（农产品加工及贮藏工程专业论文）葡萄糖耐受因子富集酵母发酵工艺及其动物功能性研究.pdf

中文摘要 葡萄糖耐受冈子( g l u c o s et o l e r a n c ef a c t o r , 简称g t f ) 是一种小分子鼙铬结合蛋白，一个蛋白分 子结合四个铬离子。葡萄糖耐受冈子能够提高胰岛素受体的活性，加强胰岛素与其受体的亲雨i 力， 调。1 ，机体糖代谢功能。本课题研究了葡萄糖耐受冈子富集菌株的诱导和驯化、产品开发、降糖功 能及产品质量稳定性等。为实现葡萄糖耐受冈子富集酵母的i ：业化生产奠定了基础，具体研究结 果归纳如下： 1 、以天然啤酒酵母为山发菌株，通过铬耐受试验进行定向的诱导s h 到i l 化，获得葡萄糖耐受因子 富集酵母的工业生产菌株，葡萄糖耐受因子的总含量9 3 4 0 8u g l 将该菌株命名为b h l - 0 4 。 2 、通过对摇瓶、1 0 l 罐、5 0 l 罐发酵工艺的研究，获得本研究最佳的中试发酵工艺：麦芽汁为培 养基，溶解氧高于2 0 ，铬诱导剂分段连续流加，铬离子的最终浓度为0 2 1 3 l 鲫0 2 5g i 初始发酵 液，p h 值采用分段控制，整个发酵过程保持在在5 5 6 0 之间，发酵时间4 0 5 0 小时。发酵结果 为菌体湿重6 8 2 7 0 6 9 1 ，葡萄糖耐受因子含量( 以铬计) 3 0 0 3 2 0 u g g 干菌体。 3 、以野生型啤酒酵母为检测菌种，利用糖代谢量建立葡萄糖耐受因子活性检测方法，该检测方 法以中国药典为基础，步骤简单，仪器要求低，适用于工业化生产企业质检部门的常规操作，作 为含量检测的辅助项目，使检测结果更加科学。 4 、利用s d 大鼠进行为期3 0 天的动物功能性实验，研究葡萄糖耐受因子富集酵母对糖尿病大鼠 空腹血糖和糖耐量的影响。结果显示葡萄糖耐受因子富集酵母干粉对正常大鼠血糖无影响，可以 使糖尿病大鼠的空腹血糖降低3 2 3 4 ，胶囊剂( 葡萄糖耐受因子富集酵母干粉+ 枸杞多糖+ 木糖 醇) 可以使糖尿病大鼠空腹血糖降低5 2 4 5 ，对照品面包酵母干粉无降糖作用。在糖耐受试验 中，各样品组糖尿病大鼠糖血糖2 小时后均有下降，胶囊剂组下降迅速。 5 、通过单因素影响实验、快速破坏实验及九个月留样实验室温考察葡萄糖耐受因子富集酵母菌 粉的稳定性，葡萄糖耐受因子富集酵母对温度和光照不敏感，对环境湿度敏感，易吸潮，导致葡 萄糖耐受因子含量降低。因此葡萄糖耐受因子富集酵母应密闭储存于通风干燥的环境中。 关键词：葡萄糖耐受因子，铬，啤酒酵母，发酵，糖尿病 a bs t r a c t g l u c o s et o l e r a n c ef a c t o r ( g t f )i sak i n d o fl o w m o l e c u l a r w e i g h t c h r o m i u m b i n d i n gs u b s t a n c e o n em o l e c u l ec a nc o m b i n ef o u rc r g t fc a nr e g u l a t e g l u c o s em e t a b o l i s mt h r o u g hi m p r o v i n gi n s u l i na c c e p t o r sa c t i v i t ya n ds t r e n g t h e n i n g c o m b i n a t i o nb e t w e e ni n s u l i na n di t sa c c e p t o r t h i ss t u d yi n c l u d et h es c r e e n i n gf i n es t r a i n s f r o mi n d u c i n gs t r a i n 、d e v e l o p i n gn e w p r o d u c t s 、 f u n c t i o no fg t fo na n i m a lm o d e l 、 s t o r a g eo fp r o d u c t s t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w ： 1 g t fe n r i c h e ds t a i n sw a so b t a i n e db yi n d u c i n g s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a ew i t h c r j 十t h et o t a lg t f ( c o u n tb yc r ) c o n t e n tr e a c h e d9 3 4 0 8 lf e r m e n t a tio nm e diu m 2 t h eb e s tf e r m e n tc o n d i t i o ni n t h i s s t u d yw e r ea sf o l l o w s ：p hw a s5 5 6 0 