（农产品加工及贮藏工程专业论文）液态发酵美味牛肝菌生成壳聚糖的研究.pdf

摘要 壳聚糖( c h i t o s a n ，简称c s ) 又称聚氨基d 葡萄糖，是几丁质的脱乙酰产物， 它是自然界中唯一存在的碱性多糖。由于其特殊的性质，壳聚糖被广泛应用在药物制 剂学、印染、化工、食品、农业等方面。目前，壳聚糖的工业化生产原料主要来自于 虾、蟹的外壳，该原料制备壳聚糖的提取方法耗能较高，对环境有污染，且原料受季 节和产地的影响较大。自从上世纪证实在真菌菌丝体细胞壁中有甲壳素存在以来，有 关从真菌菌丝中提取壳聚糖的报道不断涌现。但是大部分研究侧重于提取方法的研 究，对高产菌株的筛选与培养条件的优化的研究却不多。本实验主要通过利用对实验 室保藏的担子菌门牛肝菌科的美味牛肝菌液态发酵，研究得出高产壳聚糖的菌株培养 基主要组成成分和培养条件，并对发酵液中分离提取的目的物进行测定，主要研究结 果如下： 实验首先通过对美味牛肝菌液态发酵牛成壳聚糖的主要营养成分，碳源、氮源及 实验条件的单因子优化，确定了美味牛肝菌发酵的最佳基础培养基，结果表明美味牛 肝菌发酵生成壳聚糖的最佳碳源是葡萄糖，氮源是酵母浸出粉。并对其发酵条件进行 单因子优化，结果表明：在2 5 0 m l 三角瓶中美味牛肝菌的液态发酵生成壳聚糖的最 适p h 5 5 ，温度2 8 ，装液量8 0 m l ，发酵天数6 天。 在单因子研究基础上选择葡萄糖，酵母浸出粉和对实验结果影响较为明显的两个 发酵条件因素p h ，装液量共四因子，使用d p s 数据处理软件，设计响应曲面统计方 法( r s m ) ，优化出美味牛肝菌发酵生成壳聚糖的最佳条件。结果显示：以2 5 0 m l 三 角瓶作为发酵摇瓶，采用葡萄糖3 0 5 3 l 作为碳源，酵母浸出粉7 0 2 l 作为氮源， 在发酵温度为2 8 。c ，装液量达7 7 4 2 m l ，起始p h 为5 6 4 的条件下发酵6 天，获得壳 聚糖最大积累量为3 8 l l ，占菌丝体干重的1 5 4 3 。实验的验证结果表明该方程有 较好的拟合性。 通过对产物进行红外光谱( 瓜) 和紫外光谱( u v ) 的定性分析，确认了从美味 牛肝菌中提取的物质为壳聚糖，并且达到了较高的脱乙酰度和纯度，具有较好的品质。 利用从美味牛肝菌中提取的壳聚糖进行抑菌活性实验，发现浓度为2 的壳聚糖 溶液对大肠肝菌及枯草杆菌都具有抑菌活性，且对大肠杆菌的效果要优于枯草杆菌， 从而为其的进一步实际应用奠定了基础。 关键词：美味牛肝菌，液态发酵，壳聚糖，响应曲面法，抑菌活性 a b s t r a c t c h i t o s a ni sc a l l e da sp o l y a m i n o - d g l u c o s e ，a n di st h es h u c k i n ga c e t y lo f fp r o d u c t i o n f r o mc h i t i n ，w h i c hi st h ee x c l u s i v ea l k a l i n ea m y l a s ei nt h en a t u r e b e c a u s eo fc h i t o s a n s s p e c i a lc h a r a c t e r , i ti su s e dw i l d l yi nm e d i c a t i o n ，p r i n t i n gd y e ，c h e m i c a l ，f o o d ，a g r i c u l t u r e ， a n ds oo n a tp r e s e n t ，t h es h e l lo fs h r i m pa n dc r a ba r eu s e da st h es o u r c eo fi n d u s t r i a l i z e d p r o d u c t i o nc h i t o s a n b u tt h i se x t r a c t i o nw a y o fp r o d u c t i o nc h i t o s a nu s e su ps u b s t a n t i v e e n e r g y , p o l l u t e se n v i r o n m e n t ，a n dt h es o u r c e s i sr e s t r i c t e db ys e a s o na n dl o c a t i o n s i n c et h e n e x tc e n t u r yi tw a sa p p r o v e dt h a tt h ec h i t i ne x i ti nt h ew a l lo ff u n g i c i d a lc e l l ，t h er e p o r t so f e x t r a c t i n gc h i t o s a nf r o mm y c e l i u mo ff u n g a la p p e a r e dm o r ea n dm o