（农产品加工及贮藏工程专业论文）鸭梨酒酵母菌的选种研究.pdf

摘要 本研究利用豆芽汁琼脂培养基，以市售各种水果及果皮为分离源，从中共 分离得到1 9 5 株酵母菌，经过四级筛选，获得两株适宜鸭梨酒酿造的酵母菌，编 号为g y - 和g y z ，其中g y 。来自于鸭梨果皮，g y ：来自猕猴桃的自然发酵醪。通过 形态和培养特征观察、生化试验( 发酵碳源、同化碳源、同化氮源) 和其它理化 试验，两株酵母菌最终被鉴定均为酵母属( s a c c h a r o m y c e x ) 的酿酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e f e v i s i a e ) 。这两株酵母菌均能耐受1 5 的酒精度，其中g y l 能耐受1 6 的酒精度；两株酵母菌均能耐受p h o 9 8 的酸度和浓度为3 7 5 m g l 的 二氧化硫；均能在3 5 ( g m 1 ) 的糖溶液中正常发酵，在7 0 ( g m 1 ) 的糖溶液中仍 能起酵。是两株较有发展潜力的酵母菌种。 将两自选菌株与安琪活性干酵母在酿酒特性上进行比较，结果表明：在2 5 下，g y 和g y 。的发酵性能优于安琪活性干酵母，在此温度下所测得的两者的生 长曲线对数生长期短，为l 天，稳定期长达3 天，而安琪酵母的对数生长期为2 天，稳定期不明显。g y 和g y 。，尤其是g y 均表现出了优良的耐s o ：性能：浓度 较高时( 1 0 0 m g l 1 5 0 m g l ) ，g y 、受s o 。浓度的影响较小，浓度较低时 ( 5 0 m g l l o o m g l ) ，g y ：受s 0 ：浓度的影响较小。这对酵母菌在其它发酵中的应 用和其它菌种的改良有着重要的意义。经感官评定，两株自选酵母菌所酿造的鸭 梨酒明显优于安琪活性干酵母所酿的鸭梨酒。气相色谱分析结果表明：两自选酵 母所酿造的鸭梨酒所含主要酯类( 甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯) 的量均高于安琪酵母所酿造的鸭梨酒含酯量：甲醇两自选酵母所酿制的两种鸭梨 酒所含的甲醇含量分别为7 6 7 1 0 。6 l 和9 3 4 1 0 。6 l ，符合国家标准中葡萄 酒中甲醇含量不得高于0 8 9 l 的规定，对人体不会产生甲醇危害。 采用三因素三水平正交试验分别确定了两自选酵母的鸭梨酒酿造工艺。结果 表明两者的适宜酿造条件均为：发酵温度，2 5 ；加菌量，1 1 0 7 c e l i m l ；初 始p h 值，4 。两株自选酵母在此工艺条件下发酵而成的鸭梨酒，感官评定的结果 均优于安琪活性干酵母和实验室保藏枣酒酵母所酿造的鸭梨酒。 关键字：鸭梨酒；酵母菌：筛选；鉴定：酿造工艺 t h e s t u d y o n s e l e c t i n g y e a s t sf o r f e r m e n t i n g y ap e a rw i n e s p e c i a l t y ：a g r i c u l t u r ep r o d u c tp r o c e s sa n d s t o r a g ee n g i n e e r i n g y u a nl a d v i s e r ： w a n g j i e a b s t r a c t u s i n gt h ec u l t u r em e d i u mo fb e a ns p r o u tj u i c ea g a r , 19 5s t r a i n sw e r ei s o l a t e d f r o ma l lk i n d so ff r u i t sa n dt h e i rs k i n s ，w h i c hw e r es o l di nm a r k e t si nb a o d i n gc i t v a f t e rs e l e c t i n gb yf o u rg r a d e s ，t w os t r a i n s ，w h i c hw e r es u i t e dt of e r m e n t i n gy a d e a r w i n e ，w e r eg o t ，n a m e dg y la n dg y 2 ，t h ef o r m e rf r o my a p e a r sa n dt h el a t t e rf r o m m t h o up e a c h s b o t ho ft h et w os t r a i n s ，i d e n t i f i e da ss a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ew e r e n o tp o i s o n o u st oh u m a n b e i n ga n d c o u t db ea p p l i e dt ot h e p r o d u c t i o no f y a p e a r w i n e b o t ho ft h