺竺1 0 0 1 0 0 0 7 c ? 硫代硫酸钠摩尔浓度( t o o l l ) y 窑；滴定空白所消耗的硫代硫酸钠体积( i n l ) y 撑；滴定样品所消耗的硫代硫酸钠体积( m l ) m ? 样品质量g 6 7 5 7 纤维素的摩尔质量( 咖o l ) 1 6 材料与方法 2 2 2 样品检测的方法 2 2 2 1 蛋白质提取率的计算 米糠蛋白提取率c ，一篱纛蓑连姜器x 1 0 0 2 2 2 2 样品水解度的测定 ( 1 ) 标准曲线的制作 将恒重的甘氨酸o 1 0 0 0 9 溶解并定容至l o o m l ，再从中取2 m l 定容l o o m l 得浓度为 2 0 肛g m l 的甘氨酸溶液。再稀释成甘氨酸含量为2 2 吮咖l 的溶液。各取稀释液2 m l 于具 塞刻度试管中，分别加入l m l 茚三酮显色剂，混匀后沸水浴1 5 r a i n ，同时作空白试验，冷水 中冷却，补充蒸馏水至刻度，加入4 0 乙醇溶液5 m l ，振荡。空白调零，在5 7 0 h m 处测吸 光值。以吸光值为纵坐标，甘氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。 ( 2 ) 样品水解度测定 取水解液l m l 定容到l o m l 容量瓶中，从中取0 4 m l 稀释液于试管中，并加入1 6 m l 蒸馏水，l m l 茚三酮显色剂，按标准曲线同样操作，测定吸光值。 水解度计算公式：d h = x1 0 0 ，k 查堡堕 尘里篁鎏粤垡掣一原料蛋白质中游离一n h ：含量( m 所甜g ) 5 9 5 n ( m g m l l 。、。7 hc 0 1 t ( r e t o o l g 、) 式中： j i l ：单位质量蛋白质中被水解的肽键的量( r e t o o l r a g ) h t o t ：单位质量蛋白质中肽键的总量( m m o t r g ) 2 2 2 3 色素抑制率的计算 x 1 0 0 取离心后的脱脂米糠水解上清液，在波长为4 2 0 r i m 处，用分光光度计测其吸光度值。( 当 吸光值大于0 8 时，用蒸馏水进行1 ：9 稀释后再进行吸光度值的测量) 。色素抑制效果以色 素抑制率表示，由测得的吸光度计算而得： 色素抑制率= 型1 0 0 a o 式中： 爿d ：未经抑制色变的水解液吸光度 彳：经抑制色变的水解液吸光度 1 7 东北农业大学t 学硕士学位论文 2 2 3 米糠蛋白的制备流程 本试验采用酶法提取米糠中的蛋白质，具体方法如下： 2 2 3 1 脱脂米糠的制备 原料米糠经粉碎，过8 0 目筛子，向过筛米糠中以1 ：1 0 的比例加入正己烷，室温下搅 拌3 0 m i n ，3 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，沉淀在室温下晾干，即得脱脂米糠。 2 2 3 2 米糠水解工艺 脱脂米糠_ 加水( 配成固液比1 ：1 0 ) 一搅拌调适当的p h 、t ( 依据反应条 件而定) 一加酶_ 反应一定时间( 期间加l m o l l h c i 、l m o l ln a o h 维持p h 在 0 0 5 之间) 一离心( 3 0 0 0 r r a i n 、2 0 r a i n ) 一灭酶( 调p h = 8 ，8 5 ，1 0 r a i n ) 广清液一收集上清液v 1 l 沉淀- 加入0 5 n a c i 溶液 搅拌- 离心卜收集清液v 2 2 2 4 米糠蛋白水解工艺条件的研究 资料表明，目前用于提取米糠蛋白的酶类，主要有糖酶、蛋白酶、植酸酶三种。糖酶的 作用方式是通过破碎植物细胞壁，使植物细胞的内溶物充分游离出来而达到提取蛋白的目的 ( 刘志强，1 9 9 9 ) 。纤维素酶是糖酶的一种，是由若干种相互关联的酶组成的相当复杂的酶 系( f r e d e r i c kfs h i h ，2 0 0 0 ) ，该酶系具有“协同作用”。 本试验对纤维素酶和复合蛋白酶( p r o t a m e x ) 提取米糠蛋白的条件进行优化。