（遗传学专业论文）gna单克隆抗体的制备及在检测gna转基因大豆方面的应用.pdf

摘要 雪花莲凝集素( g n a ) 是植物凝集素家族中非常重要的一员。g n a 单体由1 0 9 个氨基酸 组成，分子量为1 2 k d a ，天然的g n a 是一个由四个单体以非共价结合而形成的一个分子 量为5 0 k d a 多聚体糖蛋白。g n a 可以专一识别甘露糖，并通过破坏昆虫中肠的表皮细胞 从而达到杀虫的目的。g n a 对刺吸式口器的害虫和某些咀嚼式口器的害虫及多种线虫均 有较好的毒杀效果，如蚜虫、稻飞虱、叶蝉等，可以部分弥补b t 的杀虫图谱，近年来引 起了科学家的广泛关注，越来越多种植物被转入了g n a 的基因。随着转基因植物突飞猛 进的发展，转基因植物以及转基因食品安全性的问题越来越受到人们的关注。本实验制 备了抗g n a 的单克隆抗体，并把它用于对g n a 转基因大豆的检测。 首先用从s i g m a 公司购得的g n a 纯品免疫b a l b c 小鼠，每次8 嵋，共免疫4 次。 加强免疫后第四天取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合。融合率为5 ，阳性率为2 0 8 。 通过4 次有限稀释克隆获得了一株抗g n a 的杂交瘤细胞株，命名为2 d 8 。以g n a 纯 品通过w e s t e r nb l o t 法和间接e l i s a 法对单抗2 d 8 进行检测，证明了单抗2 d 8 确实是 与g n a 蛋白特异性结合的。用间接e l i s a 法测定腹水的效价为l ：4 0 0 。 ， 用改良的c t a b 法提取g n a 转基因大豆的基因组d n a ，以根据g n a 的全长序列设计的 引物进行p c r 反应，以非转基因大豆基因组作为阴性对照，证明了g n a 转基因大豆中确 实整合了g n a 的基因。 提取g n a 转基因大豆的可溶性蛋白，用单抗2 d 8 对其进行间接e l i s a 法检测，并以 非转基因大豆的可溶性蛋白作为阴性对照，结果证明了g n a 转基因大豆确实表达了g n a 蛋白，并测得其表达的g n a 蛋白占其可溶性蛋白的0 1 左右。迸一步利用单抗2 d 8 对g n a 转基因大豆的可溶性蛋白进行了w e s t e r nb l o t 法检测，同样以非转基因大豆的可溶性 蛋白作为阴性对照，也在g n a 转基因大豆中检测到了转入g n a 基因的表达。 这些结果都为我们建立一套可以在蛋白水平上，更快捷更准确的对转基因植物进行 检测的方法提供了基础。 关键词；单克隆抗体，转基因植物检测，间接e l i s a 法，w e s t e r nb l o t 法 a b s t r a c t g a l a n t l l u sn i v a l i sa g g l u t i n i n ( g n a ) i so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tn l e m b e r so ft h ep l a n t a g g l u t i n i nf a m i l y t h eg n a m o n o m e ri sc o m p o s e db y1 0 9a m i n oa c i d s a n di t sm o l e c u l a r w e i g h ti s1 2 k d a , n a t u r a lg n a i sag l y c o p r o t e i np o l y m e r sw h i c hf o r m e db yf o u rm o n o m e r s w i t ht h en o n - c o v a l e n tb o n da n dm o l e c u l a rw e i g h ti s5 0 k d a g n ac a ns p e c i f i c a l l yc o m b i n e t h el l a a n n o s e ，a n dd e s t r u c tt h ee p i d e r m a lc e l l so fi n t e s t i n e st ok i l lt h es a ps u c k i n gi n j u r i o u s i n s e c t so fh o m o p t e r a na n dm a n yo t h e ri n s e c t s i ti sae o r a p e m a t i o nt ob tr e g a r d i n gt h ei n s e c t s p e c t r u mt ok i l l g n ag e n ew a st r a n s f e r r e di n t om o r ea n dm o r ep l a n t s 1 1 1 et r a n s g e n i cp l a n t s a n di t ss a f e t yi s s u er e c e i v em o r ea n dm o r ea t t e n t i o na l o n gw i