r e b u tt h em o s tp a r t o fr e s e a r c hf o c u s e do nt h ew a yo fe x t r a c t i o n ，b u ti sn o tm u c hf o rr e s e a r c ha b o u tf i l t r a t i n g h i g hy i e l df u n g u s a n do p t i m i z i n gc u l t i v a t ec o n d i t i o n s t h i se x p e r i m e n tm a i n l yu s e d b o l e t u se d u l i st of e r m e n tl i q u o rf o rg e t t i n ge f f e c t i v ec o m p o s i t i o na n db e s tc u l t i v a t e c o n d i t i o n s a n dd e t e r m i n i n gt h ee x t r a c t i o nf r o mf e r m e n tl i q u o r t h em a i n l yr e s e a r c h c o n t e n ta n dr e s u l t si s ： 1 1 1 ee x p e r i m e n t a lf i r s t l yo p t i m i z e ds i n g l ef a c t o r s ，i n c l u d i n g ：c a r b o ns o u r c e ，n i t r o g e n s o u r c ea n dc u l t i v a t ec o n d i t i o n s c o n f i r m e dt h eb e s tb a s i cc u l t u r em e d i u mt of e r m e n t b o l e t u se d u l i s ，g l u c o s ea st h eb e s tc a r b o ns o u r c e ，y e a s te x t r a c ta st h eb e s tn i t r o g e ns o u r c e t h er e s u l t so fo p t i m i z e dc u l t i v a t ec o n d i t i o n s ：i n i t i a lp hw a sp h 5 5 ，t e m p e r a t u r ew a s2 8 c ， b r o t hc o n t e n tw a s8 0 m l ，i n2 5 0 m lf l a s kf o r6d a y s c h o s e dg l u c o s e , n i t r o g e n ，i n i t i a lp h ，a n db r o t hc o n t e n ta sf o u rk e yf a c t o r sb a s e do n s i n g l ef a c t o rr e s e a r c h r e s e a r c hu s e dd p sd a t am a n a g es o f t w a r et od e s i g nr s mm e t h o d f o ro p t i m i z i n gc u l t i v a t eb e s tc o n d i t i o n so fb o l e t u se d u l i sf e r m e n tt op r o d u c ec h i t o s a n t h e r e s u l t ss h o w e d ：g l u c o s eo f3 0 5 3 9 1 ，y e a s te x t r a c to f7 0 2 9 l ，o p t i m a lt e m p e r a t u r ew a s2 8 。c ， i n i t i a lp ha t5 6 4 t h eb r o t hc o n t e n to f7 7 4 2 m li n2 5 0 m lf l a s kf o r6d a y s t h em a xq u a l i t y o f c h i t o s a ni s3 8 1 9 1 t a k i n g1 5 4 3 t h ed r yw e i g h to f m y c e l i u m t h ee x p e r i m e n td e t e r m i n e dt h ep r o d u c t i o nf r o mb o l e t u se d u l i sb yi ra n du v c o n f i r m e dt h a tt h ep r o d u c t i o nf r o mb o l e t u se d u l i sw a