（农产品加工及贮藏工程专业论文）梭子蟹壳色素的提取、纯化及其稳定性的研究.pdf

梭子蟹壳色素的提取、纯化及其稳定性的研究 摘要 随着医学毒理学和生物学研究的不断深入，安全的且具有一定生理功能的 天然食用色素不断受到人们的青睐。从梭子蟹壳中提取出天然色素，不但能为 食用天然色素增添新的品种，还对梭子蟹壳的综合开发利用具有积极的意义。 本文对梭子蟹壳色素的提取、纯化及其稳定性进行了研究。优化了回流提 取和微波辅助提取蟹壳色素粗产品的工艺条件；确定了蟹壳色素粗产品的皂化 条件，利用硅胶柱层析对粗提色素进行分离纯化；研究了光照、温度等因素对 蟹壳色素稳定性的影响。实验结果如下： ( 1 ) 通过单因素和正交实验，确定了回流提取和微波辅助提取梭子蟹壳色 素的最佳提取工艺。回流提取的最佳工艺为：物料粒度8 0 目，乙醇浓度6 0 ， 液料比1 0 ：1 ( m l g ) ，提取温度7 0 ，提取时间1 0 5 m i n ，提取次数1 次。此时 色素得率为1 0 2 8 ，色价1 3 1 。微波辅助提取的最佳工艺为：物料粒度8 0 目， 乙醇浓度5 0 ，液料比1 5 ：1 ( m l g ) ，微波功率3 0 0 w ，提取时间1 4 0 s ，提取次 数1 次。此条件下产品得率为1 5 9 7 ，色价7 9 。与回流提取相比，微波辅助 提取法耗时短，色素提取量高，但色素色价略低。 ( 2 ) 梭子蟹壳色素粗产品的最佳皂化条件为：皂化温度3 0 、皂化时间 4 0m ir l 、粗色素油浓度1 0 m g m l ，碱浓度1 5 m o l l 。硅胶柱层析采用梯度洗脱， 洗脱剂选择为丙酮：环已烷：石油醚混合溶剂，其比例( v v ) 依次为3 ：2 0 ：4 ( 5 4 m 1 ) 、3 ：1 5 ：4 ( 6 6 m 1 ) 、3 ：1 2 ：5 ( 6 0 m 1 ) 、3 ：1 0 ：6 ( 5 7 m 1 ) 。收集液真空浓缩 后得到的蟹壳色素为红色，得率为3 7 1 ，色价4 8 。 ( 3 ) 梭子蟹壳色素在低于7 5 、避光或自然光以及酸性条件下比较稳定； 在氧化还原剂中以及紫外光照射下色素降解；碱性条件、蔗糖及k 十、n a 十对色 素有增色效果，f e ”、c u 2 + 使其变色，c a 2 + 、m 9 2 + 、a 1 3 + 、z n 2 + 及柠檬酸、山梨 酸钾对色素几乎无影响；高浓度v c 使色素产生沉淀。 关键词：梭子蟹壳色素提取纯化硅胶柱层析 稳定性 s t u d yo ne x t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o na n ds t a b i l i t yo f p i g m e n tf r o mp o r t u n i dca r a p a c e a b s t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to fm e d i c a lt o x i c o l o g ya n db i o l o g y , p e o p l ep r e f e rt h e n a t u r a le d i b l ep i g m e n to ft h es a f ea n dp h y s i o l o g yf u n c t i o n t h ep i g m e n te x t r a c t s f r o mp o r t u n i dc a r a p a c ei san a t u r a lp i g m e n t ，w h i c hc a ni n c r e a s et h ek i n d so f n a t u r a lp i g m e n t ，b u ta l s oh a sp o s i t i v es i g n i f i c a n c ef o rc o m p r e h e n s i v ee x p l o i t a t i o n a n du t i l i z a t i o no f p o r t u n i dc a r a p a c e t h ep a p e rs t u d i e dt h ee x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o nt e c h n i c s ，t h es t a b i l i t yo ft h e p i g m e n tf r o mp o r t u n i dc a r a p a c e t h ec o n d i t i o no fc o n v e n t i o n a ls o l v e n t se x t r a c t i o n ， m i c r o w a v e a s s i s t e de x t r a c t i o nf o r e x t r a c t i n gc r u d ep i g