t ht h ev e r yf a s td e v e l o p m e n to f 仃a i l s g i cp l a n t s i nt h i ss t u d yt h ea n t i g n am o n o c l o n a la n t i b o d i e sw e r eg e n e r a t e dt h r o u g h c e l lf u s i o na n dw e r eu s e dt ot h ee x a m i n a t i o no f s o y b e a np l a n t st r a n s f o r m e dw 媳g n ag e n e t h ep u r eg n a p u r c h a s e df r o ms i g m ac o r p o r a t i o nw a su s e dt oi m m u n et h eb a l b c m o u s ef o rf o u rt i m e sa n d8 嵋f o re a c ht i m e mc e l lf u s i o nw a sc o n d u c t e db yt h es p l e e n c e l l sa n dn s 1c e l l sa f t e rf o u rd a y so ft h el a s ti m m u n i z a t i o n , a n dt h ef u s i o nr a t ew a s5 a n d t h ep o s i t i v er a t ew a s2 0 8 a na n t i g n ah y b r i dc e l ls t r a i nw a sy i e l d e da n dn a m e da s2 d 8 a f t e r4r o u n d o fc l o n i n gb yl i m i td i l u t i o n s n er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea n t i b o d y2 d 8w a g s p e c i f i ct og n ap r o t e i na n di t st i t r a t i o nw a s1 ：4 0 0d e t e r m i n e db yw e s t e r nb l o ta n di n d i r e c t e u s a 1 1 l es o l u b l ep r o t e i n sw e r ei s o l a t e df r o mt h eg n a t r a n s g e n i cs o y b e a n sa n d2 d 8a n t i b o d i e s w e r eu s e dt ot e s tt h ep r o t e i n sb yi n d i r e c te l i s a 1 1 ”g n ap r o t e i nw a so 1 o ft h et o t a l s o l u b l ep r o t e i n s t h e s er e s u l t sw i l lp r o v i d ea l la l t e r n a t i v ew a yt od e t e c tt h et r a n s g e n i cp l a n t sm o r eq u i c k l y a n dm o r ea c c u r a t e l yi np r o t e i nl e v e l k e yw o r d s ：m o n o c l o n a la n t i b o d y , t r a r t s g 瓤cp l a n t ，i n d i r e c te l i s a ，w e s t e r nb l o t l i 独创性声明 本人声明所里交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 ，t ， 学位论文作者签名：镒整日期：丝显：2 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复 印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它 复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名；盥 日 期：2 翘：= ) 学位论文作者毕业后去向； 工作单位： 通讯地址； 指导教师签名：兰堕 日 期：型翌： ：2 电话： 邮编： 1 引言 1 1 雪花莲凝集素概述 1 1 1 植物凝集素 广义上凝集素被定义为聚糖结合性蛋白，或无免疫原性的糖蛋白，具有使红血球凝 聚的功能随着研究的不断深入，植物凝聚素被重新定义为：含有至少一个非催化结构域， 并能可逆结合到特异单糖或聚糖上的所有植物蛋白质。目前数百种凝集素已经被鉴定， 越来越多的凝集素正在被克隆，有关植物凝集素的功能研究己广泛展开。