t h e c o n c e n t r a t i o no fc h r o m i u mw a s0 2 - 0 2 5 9 lf e r m e n t e dl i q u i d ，p 0 2w a sh i g h e rt h e n2 0 ， a d d i n gm e t h o do fc h r o m i u mw a sc o n t i n u o u sw a y , f e r m e n t a t i o nt i m ew a sc o n t r o l l e d b e t w e e n4 0h o u r st o5 0h o u r s i nt h i sf e r m e n tc o n d i t i o n s ，t h ew e t w e i g h to fg t f e n r i c h e d s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a eh a v er e a c h e d6 8 2 7 0 6 酣a n dc o n t e n to fg t fa r r i v e d 3 0 0 3 2 0 “g 甙b i o m a s so fd r yy e a s t ) 3 ad e t e r m i n a t i o nm e t h o do fg t fa c t i v i t yw a se s t a b o l i s h e do ng l u c o s em e t a b o l i z ew i t h b r e w e ry e a s t t h i sm e t h o dw a sb a s e do nc h i n e s ep h a r m a c o p e i ac o d e i t ss t e pw a sv e r y s i m p l ea n di n s t r u m e n t sw e r ev e r yc h e a pt o o i tw a sag o o ds u p p l e m e n te x a m i n i n gm e t h o d o f g t e 4 t h ef u n c t i o n a lr e s e a r c ho na n i m a l sw a sc o n t i n u e d3 0d a y sf o ri n s p e c t i n gt h ei n f l u e n c e o fg t fo nf a s t i n gb l o o dg l u c o s ea n dg l u c o s et o l e r a n c el e v e l so fd i a b e t i cs dr a t s t h e f a s t i n gb l o o dg l u c o s el e v e l so fn o r m a lr a t sa d m i n i s t e r e dw i t hg t f e n r i c h e dy e a s tp o w d e r s h o w e dn od e c r e a s e ，b u tt h ef a s t i n gb l o o dg l u c o s el e v e l so fd i a b e t i cr a t sa d m i n i s t e r e dw i t h g t fe n r i c h e dy e a s tp o w d e ra n dt h eg t fc a p s u l ed e c r e a s e db y3 2 3 4 a n d5 2 4 5 r e s p e c t i v e l y , w h i l et h o s ew i t hb a k e r sy e a s ts h o w e dn o d e c r e a s e i ng l u c o s et o l e r a n c e t e s t a l lt h eg l u c o s eb l o o dl e v e l so fd i a b e t i cr a t sa d m i n i s t e r e dw i t ht w og t f s a m p l e s d e c r e a s e d2h o u r sl a t e r t h eg l u c o s eb l o o dl e v e l so fd i a b e t i cr a t sa d m i n i s t e rw i t hg t f c a p s u l ed e c r e a s e dr a p i d l y 5 t h es t a b l i z a t i o no fg t fe n r i c h e dp o w e rw a se x a m i n e dw i t hs i n g l ee l e m e n ti n f l u e n c e t