m e n tw a so p t i m i z e d ；t h e s a p o n i f i c a t i o nc o n d i t i o no fc r u d ep i g m e n tw a sc o n f i r m e d ；t h ec r u d ee x t r a c t sw a s s e p a r a t e da n dp u r i f i e db ys i l i c ag e l ；t h ec o m m o ne f f e c t s ，s u c ha sl i g h t 、t e m p e r a t u r e a n ds oo n ，o nt h es t a b i l i t yo ft h ep o r t u n i dp i g m e n tw a ss t u d i e d t h er e s u l t sw e r ea s f o l l o w i n g ： ( 1 ) t h eo p t i m u me x t r a c t i n g c o n d i t i o n sf o r s o l v e n te x t r a c t i o na n d m i c r o w a v e a s s i s t e de x t r a c t i o no fp i g m e n ti np o r t u n i dc a r a p a c ew e r es t u d i e db y s i n g l ef a c t o ra n a l y s i sa n do r t h o g o n a lt e s t t h eo p t i ma lc o n d i t i o n so fc o n v e n t i o n a l s o l v e n t se x t r a c t i o nw e r ea sf o l l o w ：m a t e r i a ls i z e s ，8 0m e s h ；e t h a n o lc o n c e n t r a t i o n ， 6 0 ；r a t i oo fl i q u i dt om a t e r i a l ，10 ：1 ( m l g ) ；e x t r a c t i o nt e m p e r a t u r e ，7 0 。c ；e x t r a c t i o n t i m e ，10 5 r a i n ；e x t r a c t i o nt i m e ，1t i m e a tt h i sc o n d i t i o n ，t h ey i e l do fp i g m e n tw a s 1 0 2 8 ，c o l o rs c a l ew a s1 3 1 t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fm i c r o w a v e 。a s s i s t e d e x t r a c t i o nw e r ea sf o l l o w ：m a t e r i a ls i z e s ，8 0m e s h ；e t h a n o lc o n c e n t r a t i o n ，5 0 ： r a t i oo fl i q u i dt om a t e r i a l ，15 ：1 ( m l g ) ；m i c r o w a v eo u t p u tp o w e r , 3 0 0 w ；e x t r a c t i o n t i m e ，14 0 s ；e x t r a c t i o nt i m e ，1t i m e a tt h i sc o n d i t i o n ，t h ey i e l do fp i g m e n tw a s 15 9 7 ，c o l o rs c a l ew a s7 9 c o m p a r e dw i t hc o n v e n t i o n a ls o l v e n te x t r a c t i o n ，t h e m i c r o w a v e a s s i s t e dw a sr a p i da n dq u a l i t a t i v e l ye x t r a c t i o n ，b u tt h ec o l o rs c a l ew a s l o w e r ( 2 ) t h eo p t i m a ls a p o n i f i c a t i o nc o n d i t i o n so fc r u d ep i g m e n tw e r ep e r f o r m e da s ： s a p o n i f i c a t i o nt e m p e r a t u r e3 0 。