sc h i t o s a n a n dt h ec h i t o s a nw a s h i g hd da n dp u r i t y , r e a c h e dg o o dq u a l i t y t h e nu s e dt h ec h i t o s a no fb o l e t u se d u l i st or e s t r a i nb a c t e r i ad e v e l o p t h er e s u l t s s h o w e d ：t h e2 c o n c e n t r a t i o no fc h i t o s a na c e t i c b o t hb a c t e r i a a n dt h ea n t i b a c t e r i a la b i l i t yt o i i a c i dl i q u o rh a v ea n t i b a c t e r i a la b i l i t yf o r e c o l iw a sb e t t e r 山a nb s u b t i 缝s o e s t a b l i s h e db a s ef o rc h i t o s a nf i o mb o l e t u se d u 超a p p l i c a t i o ni np r a c t i c e k e yw o r d s ：b o l e t u se d u l i s ，l i q u o rf e r m e n t a t i o n ，c h i t o s a n ，r s m ，a n t i b a c t e r i a la b i l i t y 1 1 1 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：时间：年月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 第一导师签名： 时间： 年月日 时间：年月日 1 文献综述 1 1 壳聚糖 1 1 1 壳聚糖的命名及结构 壳聚糖( c h i t o s a n ，简称c s ，结构式见图1 - 1 ) 又称聚氨基d 葡萄糖或甲壳素， 是几丁质的脱乙酰产物，它是自然界中唯一存在的碱性多糖【l 】。几丁质( 结构式见图 1 2 ) ，即p ( 1 4 ) 2 乙酰氨基2 脱氧d 葡萄糖，是一种在自然界中广泛存在的高分子 多糖，由n 乙酰氨基葡萄糖以p 1 ，4 糖苷键缩合而成，其基本结构单元是甲壳二糖。 壳聚糖是将几丁质结构式上的n 乙酰基大部分或部分被脱去而得到的几丁质衍生 物。一般而言，n 乙酰基脱去5 5 以上的就可称之为壳聚糖，而n 乙酰基脱去5 0 以下的都称之为几丁质，由此可见，壳聚糖与几丁质的差别仅仅是n 脱乙酰度不同 而已【2 】。 自从1 8 1 1 年法国科学家发现甲壳素以来甲壳素及壳聚糖的特性被逐渐认识和利 用。尤其是近年来，国内外相关的研究日趋活跃，甲壳素和壳聚糖已被现代科学称之 为继糖类、蛋白质、脂肪、维生素、矿物质等五大生命要素之后的第六生命要素 2 1 。 h o 图1 - 1 壳聚糖的结构式 f i g 1 1t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo fc h i t o s a n o c h ，o h 图l - 2 几丁质的结构式 f i g 1 - 2 t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo f c h i t i n 1 1 2 几丁质与壳聚糖在自然界中的存在 几丁质作为壳聚糖的主要来源，在自然界中存在十分广泛，在自然界中每年的生 物合成量达近百亿吨之多。 在自然界中主要存在于：( 1 ) 节肢动物中的甲壳纲类，譬如虾蟹的外壳，其甲壳 素含量可达到5 8 - 8 5 ，这也是现在市面所受壳聚糖的主要原料来源；( 2 ) 在其他 一些如软体动物、环节动物、原生动物、腔肠动物中，也有几丁质存在，但含量不高 ( 最多3 0 ) ；( 3 ) 海藻当中，尤其是绿藻含有少量的甲壳素。( 4 ) 自然界中除少数 真菌外，其他真菌均含有甲壳素或和壳聚糖。因为甲壳素是真菌细胞壁的主要组成 成分，特别是在子囊菌纲、担子菌纲、藻类纲及半知菌纲等真菌细胞壁中的含量是十 分可观的( 甲壳素含量为菌体干重的2 0 一2 2 ) 。 1 1 3 壳聚糖的应用及市场前景 1 1 3 1 壳聚糖在食品工业中的应用 壳聚糖在食品工业中可作为：( 1 ) 抗菌防腐剂【3 删( 2 ) 抗氧化剂5 1 ( 3 ) 稳定和凝固 剂【6 1 ( 4 ) 被膜保鲜制7 删( 5 ) 甜味剂9 1 ( 6 ) 饮料澄清剂 1 0 1 1 1 3 2 壳聚糖在其他领域的应用 壳聚糖除了在食品工业中得到了广泛应用外，还在以下几个领域中得到了越来越多的 应用：( 1 ) 医药领域：由于壳聚糖来源于生物体结构物质，与人体细胞有很强的亲和 力，可被体内的酶分解而吸收，对人体无毒性和副作用，且利用壳聚糖制成的纳米粒 具有缓释、靶向、增加药物吸收等作用【l l 】【1 2 】。