凝集素的已知 功能包括以下几方面：作为储存蛋白，并对储存物质进行包装和运输；作为植物细胞的有 丝分裂因子；参与细胞壁的延伸；生长调节及运输碳水化合物；参与豆科植物感染结瘤； 具有酶的功能：协同其它防御蛋白在植物防御中起一定的作用“1 。 植物凝集素的杀虫机理涉及到几种相互作用：凝集素可以结合害虫消化道上皮细胞 表面的糖缀合物，糖基化的消化酶，几丁质及受体植物的糖蛋白，使蛋白不能被消化， 这些结合影响了害虫吸收营养物质。同时还可能在害虫消化道内诱发病灶，促使消化道 内细菌的繁殖，对害虫造成危害，抑制害虫生长发育繁殖”。 随着抗虫植物基因工程的研究发展，植物凝集素在抗虫基因工程上的应用受到了越 来越多的重视，获得了越来越多的转植物凝集素基因的抗虫转基因植物。 1 1 2 雪花莲凝集素 雪花莲凝集素是单子叶甘露糖凝集素中石蒜科外源凝集素，天然的g n a 是一个由 四个单体( 1 2 k d a ) 非共价结合而成的多聚体糖蛋白( 5 0k d a ) 3 j 。组成每个单体的1 0 9 个 氨基酸形成1 2 条8 片层结构，在空间上相互折叠，彼此又形成三个亚结构域( i ，i i 和 i i i ) ，其中亚结构域i i 和i i i 对应四条链，亚结构域i 对应三条片层。1 2 条片层 结构组成的单体结构近似三棱柱，组成每个亚结构域折叠片与三棱柱中轴相垂直，并且 甘露糖结合位点位于亚结构域之间的缝隙部位，故有1 2 个甘露糖结合位点。非共价相 连的四个g n a 单体( a ，b ，c 和d ) 组成一个结构上近似王冠的g n a 四聚体，单体a 和d 、b 和c 之间又通过其c 端的氢键形成紧密的二聚体，两个二聚体再通过氢键结 合形成四聚体，四个亚基之间为一个溶剂通道( 图1 ) “”。 图1 g n a 空间结构及甘露糖结合位点 l 1 - 1 3 雪花莲凝集素的生物学功能 g n a 是一种甘露糖专一识别的植物凝集素。1 ，它对昆虫的作用部位主要在中肠的 表皮细胞。通过免疫定位研究发现，g n a 在褐飞虱体内的结合位点是在中肠的碳水化 合物域。超微结构显示，g n a 的结合可引起其中肠微绒毛膜破裂，边缘部分发生病变， 引起细菌在微绒毛区增殖，使细胞溶解；中肠表皮细胞发生异常变化，功能结构受到破 坏，引起死亡o “”“。另外，在褐飞虱的脂肪体，卵巢管以及整个血淋巴中均发现了g n a ， 说明g n a 可以穿透中肠壁进入昆虫的循环系统，引起系统中毒反应【1 ”。研究表明g n a 对刺吸式口器的害虫和某些咀嚼式口器的害虫及多种线虫均有较好的毒杀效果，如蚜虫、 稻飞虱、叶蝉等，只是对种类繁多的刺吸害虫和线虫来说依然非常有限“，但因为其 可以部分弥补b t 的杀虫图谱“”“”，近年来引起了科学家的广泛关注。 1 2g n a 转基因植物的检测 1 2 1g n a 转基因植物检测的现状 g n a 可以部分弥补b t 的杀虫图谱，近年来引起了科学家的广泛关注，越来越多 种植物被转入了g n a 的基因。从1 9 9 5 年至今已经被转入g n a 基因的植物有大豆“”， 土豆m ，棉花n 町，小麦，水稻川，烟草，油菜脚等十余种，并且数量还在持续增加 中嘲。目前在g n a 转基因植物检测方面大都是在d n a 水平上的检测矧唧，大都采用 p c r 法嘲，s o u t h e r nb l o t 法曲1 或者p c r - - s o u t h e r nb l o t 法m 1 。而在真正影响转基因 食品安全性嘲1 的蛋白水平上的检测却少之又少m 1 ，而在蛋白水平上的检测都用的是兔 抗g n a 的多抗血清做w e s t e r nb l o t 法检测啪”。 1 - 2 2 单克隆抗体技术原理 英国科学家k o h l e r 和m i i s t e i n 在1 9 7 5 年将产生抗体的淋巴细胞同可无限分裂的 骨髓瘤细胞融合，成功的建立了单克隆抗体技术。该技术被誉为免疫学的一次革命，是 2 0 世纪后2 0 年内最重要的生物高技术之一，其创建者因对人类做出的杰出贡献荣获 1 9 8 4 年诺贝尔医学与生理学奖。当动物受到外界抗原刺激后可诱发免疫反应，产生相应 抗体，这一职能由b 淋巴细胞承担；肿瘤细胞在体外培养条件下可以无限传代。为了制 备大量纯一的单克隆抗体，k o h l e r 和m i i s t e i n 设计了如下方法：小鼠骨髓瘤细胞与经 绵羊红细胞免疫过的小鼠的脾细胞( b 淋巴细胞) 在聚二乙醇或灭活病毒的介导下融合。 融合后的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性：一方面可以分泌抗绵羊红细胞的抗体， 另一方面像肿瘤细胞一样，可在体外培养条件下或在移植到体内后无限增殖，从而分泌 出大量的单克隆抗体。单克隆抗体技术最主要的优点是可以用不纯的抗原分子制备纯一 的单克隆抗体。其原因是，可以从产生各种不同抗体的杂交瘤混合细胞群体中筛选出产 生特异抗体的杂交瘤细胞株汹“矧。 