c ；s a p o n i f i c a t i o nt i m e ，4 0m i n ；t h ec o n c e n t r a t i o no f c r u d ep i g m e n to i l ，10 m g m l ；t h ec o n c e n t r a t i o no fk o h ，1 5 m o l l t h ec r u d e e x t r a c t sa f t e rs a p o n i f i c a t i o nw a ss e p a r a t e da n dp u r i f i e d b ys i l i c ag e l ，e l u t e d f r a c t i o n a l l yb ya c e t o n e h e x a h y d r o b e n z e n e p e t r o l e u ml e v e ，t h ep r o p o r t i o n ( v v ) w a s ：3 ：2 0 ：4 ( 5 4 m 1 ) 、3 ：1 5 ：4 ( 6 6 m 1 ) 、3 ：1 2 ：5 ( 6 0 m 1 ) 、3 ：1 0 ：6 ( 5 7 m 1 ) t h e r e dc o l l e c t i o ns e p a r a t e db ys i l i c ag e lw a sc o n d e n s e da tv a c u u mc o n d i t i o na n dt h e y i e l do fp i g m e n tw a s3 71 c o l o rs c a l ew a s4 8 ( 3 ) t h ep i g m e n tr e s i s t a n tt oh e a tu n d e r7 5 ，d a r k ，s u n l i g h ta n da c i d ；i n o x i d a n t r e d u c t a n t ，a n du n d e ru vl i g h t ，t h ep i g m e n tc a nd e c o m p o s e ；i n c o n d i t i o n o fa l k a l i c a n es u g a ra n dm e t a li o n ，s u c ha sk + 、n a + c a na d di t sc o l o r ；f e 3 + 、c u 2 + c a nc h a n g ei t sc o l o r ；c a 2 + 、m 9 2 + 、a 1 3 + 、 z n 2 + a n dc o m m o nf o o da d d i t i v e s ，s u c h a sc i t r i ca c i d p o t a s s i u ms o r b a t ec a nn o tb a d l ya f f e c ti ta ta l l ；h i g hc o n c e n t r a t i o no f v cc a nm a k et h ep i g m e n tt op r o d u c ep r e c i p i t a t i o n k e yw o r d s ：p o r t u n i dc a r a p a c e ；p i g m e n t ；e x t r a c t i o n ；p u r i f i c a t i o n ；s i l i c a g e l ； s t a b i l i t y 插图清单 图2 1 蟹壳色素吸收光谱图1 5 图2 2 不同提取剂对提取效果的影响1 6 图2 3 物料粒度对提取效果的影响1 6 图2 4 乙醇浓度对提取效果的影响1 7 图2 5 液料比对提取效果的影响1 8 图2 - 6 提取温度对提取效果的影响1 8 图2 7 提取时间对提取效果的影响1 9 图3 1 不同提取剂对提取效果的影响2 5 图3 2 不同粒度对提取效果的影响2 5 图3 3 乙醇浓度对提取效果的影响2 6 图3 。4 液料比对提取效果的影响2 7 图3 5 微波功率对提取效果的影响2 7 图3 - 6 提取时间对提取效果的影响2 8 图4 1 皂化时间对皂化效果的影响3 5 图4 2 碱浓度对皂化效果的影响3 5 图5 1 光照对蟹壳色素稳定性的影响4 0 图5 2 温度对蟹壳色素稳定性的影响4 1 图5 3 温度对蟹壳色素稳定性的影响4 1 图5 4n a + 、k + 、c a 2 + 、m 9 2 + 对蟹壳色素稳定性的影响4 2 图5 5z n 2 + 、c u 2 + 、f e 3 + 、a 1 3 + 对蟹壳色素稳定性的影响4 2 图5 - 6n a 2 s 0 3 对蟹壳色素稳定性的影响4 3 图5 7h 2 0 2 对蟹壳色素稳定性的影响4 3 图5 8v c 对蟹壳色素稳定性的影响4 4 图5 - 9山梨酸钾对蟹壳色素稳定性的影响4 4 图5 1 0柠檬酸、蔗糖对蟹壳色素稳定性的影响4 