考虑到采 用的提取方法和实验室的实验条件，本试验主要考察温度、时间、p h 及酶添加量对蛋白提 取率的影响，分别做单因素试验，观察它们对蛋白提取率的影响趋势。然后在此基础上，根 据b o x b e h n k e n ( b o x b e h n k e nd e s i g n s ，b b d ) 的中心组合试验设计原理( 胡良平，2 0 0 3 ) ， 采用三因素三水平的响应面分析方法，对米糠蛋白的提取条件进行优化。 2 2 4 1 纤维素酶提取米糠蛋白的条件优化 ( 1 ) 提取温度的单因素实验 温度选取3 0 。c 、4 0 、4 5 、5 0 、6 0 五个水平，其它条件定为提取时间l h ，p h 4 3 ， 酶添加量为9 0 u g ，液固比1 0 ：1 ，以蛋白回提取率为指标，考察提取温度与脱脂米糠蛋白 提取率的关系，并绘制温度对蛋白提取率的影响曲线。 ( 2 ) 提取时间的单因素实验 提取时间分别取1 h 、2 h 、2 5 h 、3 h 、3 ，5 h 、4 h 六个水平，其它条件定为提取温度为4 5 ， p h 4 3 ，酶添加量9 0 u g ，液固比1 0 ：1 ，以蛋白回提取率为指标，考察提取时间与脱脂米糠 蛋白提取率的关系，并绘制时间对蛋白提取率的影响曲线。 ( 3 ) p h 的单因素实验 分别取p n 4 0 、p h 4 3 、p h 4 8 、p h 5 3 、p h 5 8 、p h 6 0 六个水平，提取时间1 h ，温度为 1 8 材料与方法 4 5 ，酶添加量9 0 u g ，液固比1 0 ：1 ，以蛋白回提取率为指标，考察提取p h 与脱脂米糠蛋 白提取率的关系，并绘制p h 对蛋白提取率的影响曲线。 ( 4 ) 酶添加量的单因素实验 酶添加量分别取9 0 u g 、i s o u g 、2 7 0 u g 、3 6 0 u g 四个水平，提取时间为1 h ，温度为 4 5 ，p h 4 3 ，液固比1 0 ：1 ，以蛋白回提取率为指标，考察酶添加量与脱脂米糠蛋白提取率 的关系，并绘制酶添加量对蛋白提取率的影响曲线。 2 2 4 2 复合蛋白酶提取米糠蛋白的条件优化 米糠中的蛋白质嵌在细胞壁上，与细胞中的其他物质相结合，采用蛋白酶水解能够提高 它从原料中的提取率，并且改进它的功能性质。本试验对复合蛋白酶提取米糠蛋白的条件进 行优化，保证蛋白提取率较高的同时对水解度控制在5 以下。 ( 1 ) 提取温度的单因素实验 ! 温度选取3 0 、4 0 、4 5 、5 0 、6 0 五个水平，其它条件定为提取时间l h ，p h 5 5 ， 酶添加量1 0 0 u g ，液固比1 0 ：1 ，以蛋白回提取率为指标，考察提取温度与脱脂米糠蛋白提 取率的关系，并绘制温度对蛋白提取率的影响曲线。 ( 2 ) 提取时间的单因素实验 提取时间分别取1 h 、2 h 、2 5 h 、3 h 、3 5 h 、4 h 六个水平，其它条件定为提取温度为4 5 ， p h 5 5 ，酶添加量1 0 0 u g ，液固比1 0 ：1 ，以蛋白回提取率为指标，考察提取时间与脱脂米 糠蛋白提取率的关系，并绘制时间对蛋白提取率的影响曲线。 ( 3 ) p h 的单因素实验 分别取p h 5 5 、p h 6 0 、p h 6 5 、p h 7 0 、p h 7 5 五个水平，提取时间1 h ，温度为4 5 c 和酶 添加量1 0 0 u g ，液固比1 0 ：1 ，以蛋白回提取率为指标，考察提取p h 与脱脂米糠蛋白提取 率的关系，并绘制p h 对蛋白提取率的影响曲线。 ( 4 ) 酶添加量的单因素实验 酶添加量分别取1 0 0 u g 、2 0 0 u g 、3 0 0 u g 、4 0 0 u g 、5 0 0 u g 五个水平，提取时间为1 h ， 温度为4 5 ，p l - 1 5 5 ，液固比1 0 ：1 ，以蛋白回提取率为指标，考察酶添加量与脱脂米糠蛋 白提取率的关系，并绘制酶添加量对蛋白提取率的影响曲线。 2 2 4 3 响应面法优化米糠蛋白的提取条件 响应面分析法( r e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s ，r s a ) 是利用合理的试验设计并通过实验得到 的一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程 的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。