在医药领域，可被用来作为包裹药物 的微胶囊试剂【1 3 】和作为基因治疗的传送载体：( 2 ) 化妆品领域：虽然壳聚糖良 好的保湿性，吸水性，p h 稳定性和抑菌性，但由于壳聚糖只溶于酸性溶液，极难溶 于水中，从而限制了其在化妆品领域中的应用。 1 6 但是将壳聚糖进行分子修饰改性 后得到的衍生物可以改变壳聚糖不溶于水和易降解的缺陷，使其达到了在化妆品应用 中的目的，且效果要比甘油更好 17 1 。( 3 ) 纺织领域：在纺织工业中，壳聚糖主要应用 于两方面：一方面是利用壳聚糖的成纤性纺制纤维，开发制作织物；另一方面利用其能 溶于稀酸的性质和其化学反应活性，对织物进行后整理，赋予织物优良的性斛1 8 】【1 9 】。 1 1 3 3 壳聚糖的市场概况【2 u j ( 1 ) 国际市场情况 壳聚糖在国际市场上供不应求，多年来在国际市场上都一直保持旺市畅销的局 面，故此，促使销售价格不断上涨。如1 9 9 0 年，每吨工业级壳聚糖的售价仅为1 万 美元左右，到1 9 9 9 年则猛升为5 万美元。其中食品级，药用级壳聚糖的价格则分别 2 达每吨1 2 万美元和2 0 0 万美元。仅美国，日本每年壳聚糖的消费量就分别高达4 0 0 吨和2 0 0 0 吨。 ( 2 ) 国内壳聚糖的市场现状及前景展望 我国具有丰富的甲壳素资源，发展壳聚糖产业具有得天独厚的优势条件，壳聚糖 及其衍生物的开发应用及市场发展前景较好。 国内对壳聚糖的需求势头旺盛。我国壳聚糖的应用研究及生产始于2 0 世纪9 0 年代初期，至1 9 9 7 年，壳聚糖生产已实现工业化批量生产，当年全国的总产量约为 1 5 0 吨，1 9 9 9 年上升为4 0 0 吨，国内需求量则高达8 0 0 吨，处于供不应求的状态。 1 1 4 利用真菌提取壳聚糖的研究进展 真菌细胞中的甲壳素是在甲壳素合成酶的作用下。以二磷酸尿苷( u r i d i n e d i p h o s p h a t eu d p ) - n 一乙酰氨基葡萄糖为单位合成的( 图1 3 ) 。与甲壳素合成酶共存的 还有甲壳素脱乙酰酶，因此在甲壳素合成过程中同时发生着n 脱乙酰基过程，合成 出来的甲壳素分子链的糖单元不是1 0 0 的n 乙酰氨基葡萄糖( 甲壳素) ，还有一部分 是氨基葡萄糖( 壳聚糖) 【2 1 1 。这就是为什么有些真菌体内不仅存在着甲壳素，还存在着 壳聚糖，甚至壳聚糖含量比甲壳素含量更高【2 2 】【2 3 】。 图1 3 真菌细胞中甲壳素的生物合成过程1 2 4 】 f i g i - 3t h eb i o s y n t h e s i sp r o c e s so f c h i t i ni ne p i p h y t ec e l ! 当前市场出售的甲壳素壳聚糖类产品主要是从虾、蟹壳中提取，菌体壳聚糖的 制备工艺尚处在研究阶段。地球上有丰富的微生物资源，大部分种类可以用工业发酵 技术实现大规模培养，这为壳聚糖的集约化生产提供了物质基础。【2 5 】 自从1 9 6 0 年s a l t o n 掣2 6 】证实在粗糙脉抱壳菌的细胞壁中有微丝几丁质以来，从 真菌菌丝中制备出壳聚糖的报道不断涌现。主要可以分为以下几个大方面： ( 1 ) 黑曲霉制备壳聚糖 黑曲霉作为发酵工业中常用的真菌，在我国有悠久的培养和使用历史 2 7 1 。黑曲霉 又是含甲壳素最多的真菌，因此研究和开发由黑曲霉生产壳聚糖的技术，对促进我国 壳聚糖的生产和应用具有十分广阔的前景。 黄惠莉等【2 8 】使用培养基发酵产生黑曲霉菌体，采用机械破碎与酸碱交替结合，从 菌体中提取几丁质制备壳聚糖。并采用高压稀碱法处理甲壳素，得到较好的效果：由 碱法处理从黑曲霉菌体中得到的壳聚糖收率7 7 5 ，脱乙酰度7 4 9 5 ；使用高压稀 碱法，从甲壳素中提取壳聚糖，碱浓度为5 0 0 m o l l ，时间1 h 脱乙酰度大于8 0 ：碱 浓度大于7 5 0 m o l l ，2 h 脱乙酰度可达到9 0 左右，采用高压稀碱法可以达到较好的 脱乙酰效果。曹健等【2 9 】以实验室发酵的黑曲霉菌丝体为原料，采用电解法从中提取甲 壳素，再将甲壳素碱法脱乙酰转化为壳聚糖，取得了不错的结果。试验证明，利用电 解法从黑曲霉中提取甲壳素实践上是可行的。叶龙祥等【3 0 】利用大容量发酵罐对黑曲霉 进行扩大培养，并以壳聚糖为目标产物对发酵的培养基成分进行了优化，为黑曲霉发 酵提取壳聚糖的扩大化生产奠定了基础。 ( 2 ) 毛霉制备壳聚糖 结合菌纲毛霉目毛霉科的真菌在现今工业发酵上有极为重要的经济价值，该科真 菌细胞壁中的主要成分是壳聚糖，在提取时不必再经过脱乙酰过程，所以有望作为壳 聚糖提取的新原料来源【3 1 | 。所以具有广阔的应用前景。 王荣等【3 2 】选用总状毛霉和根霉两种真菌作研究对象，结合从虾蟹壳中用酸碱法提 取甲壳质的方法，根据实脸材料的具体情况，进行了一系列的修改、补充，通过发酵， 然后对菌丝体中壳聚糖的提取流程后，获得了壳聚糖。从中得出一条适合于从丝状真 菌中提取壳聚精的新途径。