e s t ，f a s tin gd a m a g et e s ta n dt h et e s to fs t o r i n gu pn i n em o n t h si nr o o mt e m p e r a t u r e t e m p e r a t u r ea n dl i g h th a dn oi n f l u e n c eo ng t f e n r i c h e dy e a s tp o w e r ，b u tt h ep o w e rw a s s e n s i t i v et om o i s t i tw a sd a m p e de a s i l yb yt h eh u m i d i t yo fe n v i r o n m e n t w h e nt h em o i s t i ng t fe n r i c h e dp o w e ri n c r e a s e d t h ec o n t e n to fg t fi ni td e c r e a s e ds h a r p l y s og t f e n r i c h e dy e a s tp o w e rs h o u l db es e a l e du pa n ds t o r e di nv e n t i l a t i v ea n dd r ye n v i r o n m e n t k e yw o r d ：g l u c o s et o l e r a n c ef a c t o r ， c h r o m i u ，b e e ry e a s t ，f e r m e n t a t i o n ，d i a b e t e i i 独创性l 声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谓 的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 引钆移 帅：矿月 关于论文使用授权的声明 日 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者虢引吮铭 导师签名：吕加f 如 如 ； 脂 舻 作 “ 对 对 中同农、f k ：r 院仰ii ，p t , i 论艾 第。尊绪论 第一章绪论弟一早 z 百t 匕 葡萄糖耐受冈子是一种小分子铬结合蛋向，能够提高胰岛素的效率，促进胰岛素与胰岛素受 体的亲和力，在胰岛素凋1 ，机体代谢中起着关键控制作川。葡萄糖耐受冈子具有很高的保守性， 最早发现丁啤酒酵母中。近年的研究发现，哺乳动物细胞内也含有与葡萄糖耐受冈子结构、功能 相似的小分子铬结合蛋白，统称为铬凋素。葡镯糖耐受i 灭l 子缺乏是引发l i 型糖尿病的主要原冈之 一。筛选大然的葡萄糖耐受冈子高效表达株、优化适宜的细胞培养发酵条什，开发以葡萄糖耐受 因子为主要功能冈子的降糖产品，成为当前糖尿病治疗研究领域的热门课题。 1 1 葡萄糖耐受因子的发现过程 二十世纪初期，g l a s e r 和h a l p e m 发现啤酒酵母提取物可以加强胰岛素的作用，将啤酒酵母 提取物与胰岛素保温后，可显著提高胰岛素的降糖作用，提高胰岛素的效率【。二十世纪中叶 w a l t e rm e r t z 和s c h w a r z 发现啤酒酵母饲料可以显著改善大鼠的糖耐受不良现象【z 】，在此之后， w a l t e rm e r t z 发现三价铬离子是机体新陈代谢必须的微量金属离子，具有提高胰岛素作用及外周 组织( 肌肉、脂肪、细胞) 对胰岛素敏感度的功能，对降低血糖浓度有重要的作用。通过7 7 个 动物实验，实验结果表明，缺铬可使大鼠血糖浓度升高，出现类似糖尿病症状i3 1 。在对大鼠进食 猪肾的酸解产物或啤酒酵母提取液后，大鼠的这种糖尿病症状得到逆转【4 1 。进一步的实验发现， 猪肾的酸解产物和啤酒酵母提取液中都含有铬蛋白结合物。铬蛋白结合物可以使机体迅速有效的 补充具有生物活性的铬，可以快速改善糖尿病症状【5 1 。由于啤酒酵母提取液具有类似胰岛索功能， 能够降低血糖浓度，早期被称为“酵母胰岛素”，后来改称为葡萄糖耐受因子( g l u c o s et o l e r a n t f a c t o r 简称g t f ) ，葡萄糖耐受因子在胰岛素与其受体结合过程中起到决定性作用【6 j 。 1 9 7 3 年t o e p f e r 等证实葡萄糖耐受因子是一种含铬的化学物质【7 】，动物实验结果显示，单纯 的三价铬离子对糖耐受不良不能起到直接的改善作用，对于蛋白合成能力低下的人群，都不同程 度的依赖外源的葡萄糖耐受因子【引，进一步的实验证明葡萄糖耐受因子可以提高细胞对葡萄糖的 利用，促进糖代谢，抑制脂解作用p j 。 葡萄糖耐受因子是由微量元素铬、烟酸、甘氨酸、谷氨酸、半胱氨酸等成分组成的小分子蛋 白复合物，分子量为1 5 k d ，具有水溶性，在2 6 0 n m 有光吸收，不被蛋白酶水解。一个葡萄糖耐 受因子结合4 个三价铬离子。