其中较常用的是b o x b e h n k e n 法和b o x - w i l s o n 法。此两种方法使用于2 5 个因素的优化实验。b o x b e h n k e n 法是将每个因 素取3 个水平，以( 1 ，0 ，1 ) 编码( 赵思明，2 0 0 5 ) 。 本试验采用b o x b e h n k e n 法进行设计和试验，固定提取时间为2 h ，p h 为5 5 ，选取提取 温度、底物浓度和酶( 三种酶复合) 添加量为试验因素，米糠蛋白的提取率为试验指标。其 因素水平选取见表2 1 ，试验设计方案见表2 2 。 1 9 东北农业大学工学硕士学位论文 表2 1 试验的因素水平编码表 t a b l e 2 1f a c t o r sa n dl e v e l so ft h et e s t - _ _ _ i _ _ _ _ _ l l _ _ _ _ - i l - _ _ _ _ _ _ - _ _ i _ _ _ l - l - _ _ _ i - _ _ i _ _ _ _ _ _ _ _ - _ - _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ l _ _ _ _ i - - i _ _ _ _ - _ _ l _ _ _ _ _ - _ - _ l _ _ - - _ _ _ _ l _ _ _ - _ _ - _ i l - l _ _ - 麴堡笪垒! 堡墼量堕兰! 里! 瘗塑堕鏖丝!堡! 堕鋈垫量型丝! 1 0 1 4 0 4 5 5 0 1 0 1 5 2 0 2 2 0 0 3 3 0 0 4 4 0 0 2 2 5 确定酶法提取米糠蛋白过程中的主要褐变因素 试验通过对米糠蛋白提取过程中的一些可能导致褐变( 如多酚氧化酶引起的酶促褐变、 还原糖等引起的非酶褐变) 因素进行研究，确定导致酶法提取米糠蛋白褐变的主要因素。 2 2 5 1 米糠中多酚氧化酶( p p o ) 特性的研究 ( 1 ) p p o 溶液的制备 多酚氧化酶粗酶液的提取按照k r u g e r 等( 1 9 9 4 ) 和t a n e j a 等( 1 9 7 4 ) 方法进行，其中对 部分细节稍加修改( 司红起等，2 0 0 6 ) 。称取5 0 0 r a g 脱脂米糠放入1 0 m l 离心管中，再向离 心管中加入5 0 m l 0 2 m o l l 的柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液( p h 6 0 ，4 c ) ，迅速振荡、摇匀 2 0 材料与方法 mw m。e 后置入预设温度为4 的电冰箱内，浸提约2 5 h 后在冷冻离心机上离心( 1 0 0 0 0 r m i n ，4 ) 1 5 m i n ，取上清液置于另一个l o m l 离心管中，放入4 c 的电冰箱内保存备用。 ( 2 ) 米糠p p 0 最大吸收波长的确定 取0 2 m o l l 柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液( p h 6 0 ，4 c ) 2 m l ，加入0 2 m o l l 邻苯二酚溶 液1 o m l 和0 1 m l p p o 粗酶液，至比色杯中，室温下迅速混合均匀，然后在波长3 5 0 4 5 0 n m 间测量吸光度a 的变化。每隔6 0 s 记录1 次吸光值a ，共记录5 次，重复三次。( 李君兰等， 2 0 0 7 ) ( 3 ) p p o 活力的测定 采用消光值法。吸取0 2 m o l l 的柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液( p h 6 0 ，4 c ) 5 m l ，加入 0 2 m o l l 邻苯二酚溶液1 0 m l 先于室温保温5 m i n ，再加入粗酶液l m l ，迅速混匀后进行测 定。