et w o y e a s t sc o u l de n d u r et h ea l c o h o lc o n c e n t r a t i o no fi5 t h ep hv a l u eo f 0 9 8a n dt h es o zc o n c e n t r a t i o no f3 7 5 m l i nt h eo t h e rh a n d ，t h e yc o u l df e r m e n ti n t h es u g a rc o n c e n t r a t i o n o f 3 5 n o r m a l l y ，a n d s t i l is t a r t t o f e r m e n t i n t h e s u g a r o f 7 0 s o t h e y a r ep o t e n t i a l t h ep r o p e r t i e so ff e r m e n t a t i o no ft h et h r e es t r a i n s ，g y i ，g y 2a n da n g l ew e r e s t u d i e d c o n c l u s i o n sw e r em a d et h a ta tt e m p e r a t u r eo f2 5 t h ep r o p e r t i e so fg y l a n dg y 2 w e r eb e t t e rt h a nt h o s eo f a n g l e t h el o g a r i t h m i c s t a g eo f t h e t w o y e a s t sw a s o n ed a y , w h i c hw a so n ed a ys h o r t e rt h a nt h a to f a n g e l ；a n dt h es t e a d ys t a g ew a s3 d a y s ，w h i l et h a to fa n g e l w a sn o ts i g n i f i c a n t l y a n db o t ho ft h e p r o p e r t i e so fe n d u r i n g s 0 2w e r eg o o d ，b u tt h e yw e r en o ts a m ec o m p l e t e l y t h ef e r m e n t i n gp e r i o do fg y i h a dl i t t l e a n y t h i n g t od o 、v i t ht h ec o n t e n to fs 0 2 ( 1 0 0 m g ，v 1 5 0 m l ) ，a n dt h e f e r m e n t i n gp e r i o do fg y 2h a dl i t t l ea n y t h i n gt o d ow i t 1t h el o w e rc o n t e n to fs 0 2 ( 5 0 m g l 10 0 m g l ) t h a tw i l lb eu s e f u li ni m p r o v i n go t h e rs p e c i e si nf u t u r e s e n s o r y e v a l u a t i o nt e s t e dt h a tt w ok i n d so fw i n ef e r m e n t e db yg y la n dg y 2i n2 5 w e r e b e t t e rt h a nt h ew i n e b ya n g l e r e s u l t sb yg a sc h r o m a t o g r a p h s t e s t e dt h a tt h ec o n t e n t s o ft h em a j o rf a v o rs u b s t a n c e sfe t h y l f o r m a t e 、e t h y l a c e t a t e 、i s o a m y la c e t a t ea n d e t h y l h e x a n o a t e ) i nt h ey ap e a r sw i n ef e r m e n t e db yg y ia n dg y 2 w e r eh i 曲e rt h a nt h o s e b ya n g e l ；w h a t sm o r e t h ec o n t e n to f m e t h a n o lo f t h et w ok i n d so f w i n e sw e r e 7 6 7 1o o la n d9 3 4 l0 0g lr e s p e c t i v e l y ，w h i c hw e r ea c c o r d a n tw i t hg b ，w h i c h r e g u l a t e d t h a