且实验证明：总状毛霉比根霉的产率高。陈忻等人【3 3 】以经 过筛选的第三代雅致放射毛霉为原料，在温度2 8 、摇床转速2 5 0 r m i n 、p h 7 4 7 6 条件下培养4 5 h 。发酵后菌体经稀碱加热脱蛋白，再用稀酸处理提取壳聚糖，产品产 率达1 5 6 8 ，脱乙酰度达9 0 左右。他们还发现培养初期菌丝体生长迅速，壳聚糖 含量也迅速增加，但随着培养时间的延长，菌丝体中壳聚糖含量和相对分子质量逐渐 下降。因此适时收获菌体非常关键。 ( 3 ) 犁头霉制备壳聚糖 实验证明，犁头霉在发酵时可利用较为廉价的营养元素，发酵的生物物质为颗 粒状，有利用发酵成本的降低和菌丝体的提取。且利用犁头霉发酵提取壳聚糖在国外 已经取得了不错的研究结果，得出了较为成熟研究方法畔j 。 国内的谢德明【3 5 】利用液体发酵培养犁头霉属真菌，培养温度控制在2 8 2 9 c ，初 始p h 值5 0 的条件下，可使壳聚糖的收率达到7 8 0 m g l 。实验证明培养温度、培养 时间以及培养液p h 值大小都直接影响到壳聚糖产品的产率以及脱乙酰度。有效控制 发酵条件，可以获得不同微观形态结构的壳聚糖，这对制备特殊用途的壳聚糖产品非 常重要。 ( 4 ) 从其他真菌中制备壳聚糖 从其他一些文献中，还能得出不仅利用真菌菌丝体得到壳聚糖，还可以通过子实 体的提取方法来得到目的产物。国内有人在2 0 0 0 年【3 6 】就利用香菇梗结合简单的提取 4 壳聚糖工艺流程得到了脱乙酰度达7 8 的壳聚糖产品。同时使在食用过程中的废弃物 得到了利用。 不仅通过液态发酵方法来生成壳聚糖，固态发酵方法同样可以得到壳聚糖产品。 陈凡等【3 7 】利用对糙皮侧耳固体发酵菌丝的断裂繁殖，定量测定了其细胞结构特征物一 壳聚糖，在断裂繁殖过程中的变化情况。根据实验结果可得了两个结论：( 1 ) 固体发 酵菌丝断裂繁殖可促使菌丝生长量显著增加；( 2 ) 断裂繁殖对菌丝生长的促进效果不 能无限制地延续，这可能与培养基中某种营养成份的耗尽有关。 1 1 5 壳聚糖的抑菌作用 1 1 5 1 壳聚糖抑菌机理 人们对于壳聚糖的抑菌机理的认识已经有了长远的发展。但是，就其确切的抑菌 机理来讲至今还不太清楚，可以说是众说纷纭。可能是由于实验条件的差别及人们的 观察角度也有所不同造成的。因此在抑菌机理方面还存在不同的看法。普遍认为壳聚 糖的抑菌机理主要有以下三种可能： ( 1 ) 大分子壳聚糖溶液扰乱细菌细胞的新陈代谢。大分子的壳聚糖酸溶液在细菌细 胞表面容易形成致密的外膜，抑制了细菌细胞膜的通透性，干扰菌体细胞膜的功能， 影响细菌对营养物质的吸收，阻止代谢废物的排泄，导致菌体的新陈代谢紊乱，从而 起到抑制细菌增殖和杀灭细菌的目的【4 】【3 8 】。 ( 2 ) 壳聚糖破坏细菌细胞壁的完整性，达到抑菌抗菌作用。壳聚糖的有效基团n h 3 + 可以与细菌细胞膜上的类脂蛋白质复合物反应，使蛋白质变性，改变细胞膜的通透 性或者与细菌细胞壁形成一个负电荷环境，致使壳聚糖损坏细胞壁的完整性或使细胞 壁趋于溶解，直至细胞死亡【3 圳。 ( 3 ) 壳聚糖直接与菌体d n a 和m r n a 作用。低分子质量的壳聚糖可以通过渗透的 方式进人到细菌的细胞体内。带有正电荷的壳聚糖与带有负电荷的d n a 发生了相互 作用，影响了r n a 的转录和蛋白质的合成，从而实现了抑茵的目的【4 0 】。如果分子量 进一步减少，则有效基团减少，失去了抗菌能力，甚至作为营养物质被利用，反而促 进了菌体的生长【4 。 1 1 5 2 影响壳聚糖抑菌效果的因素 ( 1 ) 浓度对壳聚糖抑菌活性的影响 目前大多数的研究结果都认为，壳聚糖的抑菌能力随其浓度增大而增强，原因归 结为壳聚糖分子中n h 2 基团的存在，随着壳聚糖浓度的增加，溶液中- n h 2 的浓度也 增加，从而增强抑菌的效果”2 | 。但是有报道认为适当低浓度的壳聚糖的抑菌能力最强 【4 3 1 。张伟等【州对水溶性壳聚糖的抗菌性进行了实验，发现水溶性壳聚糖的抗菌活性 随其浓度的增加而增加，且它的抗真菌活性强于抗细菌活性。 ( 2 ) 分子量对壳聚糖抑菌活性的影响 5 分子量是影响壳聚糖抑菌性能的最主要因素。宋献周等”就几种不同分子量的壳 幂糖对几种常见苗( 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、产气荚膜杆菌) 的抑制研 究表明，低分子量壳聚糖的抑苗效果优于高分子量的壳聚糖。夏文水等【4 q 采用大肠杆 菌作为试验菌株，测得分子量为1 5 0 0 d a 的低聚壳聚糖抑菌效果最强。但是，也有一 些研究利用不同的试验菌，得出结论认为壳聚糖分子量较大时，其抑菌能力更强 【4 【 ( 3 ) 脱乙酰度对壳聚糖抑菌活性的影响 许多实验结果证明，随着脱乙酰度的增加壳聚糖的抑菌活性也随之增加蛔【”1 。 高脱乙酰度的壳聚糖使一n h 2 的浓度增加，使得更多的带正电的一h n 3 + 吸附到带负电 的细菌表面上，从而干扰了细胞的正常的生长、繁殖。 