5 表格清单 正交实验因素水平表l 1 6 ( 4 5 ) 2 0 正交实验结果2 0 提取次数对提取效果的影响2 1 正交实验因素水平表l 9 ( 3 4 ) 2 9 正交实验结果2 9 正交实验方差分析表2 9 提取次数对提取效果的影响3 0 回流提取与微波辅助提取方法比较3 0 不同溶剂薄层层析结果3 6 p h 值对蟹壳色素稳定性的影响4 2 d 之o 0 乞o 4 巧o 0 2 2 2 3 3 3 3 3 4 5 表表表表表表表表表表 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标志和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得 金日里王些叁堂 或其他教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文作者签字：王札确签字日期：刁年2 月1 , 0 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 金妲王些太堂 有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅或借阅。本人 授权 金筵工业太堂 可以将学位论文的全部或部分论文内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文者签名：王也俩 签字日期：o 弓年) ，月 v o 日 l 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 签字日期： 电话： 邮编： 致谢 本论文是在我的导师王泽南教授的悉心指导和严格要求下完成的，从论文 选题、实验设计、实验实施直至最后的论文撰写，无不凝聚着王老师的心血和 汗水。王老师广博的知识、敏锐的洞察力严谨的治学态度、宽广的心胸及其 睿智的人格魅力对我的科研和生活都给予了潜移默化的帮助和影响。三年求学， 余秋雨先生的一本书的名字最能恰当体现老师对我的影响借我一生。在此， 谨向恩师致以最诚挚的敬意和不尽的感激! 论文完成过程中，得到了陈从贵教授、魏兆军教授、王武副教授、余顺火 老师、孙汉巨老师、马道荣老师、杨雪飞老师、韩卓老师、陈小燕老师、张建 国老师多方面的指导和帮助。另外，师兄师姐任苏玲、张全军、赵平，师弟师 妹张秋子、幺玲玲、郭俊珍、范建风、李洪波，以及同学陶学明、卢进峰、姜 震、张秀喜、郝洁、张冰慧、许胜、何青云等人在我的实验和生活中都给予了 无私的帮助，在此表示衷心的感谢! 感激我的母亲、家人及男友对我始终如一的呵护和支持! 三年的研究生学习生活中，我感恩身处良好的实验氛围，感恩相处亲如家 人的老师同学，感恩共处和谐的寝室姐妹! 值此论文即将完成之际，再次向所有帮助、关心和支持我的家人及师友表 示最诚挚的谢意! 作者：王晓倩 2 0 0 9 年2 月 第一章前言 1 1 天然色素概述 颜色是食品感官评价的重要指标之一，色泽优良的食品不仅给人以美的享 受，而且可以增加食欲【1 2 1 。天然食品一般都具有绚丽的色泽，然而在加工、 运输、贮藏的过程中常会因为光照、温度等原因使其褪色，甚至变色，不仅品 相变差，甚至会让人误以为食品变质。因此，为改善食品的感官品质，保持食 品良好的色泽，就不可避免的要添加食用色素来提高其商品性【3 j 。 在食品中添加色素的历史最早可以追溯到古代埃及，大约在公元前l5 0 0 年， 当地的糖果制造商就利用天然提取物和葡萄酒来改善糖果的色泽【4 】。在我国， 天然色素的应用也有悠久的历史，古代人民将其作为纺织、米饭、酿酒、化妆 品等的染料，公元前2 2 1 年以前的东周时期就有“茜栀千亩，亦比千乘之家 【5 j 之说。直到l9 5 6 年英国人w h p e r k i n s 合成出了世界上第一种人工色素一苯胺 紫，从那以后合成色素就一直用于改善食品色泽。合成色素是指用化学合成的 方法制得的色素，此类色素色泽鲜艳、着色力强、性质稳定且价格便宜。然而 到了2 0 世纪初，随着毒理学和生物学研究的不断深入，人们发现以前曾允许使 用的合成色素，多数种类对人体有不同程度的危害，除一般毒性外，还有致突 变与致癌作用 6 】。因此，天然色素以其安全、营养重新受到人们的青睐。天然 色素最终将取代合成色素已成为一种必然的发展趋势。 1 1 1 天然色素的分类 j 天然色素种类繁多，可根据其溶解性、化学结构、来源等分类： 按其溶解性不同可分为水溶性和脂溶性色素。 按其所含成分的化学结构分类，主要有：类胡萝卜素、花色苷类、黄酮类、 醌类、卟啉类、双酮类色素、多酚类色素、b 一花色苷、碳类色素等。 按天然色素的来源不同可分为【8 】：动物色素、植物色素、微生物色素和昔 色。动物色素包括：胭脂虫红( 寄生于仙人掌的雌胭脂虫的分泌物) 、紫胶红( 紫 胶虫在寄生植物上所分泌原紫胶中的一种色素成分) 、鱼鳞箔、虾壳色素、龙虾 红色素、蟹壳色素( 蟹壳中萃取出的色素) 等；植物色素包括：存在于植物的 根、茎、叶、果实、种子中的天然色素，包括番茄红素、辣椒色素、红米( 黑 米) 色素、甘草色素、栀子黄、辣椒红、辣椒橙、玫瑰茄红、花生衣红色素等； 微生物色素包括：红曲色素( 我国传统使用的天然色素，由接种在米上培养的 红曲霉制取) 等。