tt h ec o n t e n to f m e t h a n o l i nw i n ec o u l d n te x c e e d0 8 9 li nw i n e o p t i m u mf e r m e n t a t i o np a r a m e t e r so fb r e w i n gp r o c e s s i n gb yt h et w os t r a i n sw e r e g a i n e db yo r t h o g o n a lt e s t i tw a sp r o v e dt h a tt h ep r o p e rp a r a m e t e r so f t h et w os t r a i n s w e r ea ss a m ea sf o l l o w i n g ：f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e ，2 5 ：a d d i t i o no fy e a s t ，l l0 7 c e l l m l ；p r i m i t i v ep h v a l u e ，4 b yu s i n g t h ea b o v ec o n d i t i o n s ，t h ey a p e a rw i n eb y g y ia n dg y ，w e r eb e t t e rt h a nt h ew i n e sb ya n g e la n dt h ey e a s ts t o r e db yt h el a b k e y w o r d s ：y a p e a rw i n e ；y e a s t ；s c r e e n ：i d e n t i f i c a t i o n ；b r e w i n gp r o c e s s i n g 独创性! 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。掘我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中小包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也小包含为获得皿j e 壅业太堂或其它 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 苏西诧 签字闩期：巩口p 牛年占月肋h 关于论文使用授权的说明 本学位沦文作者完全了解逦j b 查些太堂有关保留及使用学位论文的规定，有 权保留并向国家有关部门( 机构) 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查( 借) 阅。本人授权迎j e 盔些太堂可以将论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等方法加以保存或编成学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 学位论文作者签名： 裳丽 签字f 1 期：劫够 年莎月汐日 导师签名：立鸣弓 签字h 期：。沏口斗年口月纠r 鸭梨酒酵母菌的选种研究 l 引言 梨是分布最广泛的果树之一。我国是种梨最早的国家，又是“东方梨”起源地， 古人称梨为“百果之宗”，即水果之主的意思，人们视梨为品味佳美的珍果。梨成熟 于夏秋暑热之季，对某些暑热病有显著的食疗效果，民间有“一日一梨，医生远离” 的说法传至今日。所以梨在我国是经久不衰，深受广大人民群众欢迎的大宗消费水果 2 1 。在我国，从北到南。从东到西，各省市自治区均有分布。它营养丰富( 其可食性 成分见表1 ) 、嫩脆化渣、口味极佳，每年大量出口港澳及东南亚市场，深受欢迎。 它适应性强，无论山地、平地、甚至低洼地都能栽培，对于涝害、盐碱的抵抗力很强。 果实耐贮藏运输，生产者不必担心销售困难时发生烂果。由于以上种种优点，经过近 十年的高速发展，我国梨的栽培面积和总产量己迅速扩大和提高栽培面积已达i 0 0 多万公顷，是我国排在苹果、柑桔之后的第三大果树树种。其产量也相当大，据统计， 2 0 0 1 年中国梨的产量为8 7 9 6 万吨，仅次于节果( 2 0 0 1 j 万吨) 和相橘( 11 6 0 7 万吨) ， 高于葡萄( 3 6 8 ，0 万吨) 和香蕉( 5 2 7 3 力1 吨) 口j ，梨资源可谓相当丰富。可以浇最近的 1 0 年是我国历史上梨发展最迅速、成就最辉煌的l o 年。其中鸭梨在我国的河北和山 东等地有广泛种植，资源也很丰富。 表1鸭梨可食部分成分分析 ! 生! 鲤型! l ! g ：i l ! ! i ! ! ! ie ! ! ! ： 一一一一 堕坌 金星些! 一一! 