1 2 3 间接法e l i s a 技术原理 1 9 7 1 年e n g v a l l 和p e r l m a n n 发表了酶联免疫吸附剂测定( e n z y m el i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 用于i g g 定量测定的文章，使得1 9 6 6 年开始用于抗原 2 定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是i 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；使抗原或抗体与某种酶连 接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测 定时，把受检标本( 测定其中的抗体或抗原) 和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载 体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他 物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶 反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关， 故可根据颜色反应的深浅来作定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地地 放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度“小蜘。 e l i s a 法是蛋白质分析中一项重要的技术，既可用于测定抗原，也可用于测定抗体。 在这种测定方法中有3 种必要的试剂：1 固相的抗原或抗体。2 酶标记的抗原或抗体。 3 酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测所具备的条件，可设计出各种 不同类型的检测方法。主要方法有双抗体夹心法，双位点一步法，间接法测抗体和竞争 法等1 。 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测己与固相结 合的受检抗体，故称为间接法，只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测 各种与抗原相应的抗体“”“”。 l2 。4w e s t e r nb l o t 法技术原理 蛋白质印迹法( w e s t e r nb l o t 法) 是将蛋白质混合样品经s d s p a g e 电泳后分离为 不同的条带，其中即含有能与特异性抗体相结合的待检测蛋白条带。将p a g e 胶上的蛋 白条带转移到硝酸纤维素膜上的过程称为b l o t t i n g ，随后将硝酸纤维素膜与抗体血清一 起孵育，使第一抗体与待检测的特异蛋白条带上的蛋白相结合。再与酶标的第二抗体反 应，最后加入底物进行显色或曝光，并可对待检测蛋白进行定量分析。w e s t e r nb l o t 法既可用于测定抗原，也可用于测定抗体，是蛋白质分析中一项重要的技术1 。 1 3 立题依据 制备兔血清抗体需要的抗原量是很大的，本实验准备以b a l b c 小鼠为实验材料， 这将大大节省抗原的用量“”，并准备制备鼠抗g n a 的多抗血清和抗g n a 的单克隆抗体， 除了w e s t e r nb l o t 法外再用更加方便并且可以进行蛋白定量的间接e l i s a 法检测转g n a 植物，为我们建立一套可以在蛋白水平上，更快捷更准确的对转基因植物进行检测的方 法提供基础。目前还没有这方面的相关报道。 2 材料和方法 2 1 材料 2 1 1 动物材料 队l b c 小鼠购于长春生物制品所。 g n a 纯品购于s i g m a 公司。 g n a 转基因大豆由公主岭农科院袁鹰老师课题组提供，品系为吉农3 号。 2 1 2 细胞株 骨髓瘤细胞n s l 购于长春博德生物公司。 2 1 3 化学试剂 福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂，p f a ：4 0 0 0 ，降植烷，小鼠抗体亚型检测试剂盒， 硝酸纤维素膜均购自s i g m a 公司。 h r p 标记山羊抗小鼠i g g 抗体购自北京中山生物技术有限公司。 化学发光试剂，购自p i e r c e 公司 2 i 4 引物 根据g n a 的全长序列设计p c r 的引物序列，并由上海生工生物工程技术服务有限公 司合成。 s e n s e ：5 a t g g c t a a g g c 从g t c t c c t c a n t i s e n s e ：5 ，t c a t t a c t t t g c c g t c a c 从g 2 1 5 培养基 r p m i 一1 6 4 0 培养基，h a t ， i t 购自g i b c o 公司。 新生牛血清购自杭州四季青公司。 2 2 实验方法 2 2 1g n a 单克隆抗体的制备 2 2 1 1b a l b c 鼠的免疫 对b a l b c 鼠进行腹腔注射抗原免疫。 1 选取2 只6 - 8 周龄的b a l b c 雌性小鼠。将g n a 蛋白用磷酸缓冲液( n a c i8 9 l ，k c l 0 2 9 l ，l ( h 2 p 0 40 2 9 l ，n a 2 h p 0 4 1 2 h ：02 9 9 lp u 7 4 ) 稀释到1 6 0 n g m l 和等体积 的福氏完全佐剂混合完全，每只鼠腹腔注射1 0 0 p i ，使每只鼠的免疫量为8 。 