在上述测定的最大吸收波长处测定吸光度a 的变化，每隔6 0 s 记录1 次吸光值a ，共记 录5 m i n ，重复三次。以每6 0 s 吸光度a 的变化表示p p o 活力的大小( 罗晓妙等，2 0 0 6 ) 。 ( 4 ) 米糠p p o 活力与温度的关系 吸取0 2 m o f l 柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液( p h 6 0 ，4 c ) 5 m l ，加入0 2 m o l l 邻苯二酚 溶液和粗酶液各1 0 m l 。分别在2 0 、2 5 、3 0 、3 5 、4 0 、4 5 、5 0 、5 5 、6 0 、 6 5 、7 0 的水浴中保温5 m i n ，取出迅速冷却至室温，按上述方法测定p p o 的活力的变化。 ( 5 ) p p o 的热稳定性 吸取0 2 m o l l 柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液( p h 6 0 ，4 1 2 ) 5 m l ，加入0 2 m o l l 邻苯二酚 溶液1 0 m l 和粗酶液l m l 。分别在7 0 、8 0 、9 0 的水浴中保温不同的时间，取出迅速 冷却至室温，按上述方法测定p p o 的活力变化。 ( 6 ) 米糠p p o 活力与p h 值的关系 用磷酸二氢钠一磷酸氢二钠、柠檬酸一磷酸氢二钠的缓冲液调节反应体系的p h 值。室温 下，在5 m lp h 值分别为2 0 、3 o 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 的一系列缓冲溶液中，分别加入 0 2 m o l l 邻苯二酚溶液1 0 m l 和粗酶液l m l ，按上述方法测定不同p h 值对酶活力的影响， 确定其作用最适的p h 值。 2 2 5 2 脱脂米糠中还原糖含量的测定 采用直接滴定法( g b t 5 0 0 9 7 2 0 0 3 ) ，略有改动。称取1 2 9 试样置于2 5 0 m l 容量瓶中， 加2 0 0 m l 蒸馏水，在4 5 水浴中加热1 h ，并不时振摇。冷后加水至刻度，混匀，静置，沉 淀。吸取2 0 0 m l 上清液于另一个2 5 0 m l 容量瓶中，慢慢加入5 m l 乙酸锌溶液及5 m l 亚铁 氰化钾溶液，加水至刻度，混匀，沉淀，静置3 0m i n ，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，滤液 备用。然后用标定好的碱性酒石酸铜溶液进行试样溶液的预测。即吸取5 0 m l 碱性酒石酸铜 甲液及5 0 m l 乙液，置于1 5 0 m l 锥形瓶中，加水1 0 m l ，加人玻璃珠2 粒，控制在2 m i n 内 加热至沸，趁沸以先快后慢的速度，从滴定管中滴加试样溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶 液颜色变浅时，以每两秒1 滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体 积。当样品溶液中的还原糖浓度过高时应适当稀释，再进行正式测定，使每次滴定消耗样液 的体积控制在与标定碱性酒石酸铜溶液时所消耗的还原糖标准溶液的体积相近，约在1 0 m l 左右。当浓度过低时则采取直接加人1 0 m l 样品液，免去加水1 0 m l ，再用还原糖标准溶液 2 1 东北农业大学工学硕士学位论文 滴定至终点，记录消耗的体积与标定时消耗的还原糖标准溶液体积之差相当于l o m l 样液中 所含还原糖的量。晟后进行试样溶液的测定，即吸取5 o r a l 碱性酒石酸铜甲液及5 0 m l 乙液， 置于1 5 0 m l 锥形瓶中，加水l o m l ，加入玻璃珠2 粒，从滴定管滴加比预测体积少l m l 的试 样溶液至锥形瓶中，使在2r a i n 内加热至沸，趁沸继续以每两秒1 滴的速度滴定，直至蓝色 刚好褪去为终点，记录样液消耗体积。