量一 水分( g l o o g ) 8 8 3 p 于( m g 1oog)400 0 能量( k 7 i o o g ) 1 8 0 0断类( r n g l o o g ) 0 1 5 9 蛰白质( m g l o o g ) 2 0 00钙( m g l o o g ) 5 0 粗脂肪( m g l o o g ) 2 0 00磷( m g l o o g ) 6 0 膳食纤维( g l o o g ) l i 铁m g ioog)02 版分( m g l o o g ) 2 0 00v c ( m g l o o g ) 4o 碟水化合物( g q o o g ) 1 00胡萝h 索( m g l o o g ) 0 0 1 近年来，泰国、缅甸、越南向我国出口水果增势猛烈，对以较低价位应对国外优 质高价品牌水果竞争的国产水果产生强烈冲击，国产水果传统的价格优势正在丧失。 时下，在国内的商店、超市乃至水果摊点，都能看到洋水果的踪影。作为较早进入我 国市场的农产品，洋水果一直受到广泛的关注。由于在我国加入世界贸易组织前，农 产品的关税保持在很高的水平，洋水果并没有在实质上冲击本土水果市场。随着关税 的下调，洋水果在品质及外观上的优势更明显地显现出来，加之洋水果一直注重品牌， 品牌洋水果的优势更加突出。品牌洋水果的竞争对手主要是国产高档水果，越南等我 国周边水果产地的竞争则直接针对我国总体上还停留在低效、小规模的水果产业，并 洞北农业大学硕士学位论文 且在价格方面具有更为明显的优势。水果专家称，品种退化、水果品质下降，缺乏自 己的品牌，分教、粗放的经营管理体制阻碍了产业化形成，忽视采后处理技术，缺乏 大的水果加工企业尤其是龙头企业等等，这些都是国产水果与品牌洋水果在竞争中失 去价格优势的重要原因。 由上可见，在我国迫切需要寻找水果深加工的新途径。响应国家提倡发展果酒 的政策，酿造以水果为主原料的低度饮料酒，既可提高农产品的附加值，又可增加果 农的收入，具有很好的经济效益和社会效益，发展前景广阔 4 5 1 。对鸭梨来讲也是如 此。到目前为止，人们对鸭梨酒的研究主要集中在两个方面：一是防止褐变：二是在 发酵中鸭梨香气成分保持以及增加。王颉等人曾于1 9 9 6 至1 9 9 7 年对鸭梨酒进行了深 入的研究，但终因鸭梨酒在贮减和陈酿过程中容易产生褐变且酒体特征风味不突出等 问题，而没有形成商业化生产【4 l 。在以往的研究中众学者都是在工艺上做文章，比如 根据褐变产生的原因从( 1 ) 单宁中的酚类还原性物质的存在；( 2 ) 氧的存在；( 3 ) 存在多酚氧化酶和过氧化酶等三方面考虑，用降低单宁和果胶的含量，基质的甲基化， 抑酶等方法防止褐变的产生【6 “。 鸭梨酒的风味成分十分丰富，主要有醇类、酯类、有机酸、羰基化合物等。这 些风味物质的来源主要有两方面：一是原料本身含有的：二是由酵母发酵形成的。其 中，醇类、酯类、有机酸和羰基化合物中的大部分是酵母发酵的副产物。造成鸭梨酒 风味不足的主要原因是：( 1 ) 原料本身风味淡雅，含香气成分虽多( 鸭梨果实含有 的挥发性香气成分有3 2 种，在已知的1 8 种物质中有酯类1 2 种，酮类1 种，醇类1 种，其他4 种，未知待定成分1 4 种 4 】) ，含量却较小，且在加工过程中易挥发而散 失，所以在加工过程中除采取增香措旎外。还应注重保香；( 2 ) 缺乏鸭梨酒专用的 产香酵母。目前为止用于增加果酒香气的方法很多，李从发等研究表明抗坏血酸不但 可以防褐变，还有利于果酒原果香的保持【lo 】；多酚是许多植物性食品中存在的天然 抗氧化剂，对葡萄酒的香气形成有重要作用f i “，其贡献主要在于其抗氧化性及自身分 解所带来的新的风味物质【”】；f e u i l am 研究表明，在酒精发酵过程中及当白葡萄酒 在酒泥上陈酿时有酵母菌释放或自溶产生的甘露蛋白不仅可以影响葡萄酒的香气质 量，还可以改变芳香物质的挥发性，提高葡萄酒香气的馥郁性3 j ：另外还有酶法【i 州 和带皮发酵。 另外还有影响果酒香气的重要因素一酵母菌，菌种性能的好坏直接影响到果酒 的质量。酒类酵母分为酒精酵母、生香酵母和威士忌酵母。其中生香酵母有较好的产 醋酸及其乙酯的能力，在发酵中可以提高白酒的有机酸和酯的含量，增进酒的香味， 是提高酒质量的有效途径。而目前果酒生产上常用的酵母菌多为活性干酵母p ”1 t 它们通常为酿酒酵母，主要有啤酒酵母( s a c c h a z o m u c e sc e r e v i s i a e ) 、葡萄酒酵母 ( s a c g h a r o m y c e se l l i s o i d e n s ) 等。活性干酵母的使用虽然可以简化酵母培养工艺 及设备，但也存在价格较高、不易储藏等缺点。另外，活性干酵母在生产上多经好氧 培养，因此其厌氧性能、低温发酵性能及耐乙醇性能等较差【2 ”。在生产中，厂家一般 都应用适合自己产品特点的酵母菌株。在鸭梨酒酿造中，除常用的活性干酵母外，一 些厂家还选用葡萄酒酿造酵母或购买其他商业菌株，这使鸭梨酒在感官质量上尚存在 鸭梨酒酵母菌的选种研究 某些缺陷，不能酿出质量上乘的鸭梨酒。目前尚无专门适宜鸭梨酒酿造的酵母菌株。 在以往的研究中，大多数研究者都在工艺上做文章，到目前为止，尚未见有关于筛选 鸭梨酒酵母菌的报道，这也是本课题的创新点。针对鸭梨本身的特点，本试验的目的 就是选育一株或几株适宜鸭梨酒酿造的产香酵母。 酵母菌在自然界中存在的范围非常广泛，可以从不同的陆地或海洋生物环境中 分离得到。在成熟水果的果皮、果梗上就有大量的酵母菌存在，例如葡萄表皮存在的 酵母种类十分丰富 2 4 ”j 。