由于酵母细胞中葡萄糖耐受因子含量极微，到目前为止，还没有分 离纯化得到保持完整结构的葡萄糖耐受因子的单一组分，因此其分子结构尚未被完全确趔1 0 j 。 1 2 葡萄糖耐受因子在糖尿病治疗中的作用 1 2 1 糖尿病分类及i i 型糖尿病治疗概况 糖尿病是一种复杂的内分泌系统失调的疾病，其临床表现为：多饮、多食、多尿、烦渴、易 饥、消瘦、疲乏无力等。糖尿病主要分为两种，一种为胰岛素依赖性糖尿病简称为i 型糖尿病， 患者失去或部分失去胰岛素分泌功能，导致胰岛素绝对不足引发糖尿病，患者必须依靠外源补充 胰岛素才能维持正常的生理代谢；另一种为非胰岛素依赖型糖尿病，简称为i i 型糖尿病，患者体 1 i f l m 农、l p 7 ：院坝卜化论艾筇一帝绪论 内胰岛素分泌止常，但胰岛素作州降低，既胰岛素相对不足引发的糖尿病为i i 型糖尿病【1 1 j 。在糖 尿病人群中，i i 删糖尿病患者i i i 。9 5 以上。在i i 型糖尿病发病初期，可以通过控制饮食、适颦运 动、补充营养剂及配合约物治疗笛手段达剑控制血- 糖目的【1 2 】。但糖尿病病情的发展，斤期会引起 心脏、脑、肾脏、眼底及木梢神经等器官发生严重并发症，而糖尿病并发症是引起患者夕匕亡的主 要原冈。世界卫生组织凋奄显示，2 0 0 0 年全球有成年糖尿病患者约1 5 亿，其发病率在所有疾病 中io i 第二位，仅次丁心脑血管疾病，而全球统计其死亡率仅次丁肿瘤和心脑血管疾病，居第三位。 i i 型糖尿病的治疗药物治疗以阳约为主，如磺脲类、双胍类、茁酶抑制剂及胰岛素增敏剂等。 作川机理为抑制食物的酶解、吸收、促进胰岛素分泌释放等，以期达到快速降低血糖的目的。该 类约物能够平稳快速的降低血糖，但没有改善糖尿病人血糖利用障碍的根本问题，很难避免并发 症的发生，同时该类药物毒副作用较大，跃期服用该类药物会出现胃肠代谢紊乱、肝肾功能损伤 等副反应。 1 2 2 铬缺失与i i 型糖尿病 1 9 7 7 年，一个长期输液的病人出现糖不耐受现象，进而出现i i 型糖尿病症状，研究发现诱发 糖尿病症状的主要原因为，铬不足，经口服含铬食物后，糖尿病症状消失，恢复正常【1 3 l ，1 9 8 6 年，b r o w nr o 等人在临床研究中发现了同样的现象【1 4 1 。1 9 7 9 年，临床研究发现，完全靠输液维 持营养的病人容易引起铬不足，进而导致糖尿病症状发生，而如果在输液中添加三价铬可以避免 该现象的发生【1 5 】，体内铬的减少可能是血色沉着症并发糖尿病的主要原因【1 6 1 。进一步的临床研究 表明，对注射治疗的糖尿病患者补充三价铬，不但可以部分逆转糖尿病症状，还可降低胰岛素的 使用剂量【l 。2 0 0 4 年的一项调查表明，糖尿病患者趾甲中铬含量仅为o 6 1 “g ，明显低于健康 人0 7 1 g 僖，而合并有心血管疾病的糖尿病患者其趾甲中铬含量更低，仅为o 5 2 , u g g t l 8 】，该结果 进一步证明，铬缺乏或不足是糖尿病发病的主要原因之一。a n d e r s o nr a 等对三价铬离子在机体 代谢中的作用进行了较系统的研究，结果显示，铬能够明显的提高i i 型糖尿病葡萄糖的利用率、 提高胰岛素的敏感性【1 9 1 ，a n d e r s o nr a 认为，三价铬离子在机体的糖、脂代谢中起着非常重要的 作用，是胰岛素实现代谢调节的关键控制要素【2 0 1 ，三价铬离子与糖耐受不良及糖尿病之间存在着 必然的联系1 2 。p w c h o v a a w i l l a mt 进一步阐明了三价铬、葡萄糖耐受因子( 或称低分子量铬 结合蛋白) 与糖尿病三者之间的关系 2 3 1 。 三价铬离子是存在于人体内的一种微量元素，许多内在、外在的因素会影响机体对三价铬离 子的吸收，动物实验表明，机体内金属元素如铬、铜、铁、锌之间可以进行置换陋】，在铁负荷环 境下，铬在体内的转运率降低，导致胰岛素敏感细胞内铬含量降低，而体液中铬浓度增加，最终 导致机体铬吸收利用降低，出现胰岛素抵抗等代谢紊乱现象【2 5 l 。其他如锌、镁、钙离子都会影响 到三价铬离子的吸收，长期使用胰岛素也会加速三价铬离子流失。缺铬在老年人中非常普遍，随 着年龄增加，人体对金属离子吸收能力逐步降低【2 6 i ，三价铬离子是目前已知的唯一随着衰老而体 内含量递减的金属离子【27 1 ，因此i i 型糖尿病患者以中老年人居多。i i 型糖尿病患者铬利用能力下 降，造成铬大量流失，血液中铬的含量低于正常人，而尿液中铬的含量高于正常人【2 踟，即使维持 正常的饮食习惯，机体胰岛素敏感细胞也会处于缺铬状态。目前，由于成年人和青少年随着饮食 的精细化，食物中的铬人量流失，i i 型糖尿病患病率急剧上升【2 9 】。 2 中用农、眦 ： 学院形! 卜7 r 论艾筇帝绪论 综上所诉，缺铬是i i 刑糖尿病的土要发病原冈。所以，促进铬的吸收利川，使机体胰岛素敏 感细胞维持止常的铬含鼙，可以有效的预防i i 刑糖尿病的发生，从而改善由缺铬引起的i i 刑糖尿 病的血糖利川障碍问题。 1 2 3 葡萄糖耐受因子与三价铬补充剂 补充铬，对降低血糖【3 0 】、降低血脂及改善胰岛素抵抗【3 2 】有明显的效果。