昔色俗称焦糖，是将蔗糖、葡萄糖或麦芽糖浆在1 6 0 l8 0 高温下加热使之焦糖化，再用碱中和制成的红褐色或黑褐色膏状物或固体物。 1 1 2 天然色素的功能性质 天然色素来自天然材料，经过提取精制所得，与合成色素相比，有自身特 有的功能性质，现代科学研究己表明：天然色素中有的参与生理代谢，有的具 有抗菌、防治疾病的作用，是人类必须的维生素来源。 1 1 2 1 天然色素的特性 与合成食用色素相比，天然食用色素的优点有： ( 1 ) 绝大多数色素无副作用，安全性高； ( 2 ) 很多天然色素中含有人体必需的营养物质或是可转化为营养素的物质，如 1 3 一胡萝b 素可转化为v a ； ( 3 ) 某些天然色素具有药理作用，对有些疾病有预防治疗作用，如黄酮类色素 对心血管系统有防治作用； ( 4 ) 天然色素的色调比较自然，可更好的模仿天然食物的颜色。 天然色素具有诸多优点，但亦非完美无缺： ( 1 ) 稳定性较差，大部分对热、氧、光、p h 及金属离子等敏感，性质不如合 成色素稳定 9 - 10 1 。 ( 2 ) 天然色素种类繁多，性质复杂，就一种天然色素而言，应用时专用性较强， 使用局限性大，运用范围较窄。 ( 3 ) 溶解性差，溶解度较低，使用时不易混合均匀，有时会产生沉淀，不易调 色或着色】。 ( 4 ) 纯度较低，天然色素是从动植物等生物体中提取出的，常共存有其它成分， 纯化难度较大。 1 1 2 2 天然色素的生理功能 天然色素的成分复杂，结构多样，不仅具有绚烂多变的色彩，而且许多种 类还具有不同的生理作用。如1 3 一胡萝b 素、番茄红素、姜黄色素、红花黄色素、 虾青素等许多天然色素都具有抗氧化、清除自由基、抗肿瘤和保护心血管、免 疫抑制和脑保护等作用 1 2 - 1 7 】。除此之外，天然色素的粗制品中还可能含有氨基 酸、维生素和多糖类等具有一定营养价值的物质。 类胡萝卜素等天然色素有抗氧化作用是人们很早就己研究得知的，其中虾 青素更具有超级抗氧化性。天然虾青素具有特殊的分子结构，体外实验发现它 是单线态氧的强大淬灭剂，是一种极有效的抗氧化剂【l8 1 ，其抗氧化活性是维生 素e 的5 5 0 倍，是b 一胡萝b 素、玉米黄素、叶黄素和角黄素等类胡萝b 素的1 0 倍，被誉为“超级维生素e 、“超级抗氧化剂”【”1 。天然虾青素的生物活性主 要表现在：保护皮肤免受光损伤，预防动脉硬化和相关疾病，抗癌活性，增强 免疫系统功能，维护眼睛和中枢神经系统的健康，强化肌体的能量代谢，抗感 2 染活性等方面【2 0 2 6 1 。 1 1 3 天然色素的提取 天然色素的提取方法大致有溶剂萃取法、超声波提取法、微波辐助提取法、 酶法提取、生物技术生产天然色素等。 1 1 3 1 溶剂萃取法 溶剂萃取法是目前最常用的天然色素的提取方法。其基本原理是根据原料 中各种成分在不同溶剂中的溶解度不同，选用对色素成分溶解度大，对杂质成 分溶解度小的溶剂，将色素从原料中溶解出来的方法【2 7 】。这是一种固液萃取 过程，其提取过程包括三个步骤：首先是溶剂渗透到原料颗粒内部含有色素的 组织细胞内，色素被溶解，在细胞组织内形成胞内溶液；其次是胞内溶液通过 分子扩散或涡流扩散到原料的颗粒表面；最后是色素从原料颗粒表面接触的提 取液中向提取液主体扩散，当原料内、外溶液的浓度相等时( 实际很难达到) ， 扩散作用停止。如果放掉提取液，换入新的提取液，扩散作用重新开始，直到 建立新的平衡为止【2 引。常见的溶剂萃取法有浸渍、渗漉、煎煮、回流及连续回 流等，溶剂的选择要遵循3 点原则：溶剂对色素成分溶解度大，对杂质溶解 度小；溶剂不能与原料中的成分起化学变化；溶剂要经济、易得、使用安 全、易于回收等。除溶剂的选择外，影响萃取效果的因素还有：原料的粒度、 液料比、提取时间、提取温度等【2 。 溶剂萃取方法简单、设备要求不高，广泛应用于实验室与工厂。刘福州1 2 9 将新鲜蟹壳酸化后水洗至中性，用8 5 乙醇在加热回流状态下萃取出蟹壳红色 素，加入絮凝剂沉降过滤后，再用9 5 的乙醇进行二次色素萃取，低温浓缩干 燥得到深红色油膏状蟹红色素。肖伟敏【3o 】等采用乙醇加热回流法提取虾壳中的 红色素，实验结果表明：该提取工艺简单，用时较短，产率高，色泽鲜艳。张 捷莉 3 1 】等采用乙醇回流从板栗皮中提取出棕色素。张钟【3 2 】等采用0 0 5 m o l h c l 溶液浸提出黑糯玉米芯色素，并对其性质进行研究。 1 1 3 2 超声波提取法 这种方法目前在植物化学成分的提取中应用比较广泛，其原理是主要利用 超声的空化、搅拌等作用破坏植物细胞膜，使溶剂渗透到被提取物的细胞中， 以有助于有效成分的溶出与释放，再通过分离、提纯得到所需的成分【33 3 4 】。与 常规的提取方法相比，超声波提取具有提取速度快、时间短、收率高、无需加 热等优点【35 1 。