除水果果实外，土壤环境中也有十分丰富的酵母菌，特别是 有水果残渣等的果园土壤中酵母较多，因此可以从自然界中分离筛选酵母菌以满足不 同生产要求，见参考文献2 6 3 5 。针对鸭梨果实香气淡雅的特点，所筛选的酵母菌要 求有较好的产香性能。生香酵母大多应用在白酒中以进一步提高白酒的质量。生香 酵母有较好的产醋酸及其乙酯的能力，在白酒中可以提高酒中有机酸和酯的含量，增 进酒的香气，是提高白酒质量的有效途径口。李剑芳等曾从自然发酵的猕猴桃汁筛选 出一株能明显改善果汁风味的产香酵母k a p i c u l n a e - - 4 5 ，但这株酵母菌的酒精耐 力较差( 【6 2j 和常见与 常用真菌【6 驯 a 生理生化基础培养基，见附录l 。 b ，玉米粉琼脂培养基：将1 2 5 9 黄玉米粉溶于3 0 0 m l 水中，搅匀，以6 0 9 c 热水 浴预温l 小时，滤纸过滤，滤液加水至3 0 0 m l ，加入琼脂3 8 9 。1 2 1 ，1 5 m i n s ，趁 热用脱脂棉过滤，分装试管，然后11 2 c ，灭菌1 5 m i n s ，倒平板。 c 产子囊孢子培养基( k l e y n 氏培养基) 醋酸钠9 8 9d 一葡萄糖 1 0 9 n a c l1 2 9七水硫酸镁0 7 9 干酵母浸出物2 5 9琼脂 2 0 9 将上述物质溶于l l 蒸馏水中，然后1 2 0 。c ，灭菌1 5m i n s ，做斜面。 d 生成类淀粉化台物培养基 硫酸铵0 2 磷酸二氢钾0 2 七水硫酸镁0 1 酵母膏0 1 葡萄糖 2 琼脂2 0 9 河北农业大学硕七学位论文 将上述物质溶于蒸馏水中 2 0m i n s ，倒平扳。 e 刘格氏( l u 9 0 1 ) 碘液 2 9 碘化钾溶于2 0 m l 水中 冰箱保存，待用。 并用盐酸调整溶液p h 值至4 8 ，然后于1 1 56 c ，灭菌 加碘l g ，待碘溶解后，再加水使总体积达到3 0 0 m l 。 f 斐林试剂：参考食品分析 8 9 1 。 g 生化鉴定糖类：葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、棉予糖、纤维二糖、肌醇、核糖、 赤藓糖醇、鼠李糖、木糖、核糖醇、柠檬酸、琥珀酸、甘露糖、可溶性淀粉、阿拉伯 糖、海藻糖，均为分析纯。 2 1 3 其他试剂及材料 主要有购自s i g m a 公司的放线菌酮、乙胺、尸胺，市售玉米粉，等等。 2 1 4 主要仪器设备 l r h 一2 5 0 a 生化培养箱：广东省医疗器械一厂； d l c j 2 n 医用型洁净工作台：哈尔滨东联电子技术 t 发公司； 高压灭菌锅：山东新华医疗器械股份有限公司； 显微镜：r 本o l y m p u s ： p h 2 l l 酸度计：h a n n a 公司： s k l 快速混匀器：常州国华电器有限公司； 7 9 一l 磁力加热搅拌器：常州国华电器有限公司； 取液器：北京青云航空仪表有限公司； 干燥箱：天津市中环实验电炉有限公司： 电子恒温水浴锅：北京市光明医疗仪器厂： 组织捣碎机：上海市精利实业有限公司： k d 浓缩器：涿州市玻璃仪器厂； 气相色谱：g c - 1 _ 7 a ，日本岛津公司； 另外，还有杜氏小管、无菌过滤器、酒精蒸馏设备、酒精比重计、发酵罐、电子 天平、手持折光仪、血球计数板、目镜测微尺、镜台测微尺等。 2 2 方法 2 2 。1 酵母菌的分离 ( 1 ) 酵母菌分离源的采集：2 0 0 2 年9 月至1 2 月份，分别从市售的鸭梨、葡萄、大 枣、猕猴桃、苹果等水果的果皮及果肉中采样t 并分离。 ( 2 ) 菌种的分离方法 采用富集培养法，以灭菌麦芽汁为富集培养基( 含有4 7 的酒精) ，2 5 恒温培 堕型塑壁墨堕塑垄! ! 婴窒 养3 天后，在麦芽汁琼脂培养基上用稀释平板法进行分离，待长出菌落后，选择具有 典型酵母菌特征的单个菌落迸步划线分离2 3 次，经镜检为纯种后分别移植单个 菌落于豆芽汁琼脂斜面上保存待用。为了保持酵母活性，每隔两个月转接一次。 2 2 2 酵母菌的筛选 ( 1 ) 酵母菌一级筛 筛选方法：杜氏小管发酵法： 筛选指标：在规定时间内产气泡的大小： 菌株活化：2 5 ( 2 下于折光为8 的麦芽汁振荡培养l o 小时； 发酵：2 5 。c 在5 m l 折光为1 3 的麦芽汁中发酵4 8 小时： 接种量：1 1 0 7 c e l i m l ： 试验重复三次。 ( 2 ) 酵母菌二级筛 筛选方法：鸭梨汁发酵法； 筛选指标：产酒精度的大小，酒的风味； 菌株活化：2 5 。c 下于折光为8 的麦芽汁中振荡培养l o 小时： 发酵：2 5 下于折光为1 3 的鸭梨汁中发酵j 天； 接种量：l l o e c e l l m l ： 试验重复三次。 ( 3 ) 酵母菌三级筛 筛选方法：杜氏小管法； 筛选指标：耐乙醇性能、耐二氧化硫性能、耐酸性能； 筛选方法：将酵母菌分别接入含不同乙醇浓度梯度( 1 0 1 5 ) 、不同二氧化 硫浓度梯度( 1 0 0 5 0 0m l ) 、不同p h 值( 0 9 8 ，l5 0 ，2 0 4 ，2 7 2 ，4 0 3 ) 折光为5 的鸭梨汁，2 5 ，培养周，观察杜氏管中气泡情况。 