人1 ：合成的无机 铬( 氯化铬) 和有机铬( n 比啶铬) 都已在临床应用。由于人体对人：j ：合成的无机铬和有机铬吸收 率较低，临床应用的荆颦较火，一般高于推荐的安全剂量2 0 0 微克天达到1 0 0 0 微克天，虽然在 短期内服可以保证安全1 3 3 1 ，但k = 期服用会加人肝肾的负担，引起其他微量金属元素的流失，产生 不可逆的毒副作用。美国科学院学报( p n a s ) 曾报导，n 比啶铬可导致果蝇致死性突变和雌性不 育，破坏细胞的d n a 结构【3 引。随着临床研究的深入发现，长期服用吡啶铬会对机体产生潜在的 危掣巧】。吡啶铬在被细胞利用和转化的过程中，还原为二价铬化合物，同时产生大量的自由基， 使机体细胞癌变的可能性明显增大，在亚细胞结构水平对细胞产生损害【3 6 】。 近年来，对吡啶铬等有机铬作用的研究得到的结论往往相互矛盾：一些研究表明，补充吡啶铬 对糖耐受不良及糖尿病没有明显的效果，对照组与实验组病人在各项检验指标上没有显著区别， 但实验组血液中铬含量却远高于对照组1 37 、3 8 】，即，有机铬虽然进入血液，但没有被胰岛素敏感细 胞利用；此外，在验证补充n 比啶铬能够促进机体脂肪消耗、肌肉发达的一项研究中也发现，补充 吡啶铬未能促进脂肪的代谢，对体重没有产生任何降低的作用【3 9 】。但另一些研究表明，补充吡啶 铬可以明显改善胰岛素抵抗症状，提高胰岛素敏感性，降低血浆中胰岛素浓度【加“1 1 ，调= i 了脂肪代 谢，降低体重，对i i 型糖尿病有明显的治疗效果1 4 2 1 。从以上临床研究结论分析可以看出，单纯的 补充有机铬，对不同的个体、不同的实验人群，在提高糖耐量、改善糖尿病症状、促进脂肪代谢 等方面效果不同。分析认为，存在上述不同效果的主要原因可能在于，不同的个体或实验人群对 铬的吸收和利用能力不同，当机体仅仅是由于铬吸收不足而出现糖尿病症状时，单纯的补充有机 铬会产生比较好效果；而当机体对铬的利用也出现障碍时，单纯的补充有机铬对改善糖尿病症状 作用会十分微弱。由于地域及饮食习惯不同，引起糖耐受不良及糖尿病的原因也有所不同，可能 是单纯的铬不足，也可能是利用铬合成葡萄糖耐受因子的能力不足。因此，对i i 型糖尿病病人进 行有机铬临床应用研究中，单纯的补充有机铬会产生截然不同的结果。同时，随着有机铬在临床 应用中的缺点和危害不断暴露，有机铬作为铬补充剂受到质疑，寻找一种更加安全、有效的铬补 充剂成为当前糖尿病领域和营养学领域的研究热点。 葡萄糖耐受因子是在酵母中发现的一种生物铬蛋白，三价铬离子是其重要的组成部分【4 3 】，人 体对它的吸收率极高。人对无机铬的吸收率平均只有0 6 ，而酵母中铬的吸收率则达到1 0 2 5 l 4 4 j 。已有研究证明，葡萄糖耐受因子可加快脂肪细胞、肌肉细胞和心肌细胞的糖代谢，逆转 糖耐受不良【4 5 1 ，改善糖尿病并发型拍1 。从牛、鼠等哺乳动物肝脏中也分离得到了低分子量的铬结 合蛋白( 1 0 w m o l e c u l a r - w e i g h tc h r o m i u m b i n d i n gs u b s t a n c e ，l m w c r ) ，其基本结构与葡萄糖耐受因 子相同，被统称为铬调烈47 1 。葡萄糖耐受因子是种金属结合蛋白，具有金属结合蛋白的共性： 保守性高，种间差异小，分子结构稳定，分子量相对较低，可以被机体安全高效的直接吸收、利 用。美国科学家m e r t z 说“啤酒酵母中提取的葡萄糖耐受因子是生物活性最高的铬化合物”。 3 中用农q p ? 卜亨院彻i 。产付论殳筇一市绪沦 葡萄糖耐受冈子对血糖、血脂代鲥起调1 7 作川的不是二价铬离子本身，而是葡萄糖耐受冈子 以完整的铬结合蛋f 1 分子参与血糖、血脂代谢起凋仃作川，即只有完整葡萄糖耐受冈子才能与胰 岛素受体结合，从而调1 ，胰岛素功能。冈此，酵母中的葡萄糖耐受冈子比单纯的人i ：合成的无机 铬和有机铬效果更好。刑糖尿病人二价铬离子缺乏并不是导致血糖火凋的直接原冈，而是k 期 缺铬使体内不能合成葡萄糖耐受冈子，致使细胞内糖耐受冈子水平。卜降，导致胰岛素不能与受体 充分结合，进而山现糖耐受不良及胰岛素抵抗而发展为糖尿病。无机铬吸收率低，且在人体内很 难转化为具有生物活性的铬化合物。而吡啶铬等有机铬虽易丁被机体吸收，但1 生机体代谢过程中 首先须释放出三价铬离子，三价铬离子义与相应的小分子蛋白结合，最终才能转化为具有生物活 性的铬化合物一葡萄糖耐受因子，而在糖尿病人体内将有机铬转化为生物活性铬蛋白的效率很 低。1 9 9 2 年，s i m i n o f f m 等人发现不含铬的糖耐受冈子也具有生物活性1 4 刚，进一步证明糖耐受冈 子才是调节人糖脂代谢的生物网子。 1 2 4 葡萄糖耐受因子作用机理 4 0 年前人们在研究中发现，啤酒酵母提取物对于降低血糖有十分显著的效果，对于i i 型糖尿 病尤其有效。人们推测酵母中的某种物质是降低血糖的关键，该物质结构功能可能与胰岛素有关 联。此后的研究发现，三价铬离子是该物质的重要组成成分，三价铬离子与一种小分子蛋白结合， 形成一种小分子铬结合蛋白既葡萄糖耐受因子，葡萄糖耐受因子在胰岛素调节机体的糖、脂代谢 中起着十分重要的作用，是胰岛素实现代谢调节的关键控制因素。