l2 美昧牛肝菌 12 1 美昧牛肝菌简述 美味牛肝菌( b o l e r o se d u l i sb a l l 既f r ) ( 见图l _ 4 ) 属于担子菌亚门 ( b a s i d i o m y c o t i n a ) 、层菌纲( h y m c n o m y c c t e s ) 、伞菌目( a g 舯c a s e ) 、牛肝菌科( b o l c l a c e a e ) 中的一种口。是一种世界范围内分布的药食兼用经济价值较高的真菌。我国各省均有 分布，西南地区产量较高。据报道口“，全世界己知的牛肝菌属约有1 0 2 4 种或变种， 我国已知的可食用的就有1 9 9 种。 圈 k 蔓：篁 图1 - 4 美味牛肝菌子实体 f i g1 - 4 t n e m u s h r o o m b o e m se d u l i s 12 2 美味牛肝菌的液态发酵研究 张华山口2 1 对玉米粉在美味牛肝菌深层培养作用进行了研究，结果表明玉米粉适 合美味牛肝苗的深层培养，得到发酵培养基配方为：糖蜜15 ，玉米粉4 ，黄豆粉 2 ，酵母粉o2 ，k h 2 p 0 4o2 ，m g s 0 47 h 2 00 l5 p h 6 。发酵试验以5 0 0 m l 三 角瓶装培养液15 0 m l 将1 0 的接种量接入一级种子培养物，15 0r r a i n ，2 6 c 振荡培 养5 天，得到的菌丝体干重最重达2 46 9 l 。 另一名学者邓百万对美味牛肝菌的深层发酵条件进行了分析研究，结果表明：最 适培养基配方为：葡萄糖3 0 眙，酵母膏7 0 9 ，k h 2 p 0 42 0 9 ，m g s 0 4 7 h 2 01 0 9 ，v b1 0 0 1 m g ，c a c 0 32 0 9 ；最优发酵条件的初始p h 值5 2 5 8 ，振荡速度18 0 r m i n ，培养 温度2 7 c ，1 0 0 m l 三角瓶装液量6 0 m l ，取得了较好的结果【5 3 1 。之后邓百万又对美 味牛肝菌的液态发培养菌丝体与野生子实体的品质进行分析比较，结果表明，美味牛 肝菌液态培养菌丝体和野生子实体均含有蛋白质、多糖、氨基酸、脂肪、纤维、矿物 质等多种营养成分，其组成基本一致，但菌丝体在多种成分的质量分数上均高于野生 子实体阱】。在此研究的基础上邓百万等【5 5 】对美味牛肝菌的胞外多糖的发酵条件进行 优化筛选，结果显示，美味牛肝菌发酵产胞外多糖的最适碳源是蔗糖，氮源是豆饼粉； 液体发酵的优化培养基是马铃薯10 ，蔗糖2 o ，豆饼粉0 6 ，k h 2 p 0 40 3 ， m g s 0 4 7 h 2 00 2 ，c a c 0 30 2 ；液体发酵的优化条件是初始p h 5 4 5 8 ，振荡速度 1 8 0 - 2 2 0 r m i n ，培养温度2 8 ，装液量6 0 ( v v ) 。并将菌株放大至7 l 罐发酵进行扩 大培养，2 8 发酵9 0 h ，胞外多糖得率是3 2 8 4 9 l 。 7 2 引言 2 1 课题的立题背景及意义 由于几丁质壳聚糖具有天然、无毒【5 6 】、无刺激性、无免疫性及良好的生物相容 性等多方面优点，其应用领域正逐步扩大，以发展趋势看，二十一世纪的几丁质工业 在材料科学、医药工业、制剂工业，食品科学的发展中占着举足轻重的作用。 随着人们对甲壳素壳聚糖及其衍生物应用研究的逐渐深入，对甲壳素和壳聚糖 及其制品的需求将会大幅度增长。目前，国内的工业级壳聚糖价格约5 万元t ，经进 一步加工制成的水溶性壳聚糖价格达1 0 万元t 以上，生物及医药级壳聚糖衍生物价 格高达2 0 0 万美元t 。从市场消费看，国内1 9 9 9 年的壳聚糖需求量达8 0 0 t ，预计到 2 0 0 5 年，国内需求量达4 0 0 0 t ，世界总需求量达2 0 0 0 0 t t 5 7 1 。这就迫切需要加速发展壳 聚糖产业，寻找可以替代虾蟹壳原料，能够生产出高质高量的壳聚糖产品。 并且虾蟹壳来源壳聚糖具有以下缺点：制备成本较高，能耗较大，并且在使用 4 5 n a o h 高温脱乙酰基制备壳聚糖的过程时，会产生大量的废水污染环境。壳聚糖 的生产受到原料产地限制影响较大。而且近年来，废弃虾、蟹壳被用作饲料生产原料， 已经造成几丁质壳聚糖生产原料短缺。 而利用微生物生产几丁质与壳聚糖有巨大优势：( 1 ) 大部分真菌可通过工业发酵 技术大规模培养，( 2 ) 不受原料复杂性、季节性、地域性等的限制，( 3 ) 产品质量和 产量易于控制，生产工艺简单，周期短，( 4 ) 动力消耗和环境污染小【5 8 】。( 5 ) 并且可 以利用工业废菌来生产，更能降低成本，减少环境污染。 目前，以有许多研究报道了从不同真菌中提取壳聚糖的提取方法。但是从担子菌 纲的真菌中提取壳聚糖的报道还没有见到。并且许多学者只是对提取方法加以研究， 而对真菌发酵产壳聚糖的培养基成分的分析并不是很多，并对提取产物的功能应用也 不是很重视。本实验主要利用担子菌纲的美味牛肝菌液态发酵提取壳聚糖，来测定美 味牛肝菌中的壳聚糖含量及优化出适合牛肝菌发酵生成壳聚糖的培养基的营养配方， 并对提取的产物进行测定。最后利用提取的产物对常见的食品致病菌进行抑菌实验， 观察效果。 