3 6 , 6 4 接种量：1 l o r c e l l m l ； 试验重复三次。 ( 4 ) 酵母菌四级筛 筛选方法：试管发酵，嗅觉判断其产酯香； 筛选指标：测定酵母菌的产酯性能： 筛选方法：用1 0 的麦芽汁配成5 ( g m l ) 的葡萄糖溶液，接入新培养的酵母菌， 2 8 。c ，培养3 5 天。打开试管塞，轻轻摇动试管，用嗅觉判断是否有酯类香气。 接种量：l 1 0 7 c e l l m l ； 试验重复三次。 2 2 3 酵母菌的鉴定 酵母鉴定方法参考t h ey e a s t ：a t a x o n o m i cs t u d y ) ) ( 第三版) f 6 2 】。 问北农业大学硕士学位论文 ( 1 ) 形态与培养特征：将菌种接种到麦芽汁液体培养基中，2 8 。c ，培养3 7 天，观察 是否发酵、培养液的清浊情况、是否形成环或岛、沉淀量多少以及松紧状况，并用水 浸法制片于显微镜下观察，以目镜测微尺和镜台测微尺测其营养细胞的大小。将酵母 在豆芽汁琼脂培养基平板上划线，2 8 。c ，培养3 4 天，观察其菌落形态。 ( 2 ) 酵母假菌丝的观察 将已活化好的酵母划线于玉米粉琼脂培养基平板上，每个平板划2 3 条，在菌线 上盖以无菌盖玻片，2 8 培养5 1 0 天。镜检是否有假菌丝。 ( 3 ) 酵母菌子囊孢子的观察：在接种到生孢培养基之前，菌株在麦芽汁培养基上， 2 5 。c 重新培养l 2 天，进行活化。将已活化好的酵母在产孢子培养基斜面上划线， 2 5 培养3 天，镜检是否有子囊孢子。如未见孢子需继续培养，保持4 6 周，每周 再检查是否出现子囊孢子。注意观察子囊形成前是否有接台现象子囊与子囊孢子的 形状，每一子囊内孢子的数目，孢子是否有颜色。 ( 4 ) 生理生化试验 进行生理生化试验的目的是将两株自选酵母鉴定到种，这些生理生化试验包括以 下的发酵糖类试验、同化碳源试验、同化氮源( 硝酸钾、乙胺、尸胺) 试验、生成类 淀粉化合物试验、无维生素生长测试、在5 0 ( w w ) 葡萄糖酵母膏中生长测试和在 1 0 0 0 m g l 放线菌酮抗性试验六大方面，其具体操作方法与步骤如下： a 发酵糖类试验：鉴定所需发酵碳源为葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖和蔗糖。 将上述糖分别加入到含有杜氏发酵管的生理生化培养基中，使之含量达到 5 0 m m o l 几，经过滤( 0 2 0 p m ) 除菌。酵母菌经活化后分别接入到上述培养基中，2 5 的条件下培养2 4 周后观察，以杜试小管中有气泡计为阳性，无气泡为阴性。试验 重复三次。 b 同化碳源试验：鉴定所需同化物质共十八种，为半乳糖、棉籽糖、赤藓糖醇、 蔗耱、可溶性淀粉、核糖醇、麦芽糖、d 一木糖、d 一甘露糖醇、纤维二糖、l 阿拉伯糖、 琥珀酸、海藻糖、d 一核糖、柠檬酸、乳糖、l 一鼠李糖和肌醇。 将上述糖分别加入到生理生化培养基中，使之含量达到5 0 m m o l ，经过滤 ( 0 2 0 帅) 除菌。酵母菌经活化后分别接入到上述培养基中，2 54 c 条件下培养2 4 周后观察，以试管中出现混浊计为阳性，否则计为阴性，第一次观察为阴性的试管， 为了防止出现假阳性，需要再转接一次。重复三次，以不加糖的培养基为对照。 结果观察标准：将已培养数天的试管于混合振荡器上摇动，使内容物充分混匀。 在一张白色卡片上画一条约3 4 m m 宽的线，将卡片紧靠试管，直对自然光观察，如果 管中溶液的混浊度完全将线掩盖，记此结果为+ + + ；如果透过试管中溶液仅能看到不 连续的线段，则记为+ + ；如果能看到不连续线段的清晰边缘，则记为+ ；如果溶液非 常澄清，记为一，即说明未有酵母生长。 c 同化硝酸钾、乙腹、尸胺试验：该试验主要考察酵母菌在分别以硝酸钾、乙 胺和尸胺为唯一氮源时的生长情况，向同化碳源培养基中加入硝酸钾，加入量为 0 0 7 b ( w w ) ，1 1 5 灭菌2 0 分钟。向同化碳源培养基中加入乙胺( 尸胺) ，加入量为 鸭梨酒酵母菌的选种研究 乙膝0 0 6 4 ( w w ) ，尸胺0 0 6 8 ( w w ) ，过滤( o 2 0 ) 除菌，接种已活化好的酵母， 于2 5 c 培养l 周。试验重复三次，以不加硝酸钾、乙胺和尸胺的培养基做为对照。 结果观察标准同碳源同化测试。 d 生成类淀粉化合物试验： 将培养基倒平板( 平板厚度约为培养皿高度的三分 之一) ，接种已活化好的酵母，于2 8 c 培养l 一2 周后，在平板长菌处周围滴加刘格 氏碘液，凡能产生类淀粉化合物的酵母会在菌落周围呈现蓝色。 e 无维生素生长测试：培养基经过滤( 0 2 0 1 j m ) 除菌，无菌操作接种已活化好 的酵母菌，2 5 培养7 天后观察。为避免由于接种而混入的微量维生素而引起的误差， 可将已培养7 天的初始培养液作为酵母的活化液，取少量接种到另一无维生素培养基 试管中，经2 5 培养7 天后观察结果。结果观察标准如碳源同化测试，如果试管中 溶液呈现+ + + ，则说明该酵母具有合成生长所需的维生素的能力；若为+ + 或+ ，则说 明无此能力。 