糖尿病发病原因十分复杂，有 的是因为胰岛素b 细胞不正常，导致不能正常分泌胰岛素；有的是胰岛素信号传导途径出现障碍， 而葡萄糖耐受因子的缺乏正是导致胰岛素信号传导障碍，使血糖代谢紊乱出现糖尿病症状的重要 原因。 在机体每个细胞上能够和胰岛素结合的受体( 胰岛素受体) 并不多，一般正常人体内每个细胞 上高亲和力的受体只有4 0 - - - 8 0 个，低亲和力的受体是1 5 0 0 3 0 0 0 个，这些受体数量的多少对胰岛 素发挥降糖功能是至关重要的。研究证实i i 型糖尿病人胰岛素受体数量惊人的减少，胰岛素受体 ( 高亲和力的受体) 数量仅达到正常人的4 4 ，胰岛素与其受体间的结和力( 亲和力) 明显 减低，仅达到正常人的7 1 。由此，胰岛素受体数量的减少及其与受体间亲和力的降低，是导致 糖尿病人胰岛素抵抗的重要原因之一。 葡萄糖耐受因子是一种小分子铬结合蛋白，1 分子蛋白结合4 分子三价铬离子，蛋白分子量 1 5 0 0 d a 左右，在2 6 0 n m 波长有紫外线吸收峰，含有半胱氨酸、天门冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸【4 9 1 ， 葡萄糖耐受因子必须与三价铬离子结和才具有生物学活性。近期的研究表明，酵母葡萄糖耐受因 子在极低剂量下就可以激活蛋白激酶的活性【5 0 1 。 4 一寸翳2 2 露孥露秒 1 3 国内外研究应用现状 131 葡萄糖耐受因子生产用菌种的筛选与优化研究现状 自二卜世纪韧发现葡萄精耐受因于以来，葡萄糖耐受因子生产菌株多采用天然啤酒酵母或酿 酒酵母。经过铬耐量试验，筛选出铬高耐受菌株。目前尚未有菌株专利，研究甲忙多采用自主 筛选的天然啤酒酵母菌株进行优化岬5 ”，挑取优化筛选莸得的单菌落进行发酵试验，考察确定其 台成葡萄糖耐受冈子的能力。 132 葡萄糖耐受园子富集酵母发酵工艺研究现状 葡萄糖耐受 1 1 f 土掣n 】酵母发酵获得，口前人部分发酵r 艺的研究多处丁实验室摇瓶发酵及 莳种分离阶段。 w _ ， 埘 h ， 忡 r1 = h= l 中田伙、眦科亨! 院坝卜7 - 1 寸论史筇审绪沦 v l a t k ag u l a n 等住摇瓶发酵实验中发现，有氧发酵啤酒酵母葡萄糖耐受冈子含域高丁静i 卜培 养【10 1 。a l id e m i r c i 筲对野生刑啤酒酵母合成葡萄糖耐受冈子的发酵i ：艺进行了人苗的研究，采h j 复合培养基及补料分批发酵，利川铬酸钠为培养基中铬的米源，在发酵5 0 小时、铬酸钠终浓度 达剑7 1 9 l 的条1 i ，| ：卜，获得最佳结果，酵母生物苗为湿菌体4 2 9 l ，每克干凶体中总铬含量为 3 1 1 3 g g ，葡萄糖耐受冈子含鼙( 以铬计) 为7 9 5 x g g 【5 5 】。住舢id e m i r c i 的实验中，培养基为完 全培养基，成分复杂，成本高，很雉实现i ：业化生产，且当铬与硫的比例人丁o 1 5 ：1 时，即会 产生毒性，菌体生物量仅为湿菌体0 2 6 9 l ，发酵f ：艺可控性小，不适丁人型l ：业化生产。1 9 8 2 年，s k o g e r s o n 等就铬酵母的制备方法中请了专利【5 6 】，研究以摇瓶发酵j l ：艺为主，发酵过程分为 菌体富集、 三价铬离子刺激及菌体复苏三个阶段，各发酵阶段采州不同的培养基和控制条件。 虽然s k o g e r s o n 等的研究过程比较复杂，但对后期的发酵 ：艺研究具有较火的参考价值。2 0 0 1 年 又有相关的铬酵母专利出现，专利内容以铬酵母作为添加剂在食品方面的应川【5 7 】为主。在美国、 加拿大等发达国家，葡萄糖耐受因子已经成为糖尿病患者日常的营养补充剂。至今尚未发现有关 高效表达葡萄糖耐受因子菌株及发酵工艺水平重大突破的相关报道。 2 0 0 1 年，中国科学院微生物所从2 4 0 株啤酒酵母原始菌株中，筛选出一株葡萄糖耐受因子高 产啤酒酵母菌，并进行了摇瓶发酵研究，确定最佳摇瓶发酵工艺为：2 5 0 m l 三角瓶中液体培养基 装量为2 0 m l 时，培养基采用糖度为1 0 。的麦芽汁，三价铬离子浓度为1 2 0 0 g l 培养基，三价铬 离子来源为醋酸铬，发酵条件为2 8 。c 、p h 6 0 发酵3 0 小时；发酵结果为生物量为2 3 4 0 + 7 1 m g 1 0 0 m l 、 细胞中铬含量3 2 4 8 _ + 6 5 g 鹰干菌体【5 引。目前，我国在发酵工艺方面的研究仍停留在摇瓶发酵的实 验室阶段p w ，发酵工艺的中试研究进行较少。2 0 0 4 年湖南威恒生物技术有限公司获得中试研究 的发酵工艺专利 6 0 1 ，但发酵周期较长，控制条件有待进一步优化。 1 3 3 葡萄糖耐受因子的检测方法 酵母中葡萄糖耐受因子具有耐酸、耐热特性，可溶于氨水和乙醇溶液中。无机状态的三价铬 离子在碱性条件下，会形成不容的氢氧化铬。生物形式的铬化合物即葡萄糖耐受因子能够溶解于 氨水中【6 1 6 2 1 ，使用0 1 m 的氨水作为提取液【6 3 l ，可使葡萄糖耐受因子提取率可达到4 4 以上。