2 第1 4 天，将g n a 蛋白用磷酸缓冲液稀释到1 6 0 1 1 9 m l 和等体积的福氏不完全佐剂混 合完全，每只鼠腹腔注射1 0 0 9 l ，使每只鼠的免疫量为8 垤。 4 第2 4 天，取小鼠鼠尾血用间接e l i s a 法检测免疫鼠的血清效价。 4 5 第3 5 天，将g n a 蛋白用磷酸缓冲液稀释到1 6 0 1 a g m l 和等体积的福氏不完全佐剂混 合完全，每只鼠腹腔注射1 0 0 n ，使每只鼠的免疫量为8 垤。 6 第4 5 天，取小鼠鼠尾血用间接e l i s a 法检测免疫鼠的血清效价。 7 第5 6 天，进行冲击免疫。将g n a 蛋白用磷酸缓冲液稀释到1 6 0 垤i i l l ，每只鼠腹腔 注射1 0 0 p l ，使其免疫量是之前免疫的2 倍为1 6 腿。 8 第6 1 天，取免疫效果好的小鼠进行眼部取血制备多抗血清，并取其脾细胞，对脾细 胞进行细胞融合。 2 2 1 2 间接e l i s a 法检测b a l b c 鼠的免疫效果 取免疫后的b a l b e 小鼠鼠尾血进行间接e l i s a 法检测。 1 小鼠鼠尾血的取得。将小鼠的尾巴放入4 5 左右的热水中使其充分充血。擦干鼠尾， 用手术刀轻轻划破鼠尾上的一条血管，取2 9 1 血加入到l m l 封闭液( 1 0 w v 脱脂奶 粉一磷酸缓冲液) 中，4 保存。 2 以包被缓冲液( 5 0 m mp h9 6 碳酸盐缓冲液：n a 2 c o 。1 5 9 9 l ，n a h c 0 32 9 3 9 l ) 稀释 g n a 蛋白抗原至终浓度为5 r t g m 1 。以每孔1 0 0 1 _ 1 1 的量包被9 6 孔酶标板，包被2 孔。 用保鲜膜包裹9 6 孔酶标板，3 7 c 温箱中包被2 小时。 3 充分弃掉包被缓冲液( 可用力在吸水纸上拍打数下) ，加入洗涤缓冲液p b s t ( p h 7 4 磷酸盐缓冲液：n a c l8 9 l ，k c l0 2 9 l ，k h 。p o , 0 2 9 l 。n a 2 h p 0 4 1 2 h z 02 9 9 l ，t w e e n 2 00 0 5 ) 静止4 分钟，充分弃掉p b s t ，重复3 次。 4 每孔加入1 0 0 p 1 封闭液，3 7 封闭1 小时同上。 5 充分弃掉封闭液，用p b s t 溶液充分洗涤3 次同上。 6 其中一孔加入5 0 0 倍稀释的待检测的b a l b c 小鼠血清1 0 0 r q ，另一孔同时加入等量 等体积稀释的未免疫的b a l b c 小鼠血清作为阴性对照，3 7 反应1 小时同上。 7 充分弃掉一抗溶液，用洗涤缓冲液p b s t 充分洗涤3 次同上。 8 每孔加入2 5 0 0 倍稀释的h r p 标记山羊抗小鼠i g g 抗体1 0 0 9 l ，3 7 反应1 小时同上。 9 充分弃掉二抗溶液，用洗涤缓冲液p b s t 充分洗涤3 次同上。 l o 每孔各加5 0 n 底物工作液a ( n a ：h p 0 4 1 2 也02 6 8 9 l ，过氧化脲0 6 9 l ) ，b ( 柠檬酸 1 0 3 9 l 与1 w v 的t m b ( 溶于d m s 0 ) 体积比4 9 ：1 混合) ，室温避光反应1 2 分钟。 1 1 每孔加入5 0 蛆2 m 硫酸终止反应，分别于6 3 0 和5 7 0 n m 下铡值进行双波长检测。 2 2 1 3g n a 单克隆抗体的制备 2 2 1 3 1 骨髓瘤细胞n s - 1 和b a l b c 小鼠抗体分泌脾细胞的融合 1 取h a l b c 小鼠腹腔细胞制备饲养细胞。 融合前一天，取成熟的b a l b c 小鼠2 只，以颈关节脱位法处死一只小鼠，浸泡于 7 0 酒精中1 0 1 5 m i n 。无菌条件下剪开小鼠皮肤，充分撕开腹部皮肤并充分暴露腹膜。 用无菌注射器( 1 2 号针头) 注入5 m l 预冷的r p m i 一1 6 4 0 不完全培养基，保持针头不拔出 并小心的轻轻挤压腹膜2 m i n 。小心的吸出液体，注入到4 c 预冷的5 0 m l 离心管中。另 一只小鼠做同样的处理，注入同一离心管中，1 2 0 0 r p m ，4 ，离心5 m i n 。弃上清，用4 c 预冷的h a t 选择培养基重悬腹腔细胞，1 2 0 0 r p m ，4 c ，离心5 m i n 。弃上清，用4 c 预冷 5 的h a t 选择培养基重悬腹腔细胞并进行细胞计数，并用4 预冷眦t 选择培养基( 使细 胞悬液终浓度含2 0 胎牛血清) 调整细胞数至1xl o s 个m l ，按每孔l o o g l 将细胞悬液 加入到8 块9 6 孔板中( 最边缘的3 6 孔不加，只加中间的6 0 孔) ，放入c 仉培养箱中培 养过夜。 2 免疫后b a l b c 小鼠脾细胞的取得。 将免疫后的b a l b c 小鼠活体眼部取血。待不再流血后以颈关节脱位法处死，浸泡 于7 0 酒精中l o - 1 5 m i n 。无菌条件下剪开小鼠左肋的皮肤，充分撕开皮肤并充分暴露左 肋的腹膜及肋骨。小心的剪开肋骨下的腹膜，并用镊子和剪刀轻轻的取出小鼠的脾放入 到无菌的玻璃培养皿中。