f 在5 0 ( w w ) 葡萄糖一酵母膏中生长测试：将5 0 9 葡萄糖溶于5 0m l 含有0 l 酵母膏的水中，然后加入3 ( w v ) 琼脂，溶解后分装试管，每管5 m l ，1 1 5 灭菌1 0 分钟，取出做斜面( 注意：灭菌过度将会导致培养基褐变，灭菌后已褐变的培养基不 易再用) 。将已活化好的酵母在上述培养基斜面上划线，经2 5 c 培养5 天后观察有无 生长现象。为防止培养期间由于水分蒸发而导致培养基的渗透压进一步加大，可用不 透气的塑料纸将试管密封。 g 1 0 0 0 m g l 放线酮抗性测试：溶解1 9 放线酮于2 5 m l 丙酮中，向丙酮溶液中 加入6 7 9 氮源基础培养基( 见附表1 ) ，再加入含1 0 9 葡萄糖的蒸馏水，充分混匀 后过滤( 0 2 0 1 1 m ) 除菌，该溶液含放线酮1 0 ，0 0 0 m g l 。取上述溶液0 5m l 加入到含 4 5 m l 蒸馏水( 以高压灭菌) 的试管中，为含1 0 0 0 m g l 放线酮的培养基。向培养基 中接种已活化好的酵母，于2 54 c 培养3 周。结果观察标准同碳源同化测试。 表示阳性，生长较快； 表示阳性，生长较慢； 表示阴性，但有少量生长 表示阴性，没有生长。 2 2 4 自选酵母发酵性能的测试和鸭梨酒酿造工艺的确定 鸭梨酒酿造工艺流程：鸭梨一去杂一清洗一破醉一榨汁一调整成 分一接种酵母一发酵陈酿一装瓶一杀菌一成品 ( 1 ) 不同温度条件下自选酵母的发酵性能测试( 以安琪活性干酵母为对照) 将筛选出来的酵母菌株分别于2 0 4 c 、2 5 。c 、3 0 三个温度下进行鸭梨酒发酵， 同时以安琪活性干酵母为对照菌株，重复三次。 菌种活化：自选酵母先在盛有5 m l 折光为8 的麦芽汁的试管中2 5 c 振荡培养1 0 ) 一 + 坞 一 一一 塑j ! 查些奎兰堡主兰壁堡茎 小时，然后转入盛有折光为1 0 鸭梨汁的三角瓶中继续扩大培养l o 小时： 活性于酵母的活化：3 5 - 4 0 c 的温水，加入5 的蔗糖，加入l o 的干酵母，小心 混匀，静置使其复水、活化，每隔1 0 分钟轻轻搅拌一次，经2 0 3 0 分钟【6 5 “6 】，接入 斜面，待用。进行发酵试验时再进行活化，活化方法与自选酵母活化方法相同。 接种量：1 1 0 7 c e l l m l 。 鸭梨汁糖的调整：加蔗糖调总糖含量为1 3 0 9 l 。 二氧化硫的含量：为了使二氧化硫起到防止鸭梨汁褐变和抑菌的双重作用，在本 试验中二氧化硫的添加量要求达5 0 m g l ，即添加l o o m g l 的偏重亚硫酸钾，先将其 溶解后再加入鸭梨汁中。 测试项目有起酵时间、酵母数、含糖量、含酒精量、折光和p h 值。具体操作方 法是从接种开始，每隔l 小时观察一次，看是否有气泡产生，以此来判断起酵时间； 每隔2 4 小时用血球计数板测定发酵液中的酵母数，并以此来绘制酵母菌生长曲线； 与此同时用酒精计测定其酒精度，用p h 计测定其p h 值。 ( 2 ) 不同二氧化硫浓度条件下自选酵母的发酵性能测试 鉴于二氧化硫具有的杀菌作用、澄清作用、抗氧化作用、溶解作用、增酸作用， 选用二氧化硫作为鸭梨酒酿造的抑菌剂和增酸剂f 6 ”。由于果酒中二氧化硫的添加量 一般要求在5 0 1 0 0 m g l ，将筛选出来的酵母菌分别在5 0 m g l 、t o o m g l 、1 5 0 m g l 三个二氧化硫浓度梯度条件下进行鸭梨酒的发酵，发酵温度为2 5 。其中酵母活化、 接种量等同( t ) 。试验重复三次。 ( 3 ) 酵母菌耐糖性能的测试 用p d 营养液配制含蔗糖浓度为2 0 g m l 9 0 g m l 的发酵液，分装于三角瓶中， 每个三角瓶装2 0 0 m l ，接种已活化好的酵母菌，2 5 培养一周。观察并记录每个三角 瓶的起酵时间、产生气泡情况，并镜检酵母菌的生长情况，并测定发酵结束( 泡沫不 再增加) 时的酒精度。接种量为1 1 0 7 c e l l m l 。试验重复三次。 ( 4 ) 自选酵母酿造鸭梨酒的工艺确定 根据文献 3 6 的报道，生香酵母发酵的适宜温度在2 0 c 3 0 c 的范围内，其中来 源于中科院微生物所的2 11 8 2 酵母最佳温度最高，达3 5 。c ；生香酵母发酵的最佳 p h 值大致在3 5 4 5 ，其中以2 1 1 8 2 酵母的最低，达2 5 ，为了不影响果酒的风味， 加菌量一般控制在1 0 6 1 07 c e l l m l 。所以在本试验中，温度( a ) 设2 0 、2 5 。c 、3 0 三个水平；为了缩短发酵周期，加菌浓度( b ) 控制在1 0 7 c e l l m l 的水平，设 1x 1 0 7 c e t l m l 、3 1 0 7 c e l l m l 、5 x 1 0 7 c e l l m l 三个水平，初始p h 值( c ) 设3 、4 、5 三个水平。试验用l 9 ( 3 ) 4 正交表安排设计并进行发酵试验，以期寻找酿造鸭梨酒的 适宜酿造工艺条件。发酵结束后，经过一个月左右陈酿后，请1 0 名评审员对所酿制 的鸭梨酒进行感官评定。试验因子水平对照表见表2 ，l 9 ( 3 ) 4 试验方案见表3 。 