2 2 本实验的主要内容 1 ) 在实验室前期基础上，对美味牛肝菌发酵产壳聚糖的培养基组成和发酵条件 进行优化；2 ) 对提取的产品进行各个指标的品质鉴定；3 ) 对提取的产物的抑菌活性 进行实验，观察效果。 3 材料与方法 3 1 材料 3 1 1 菌株 美味牛肝菌菌株( b o l e t u se d u l i s5 0 5 5 9 ) 购自中国菌种保藏中心。 美味牛肝菌菌种的活化：将4 c 冰箱保存的试管菌株重新接种于新鲜p d a 斜面 培养基上，置于2 8 c 培养箱中培养6 天，多次转接活化后备用。 枯草杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) ，大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o i l ) 来自本实验室保藏菌 株。 细菌菌株的活化：将在4 。c 冰箱保存的枯草杆菌，大肠杆菌菌株重新划线培养于 新配制的营养琼脂培养基中，置于3 7 培养箱中，培养2 4 h ，备用。 3 1 2 真菌培养基 斜面培养基( p d a ) ( g l ) ：p d a 培养基。取去皮土_ 豆2 0 0 ，加双蒸水1 0 0 0 m l 煮沸3 0m i n ，滤去土豆块，将滤液补足至1 0 0 0m l ，加葡萄糖2 0 ，琼脂1 8 - 2 0 ，1 2 1 ， 0 1m p a 灭菌2 0m i n 。 平皿培养基：p d a 培养基。 种子液培养基( l ) ：葡萄糖2 0 ，酵母浸出粉5 ，k h 2 p 0 42 ，m g s 0 4 。7 h 2 0l ， 起始p h 为5 5 。 单因子基础发酵培养基( 班) ：碳源因子筛选基础培养基：酵母粉7 ，k h 2 p 0 42 ， m g s 0 4 7 h 2 01 ，v b l 0 0 1 ，c a c 0 32 ，玉米粉2 0 ，起始p h 5 5 ；氮源因子筛选基础培 养基：葡萄糖3 0 ，k h 2 p 0 42 ，m g s 0 4 7 h 2 01 ，v b l 0 0 1 ，c a c 0 32 ，玉米粉2 0 ，起始 p h 5 。5 。 3 1 3 细菌培养基 营养琼脂培养基( l ) ：牛肉膏3 ，蛋白胨1 0 ，n a c l 5 ，琼脂2 0 。调p h 值7 2 - 7 4 ， 1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 3 2 主要试剂 氢氧化钠、冰醋酸、重蒸酚、浓硫酸、苯酚、硫酸、无水乙醇，葡萄糖，蔗糖， 麦芽糖，乳糖，酵母粉，蛋白胨，硫酸铵，硝酸铵，琼脂，m g s 0 4 7 h 2 0 ，c a c 0 3 ， v b i ，k h 2 p 0 4 ，均为国产分析纯。标品壳聚糖( 购于上海国药集团，脱乙酰度大于 9 0 ) 。 3 3 主要仪器 9 k q 2 5 0 d e 医用数控超声波清洗器 2 1 0 2 c 型全温振荡摇床 l d z x 4 0 11 型压力蒸汽灭菌器 s p x 15 0 b z 型生化培养箱 g z x 9 0 9 0 型数显鼓风干燥箱 超净工作台 f a l l 0 4 n 型电子天平 t d l 5 型离心机 p h s 一3 c 型精密p h 计 d k 8 d 型电热恒温水槽 7 5 2 型紫外分光光度计 t u l 9 0 1 双光束紫外可见分光光度计 8 0 冰箱 红外光谱仪n e x u s 8 7 0 x s p 1 c 生物显微镜 昆山超声仪器有限公司 上海智城分析仪器制造有限公司 上海申安医疗器械厂 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 苏州净化设备有限公司 上海民桥精密科学仪器有限公司 上海安亭科学仪器厂 上海理达仪器厂 上海精宏实验设备有限公司 上海精密科学仪器有限公司 北京普析通用 中科美菱 n i c o l e ti n s t r u m e n tc o r p e r a t i o n ，u s a 上海浦东物理光学仪器厂 3 4 发酵培养条件 种子液发酵培养条件：将经过p d a 培养基活化后的菌丝体表面用孔径为l c m 的 打孔器接种至经1 2 1 3 ，2 0 m i n 高压灭菌过的5 0 m 1 种子液培养基中( 2 0 0 m l - - - 角瓶) ， 初始p h 5 5 ，置摇床中，于2 8 c 条件下，转速1 4 0 r p m 培养6 天，即得发酵用种子液。 基础发酵培养条件：将5 m l 培养到期的种子液转接入经1 2 1 3 c ，2 0 m i n 高压灭 菌过的6 0 m l 装液量的基础发酵培养基中( 2 5 0 m l 三角瓶) ，调初始p h 5 5 ，置摇床 中，在2 8 。c 条件下，转速1 6 0 r p m ，培养1 0 天。 3 5 单因子实验筛选 3 5 1 碳源优化培养 供试碳源：葡萄糖，乳糖，蔗糖，麦芽糖。 试验方法：将4 种供试碳源分别称取3 0 9 ，与3 1 2 中的碳源因子筛选基础培养 基组合制成4 种培养基，2 5 0 m l 三角瓶装6 0 m l 培养液，灭菌、冷却后取生长良好的 平面菌种在超净工作台上用孔径为l c m 的打孔器接l e m 2 菌体于三角瓶中，置于恒温 振荡培养摇床中2 8 。