加入3 7 c 预热的r p m i 一1 6 4 0 不完全培养基清洗一下脾表面的油 脂。弃掉废液并加入3 7 预热的r p m i 一1 6 4 0 不完全培养基l o m l ，用无菌的注射器芯将 脾研碎，收集脾细胞至5 0 m l 离心管中，静止2 m i n ，取上层悬浮的脾细胞( 弃掉沉淀的 未研磨完全的脾组织) ，1 2 0 0 r p m ，离心5 m i n 。弃上清，用3 7 c 预热的r p i i - 1 6 4 0 不完 全培养基洗涤脾细胞，1 2 0 0 r p m ，离心5 m i n 。弃上清，并加入新鲜的3 7 预热的r p m i - 1 6 4 0 不完全培养基l o m l 重悬细胞。取少量细胞悬液。加入台盼蓝染色并进行细胞计数。 3 骨髓瘤n s 一1 细胞的取得。 取处于对数生长期的n s l 细胞3 瓶，收集细胞于5 0 m l 离心管中，1 2 0 0 r p m ，离心 5 m i n 。取新鲜的3 7 c 预热的r p m i 一1 6 4 0 不完全培养基2 0 m l 重悬细胞。取少量细胞悬液 进行细胞计数。 4 骨髓瘤细胞和脾细胞的混合。 取全部的脾细胞悬液于一个新的5 0 m l 玻璃离心管中，按骨髓瘤细胞与脾细胞l ：5 的比例加入骨髓瘤细胞悬液，1 0 0 0 r p m ，离心5 m i n 。弃上清，充分吸净残留液体。然后 轻轻旋转并敲打管壁，使细胞充分分散开来。 5 进行细胞融合。 以下操作均在4 2 水浴中进行。在1 2 0 s 时间内均匀缓慢的加入l m lp e g ( 灭菌后 的p e g 4 0 0 0 与无菌的r p m i 一1 6 4 0 不完全培养基按质量与体积比为1 ：2 混合) ，边加边转 动离心管，使细胞充分接触p e g 。静止3 0 s 使p e g 作用完全。再在1 2 0 s 内加入2 m l 预热 的r p m i - 1 6 4 0 不完全培养基，边加边转动离心管。然后在3 0 s 内加入2 m l 预热的 r p k t i 一1 6 4 0 不完全培养基，边加边转动离心管。接着在3 0 s 内加入3 m l 预热的r p l d i 一1 6 4 0 不完全培养基，边加边转动离心管。轻摇离心管9 0 s 使p e g 稀释完全。最后静置5 m i n 。 6 1 2 0 0 r p m ，离心5 m i n 。弃掉上清，充分吸净残留液体。再用3 7 c 预热的r p m i 一1 6 4 0 不完全培养基小心的轻轻洗涤一到二次，彻底去掉p e g 。 7 充分吸净残留液体，加入3 7 预热的h a t 选择培养基5 0 m l ( 含2 0 胎牛血清) ，轻 轻混悬细胞，将细胞悬液加到昨天制备的含有饲养细胞的9 6 孔板中，每孔1 0 0 p 1 。 将9 6 孔板放入到5 c 0 2 培养箱中静置培养。 8 一周后，方可在倒置显微镜下可对融合细胞进行观察。 2 2 1 3 2 杂交瘤细胞的检测 分别在融合后的第7 天，第9 天，第l l 天，第1 3 天用h a t 选择培养基更换9 6 孔 6 板中一半的培养基。第1 5 天起开始使用h t 培养基( 含2 0 骀牛血清) 培养融合细胞， 以后每两天以h t 培养基更换9 6 孔板中一半的培养基。待9 6 孔板中细胞达到1 2 至2 3 孔底面积时，即可用间接e l i s a 法检测融合细胞培养上溃。g n a 蛋白每孑l 的包被量和一 抗的具体浓度和加法如表1 。 表1 用间接e l i s a 法检测融合细胞培养上清时，g n a 蛋白 每孔的包被量和一抗的具体浓度和加法。 i 抗原( g n a ) 2 0 0 n g2 0 0 n g2 0 0 n g 包被液 一抗抗体血清4 0 0 0封闭液融合细胞融合细胞 l 倍稀释培养上清培养上清 具体操作同上。 2 2 1 3 3 杂交瘤细胞的有限稀释法克隆 将阳性孔中的杂交瘤细胞进行有限稀释克隆，方法如下： 1 饲养细胞的制备。 有限稀释克隆前一天制备饲养细胞，方法同上。第1 5 天以后的有限稀释克隆时， 制备饲养细胞使用h t 培养基。 2 有限稀释克隆。 将阳性孔中的杂交瘤细胞轻轻悬浮起来，取少量细胞悬液，行细胞计数。重复 计数三次，以确保计数正确。取出约6 0 个绍胞，加入6 m 1 培养基中制成细胞悬液， 将细胞悬液加入到盛有饲养细胞的9 6 孔板中，每孔1 0 0 9 l 。将细胞培养板放入到5 c o s 培养箱中静置培养。 3 三天以后可在倒置显微镜下对克隆细胞进行观察。待9 6 孔板中细胞达到1 2 至2 3 孔底面积时，即可用间接e l i s 法检测由单个融合细胞得到的克隆的培养上清，方 法同上。 4 将第二次间接e l i s a 法检测还是阳性的杂交瘤细胞中o d 值最高的一孔再次进行一 次有限稀释克隆，方法同上。 5 再重复两到三次有限稀释克隆，方法同上，直到得到的克隆孔1 0 0 为阳性为止。 2 2 1 3 4 杂交瘤细胞的扩大培养。 1 将最后一次克隆化中0 d 值最高的一孔细胞从9 6 孔板转移到2 4 孔板的孔中继续培养。 2 待2 4 孔板中细胞达到1 2 孔底面积时，再将细胞转入到1 2 孔板中继续培养。 3 待1 2 孔板中细胞达到2 3 孔底面积时，再将细胞转入到6 孔板中继续培养。 