目前，这种技术已在蛋白质、多糖、色素等物质的提取中得到应 用36 1 。如李山【3 7 1 等采用超声波协助提取花生壳中的黄色素。顾文秀等3 8 1 亦采 用此方法提取乌饭树叶色素。 1 1 3 3 微波辅助提取法 微波辅助提取( m i c r o w a v ea s s i s t e de x t r a c t i o n ，简称m a e ) ，也叫微波萃取 ( m i c r o w a v ee x t r a c t i o n ，简称m e ) ，是微波和传统的溶剂萃取法相结合后形成的 一种新型的提取方法。1 9 8 6 年，匈牙利学者g a n z l e r k 【”】首先报道了利用微波萃 取从土壤、种子、食品、饲料中分离各种类型化合物的样品制各新方法。不久， g a n z l e r k 又将微波萃取技术应用于提取植物细胞中的天然产物。p a r a 将此技术 细化、完善，并申请了专利。现已经有了作为分析、样品前处理( 微波萃取) 的商业化设备，世界两大微波设备公司，美国的c e m 公司和意大利的m i l e s t o n 公司均生产适用于消解、萃取和有机合成的系列微波产品。19 9 7 年以后，中国 开始对微波萃取技术在天然产物提取中的应用感兴趣。近十几年来，国内外越 来越多的人【4 m 4 4 】加入到此研究领域里来。 微波萃取的本质是微波对物料和溶剂的特殊加热作用，其加热机理不同于 常规加热，它不但能够穿透溶剂和物料使整个萃取体系均匀加热，快速升温， 而且其产生的热效应能使细胞壁破裂和使细胞膜中的酶失去活性，因此细胞中 的有效成分很容易突破细胞壁和细胞膜障碍而被提取出来，使萃取效率得到明 显提高【4 引。经研究表明，微波萃取法具有萃取时间短、溶剂用量少、萃取率高、 溶剂回收率高、成本低、投资少等优点【46 4 7 】，可克服传统提取方法的缺陷， 与超临界流体萃取、高速逆流液相色谱等技术相比，适合面更广，且设备投资 低，是目前国内外天然产物提取的研究热点【4 引。然而，任何一种技术都不是完 美无缺的，微波萃取技术亦然。目前，国内微波萃取研究的主要障碍在于设备， 几乎所有的研究者都是使用家用微波炉或改造后的家用微波炉作为微波发生和 萃取装置，只能间歇操作。 由于微波萃取是一种新方法，许多研究将其与索氏( s o x h l e t ) 萃取、搅拌 萃取、超声波萃取或超临界流体萃取等方法进行了比较 3 9 ，4 们。黎或等【5 0 】在微 波萃取虎杖色素的研究中，发现萃取时间从溶剂浸提法的2 4 h s u 索氏提取法的2 h 减小到3 0 0 s ，提取率分别从9 1 0 和7 3 5 增加到9 7 2 。陈翠莲等【5 1 】在萃取预 混合饲料中的维生素a 、d 和e 时，比较了磁力搅拌萃取、超声波萃取和微波萃取 3 种萃取方法，结果表明：虽然回收率均在9 0 一11 0 之间，但微波萃取的回收率 最好( 1 0 0 - 1 0 4 ) ，萃取时间最短，仅需5 m i n ；而磁力搅拌萃取需1 5 0 m i n ，超声 波萃取需6 0 m i n 王灵昭等 5 2 】采用微波法提取雨生红球藻中的虾青素，确定最佳 微波萃取工艺为萃取溶剂乙酸乙酯乙醇( 1 2 ，v v ) ，萃取时间4 5m in ，萃取功 率5 4 0 w ，液料比2 2 0 ：1 ，此条件下虾青素的提取率最佳，可达1 0 2 0 。 1 1 3 4 酶法提取 对于一些被细胞壁包围不易提取的原料可用酶法提取【53 1 。常用的有纤维素 酶( c e l l u l a s e ) 、果胶酶( e x o g e n o u sp e c t i ce n z y m e s ) 等，它们并非单一酶， 4 而是起协同作用多组分配系。纤维素酶处理植物可使细胞壁发生不同程度改变， 如软化、膨胀和崩溃等，有利于细胞内物质渗出，提高提取率，以及促进汁液 澄清的作用。而果胶酶能催化细胞壁和细胞膜中果胶分解，增加细胞破壁，促 进花色苷的溶出1 5 4 j 。如王振字等5 5 】采用纤维素酶法提取大花葵中的花色苷。 1 1 3 5 生物技术生产天然色素 从天然原料中提取天然色素，易受自然条件、原料的质量、产量和价格等 的影响，鉴于此，人们开始采用生物技术来生产天然色素。采用生化技术选取 含有色素的细胞，人工条件下进行培养、繁殖，可在短期培养出大量的色素细 胞，再用正常方法提取。这种方法不受自然条件限制，能在短期内生产大量的 色素1 5 引。目前报道过的采用此方法生产出的色素有胡萝卜素、叶黄素、黄酮体 等。 1 1 4 天然色素的纯化 粗制的天然色素一般成分复杂，其中仍含有胶质、淀粉、糖类、脂肪、有 机酸碱、无机盐、重金属离子等，甚至具有特殊的异味。这直接影响到天然色 素的稳定性和染色力，也是其未能得到推广、应用的主要原因之一。因此，天 然色素的纯化、精制是生产加工中的一个重要环节。天然色素纯化的方法主要 有：膜分离纯化法、大孔树脂纯化法、柱色谱法和超临界萃取纯化法等。 1 1 4 1 膜分离纯化法 膜分离纯化技术是根据分子量的差异，选择一定截留分子量的膜除去杂 质，富集有效部位或有效成分，从而使色素达到某种程度的纯化和高倍数浓缩。 