重复测三次，得出平均消耗体积。 试样中还原糖的含量按公式进行计算： z 兰一一1 0 0 臃矿2 5 0 x 1 0 0 0 式中： j ：试样中还原糖的含量，单位为克每百克( g l o o g ) 爿：碱性酒石酸铜溶液相当于某种还原糖的质量，单位为毫克( m g ) m ：试样质量，单位为克( g ) 阢测定时平均消耗试样溶液体积，单位为毫升( m l ) 2 2 5 3 脱脂米糠中单宁含量的测定 ( 1 ) 标准曲线的制作 吸取单宁标准溶液0 ，0 5 ，1 0 ，1 5 ，2 0 ，2 5 ，3 0 ，3 5 m l ，分别置于盛有约3 0 r a l 水 的5 0 r a l 容量瓶中，摇匀；加入饱和碳酸钠溶液5 o r a l ，摇匀。用水稀释到刻度，混匀，放 置3 0 m i n 后在7 6 0 n t o 波长处用l o m m 比色皿测定吸光度。以吸光度值作纵坐标，以5 0 r a l 溶 液中的单宁含量作横坐标，绘制标准曲线。 ( 2 ) 样品单宁含量的测定( s n 厂r 0 8 0 0 9 1 9 9 9 ) 称取试样约1 9 ，精确至o 0 0 0 1 9 ，置于盛有约3 0 m l 水的具塞三角瓶中，准确加入5 0 r o l l ： 5 的乙醇溶液，加塞子密封，在振荡机上振荡6 0 m i n ，然后用双层滤纸过滤，弃去前面少部 分滤液，其余滤液供测定用。吸取滤液1 0 m l ，置于盛有约3 0 m l 水的5 0 m l 容量瓶中，摇 匀，加入f - d 试剂( 将钨酸钠l o o g 、磷钼酸2 0 9 溶于约7 5 0 m l 水中，移入1 0 0 0 m l 烧瓶中， 加入5 0 m l 磷酸，摇匀接上冷凝管在沸水浴上加热回流2 h ，冷却后用水稀释至1 0 0 0 m l ) 2 5 m l ，摇匀；加入饱和碳酸钠溶液5 0 m l ，摇匀。用水稀释到刻度，混匀，放置3 0 r a i n 后 在7 6 0 n t o 波长处用l o m m 比色皿测定吸光度( 同时吸取1 ：5 的乙醇溶液1 0 m l 按上述步骤 进行空白试验) 。单宁含量以干基中单宁质量的百分数来表示，按下式计算： 单宁( 干基，) = i 五面b 丽x 丽5 0 丽1 0 0，以l u u u i 工一朋l 式中： 丑：根据样品测得的吸光度值，在标准曲线上查出的相应5 0 m l 溶液中的单宁含量( r a g ) 胁：试样质量( g ) 。m - 试样水分含量( ) 2 2 5 4 脱脂米糠f e 含量的测定 ( 1 ) 试样消化 精确称取均匀样品1 9 ，于2 5 0 m l 高型烧杯中，加混合酸消化液2 0 m l - - - 3 0 m l ，上盖表 2 2 材料与方法 面皿。置于电热板或电沙浴上加热消化。如未消化好而酸液过少时，再补加几毫升混合酸消 化液，继续加热消化，直至无色透明为止。再加几毫升水，加热以除去多余的硝酸。待烧杯 中的液体接近2 3 m l 时，取下冷却。用去离子水洗并转移于l o m l 刻度试管中，加水定容。 取与消化试样相同量的混合酸消化液，按上述方法作试剂空白测定。 ( 2 ) 标准曲线的制作 将f e 标准溶液( 1 m g m l ) ，用0 5m o l l 硝酸溶液，分别配制成0 ，1 ，2 ，3 ，4 ，5 m g l 的标准稀释液，利用原子吸收分光光度计在波长为2 4 8 3 r i m ，紫外光源，空气乙炔火焰的操 作参数下进行标准曲线的绘制。 测定用试样液及试剂空白液由标准曲线查出浓度值( c 及c o ) ，再按下式计算： y ( c - c o ) x v x f x l 0 0 i 一 ，挖x 1 0 0 0 式中： x ：试样中元素的含量，单位为毫克每百克( m g l o o g ) c ：测定用试样液中元素的浓度( 由标准曲线查出) ，单位为微克每毫升( l g m l ) c d ：试剂空白液中元素的浓度( 由标准曲线查出) ，单位为微克每毫升( z g m l ) 阢试样定容体积，单位为毫升( m l ) ，：稀释倍数 m ：试样的质量，单位为克( g ) 2 2 6 酶法提取米糠蛋白过程中褐变抑制方法的研究 目前，关于褐变抑制