2 2 5 鸭梨酒的感官评定 ( 1 分析型感官评定 在本试验中，分析型感官评定主要用于鸭梨酒适宜酿造工艺的确定，选9 名评审 员，( 来自不同的消费群体) 对两自选酵母菌酿造的鸭梨酒进行感官评定。评审员的 培训及实验室要求参考g b t 1 3 8 3 8 和g b t 1 4 1 9 5 螗1 ，评定项目有色、透明、香、味、 风味，评分标准参考葡萄酒和果酒评分标准，见表4 。 表4 葡萄酒和枭酒评分标准表 t a m s t a n d a r d so fa p p r a is a lo nw l n e 河北农业大学硕士学位论文 ( 2 ) 嗜好型感官评定 选取l o 名评审员，按顺序法( r a n k i n gm e t i l o d ) h 9 】对上述鸭梨酒进行嗜好型感官 评定。按以下样式的问答卷，对4 个样品评价并写出自己喜欢的顺序。试验代号采用 随机的两位数字，供试条件相同。为了消除品尝顺序带来的影响，品尝时采用随机摆 放的方法。 2 2 6 鸭梨酒香气成分的测定f 5 7 9 09 采用气相色谱法对果酒中常见的四种酯( 甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸异戊酯和己 酸乙酯) 和甲醇进行测定。 ( 1 ) 鸭梨酒样品处理 取鸭梨酒5 0 0 m l 置于分液漏斗中，用2 0 0 m l 二氯甲烷萃取剂分l o 次萃取，合并 萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜，用k d 浓缩器在低于4 0 。c 的条件下浓缩为l m l 。 ( 2 ) 分析仪器 色谱仪：g c 一1 7 a 气相色谱仪 色谱柱：c p w a x5 7 c b ( 5 0 o 2 5 u r n ) 检测器：f i d ( 3 ) 分析条件 进样口：2 0 0 。c 检测器：2 0 0 柱温：采用程序升温至4 0 。c ，保持1 分钟，然后以4 分钟的速度升至1 8 0 。0 ， 保持1 分钟。 载气： 分流比：l ：5 0 进样量：2 p , l 2 2 7 其它理化指标的测定 ( 1 ) 残留二氧化硫的测定：参考g b t 1 5 0 3 8 1 9 9 4 删： ( 2 ) 总糖、总酸、挥发酸、还原糖等指标的测定参考 8 9 】。 鸭梨酒酵母菌的选种研究 3 1 酵母菌的分离 3 结果与分析 2 0 0 2 年9 月至1 2 月，从市售的鸭梨、葡萄、大枣、猕猴桃、苹果等水果的果实 及果皮中共分离得到酵母菌1 9 5 株。分离酵母结果见表5 。 表5 酵母菌分离结果 t a b 5r e s u i t so fs e l e c t in gy e a s t s 纾离时间来源形状分离培养萃 蘑落颜色及气味生殖特征菌株编弓 9 t o鸭梨椭网形豆芽汁琼脂乳白色略有酯香两端出芽 i 6 0 9 2 5葡萄椭瞬形豆芽汁琼脂乳白也略柯陵味 多边小芽 6 i 1 0 i 1 0 l 2人枣网形豆芽汁琼脂臼也，略有酒味 两瑞芽 1 0 2 1 3 2 1 12 l猕猴桃椭网形豆芽汁琼脂 乳 j 也略干1 酯香两端i j 芽 i3 3 一，16 1 1 ：! 羔墨塑旦整戛芝过堡堕 塾望垒：堕立翌喳堕鎏当茎 竖之上翌一 3 2 酵母菌的筛选 为了得到适宜鸭梨酒酿造的优良酵母菌种，对分离得到的1 9 5 株酵母菌根据不同 标准进行四个级别的筛选。 3 2 1 酵母菌一级筛 杜氏小管产气情况见表6 。 表6 杜氏小管产气情况 坠! ：! ! ! ：! ! 里型业墅里一 发酵时问，l 、时 产气堕翌兰堡竺 苎竺竺望! ：! ：翌兰! 竺兰 望竺竺 一 _ - _ 一 +6 5 8 +0 +2 o 8 + 一三一 _ _ - 一。 注“+ ”表示产气小到牡氏小管体积的i 3 ； + + ”丧小产气硝i 到杜氏小鬯体积的1 1 2 ； “+ + + ”裹h ；产气接 近或己达到杜氏小管体积。 由上表可以看出，酵母菌在含有杜氏小管的试管中，2 5 。c ，发酵4 8 小时，能产 河北农业大学硕士学位论文 气达到杜氏小管体积的一半或一半以上的酵母菌有1 8 株，打开棉塞摇动试管能嗅到 淡淡的酒香，晚明这些菌株能在厌氧条件下能较快地起酵并产生酒精和二氧化碳，因 此将此1 8 株菌进行下一步的筛选。 3 2 ，2 酵母菌二级筛 ：缛一级筛得到的1 8 株菌在盛有2 0 0 m l 折光为1 3 的鸭梨汁的三角瓶中，2 5 。c ， 发酵5 天，测其酒精度，并进行感官评定。其中酒精度大于7 ( v ) 的酵母菌有6 株，酒精度在6 7 的酵母菌有6 株，在5 一6 的酵母菌有4 株，其余2 株酵母菌 的酒精度均小于5 ，也就是院酒精得率大于j 的酵母菌有1 6 株，对这1 6 株菌所酿 造的鸭梨酒的感官评定结果可以概括为：酒香浓郁，基本上能保持鸭梨果实原有的果 香，典型性较好。 3 2 3 酵母菌三级筛 上述1 6 株菌在不同浓度的乙醇、二氧化硫、p h 值的鸭梨汁中产气情况见表7 9 。 表7 酵母菌在不同浓度乙醇中的产气情况 t a b 7r e s u i t so fp r o d u c in gg a s ind i f f e r e n ta i