国外已经使用超滤膜精制天然色素。我国亦有这方面的研究，如天津工业学院 用该法精制天然色素萝卜红，其产率和色价均得到了一定程度的提高。 1 1 4 2 大孔树脂纯化法 大孔树脂纯化法是目前研究较多的一种精制方法，是利用具有孔隙结构的 有机高聚物吸附剂的选择性吸附，将复杂天然产物分离富集的新技术。复杂的 混合物可根据吸附力及分子量大小的不同，被大孔树脂吸附，再经一定的溶剂 洗脱达到分离的目的。其分离纯化过程易于控制，并且树脂洗脱后可反复使用。 研究表明色素在经过树脂精制后，品质都有明显的改善【5 。7 1 ，有利于色素的进一 步加工和利用。如马银海等【5 8 】运用树脂吸附法提取水红木果色素，试验表明： h p d 一1 0 0 树脂对该色素的吸附效果较好，用8 0 乙醇洗脱，洗脱效果最佳，所 得色素产品质量好，而且h p d 一1 0 0 树脂使用2 0 次后吸附性能依然稳定。 1 1 4 3 柱色谱法 柱色谱( 柱层析) 常用的有吸附柱色谱、分配柱色素、凝胶过滤色谱、离 子交换色谱等。其中吸附柱色谱是利用混合物中的各组分对固体吸附剂( 固定 相) 的吸附能力不同而达到分离的层析方法。液固吸附色谱是运用较多的一种 方法，特别适用于很多中等分子量的样品的分离，尤其是脂溶性成分。吸附柱 色谱操作简便、处理样品量大且花费低廉【59 1 ，在实验室和工厂中的使用日益增 加。 吸附柱色谱的分离效果，主要决定于吸附剂、洗脱溶剂和被分离化合物的 性质这三个因素 2 1 7 1 。要根据被分离物质的性质，首先要考虑其极性，来选择合 适的吸附剂和洗脱溶剂。此外，还应正确选择柱尺寸和吸附剂用量。经验表明： 吸附剂的质量通常应是被分离样品质量的2 5 3 0 倍；所用色谱柱径高比( 直径 与高度之比) 应大于1 ：1 0 。但对于难分离的化合物，可能要使用高于样品量3 0 倍的吸附剂，柱径高比可能需要大于l ：2 0 。 吸附剂一般是具有较大的比表面积，在其表面有许多吸附中心的多孔物质， 吸附中心的多少及其吸附能力的强弱直接影响吸附剂的性能。常用的吸附剂有 硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等。其中，硅胶是使用较多 的主要固定相，它的主要优点是化学惰性，具有较大的吸附量。一般常用的硅 胶有1 0 0 4 0 0 目之间的多种规格可供选择。 层析过程中溶剂的选择对组分分离效果影响极大。柱层析时所用的溶剂习 惯上称洗脱剂，有单一溶剂或混合溶剂，用于薄层或纸层析时常称展开剂。分 离强极性成分，宜选用活性低的吸附剂，极性洗脱剂；分离极性弱的组分，宜 选用活性高的吸附剂，弱极性洗脱剂。单一溶剂的极性顺序为：石油醚 环己烷 - - 硫化碳 四氯化碳 三氯乙烷 苯 甲苯 - - 氯甲烷 氯仿 乙醚 乙酸乙酯 丙酮 正丁醇 乙醇 甲醇 吡啶 a d ，即液料 比 温度 乙醇浓度 提取时间；优方案为c l b 2 a 2 d 3 。而评价指标得率显示的优 方案为c 3 8 2 a 2 d 4 ，需进行验证试验。验证试验结果为：c 1 8 2 a 2 d 3 得率1 0 2 8 ， 优于c 3 8 2 a 2 d 4 的9 51 ，故确定最佳工艺条件为c 1 8 2 a 2 d 3 即液料比1 0 ：1 ，回 流温度7 0 ，乙醇溶液浓度6 0 ，提取时间1 0 5 m i n 。 最终得到的c l b 2 a 2 d 3 组产品颜色为红色，经测定计算，最优回流提取工 2 0 艺条件下的产品得率为10 2 8 ，色价为1 3 1 。 2 3 9 提取次数对提取效果的影响 表2 3提取次数对提取效果的影响 t a b 2 3e f f e c to fe x t r a c t i o nt i m e so ne x t r a c t i o ne f f i c i e n c y 在正交实验确定的最优工艺条件下进行提取次数对提取效果影响的实验。 提取次数对提取效果的影响见表2 3 。由表2 3 可见，多次提取的得率均只比1 次提取得率高出有限。从经济性考虑，确定提取次数为1 次。 2 4 本章小结 ( 1 ) 通过梭子蟹壳色素的吸收光谱图得到蟹壳色素的最大吸收波长为 4 1 6 n m 。 ( 2 ) 回流提取的最佳工艺条件为：物料粒度8 0 目，乙醇溶液浓度6 0 ， 液料比1 0 ：1 ，回流温度7 0 。c ，提取时间1 0 5 m i n ，提取次数1 次。此条件下梭 子蟹壳色素的得率为1o 。2 8 ，色价13 1 ，产品颜色为红色。 2 l 第三章微波辅助萃取法提取梭子蟹壳色素的工艺研究 利用微波辅助固液浸提是颇具发展潜力的一种新型的辅助提取技术【1 0 l 1 08 1 ，具有穿透力和选择性强、加热效率高等特点1 0 9 1 。采用微波技术萃取天然 色素，例如橘黄色素、玫瑰茄红色素、天仙果色素已取得一定的研究进展，但 目前尚未见到采用微波技术萃取梭子蟹壳色素的研究报道，因此本论文研究在 不同微波条件下萃取梭子蟹壳色素，并确定其最佳工艺参数。 