无 机铬化合物不容于乙醇，因而一些研究选用5 0 的乙醇溶液作为葡萄糖耐受因子提取液i 矧，并申 请了专利【6 5 】。 目前，葡萄糖耐受因子含量的检测主要采用基于1 9 7 3 年t o e p f e r 的研究建立的提取方法，用 氨水或乙醇将葡萄糖耐受因子从酵母细胞体内提取出来，消化后，利用原子吸收法或比色法测定 葡萄糖耐受因子中三价铬的含量，以三价铬离子的含量衡量葡萄糖耐受因子的含量( 表示为葡萄 糖耐受因子含量以铬计) 。检测指标为葡萄糖耐受因子的含量( 以铬计) ，对葡萄糖耐受因子的活 性检测还处于摸索阶段，尚未发现比较完善可行的活性检测方法的相关技术资料。 1 3 4 其他相关研究 葡萄糖耐受因子在其他方面的研究主要为理论研究。如葡萄糖耐受因子富集酵母中铬的分布 及价态【6 6 1 ，葡萄糖耐受因子富集酵母与天然普通酵母在氨基酸组成上的差异【6 7 】等。 1 9 9 7 年在牛的肝脏中发现类似葡萄糖耐受因子的小分子铬结合物( l m w c r ， 6 r j i q “，r i # 忆鹅巾特地 l o w m o l e c u l a r - w e i g h tc h r o m i u m r b i n d i n gs u b s t a n c e ) ，其 川。墒精纠 耐受闻f 奉相州，f “h 缸酸、 胱氨畦、外氩陵搜a ij 冬强脯u2 + 2 ：42 j 比例o l h e ， 价锵离f o 虫f 1 分r 的比例为4 ： 在毗等功物刖 c i - 也分离得剑j 慨分r t 懈结台崔白1 + tj ， 2 0 0 3 年r a c e kj 根据坼的分r 竹= 川胀耻，前玖提惰蜩柔的概念”】将哺乳动物t ，发脱的陵 炎小分r 覃绱台铬盘f 1 绒命名山锩凋素( c h r o m o d u l i n ) 葡萄赫耐受r0 指酵母q - 锵站合崔 闩。2 0 0 4 年j a s o nh a t f i c l d 枉他的i , j l 究报告巾提出，扛鸡叶十也发现r 铬啊紊。嫱新的州宄进腱 表明，葡萄精耐爱闻f 是种f 分j - l 的情结台蛋n ，娃所4 生物 t 4 f 的种儆硅的金属结台蚩 n ，jl 钉讯商的慊守性。 135 葡萄糖耐受因子富集酵母及相关产品开发现状 葡萄耱耐受田子的坷f 究早a 上个l l l gh 十年代就已经扦始r ，世葡萄糖耐受子的，产技术 的研究直没有很人提高铬补充荆坯是以无机铬和吡啶铬为生，以葡萄糖耐受因子为土要成分 的特球瘸产品较少。添加的葡萄耱耐受罔r 丰婪来源丁天然的啤洒酵母，_ 产品杯准r p 慢标注总的铬含封。例如在关闺发加拿人常见的两种糖抹情营养 补充剂p a l m e r 8 及j o r f o w f o r m m l a s “，其主要配料为天然的营养掣啤酒酵 母，每日服用最为总铬2 0 0 微克。 隆划 睦雪 葡萄糖而i 受因子在我国尚处丁概念接受阶段。到目前为i r ，仪有湖南成匾生物技术有限公司 丌发的种降糖，“品以葡萄糖耐受田子富集酵母为卡要原料。在食晶行、i k 中，相关产品主竖为毗 啶铬和删瞍钵，这阿种有机铬化台物常作为食品漆加剂麻用糖尿病食品中。神：饲料行业和养殖行 业将富集铬的酵母简单，j 称为富铬酵母”o “j 富铬酵母可以增加饲料中三价铬离r 的含量，改善 饲抖的营养结构，提岛舒禽的m 质i ”j 。富铬酵母作为饲剌漆加剂对总的饵含节、葡萄糖耐受l 州 子宙最及活性没有严格的质量要求和帕、准，生产：艺相对比较简单，多为啤酒发酵废料与柏机铬 或无机铬的灌台物，一价恪离子人郎分附着往酵母细胞袅面。 1 4 课题研究内容 木课题的研究内容土耍分为五个部分，涵盖从菌种筛选优化到开发山，“品的粘个过程。 ( i ) 葡萄檐耐受冈r 富集酵母生产优良菌种的筛选 利用梯度诱导的方法，定向驯化c ，耐受曲株，获得c t ”高耐受苗株，从【荫碲选山葡萄糖耐 受闻于高产菌株。 ( 2 ) 葡萄糖耐受因子富集酵母发酵l 艺研究 根据菌株特点及不同发酵阶段的目的要求，考察发酵过程中并参数对笈酵结果的影响，发酵 参数分段控制，补料方式采川梯度流加的方法优化发酵j 艺。 ( 3 ) 建立葡萄糖耐受田子活性检测方法 诺萄糖耐受f 能眵促进酵母对葡铺糖的啦收和利川，采埘野生啤酒酵母为检测菌株，建立 葡萄糖耐受因子活性检测方浊， ( 4 ) 葡萄精耐受i 目f 动物功能性f 宄及产品开发 制备糖尿病人鼠模型，葡萄糖耐受阿予样，目，进行n 服灌沣喂养，考察葡萄糖耐受因子对耱尿 巾i 习伙、i k 科学院顺f j 位论文第+ 审绪论 病人鼠血糖的影响，确定葡萄糖耐受冈子样品的生理功能。结合我国传统中医约理论，以葡萄糖 耐受冈子富集酵母为主要原料开发糖尿病防治产品，根据g b t 1 1 2 0 0 0 标准化i ：导则制定该 产品的企业标准。目前该类产鼎尚无国家标准或行业标准。 ( 5 ) 葡萄糖耐受冈子富集酵母菌粉稳定性研究 利川高温、高湿及光照等单冈素影响试验考察葡萄糖耐受冈子富集酵母凶粉的稳定性，利川 快速破坏试验及产品留样试验，确定曲粉的储存及包装条什。 