c ，1 6 0 r p m 条件下，振荡培养1 0 天，每种碳源3 个重复。 3 5 2 氮源优化培养 供试氮源：蛋白胨，酵母浸出粉，硫酸铵，硝酸铵 试验方法：将4 种供试氮源分别称取7 9 ，与3 1 2 中的氮源因子筛选基础培养基 1 0 组合制成4 种培养基，2 5 0 m l 三角瓶装6 0 m l 培养液，灭菌、冷却后取生长良好的平 面菌种在超净工作台上用孔径为l e m 的打孔器从平面培养基上接l c m 2 菌体于三角瓶 中，置于恒温振荡培养摇床中2 8 ，1 6 0 r p m 条件下，振荡培养1 0 天，每种氮源3 个重复。 3 5 3 初始p h 的筛选 发酵培养基( l ) ：以葡萄糖3 0 ，酵母粉7 ，k h 2 p 0 42 ，m g s 0 4 7 h 2 0l ，v b l 0 0 1 ， c a c 0 32 ，玉米粉2 0 ，接种l e n a 2 美味牛肝菌菌丝体。 实验分别设定基础发酵培养基起始p h 值为3 5 、4 5 、5 5 、6 5 、7 5 ，于恒温振 荡培养摇床中2 8 c ，转速| 6 0 r p m ，装液量6 0 m l 的条件下，振荡培养1 0 天，每个条 件做3 个重复。 3 5 4 最佳发酵温度的筛选 发酵培养基( l ) ：以葡萄糖3 0 ，酵母粉7 ，k h 2 p 0 42 ，m g s 0 4 7 h 2 01 ，v b l 0 0 1 ， c a c 0 32 ，玉米粉2 0 ，接种l e n a 2 美味牛肝茵菌丝体，每个条件做3 个重复。 实验分别设定基础发酵培养基的发酵温度为2 2 ( 2 、2 4 、2 6 、2 8 、3 0 ， 在起始p h 5 5 ，转速1 6 0 r p m ，装液量6 0 m l 的条件下，振荡培养1 0 天，每个条件做 3 个重复。 3 5 5 最佳装液量的筛选 发酵培养基( 叽) ：以葡萄糖3 0 ，酵母粉7 ，k h 2 p 0 42 ，m g s 0 4 7 h 2 01 ，v b l 0 0 1 ， c a c 0 32 ，玉米粉2 0 ，接种l e n a 2 美味牛肝菌菌丝体。 实验以2 5 0 m l 三角瓶作为发酵摇瓶，分别设定装液量为6 0 m l 、7 0 m l 、8 0 m l 、 9 0 m l 、1 0 0 m l 进行发酵培养，在温度2 8 ( 2 ，起始p h 5 5 ，转速1 6 0 r p m 的条件下，振 荡培养1 0 天，每个条件做3 个重复。 3 5 6 最佳发酵天数的筛选 发酵培养基( l ) ：以葡萄糖3 0 ，酵母粉7 ，k h 2 p 0 42 ，m g s 0 4 7 h 2 01 ，v b l 0 0 1 ， c a c 0 32 ，玉米粉2 0 ，接种l e m 2 美味牛肝菌菌丝体。 在起始p h 5 5 ，温度2 8 c ，转速1 6 0 r p m ，装液量6 0 m l 的条件下，进行发酵实 验。在发酵开始后，分别在第3 天、4 天、5 天、6 天、7 天、8 天、9 天、1 0 天、从 三角瓶中取出发酵液，通过测定菌丝体干重和壳聚糖产量，以确定产物生成曲线和最 佳培养时间，每个条件做3 个重复。 3 6 响应曲面法( r s m ) 优化发酵培养基 3 6 1 优化方案关键因子的选定 根据单因素的实验结果，培养基成分中的碳源( 葡萄糖) 、氮源( 酵母浸出粉) 和培养条件中的起始p h 、装液量，是影响美味牛肝菌液态发酵产壳聚糖的关键因子， 而温度、天数只对壳聚糖在菌丝体内的积累起辅助作用。因此，四个关键因子即葡萄 糖、酵母浸出粉、装液量以及起始p h 被选作独立变量，在优化后的培养天数6 天和 优化后的温度2 8 c 的条件下，选用转速1 6 0 r p m ，运用发酵实验使用较为成熟的响应 曲面法( r s m ) 的二次回归旋转组合设计对这四个因子参数做进一步优化。实验方案 设计为四因子五水平( 见表3 1 ) 。 表3 1 实验变量因子编码水平值 t a b l e3 - 1i n d e p e n d e n tv a r i a b l e si nt h ee x p e r i m e n t a lp l a n 本实验所采用的响应曲面法是中心组合旋转设计( c e n t r a lc o m p o s i t er o t a t a b l e d e s i g n ，c c r d ) ，设计方案为四因子五水平( 见表3 - 1 ) 。实验为四因子全实施的中心组 合旋转设计，共有3 6 组实验。( 见表3 2 ) 表3 2 四岗子五水平中心组合旋转设计实验方案( 编码实际值见表3 1 ) t a b l e3 - 2c e n t r a lc o m p o s i t er o t a t a b l ed e s i g nf o rt h eo p t i m i z a t i o no ff o u ri n d e p e n d e