3 1 实验材料及设备 3 1 1 实验材料 实验原料：梭子蟹壳( 汕头市侨丰集团有限公司提供) 主要试剂： 9 5 乙醇( a r )上海中试化工总公司 乙醚( a r )上海中试化工总公司 石油醚( a r )上海中试化工总公司 氯仿( a r )中国宿州化学试剂厂 二氯甲烷ta r )国药集团化学试剂有限公司 丙酮( a r )宜兴市展望化工试剂厂 蒸馏水( 实验室自制)合肥工业大学生物与食品学院提供 3 1 2 实验设备 n j l 0 7 - 3 实验用微波炉南京杰全仪器厂 7 2 1 分光光度计上海分析仪器厂 s h z - d ( i i i ) 真空旋转蒸发仪巩义英峪予华仪器厂 s h z 循环水式真空泵巩义市英峪予华仪器厂 t d l - 4 0 b 高速离心分离机上海安亭科学仪器厂 j y 6 0 1 电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司 d h g - 9 0 7 0 a 电热恒温鼓风干燥箱上海跃进医疗仪器厂 j y l - 3 5 0 粉碎机山东九阳小家电有限公司 酒精计冀州市耀华器械仪表厂 3 2 实验方法 3 2 1 工艺流程 梭子蟹壳一清洗一干燥一粉碎一微波辅助溶剂提取一抽滤一离心分离一浓 缩一真空干燥一色素浸膏 3 2 2 评价指标及检验方法 3 2 2 1 吸光度 方法同2 2 2 2 3 2 2 2 色价 方法同2 2 2 3 3 2 2 3 色素粗产品得率的计算方法 方法同2 2 2 4 3 2 3 实验方法设计 根据微波辅助萃取过程的理论知识，并结合考虑本研究的有关实验条件， 可认为，影响微波萃取过程的主要因素有：不同提取剂、物料粒度、提取剂浓 度、液料比、微波功率、微波提取时间6 个影响因素。首先进行单因素实验； 在此基础上对影响较大的因素进行正交实验；最后再进行提取次数的单因素实 验。通过3 个层次的实验获取最佳工艺参数。单因素实验中除液料比外的5 个 因素均以吸光度作为评价指标；而液料比因素以a ( 吸光度) v ( 溶剂体积) 为评价指标，这是因为不同液料比造成提取体系的体积差异很大，提取出的色 素浓度随溶剂体积的变化而变化，由于c = 一f f t ，又根据朗伯一比尔定律a = k b c ， 1 ， 一 则m = 等( k ，b 为定值，) 故采用a v 评价更合理；正交实验和提取次数单 k d 因素实验采用产品得率为评价指标。每个实验重复3 次，结果取平均值。 3 。2 。3 1 不同提取剂对提取效果的影响 准确称取6 0 目的蟹壳，各为4 o g ，分别加入8 0 m l 的9 5 乙醇、丙酮、石 油醚、氯仿、二氯甲烷、乙醚，设定微波温度上限4 0 ，分别在微波功率2 0 0 w 下提取1 2 0 s 。提取液经真空抽滤，再在t d l - 4 0 b 高速离心机中4 0 0 0 r m i n 离心 1 0 m i n ，取上清液，用7 2 1 分光光度计在4 1 6 n m 波长下测其吸光度。每个实验重 复3 次，取其平均值。 3 2 3 2 物料粒度对提取效果的影响 准确称取过4 0 目、6 0 目、8 0 目、1 0 0 目和1 2 0 目的蟹壳各4 0 9 ，分别加 入8 0 m l 的由实验3 2 3 1 确定的最佳提取剂，设定微波温度上限4 0 ，分别在 微波功率2 0 0 w 下提取1 2 0 s 。提取液经真空抽滤后，在t d l 一4 0 b 高速离心机中 4 0 0 0 r m i n 离心l o m i n ，取上清液，用7 2 1 分光光度计在4 1 6 n m 波长下测其吸光 度。每个实验重复3 次，取其平均值。 3 2 3 3 提取剂浓度对提取效果的影响 准确称取由实验3 2 3 2 确定的最佳物料粒度的蟹壳4 o g ，分别加入4 0 、 5 0 、6 0 、7 0 、8 0 、9 0 的最佳提取剂各8 0 m l ，设定微波温度上限4 0 ，分 别在微波功率2 0 0 w 下提取1 2 0 s 。提取液经真空抽滤，在t d l - 4 0 b 高速离心机 中4 0 0 0 r m i n 离心l o m i n ，取上清液，用7 2 1 分光光度计在4 1 6 n m 波长下测其 吸光度。每个实验重复3 次，取其平均值。 3 2 3 4 液料比对提取效果的影响 准确称取最佳物料粒度的蟹壳4 o g ，依次按液料比1 0 ：1 、1 5 ：l 、2 0 ：1 、2 5 ：1 、 3 0 ：1 加入由3 2 3 3 实验确定的最佳浓度的提取剂，设定微波温度上限4 0 ， 分别在微波功率2 0 0 w 下提取1 2 0 s 。提取液经真空抽滤，在t d l - 4 0 b 高速离心 机中4 0 0 0 r m i n 离心l o m i n ，取上清液，用7 2 1 分光光度计在4 1 6 n m 波长下测 其吸光度。每个实验重复3 次，取其平均值。 3 2 3 5 微波功率对提取效果的影响 准确称取最佳物料粒度的蟹壳4 o g ，分别按照由3 2 3 4 实验确定的最佳液 料比加入