4 待6 孔板中细胞达到2 3 孔底面积时再将细胞转入到8 m l 塑料细胞培养瓶中继续 扩大培养并冻存细胞。 2 2 1 3 5g n a 单克隆抗体的腹水的制备 1 b a l b c 小鼠预处理。 在接种杂交瘤缅胞前1 0 天，先将每只b a l b c 小鼠腹腔注射0 5 m l 降植烷。 7 2 接种杂交瘤细胞。 收集培养的杂交瘤细胞，1 2 0 0 r p m ，离心5 m i n 。弃上清，用r p m i 一1 6 4 0 不完全培养 基重悬细胞，取少量细胞悬液进行细胞计数。最后用r p m i - 1 6 4 0 不完全培养基调整细胞 浓度至1 0 7 个m l ，每只小鼠腹腔注射0 5 m l 。 3 腹水的采集。 接种1 0 1 2 天后可见小鼠的腹部明显胀大，且行动迟缓，以颈关节脱位法处死小 鼠，充分撕开腹部皮肤并充分暴露腹膜，用5 m l 注射器抽取腹水。 4 骏水的制备。 取得到的腹水加入到5 0 m l 离心管中，1 0 0 0 0 r p m ，4 c ，离心l o m i n 。弃掉最上层的 降植烷及下层的细胞沉淀，中间的即为腹水。分装后于- 2 0 保存。 2 2 l3 6g n a 单克隆抗体的腹水效价的检测 用间接e l i s a 法检测腹水效价。g n a 蛋白每孔的包被量和一抗的具体浓度和加法如 表2 。 表2 用间接e l i s a 法检测腹水效价时，g n a 蛋白 每孔的包被量和一抗的具体浓度和加法。 i 抗原( 6 n a ) 2 0 0 n g2 0 0 n g 2 0 0 n g2 0 0 n g2 0 0 n g 一抗多抗4 0 0 0 倍腹水2 0 0 倍稀腹水4 0 0 倍稀腹水8 0 0 倍稀封闭液 i 稀释释释释 具体方法同上。 2 2 1 3 7 抗g n a 单克隆抗体的亚型鉴定 用小鼠抗体亚型检测试剂盒按说明书操作进行检测。 2 2 2g n a 转基因大豆的检测 2 2 2 1p c r 法检测g n a 转基因大豆 2 2 2 1 1 改良的c t a b 法提取大豆的基因组d n a 1 用改良的c t a b 法同时提取转g n a 和非转基因大豆的基因组d n a 。 2 1 的琼脂糖凝胶电泳对基因组d n a 提取结果进行检测。 2 2 2 1 2 对g n a 转基因大豆的基因组进行p c r 检测 1 根据g n a 的全长序列设计引物，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 2 p c r 程序设计如下： 9 5 9 4 5 5 7 2 7 2 3 5 个循环 8 、l，j n n n n n1l1-1 m m m m m 5 1 l 1 2 3 取g n a 转基因和未转基因大豆的基因组d n a 进行p c r ，反应体系( 2 5 “1 ) 如下： t a q 1 2 5 u l 上游引物0 5 i t l 下游引物0 5 p 1 模版 1 | i1 h 2 01 0 5 u 1 4 1 的琼脂糖凝胶电泳对p c r 结果进行检测。 2 2 2 2 大豆可溶性蛋白的提取 1 取g n a 转基因和未转基因的大豆的茎各o 5 9 ，分别在液氮中研磨至粉末状，并装入 到预冷的2 m l 离心管中。 2 各加入l m l 预冷的磷酸缓冲液，冰上静置6 小时。 3 1 4 0 0 0 r p m ，4 c ，离心3 0 r a i n 。 4 取上清，即为大豆可溶性蛋白的蛋白提取液，分装后于一2 0 保存。 5 分光光度计下检测大豆可溶性蛋白的蛋白提取液浓度。 2 2 2 3 间接e u s a 法检测 利用单抗2 d 8 通过间接e l i s a 法对提取的大豆可溶性蛋白进行检测。 分别取g n a 转基因大豆蛋白提取液l o p1 ，8 | ll ，6 l ll ，4 pl ，2 u1 ，1u1 包被9 6 孔 酶标板，并分别取非转基因大豆蛋白提取液1 0 “1 ，8 i l1 ，6 i l1 ，4 pl ，2 1 ，1 i tl 包 被9 6 孔酶标板为阴性对照。以稀释4 0 0 倍的腹水为一抗。 其他具体操作同上。 2 2 2 4w e s t e r nb l o t 法检测 1 取g n a 转基因大豆和非转基因大豆的蛋白提取液各1 5 p1 ，进行1 5 的s o s p a g e 蛋 白电泳。 2 电泳后将分离胶进行8 0 v ，3 小时的转膜。 3 用p b s t 洗脱3 次后将硝酸纤维素膜移至含有用p b s t 稀释了4 0 0 倍的单抗2 d 8 ( 含 有0 0 2 的叠氮化钠) 中。室温下在脱色摇床上反应9 0 r a i n 。 4 用p b s t 洗脱3 次后再将硝酸纤维素膜移至含有用p b s t 稀释了2 5 0 0 倍的二抗溶液 中。室温下在脱色摇床上反应6 0 m i n 。 5 将a 和b 两种试剂在保鲜膜上等体积充分混合。l m i n 后，将用p b s t 洗脱了3 次的硝 酸纤维素膜有蛋白的面朝下与此混合液充分接触5 m i n 。 6 将硝酸纤维素膜移至另一保鲜膜上，用吸水纸沿边缘尽量去尽残液。用保鲜膜包好 后放入x 一光片夹中。 7 在暗室中进行曝光。放入x - 光片夹上片夹后开始曝光计时。分别以2 m i n ， 5 m i n 和 1 0 分钟的时间曝光3 张x 一光片。 