1 5 研究的目的和意义 我国是一个人口大国，糖尿病患病率止在逐年增加，1 9 7 9 年仅为o 6 7 ，1 9 9 5 年已经达到 3 2 1 。全国有五千万糖尿病人，全国发病率以每年4 o 递增，发病人群主要集中在人中型城市及 发达地区，经济越发达的地区发病率越高【7 引。世界卫生组织发表公报预测，2 0 2 5 年世界糖尿病 成人数量将达到3 亿，糖尿病已经成为2 1 世纪全球性的重大卫生问题。 糖尿病是一种终身性疾病，就目前的医疗水平来看，还没有任何方法能够完全治愈，仅能控 制糖尿病症状及并发症的发生。目前的糖尿病药品主要以阻断机体对糖的吸收、促进胰岛素分泌 为主，在降低血糖浓度的同时，切断了细胞的能量来源或使胰岛素过渡分泌，没有从根本上改善 细胞的糖代谢功能，长期服用会产生许多不可逆的副作用。葡萄糖耐受因子可以促进胰岛与胰岛 素受体的亲和力，改善机体细胞自身的糖代谢能力，促进细胞对血糖的利用，在降低血糖的同时， 保证了细胞的能量来源，保证细胞能够行使正常的生理功能。啤酒酵母是一种营养型酵母，长期 服用不会产生毒副作用。啤酒酵母是一种天然的葡萄糖耐受因子富集微生物，但它本身的葡萄糖 耐受因子含量远远不能满足临床需要，通常糖尿病人每天需要口服1 0 克左右的啤酒酵母提取液， 才能达到降低血糖的作用，且效果不十分稳定。筛选天然的葡萄糖耐受因子高效表达株和优化适 宜的细胞培养发酵条件，开发以葡萄糖耐受因子为主要功能因子的降糖产品，具有很大的社会意 义。 本课题的研究目的主要是为加快葡萄糖耐受因子富集啤酒酵母工业化生产的进程奠定基础， 验证葡萄糖耐受因子的生理作用，探索开发葡萄糖耐受因子在糖尿病领域的应用，为葡萄糖耐受 因子的深入研究提供理论参数，为糖尿病的预防和治疗提供技术支持。 8 巾同农q l , # 院坝1 引江论丈粥：币材 ： j 方法 第二章材料与方法 2 1 葡萄糖耐受因子富集酵母生产优良菌种筛选 2 。1 1 菌种来源 天然野生型啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ，购白美 ( c a p n a t u rd i s t r i b u t i o nl n c ) 2 1 2 主要的仪器设备 原子吸收分光光度计( 日本岛滓公司，a a 6 3 0 0 ) ，紫外分光光度计( b e c k m a nc o u l t e r ，d 0 8 0 0 ) ， 水平恒温摇床( t h e r m of o r m a ，m o d e l4 8 1 ) ，低温高速离心机( b e c k m a nc o u l t e r ，a v a n t ij 恸，电 子分析天平( m e t t l e r t o l e d o ，a b l 0 4 n ) ，电热恒温培养箱( 上海森信试验仪器有限公司，d r p 一9 0 5 2 ) ， 超净：t 作台( 苏州泰安，百级层流) ，自动电热蒸汽压力灭菌器( 上海申安医疗器械厂，z d x 一3 5 b ) ， 电热恒温鼓风干燥箱( 上海益恒试验仪器有限公司，d h g 一9 3 5 a ) ，超纯水仪( p a l l , p l 5 2 4 3 ) 及其它常规仪器设备。 2 1 3 主要试剂 c r c l 3 6 h 2 0 ( 国产分析纯) 、y p d 培养基( 进口分装) 、甘油( 国产分析纯) 、氨水( 国产分 析纯) 、其它试剂皆为国产分析纯。 2 1 4 研究方法 2 1 4 1 原始菌种活化 取一8 0 c 甘油保藏的原始菌种，接种于5 m l 2 5 m l 三角摇瓶y p d 液体培养基中，2 8 。c1 5 0 r p m 培养1 2 1 4 h 。 培养液以0 1 接种量，接种于3 0 m l 2 5 0 m l 三角摇瓶y p d 液体培养基中，2 8 0 c1 5 0 r p m 培养 2 h ，分别取1 毗l 、2 吮l 、5 毗l 、1 0 0 弘1 培养液，涂布于y p d 固体平板上，2 8 c 静止培养4 4 4 8 h 至 单菌落直径为0 5 1 r a m 。 2 1 4 2c r 3 + 耐受菌株梯度诱导 取5 0 1 0 0 个单菌落混合接种于5 0 m l 2 5 0 m l 三角摇瓶y p d 液体培养基中，2 8 。c 、1 5 0 r p m 培养2 h ，取出2 0 m l 培养液于无菌离心管中，3 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，无菌条件下，弃去上清，加入 2 0 甘油无菌水重悬沉淀，贮存于8 0 。剩余3 0m l 2 5 0 m l 加入c f 诱导剂至终浓度( 以铬计，以 下同) 0 2 9 l ，2 8 c 、1 5 0 r p m 培养1 0 h ，分别取1 毗l 、2 毗l 、5 叩l 、1 0 毗l 培养液涂布于c r 诱导 剂浓度0 2 9 l y p d 固体平板上，2 8 静止培养至单菌落直径为0 5 l m m 。 取上述操作获得的单菌落5 0 1 0 0 个，重复上述操作方法，进行梯度诱导，c f 离子浓度分别 为o 4 9 l 、0 6 9 l 、0 8 班、1 0 班。 取最高c r 离子浓