8 在暗室中进行显影和定影。将曝光后的x 一光片迅速浸入显影液中不停涮洗进行显影。 待出现明显条带后，即刻终止显影并将x 一光片浸入定影液中进行定影。 9 最后用自来水冲去残留的定影液，并在室温下晾干。 9 3 结果 3 1g n a 单克隆抗体的制备 3 1 1b a l b c 小鼠的免疫效果 按每只b a l b c 小鼠8 p gg n a 蛋白腹腔注射进行免疫，共免疫4 次。分别在免疫 的第2 4 天和第4 5 天取鼠尾血，取未免疫的b a l b e 小鼠的鼠尾血作阴性对照，用间接 e l i s a 法检测免疫效果。如果待检测鼠的检测结果是阴性对照值的2 倍以上即为阳性。 从图1 可以看出，在第2 4 天，阴性对照值为0 0 7 8 ，1 号b a l b e 小鼠为0 3 4 5 ，2 号 b a l b e 小鼠为0 3 7 9 ，可以看出两只小鼠均为阳性，但是值较低。在第4 5 天，阴性对 照值为0 0 6 5 ，l 号鼠为0 8 5 9 ，2 号鼠为0 9 5 0 ，说明每次免疫使用8 u g 蛋白的剂量是 足够的，能在3 次免疫后有效诱发小鼠的免疫反应，免疫效果明显。在第5 6 天我们对2 号鼠进行了加强免疫，第6 l 天取2 号鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。 取鼠尾血作间接e l i s a 检测的结果如图2 。 图2 纵坐标为检测的o d 值结果。横坐标l ，2 分别表示第2 4 和4 5 天的两次检测。 3 。1 2g n a 抗体血清效价的检测 在进行细胞融合前取出的鼠眼血离心后取上层血清，加入等体积甘油即为抗g n a 的抗 体血清，分装后可于一2 0 保存。经间接e l i s a 检测，所制备的抗体血清的效价为h4 0 0 0 。 3 1 3 抗g n a 杂交瘤细胞株的建立 1 融合。 使用聚乙二醇( p e g 4 0 0 0 ) 诱导小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞n s 1 融合，用h a t 1 0 选择培养基筛选。一周以后在9 6 孔板中可见融合细胞的克隆。本次融合共有融合孔 4 8 0 个，其中有“个孔出现克隆，融合率为5 。 2 检测。 待杂交瘤细胞长到孔底面积的2 3 时，用间接e l i s a 法检测上清。共检测2 4 孔， 其中5 孔的上清为阳性，阳性率为2 0 8 。 3 将阳性孔中的杂交瘤细胞进行有限稀释克隆。 进行4 次有限稀释克隆后，把杂交瘤细胞从9 6 孔板转移到2 4 孔板中培养，再 到1 2 孔和6 孔板中培养，最后到培养瓶里扩大培养，冻存。本实验由于污染等原因 只获得l 株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞，命名为2 d 8 。 2 d 8 在进行克隆化过程中的培养上清，以每孔2 0 0 n g 的g n a 抗原蛋白作为包被 底物，作间接e l i s a 检测，结果如图3 。 图3 横坐标l 一4 分别代表四次有限稀释克隆。纵坐标为o d 值。 3 1 4g n a 单克隆抗体效价的检测 以g n a 纯蛋白作为抗原，以每孔2 0 0 n g 的浓度包被9 6 孔酶标板。以腹水作为一抗， 梯度稀释( 1 ：2 0 0 ，1 ：4 0 0 ，1 ：8 0 0 ) 后用间接e l i s a 法检测效价，得到的结果如图4 。 图4 1 为阳性对照。2 4 ：腹水稀释液( 1 ：2 0 0 ， l ：4 0 0 ，1 ：8 0 0 ) 。5 为阴性对照。 3 1 5 抗g n a 单克隆抗体的亚型鉴定 按步骤操作小鼠抗体亚型检测试剂盒，测得所得到的单抗的亚型为i g g 2 a 。 3 2g n a 转基因大豆的检测 3 2 1 改良的c t a b 法提取大豆的基因组d n a 以改良的c t a b 法分别提取g n a 转基因和非转基因大豆的基因组d n a ，以1 琼脂糖 凝胶进行电泳，得到的结果如图5 。 图5 1 ，2 为g n a 转基因大豆的基因组d n a 。 3 ，4 为非转基因大豆的基因组d n a 。 3 2 2 对转g n a 大豆的基因组进行p c r 检测 以g n a 全长序列设计p c r 引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以提 取的g n a 转基因大豆基因组为模板，以非转基因大豆基因组为阴性对照进行p c r 反应。 p c r 产物以1 琼脂糖凝胶进行电泳，得到的结果如图8 。 图6 1 为d l 2 0 0 0 m a r k e r 。2 为转g n a 大豆基因组。 3 为非转基因大豆基因组。 3 2 3 间接e l i s a 法检测 以g n a 纯蛋白作为抗原，每孔以梯度浓度( 1 腿，5 0 0 n g ，2 5 0 n g ，1 2 5n g ，6 2 5n g ， 3 1 2 5n g 。1 6 2n g ，0n g ) 包被9 6 孔酶标板，以4 0 0 倍稀释的腹水作为一抗，所测的 结果如图7 。 1 2 图7 横坐标1 7 分别为每孔包被g n a 蛋白的量：1 魄，